Introduction
Rispetto alla stimolazione elettrica convenzionale, fotostimolazione offre una maggiore risoluzione temporale e spaziale, con un minimo al sistema fisiologico di esemplari. Dal momento che la manifestazione di utilizzare il laser per stimolare i neuroni nel 1971 1, molti modi creativi sono stati inventati per controllare esogena attività neuronale con la luce. Rilascio ottica di agonisti photocaged è stato a lungo utilizzato per studiare la risposta fisiologica della rete neuronale di ligandi 2,3,4. Questa tecnica ha limitato specificità dovuta alla diffusione di agonisti gabbia. Specificità genetica si ottiene che esprimono canali ectopicamente opsine sensibili alla luce e pompe 5,6,7, ed è stato applicato con successo per modulare reti neuronali selezionati in diversi organismi modello. Tuttavia, sarebbe difficile applicare questo metodo per controllare otticamente varie altre proteine neuronali, poiché l'innesto photoresponsiveness dalle proteine opsin ad altre proteine would richiedono engineering intensa che possono alterare le caratteristiche naturali della proteina in esame. Chimicamente legare un ligando esogeno fotosensibile ad una proteina ha dimostrato un altro modo per controllare la funzionalità delle proteine canale 8,9,10. Il legante è presentato o ritirato dal sito di legame della proteina attraverso la fotoisomerizzazione della porzione azobenzene. Tethering chimica limita l'applicazione principalmente al lato extracellulare di proteine di membrana, escludendo il lato intracellulare e proteine intracellulari.
Fotoresponsivi Uaas, dopo essere stato incorporato nelle proteine, forniscono una strategia generale per manipolare le proteine con la luce. Nel primi sforzi, tRNA acilata chimicamente con Uaas photocaged stati microiniettati in ovociti di Xenopus per incorporare le Uaas in recettori di membrana e canali ionici 11, che hanno avanzato la comprensione delle loro relazioni struttura-funzione 12,13,14.Questo approccio microiniezione è principalmente limitata alle grandi ovociti. Costituzione genetica di una SAU bypassa il tecnicamente impegnativo tRNA acilazione e microiniezione utilizzando una coppia di tRNA / sintetasi ortogonale, che incorpora la SAU attraverso la traduzione della proteina endogena in cellule vive 15,16,17,18. SAU incorporazione in proteine neuronali è stata dimostrata in neuroni primari e le cellule staminali neurali 19,20. Più recentemente, fotosensibile SAU è stata geneticamente incorporato in una proteina neuronale nel cervello dei mammiferi in vivo per la prima volta 21. Questi progressi permettono di studiare le proteine neuronali con Uaas nel loro ambiente cellulare nativo.
Canale del potassio Rettificante internamente Kir2.1 è un forte raddrizzatore che passa K + correnti più facilmente in quanto dalla cellula, ed è essenziale nella regolazione dei processi fisiologici tra cui eccitabilità cellulare, tono vascolare, frequenza cardiaca, reflusso di sale finale e rilascio di insulina 22. Sovraespressione di Kir2.1 Hyperpolarizes del potenziale di membrana del neurone bersaglio, che diventa meno eccitabile 23,24. Per controllare otticamente Kir2.1 nelle sue cellule native, Kang et al. Geneticamente incorporato una foto-sensibile SAU in Kir2.1 espresso in cellule di mammifero, i neuroni e cervello embrionali di topo 21. Un breve impulso di luce è in grado di convertire il SAU in un amminoacido naturale Cys, attivando così la proteina Kir2.1 bersaglio. Quando questa foto-inducibile canale proteina interiormente rettificazione potassio (Pirk) è stato espresso in ratto neuroni ippocampali primari, è soppressa neuronale in risposta all'attivazione luce. Inoltre, il canale Pirk stato espresso nella neocorteccia embrionali di topo, e la corrente di luce-attivato Pirk nei neuroni corticali è stato misurato. Il successo dell'attuazione della tecnologia SAU in vivo nel cervello dei mammiferi si apre la porta per controllare otticamente proteine neuronalinel loro ambiente nativo, che permetterà la dissezione ottica di processi neuronali e meccanismi a livello molecolare.
In questo protocollo si descrivono le procedure per incorporazione genetica di Uaas in neuroni primari nella cultura e nel cervello embrionale del mouse in vivo. Il fotosensibile SAU Cmn e Kir2.1 sono utilizzati per illustrare il processo. I metodi per valutare il successo incorporazione SAU e controllo ottico di attività della proteina neuronale sono forniti. Questo protocollo fornisce una guida chiara per geneticamente codifica Uaas nei neuroni e in vivo, e alla regolamentazione otticamente la funzione delle proteine neuronali attraverso una SAU fotosensibile. Ci aspettiamo che questo protocollo per facilitare l'adozione della tecnologia in vivo SAU per le neuroscienze e studi biologici optogenetic.
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Protocol
Tutte le procedure in corso di studio sono state eseguite utilizzando Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC) ha approvato i protocolli per la manipolazione degli animali presso il Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA.
1. SAU incorporazione in Kir2.1 ed espressione della risultante Pirk nella cultura primarie neuronali
- DNA costruzione
- Selezionare un sito di destinazione di Kir2.1 per SAU incorporazione. Exploit conoscenza preventiva e informazioni sulla struttura e la funzione di Kir2.1, in modo che il sito scelto con il fotosensibile SAU incorporato consente la modulazione ottica della funzione Kir2.1 21.
- Costruire un gene Kir2.1 codifica del DNA ricombinante con il sito scelto mutato al TAG ambra codone di stop. Utilizzare le tecniche di clonazione standard di 25 per clonare il DNA Kir2.1-TAG in un plasmide di espressione di mammifero.
- geni / sintetasi Clone tRNA che sono specifici per la SAU e incorporano la SAU in risposta ail codone di stop TAG in un'altra espressione di mammifero plasmide 21.
Nota: Per ottimale incorporazione SAU, diversi promotori e combinazioni di cassette geniche (per tRNA, sintetasi, e Kir2.1) possono essere testati in diversi plasmidi. - Ottenere DNA plasmide di alta qualità utilizzando miniprep o maxiprep kit commerciali secondo il protocollo del produttore. Intorno 1.9 del rapporto 260/280 è ottimale per il DNA purificato. Quando necessario, eseguire una elettroforesi su gel di agarosio per verificare la purezza del DNA preparata 25. DNA plasmide supercoiled con elevata purezza sono i migliori per la trasfezione neuronale.
- Cultura Rat neuroni dell'ippocampo primaria
- coprioggetto posto vetro (cerchi, 12 mm di diametro) in piastre da 24 pozzetti, uno coprioggetto su ogni bene, e cappotto ogni pozzetto con 250 microlitri di 0,5 mg / ml di poli-D-lisina (in 100 mM tampone borato: 1,24 g borico acidi e 1,90 g di tetraborato di sodio in 400 ml di acqua distillata deionizzata H 2 o o DDH 2
- Il giorno della dissezione, raccogliere i cervelli neonatali da cuccioli di ratto post-natale (1-4 al giorno postnatale) dopo di loro anestetizzare con isoflurano, e decapitare. Anestetizzare cuccioli in una camera contenente anestesia isoflurano (2-4%). Attendere fino a perdere coscienza e non riescono a rispondere a stimoli tattili e pizzicare delle zampe.
- Utilizzando la tecnica standard 26, sezionare ippocampi dal cervello a caldo (~ 37 ° C) salina (10 mM HEPES e 20 mM D-glucosio aggiunto in soluzione salina bilanciata di Hank), e raccogliere ippocampi in un tubo conico con 4,5 ml di soluzione salina calda .
- Aggiungere 500 ml di 2,5% tripsina al dell'ippocampo (0,25% tripsina concentrazione finale) e incubare per 10 min in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Sciacquare il tessuto con soluzione salina (3 x 10 ml) e triturare.
- Recuperare i neuroni dissociati in 1 ml wmezzi di crescita braccio contenenti Minimum Essential Medium (MEM) integrata con 5% siero fetale bovino (FBS), 21,2 mm D-glucosio, 2 mM L-glutammina, 2% B-27, e 0,1% di siero Extender.
Nota: aggiungere L-glutamina e B-27 del giorno di dissezione per preparare mezzi di crescita fresco. - Contare le neuroni con un emocitometro e li piastra sul coprioggetto in piastre da 24 pozzetti a 1,0-1,5 x 10 5 cellule / pozzetto densità con terreni di crescita 500 microlitri dopo filtrata attraverso una rete di nylon 40 micron.
- Incubare la coltura neuronale a 35 ° C in 5% CO 2: 95% incubatrice umidificata aria per 2-3 settimane. Per i migliori risultati, evitare di disturbare la cultura più possibile durante l'incubazione.
- Fosfato di calcio (Ca-P) Trasfezione di primaria Cultura neuronale
- Fare soluzioni madre e conservare a 4 ° C: 0.5 M BES (N, N-bis [2-idrossi-etil] -2-aminoethanesulfonic acido) Buffer (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2.8 M NaCl (10x); DDH sterili 2 O; sterile 1 N NaOH.
- Il giorno della transfezione, rendere fresca 2,5 M soluzione di CaCl 2 in DDH 2 O e filtro sterile con filtro 0,22 micron. Fare tampone 2x fresco BES-Buffered Saline (BBS) contenente 50 BES mm, 1,5 mm Na 2 HPO 4, e 280 mm NaCl a pH 7,00 (aggiustare il pH con NaOH) e filtro sterile con 0,22 micron filtro.
Nota: Calcolare la quantità di soluzione di CaCl 2 e tampone BBS a seconda del numero di coprioggetto da transfettate. Anche guardare 1.3.4. - Sostituire i mezzi di crescita culturale con 500 terreni di crescita trasfezione ml fresca pre-riscaldato. (Mezzi di trasfezione possono essere fatte con MEM inclusa 21,2 mM D-glucosio).
Nota: non gettare il vecchio supporto. - Calcolare la quantità di DDH 2 O e prepararsi ad aggiungere al fine di rendere la soluzione di trasfezione (33 microlitri per ogni coprioggetto) contenente 1,65 ml CaCl 2, 0.7 mg DNA, e 16.5 &# 181; l 2x BBS.
- Preparare la soluzione di trasfezione immediatamente prima di aggiungerlo alla cultura. Per preparare, prima combinare CaCl 2 e DDH 2 O mentre lentamente agitando il tubo. Continua agitazione e lentamente aggiungere DNA nella soluzione. Infine, aggiungere tampone 2x BBS goccia a goccia agitando.
- Aggiungere immediatamente 30 ml di soluzione di trasfezione ad ogni vetrino della cultura neuronale.
- Oscillare piatto cultura un paio di volte per miscelare la soluzione e incubare a 35 ° C in 5% CO 2: 95% incubatrice umidificata aria per 45 min-1 hr. Dopo neuroni vengono incubati con la soluzione di trasfezione, molto fini precipitati Ca-P formerebbero uno strato copre neuroni.
- Sostituire il supporto trasfezione con 500 microlitri pre-riscaldato tampone di lavaggio (135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na 2 HPO 4, 10 mM glucosio a pH 7.3, sterile filtrata con filtro 0,22 micron) e incubare a 356; C in CO 5% 2: 95% incubatrice umidificata dell'aria per 15-20 min. precipitati Ca-P sparirebbero dopo la fase di lavaggio.
- Sostituire il tampone di lavaggio con 500 microlitri terreni di coltura fresco. Anche in questo caso, sostituire i mezzi di crescita con il supporto originale salvato.
- Aggiungere SAU Cmn (premiscelato in 50 microlitri di media crescita caldo) alla cultura per raggiungere 1 mM concentrazione finale.
- Incubare la coltura transfettate a 35 ° C in 5% CO 2: 95% incubatrice umidificata aria per 12-48 ore prima del test.
- Tutta la registrazione delle cellule con l'attivazione della luce
- Preparare le soluzioni extra / intracellulari. La soluzione intracellulare contiene 135 mM di potassio gluconato, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2,56 mM K 2 ATP e 0,3 mM Li 2 GTP a pH 7,4. La soluzione di registrazione extracellulare contiene 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio, e 10 mM HEPES a pH 7,4.
- Installare un diodo a emissione luminosa (LED) con emissione di 385 nm dal microscopio alla piattaforma per fornire luce al punto focale da 1 cm a 45 °. Controllare l'alimentazione dei LED con un misuratore di potenza luminosa.
- Tirare le pipette di patch da elettrodi di vetro con un estrattore micropipetta commerciale di avere 3-6 MW resistenza pipetta. Seguire le istruzioni del produttore per impostare l'estrattore micropipetta.
- Per testare la resistenza pipetta, prima riempire la pipetta con la soluzione intracellulare e posizionarlo sul supporto per elettrodi. Immergere la pipetta in un piatto di coltura 35 millimetri riempito con la soluzione extracellulare, collocato sul microscopio platform. Immergere un elettrodo di terra nel piatto per completare un circuito.
- Accendere l'amplificatore / digitalizzatore e avviare un software di acquisizione dati. Monitor resistenza pipetta con un protocollo di test a membrana.
- Estrarre un vetrino della cultura neurone dall'incubatore e lavare una volta nella soluzione extracellulare. Utilizzando grasso per vuoto, tenere premuto il vetrino nel bel mezzo di un piatto della cultura 35 millimetri riempito con la soluzione fresca extracellulare.
- Posizionare il vetrino / piatto sulla piattaforma elettrofisiologia microscopio.
- Utilizzando le tecniche di patch di fissaggio standard rattoppare un neurone con mCitrine fluorescenza 27. attività neuronale record utilizzando pinza attuale metodo (I-clamp). Innanzitutto, regolare il potenziale di riposo a circa -72 mV iniettando una piccola corrente. Poi, iniettare una corrente passo (10-200 Pa) per indurre combustione continua (5-15 Hz) dei potenziali d'azione.
- Manualmente o utilizzando il software di acquisizione dati, lampeggiare un impulso (peccatoGLE impulso di 100 msec -1 durata sec) della luce LED per il neurone durante la registrazione, e vedere se i potenziali d'azione sono interessati.
- Aggiungere 0,5 mM BaCl 2 al bagno e verificare se i potenziali d'azione sono recuperati.
2. SAU incorporazione in Kir2.1 ed espressione della risultante Pirk nel embrionali di topo cervello In Vivo
- DNA costruzione
- Progettare il DNA plasmidico similmente come nel passo 1.1. Per l'espressione in vivo, utilizzare un forte promotore come CAG (pollo beta-actina promotore con CMV enhancer).
- Purificare DNA con un maxiprep kit commerciale privo di endotossine secondo il protocollo del produttore. Eseguire estrazione con fenolo-cloroformio seguita da precipitazione in etanolo 25 per l'acquisizione del DNA di qualità estremamente elevata (condensato di 2-5 mg / mL).
- Elettroporazione in utero al embrionali di topo neocorteccia
Nota: Il techni baseque per elettroporazione in utero è stato descritto in precedenza 28.- Anestetizzare un mouse incinta cronometrato al giorno embrionale 14,5 (E14.5) con sodio pentobarbital (iniezione intraperitoneale, 50 mcg per grammo di peso corporeo) o isoflurano (inalazione, 2-4%). Monitorare profondità dell'anestesia controllando la perdita di coscienza e nessuna risposta a stimoli tattili e pizzicare delle zampe.
- Fai una piccola incisione sulla linea mediana addominale. esporre delicatamente le corna uterine con una pinza e dita.
- Iniettare circa 1 ml soluzione DNA (2-5 mg / mL di ciascun plasmide, a seconda del costrutto) nel ventricolo laterale di ciascun littermate con una pipetta di vetro inserito attraverso la parete uterina. Nella maggior parte dei casi, circa il 60-80% del totale embrioni vengono iniettati.
- Elettroporazione gli embrioni con un elettroporatore (33-35 V, 50 durata msec, 950 msec intervallo, 4-8 impulsi).
- Riportare le corna uterine alla cavità addominale delicatamente con perporcini e punta delle dita. Suturare la parete muscolare e quindi la pelle con sutura chirurgica per consentire gli embrioni di continuare lo sviluppo.
- SAU microiniezione
- Fai una piccola incisione sulla linea mediana addominale di nuovo a E16.5, ed esporre delicatamente le corna uterine con una pinza e dita.
- Iniettare circa 2-5 ml Cmn-Ala (500 mM) al lato elettroporate o entrambi i lati del ventricolo laterale con una pipetta di vetro inserito attraverso la parete uterina. Per aumentare la biodisponibilità Cmn, utilizzare il dipeptide Cmn-Ala (CMN-alanina) per fornire CMN nel vivo 21.
- Anche in questo caso, riportare le corna uterine alla cavità addominale delicatamente con una pinza e punta delle dita. Suturare la parete muscolare e quindi la pelle con sutura chirurgica per consentire gli embrioni di continuare lo sviluppo.
- Ottenere acuta del cervello Fette
- Fare 1 L liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mm MgCl 2, 2,5 mM CaCl
- Prendete 200 ml ACSF e di congelamento rapido a -80 ° C per 20-30 minuti. Bubble il resto ACSF con 5% di CO 2: 95% O 2 gas a temperatura ambiente.
- Preparare e sterilizzare gli strumenti chirurgici per raccogliere i cervelli da embrioni. Anche preparare un secchio di ghiaccio.
- Rendere ~ 100 ml 4% soluzione di agarosio a basso punto di fusione in un pallone mediante riscaldamento in un forno a microonde. Raffreddare la soluzione per circa 5 minuti prima che cominci a solidificare.
- Euthanize l'hr del mouse 12-24 dopo Cmn-Ala di iniezione di CO 2 overdose. Fare grandi incisioni nella zona addominale, e sezionare gli embrioni elettroporate / microiniettati dall'utero con le forbici sottili e pinze.
- cervelli Harvest da embrioni con le forbici sottili e pinze.
- Posizionare ogni cervello su un piatto della cultura 10 centimetri posto sul secchio di ghiaccio. Dividere due emisferi con una lama affilata, e porre ognisemisfera sul piatto con il piano sagittale mediano toccare il fondo del piatto. versare rapidamente sulla soluzione di agarosio su cervelli (circa 500 microlitri per ogni emisfero).
- Utilizzando una lama affilata, piazza tagliare l'agarosio intorno ad un cervello per fare un blocco di agarosio cervello-embedded.
- Usando tessuto adesivo, colla giù la superficie piano sagittale mediano del blocco agarosio su un supporto per vibratome. Riempire la camera vibratome con ACSF pre-raffreddata e tagliare 200 micron fettine di cervello sagittali.
- Incubare fette acuta in ACSF integrato con 3 mM Myo-inositolo, acido ascorbico 0,4 mm, e 2 mm di sodio piruvato a 33 ° C per 42 min, mentre ribolle con 5% di CO 2: 95% O 2 gas.
- Dopo 42 min, spegnere il riscaldatore e continuare ad incubare le fette a temperatura ambiente con spumeggiante. Avviare la registrazione di patch a cellula intera almeno 15 minuti dopo aver spento il riscaldamento.
- Fare 1 L liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mm MgCl 2, 2,5 mM CaCl
- Tutta la registrazione delle cellule con l'attivazione della luce
- Preparare il Intracsoluzione ellular contenente 130 mm gluconato di potassio, 4 mM MgCl 2, 5 mM HEPES, 1,1 mm EGTA, 3,4 mm Na 2 ATP, 10 mM creatina fosfato di sodio, e 0,1 mM Na 3 GTP a pH 7,3 regolato con KOH.
- Tirare le pipette di patch da elettrodi di vetro con un estrattore micropipetta commerciale di avere 3-6 MW resistenza pipetta.
- Impostare l'elettrofisiologia rig fetta di patch di bloccaggio intero-cellula e superfuse camera di registrazione con ACSF a 2 ml / min velocità di una pompa di perfusione. Regolare la temperatura della camera a circa 33 ° C.
Nota: L'impianto fetta elettrofisiologia è dotato di una camera di perfusione, un obiettivo immersione in acqua ed un regolatore di temperatura. Inoltre, il filtro GFP (eccitazione: 480/30 nm, emissione: 535/40 nm) e filtro mCherry (eccitazione: 580/20 nm di emissione: 675/130 nm) sono necessari.- Installare un LED con emissione di 385 nm dal microscopio alla piattaforma per fornire luce per il punto focale da 1 cm di distanza a a 45 °angolo. Controllare l'alimentazione dei LED con un misuratore di potenza luminosa.
- scegliere con cura una fetta cervello con una pipetta di vetro e posto nella camera di perfusione. Tenere premuto il fetta con l'arpa.
- Patch un neurone con mCherry / fluorescenza GFP dalla regione neocorticale 27. attività Pirk record utilizzando il metodo morsetto di tensione (V-clamp). In primo luogo, tenere il potenziale di membrana a -60 mV. Poi, le correnti registrano a potenziali fisse negative di membrana (-100 mV) o rampe di tensione (-100 mV a +40 mV). In particolare, il monitoraggio Kir2.1 specifiche correnti verso l'interno a -100 mV.
- Manualmente o utilizzando il software di acquisizione dati, lampeggiare un impulso (un singolo impulso di 100 msec -1 durata sec) della luce LED per il neurone durante la registrazione, e vedere se si attivano le proteine Pirk. Una volta Pirk è attivato, le correnti verso l'interno a -100 mV aumenterebbero in modo significativo.
- Aggiungere 0,5 mM BaCl 2 al bagno e verificare se Pirk è inattivato di nuovo.
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Representative Results
Per geneticamente incorporare un SAU in una proteina nei neuroni, il primo passo importante è quello di progettare gene appropriata costruisce per fornire ed esprimere i geni in modo efficiente in neuroni. Ci sono tre componenti genetiche per SAU incorporazione: (1) il gene bersaglio con il TAG ambra codone di stop introdotta nel sito prescelto per SAU incorporazione (2) un tRNA ortogonale riconoscere il mutato codone di stop TAG, e (3) un aminoacil ortogonali -tRNA sintetasi per caricare il SAU sul ortogonali tRNA. Ogni componente deve essere guidata dal promotore appropriato. Questi tre cassette geniche possono essere incluse in un plasmide o separati in diversi plasmidi. Per esprimere Pirk nei neuroni, la foto-reattiva SAU Cmn è incorporato Kir2.1 utilizzando i ortogonali tRNA Leu CUA / CmnRS (CMN-tRNA sintetasi) coppia evoluto per essere specifico per la CMN 21,29. Residuo Cys169 del gene Kir2.1 è mutato fino alla fermata TAG ambra codone (Kir2.1-TAG), e la proteina fluorescente mCitrine è fuso al C-terminale di Kir2.1 per visualizzare espressione Pirk in colture neuronali (Figura 1).
Ottenere la cultura neuronale di buona qualità è un prerequisito per esperimenti Pirk successo. giorno postnatale 1-4 Sprague Dawley cuccioli di ratto sono generalmente utilizzati per la preparazione cultura neuronale, ancora embrioni di ratto vengono anche utilizzati di frequente. Quando placcato su vetrini in piastre da 24 pozzetti a 1,0-1,5 x 10 5 cellule / pozzetto densità, si dovrebbe vedere neuroni sani ben separati con non troppo microglia o altri detriti (Figura 2A). Neuroni sani hanno ampi processi, e corpi cellulari (soma) sono grassoccio (Figura 2B). Tipicamente struttura suborganelle visibile di solito è un segno di cultura malsana. Cultura neuronale può essere mantenuta per 2-3 settimane a 35 ° C in 5% CO 2: 95% di aria umidificata incubatore.
Cfosfato alcium (Ca-P) trasfezione è un metodo di trasfezione molto delicato adatto per la cultura neuronale sensibili. Tuttavia, esso richiede estrema precisione e cautela per ottenere un'elevata efficienza di transfezione in neuroni. Le soluzioni madre devono essere conservati a 4 ° C e mescolati per rendere 2x tampone BBS il giorno della trasfezione. la regolazione del pH precisa è la chiave per ottenere risultati di successo riproducibile. La soluzione M CaCl 2 2.5 Occorre anche fresco il giorno della trasfezione. Tutti i buffer devono essere filtrati. Inoltre, plasmidi fresche con elevata purezza e qualità migliorare i risultati. Per ottenere i migliori risultati, si possono ottenere mini-prepped DNA freschi da non invaso la cultura Escherichia coli (~ 12 ore a 37 ° C in incubatore agitazione). Dopo che tutti i buffer sono pronte, sulle soluzioni nella cappa coltura tissutale e preparare per la trasfezione. Utilizzando un vortice a bassa velocità, agitare la soluzione trasfezione durante la miscelazione. Immediatamente aggiungere la soluzione mista per il cu neuronalelture, e portare il piatto cultura di nuovo per l'incubatore. Arrestare il trasfezione dopo 45 min-1 ora, e aggiungere i mezzi di crescita originale alla cultura per l'incubazione continuo. I neuroni transfettate possono essere visualizzati da 6 ore dopo la transfezione è terminata (figura 3). In presenza della CMN nei mezzi di coltura, Pirk è espresso e neuroni Pirk esprimenti sono verde fluorescente dovuta alla proteina mCitrine fusa al C-terminale di Pirk (Figura 3D). Neuroni Pirk-esprimenti hanno normale fisiologia basale e sono in grado di sparare potenziali di azione in risposta a correnti iniettate (Figura 4). Tuttavia, questa serie di potenziali di azione viene soppressa immediatamente con un breve impulso di luce brillava alla cella (Figura 4A). Quando 0,5 mM BaCl 2, un inibitore specifico Kir2.1, viene aggiunto al bagno, scarica neuronale viene poi ripreso, indicando che la soppressione precedente è dovuta all'attivazione del Kir2.1 dal light (Figura 4B). Neuroni di controllo untransfected non rispondono alla luce o Ba 2+ (Figura 4C, D).
Per esprimere Pirk in vivo, plasmidi di DNA altamente puri e concentrati (2-5 mg / mL) devono essere preparati. Plasmidi specifici utilizzati in questi esperimenti sono mostrati nella Figura 5A. Oltre al ortogonali pair tRNA Leu CUA / CmnRS e il gene Kir2.1-TAG destinazione, un gene codificante la proteina fluorescente verde con una mutazione TAG (GFP-TAG) è anche co-elettroporate come reporter fluorescente. Il rilevamento di fluorescenza GFP indicherebbe la consegna di successo di tutti e tre i plasmidi, dal momento che la soppressione TAG in GFP richiederebbe sia il tRNA Leu CUA e le CmnRS; CMN incorporazione in GFP-TAG suggerirebbe CMN incorporazione in Kir2.1-Tagas bene, perché entrambi i geni sono presenti nella stessa cella. I tre costrutti genici sono tutti InjeCTED nel ventricolo laterale di embrioni di topo sulla E14.5 (Figura 5B, pannello di sinistra). Dopo l'elettroporazione, restituire gli embrioni alla cavità addominale per consentire gli embrioni per continuare lo sviluppo. Due giorni dopo, iniettare circa 2-5 ml Cmn-Ala (500 mM) al lato elettroporate o entrambi i lati del ventricolo laterale, in modo simile come iniezione DNA (Figura 5B, pannello centrale). Anche in questo caso, tornare gli embrioni alla cavità addominale per lo sviluppo continuo. Gli embrioni possono essere raccolte su E17.5 per l'imaging e analisi elettrofisiologiche. Come previsto, solo con iniezione Cmn-Ala, cellule fluorescenti verdi sono osservati nella neocorteccia del mouse. Le cellule con fluorescenza sia rosso e verde avrebbero dovuto Cmn incorporati in Kir2.1-TAG per rendere i canali Pirk (Figura 6a). registrazione whole-cell dalla fetta neocorteccia embrionali avviene in modo simile come è fatto su colture neuronali. I neuroni fluorescenti verdi e rossi non hanno corrente verso l'interno a NEesclusi a livello di potenziale presa a terra, ma un breve impulso di luce attiva rapidamente la corrente verso l'interno (Figura 6B). La corrente viene completamente bloccata aggiungendo Ba 2+, confermando che è generata da Pirk.
Figura 1: Pirk set plasmide di espressione per neurone cultura Schema che mostra disegno plasmide esemplare per l'espressione Pirk nella cultura neuronale.. Top plasmide codifica gene Kir2.1 (grigio) con una singola mutazione aminoacido nel sito C169 sotto citomegalovirus (CMV) promotore. C169 è mutato al codone di stop TAG ambra, dove sarebbe essere incorporato SAU Cmn. gene Kir2.1 è seguito da mCitrine gene (verde). mCitrine è fusa al C-terminale del gene Kir2.1 per visualizzare le cellule esprimenti Pirk. plasmide inferiore codifica CmnRS (rosa), la sintetasi specifica Cmn, spinti dalla chinasi-1 (MPGK) promotore del mouse fosfoglicerato. tRNA
Figura 2: Ratto dell'ippocampo cultura neuronale primario immagini esemplari che mostrano ratto sano colture neuronali dell'ippocampo.. (A) Una immagine DIC di colture neuronali di 10 giorni in vitro (DIV). Neuroni maturi come si diramano dendriti e assoni. cellule microglia (piccole e rotonde cellule senza processi) coesistono, ma non sopraffare la cultura. (B) Un'immagine DIC ingrandita di neuroni in coltura sani. Un neurone sano espone corpo cellulare grassoccio (soma) e pronunciato dendriti / assoni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Espressione Pirk in neuroni primari in coltura DIC e immagini di fluorescenza di neuroni dell'ippocampo di ratto coltivate in vitro e transfettate con costrutti genici raffigurati nella figura 1 per l'espressione Pirk. Se Cmn non viene aggiunto nella coltura dopo trasfezione (A e B), nessuna fluorescenza verde viene rilevata dai neuroni. In presenza di Cmn (1 mm) in terreni di crescita, i neuroni trasfettati sono in grado di esprimere full-length proteine Pirk-mCitrine, mostrando così fluorescenza verde (C e D). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4:. Attivazione luce di Pirk sopprime sparare dai neuroni dell'ippocampo di ratto (a) un impulso di luce sopprime l'attività del neurone dell'ippocampo esprime Pirk. tracce di tensione rappresentativi sono registrati continuamente in current-clamp. Azione potenziale cottura è evocata da 20 pA iniezione di corrente (I-step). L'esposizione alla luce (385 nm, 40 mW / cm 2, 1 sec, indicata con la freccia) rapidamente e completamente sopprime neuronale. La cottura viene ripristinato con extracellulare 500 mm BaCl 2, che inibisce selettivamente i canali Kir2.1. (B) ultravioletta (UV) illuminazione (385 nm, 40 mW / cm 2, 6 secondi; indicata con scatola gialla) non altera l'eccitabilità del controllo, i neuroni untransfected. Azione potenziale cottura è evocata da 50 pA iniezione di corrente (I-step). (C e D) Né illuminazione UV né BaCl 2 (500 mM) colpisce eccitabilità dei neuroni di controllo. Azione potenteial è evocata da 50 pA iniezione di corrente (I-step).
Figura 5: Procedure per l'espressione Pirk nella neocorteccia del mouse in vivo. Set (A) Pirk plasmide di espressione. Top plasmide: il plasmide per CmnRS guidato dal promotore CAG e mCherry tramite il sito di entrata ribosoma (IRES). mCherry fluorescenza potrebbe verificare espressione di successo di CmnRS. Plasmide Medio: il plasmide per il gene Kir2.1 accoppiato con tre copie di tRNA Leu CUA, il tRNA ortogonali per la CMN incorporazione 21. Plasmide basso: il plasmide per GFP_Y182 TAG. Il gene per la GFP è stato progettato con un codone di stop ambra sul sito Tyr182 permissiva (GFP_Y182 TAG) di visualizzare l'incorporazione di successo di CMN a TAG siti 21. (B) sho del fumettoala una procedura sperimentale per l'espressione Pirk in vivo. Costrutti genici per l'espressione Pirk sono iniettati nella neocorteccia del mouse (E14.5) e elettroporate in utero (pannello di sinistra). Due giorni dopo, Cmn-Ala viene iniettato al ventricolo nel lato elettroporate o entrambi i lati di emisferi cerebrali (pannello centrale). l'imaging fetta e test elettrofisiologici possono essere eseguite su E17.5-E18.5 (pannello di destra).
Figura 6: espressione Pirk nella neocorteccia del mouse e l'attivazione della luce. Immagini (A) fluorescenza embrionali di topo neuroni corticali che mostrano l'incorporazione di Cmn in GFP e proteine Kir2.1 in vivo. I tre costrutti genici nella figura 5a sono elettroporate in utero. mCherry fluorescenza dimostra espressione di successo del synthe specifica Cmntase gene, CmnRS. GFP fluorescenza viene rilevata solo con iniezione Cmn-Ala (in basso), indicando Cmn incorporazione in GFP TAG e probabilmente incorporazione CMN nel TAG Kir2.1. Così, fluorescenza verde e rosso indica espressione di successo di tutti e tre i plasmidi e Cmn incorporazione. (B) Terreno IV di correnti registrati da topi neuroni corticali che mostrano attivazione luce-dipendente di Pirk. Due giorni dopo costrutti genici nella figura 5a sono stati elettroporate, Cmn-Ala è stato iniettato in utero; 12-48 ore dopo l'iniezione Cmn-Ala, fette acuta neocorticale sono stati preparati dagli embrioni. Pirk-esprimendo neuroni in fette, rilevati da entrambe fluorescenza rossa e verde, vengono registrati prima (nero) e dopo (blu) esposizione alla luce (385 nm, 8 mW / cm 2, 10 sec per l'esposizione saturo). BaCl 2 (500 mm) viene aggiunta per verificare le correnti specifiche Pirk dopo fotoattivazione (arancione).
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Discussion
Per raggiungere efficace foto-modulazione, l'importante primo passo è quello di decidere dove incorporare il fotosensibile SAU nella proteina bersaglio. informazioni strutturali e funzionali della proteina bersaglio è molto utile per guidare la selezione dei siti candidati. Allo stesso tempo, allo scopo di regolazione della luce sarebbe determinare quale sito è più adatto. Dopo aver scelto i siti candidati, si consiglia di testare i siti in linee cellulari di mammiferi come il rene embrionale umano (HEK) celle per facilitare la cultura e la manipolazione, prima di procedere ai neuroni primari e in vivo. Per identificare un sito per fotoattivazione Kir2.1, più siti lungo il poro del Kir2.1 sono stati inizialmente testati in cellule HEK. C169 di Kir2.1 è stato trovato ottimale, perché la dimensione dei pori Kir2.1 cui risiede C169 è abbastanza grande per ospitare catene laterali CMN, ma abbastanza piccolo per catene laterali CMN per bloccare il passaggio ionico. Quando Cmn è stata costituita a C169 in Kir2.1 espresso in cellule HEK, tegli risultante mutante Kir2.1 era inattiva ma è diventato attivo su un breve pule di luce, confermando il successo dello sviluppo Pirk 21.
Efficiente espressione del ortogonali tRNA sintetasi e è fondamentale per ottenere un'alta efficienza di incorporazione SAU in cellule e in vivo. Il gene sintetasi ortogonale è espressa in modo efficiente utilizzando polimerasi II promotore e segnali di poli-A spesso usato in cellule di mammifero e neuroni. Per l'espressione del ortogonali tRNA, uno speciale tipo 3 polimerasi III promotore, come il promotore H1 usato qui, insieme con una sequenza 3'-flanking sono necessari come descritto in precedenza 18,20. Per gli studi in vivo, abbiamo scoperto che tre copie della cassetta di espressione tRNA aumentato Cmn efficienza incorporazione rispetto a una copia (Figura 5A). In un altro studio in cellule di mammifero, aumentando il numero di tRNA cassetta di espressione aumentata anche SAU efficienza di incorporazione 30. therrima, suggeriamo di ottimizzare il numero di tRNA cassette di espressione per le diverse Uaas, cellule e proteine bersaglio quando SAU efficienza incorporazione deve essere migliorato. La biodisponibilità di Uaas nelle cellule e in vivo è un altro fattore critico per SAU incorporazione. Studi precedenti hanno dimostrato che l'esterificazione di Uaas aumenta il loro assorbimento nelle cellule di mammifero 31, e che la preparazione di Uaas in forma dipeptide aumenta SAU assorbimento nelle cellule in Caenorhabditis elegans 32. Abbiamo scoperto che l'alimentazione direttamente CMN a terreni di coltura neuronale è sufficiente per la CMN incorporazione in Kir2.1 espresso in neuroni primari in coltura, ma inadeguata per l'incorporazione nel cervello di topo in vivo 21. Pertanto, il dipeptide Cmn-Ala è stato sintetizzato e iniettato nel cervello di topo. Oligopeptide transporter PEPT2 è altamente espresso nel cervello di roditori 33, che possono facilitare il trasporto del dipeptide in neuroni. Il dipe interiorizzatoptide sarebbe idrolizzato dalle peptidasi cellulari per cedere la SAU Cmn per l'incorporazione. Infatti, con questa ottimizzazione abbiamo raggiunto efficiente incorporazione Cmn in proteine neuronali in più regioni del cervello embrionali di topo, tra neocorteccia, talamo e ipotalamo 21.
espressione Pirk successo in neuroni dipende fortemente sulla preparazione della cultura neuronale sano. Ogni passo nel protocollo deve essere eseguita in modo preciso e accurato. Dopo la preparazione culturale, è meglio mantenere la cultura nell'incubatrice senza disturbo. Aprendo e chiudendo la porta incubatore, e lo spostamento del piatto cultura in e fuori dell'incubatore, può aggiungere fino a minare la qualità della cultura. Abbassare la temperatura incubatore (35 ° C invece di 37 ° C) aiuta a ridurre eccitotossicità. Su una nota simile, Ca-P trasfezione dovrebbe essere fatto con cautela. Preparazione di tampone 2x BBS è un passaggio fondamentale. E 'una buona idea a CaliBrate il pH ottimale per 2x BBS cuscinetto tra pH 6,90-7,15, dal momento che nuovi costrutti di DNA o preparazioni potrebbero cambiare le condizioni di trasfezione. Il pH del buffer potrebbe essere regolata con precisione alle 0,01 cifre se aiuta a raggiungere risultati coerenti. Prima di trasfezione, i mezzi di crescita di colture neuronali è sostituita con una nuova. E 'fondamentale per salvare i mezzi di crescita originale, e aggiungere di nuovo alla cultura dopo la trasfezione per ripristinare la condizione originale. Mantenere la cultura neurone nei mezzi freschi dopo la transfezione interferirebbe con i neuroni da recuperare, dal momento che manca molecole chiave per la proliferazione cellulare, come fattori di crescita rilasciati dai neuroni.
Per l'attivazione di luce Pirk nelle cellule in coltura e fette di tessuto, fonte di luce adeguata e metodo di consegna devono essere determinati. CMN assorbe le luci onda UV lunghe e medie (280-400 nm). Tuttavia, esteso esposizione alla luce UV, specialmente corta lunghezza d'onda di luce UV, sarebbe dannosa per le cellule. Alla same il tempo, la luce lontano rossa potrebbe riscaldare il campione perturbanti le cellule. Pertanto, un LED con una emissione di singolo-lunghezza d'onda è migliore per l'attivazione Pirk. Per la CMN fotolisi, un LED con emissione di 385 nm (~ 40 mW; Prizmatix) è stato selezionato. Il LED viene installata esternamente vicino al microscopio, e una fibra ottica vengono usati per fornire luce esattamente al neurone a fuoco. Per l'acquisizione di dati riproducibili, la fibra ottica è impostato 1 cm ad un angolo dal neurone a fuoco 45 °. Potenza luce il campione è stato misurato 40 mW / cm 2. Si consiglia inoltre di controllare periodicamente le prestazioni a LED utilizzando un misuratore di potenza ottica.
Abbiamo dimostrato che in utero elettroporazione è una tecnica efficace per integrare geneticamente Uaas in vivo. In utero elettroporazione di DNA plasmide nel mouse neocorteccia embrionale viene eseguita come descritto in precedenza 34, con piccole modifiche. Per esprimere proteine Pirk a neonataL cervelli di topo, due procedure chirurgiche sono necessari (Figura 5B). Il primo passo è quello di iniettare costrutti genici per l'espressione Pirk seguita da elettroporazione. Due giorni dopo, la seconda iniezione cervello è effettuata per fornire Cmn-Ala. Sarebbe necessario pratica per eseguire interventi chirurgici proficuamente senza stressare gli animali troppo. Al termine di ogni intervento chirurgico, gli animali devono essere curati e controllati su base regolare per tutta la ripresa. disponibilità sufficienti e tempestive della CMN nel cervello è essenziale per una corretta espressione Pirk. 2-5 ml di Cmn-Ala (500 mm) è in genere iniettato ad un cervello embrionale. Talvolta, è utile per iniettare Cmn-Ala nel ventricolo sia sul elettroporate e nell'emisfero opposto, poiché Cmn-Ala dal lato opposto potrebbe diffondere al lato elettroporate per esteso fornitura Cmn. Considerando utilità generale di elettroporazione in utero, questa tecnica può essere applicato non solo ai neuroni corticali ma anche ai neuroniin altre regioni cerebrali come striato, diencefalo, e nel cervelletto, quando il sito / iniezione elettroporazione viene regolata per ogni regione. cervelli embrionali / neonatali sono molto più morbida di cervello adulto, quindi sarebbe difficile ottenere fette acuta per gli esperimenti di elettrofisiologia. incorporamento Agarosio aiuta a stabilizzare la struttura del cervello embrionale per vibratome taglio. Anche se a basso punto di fusione agarosio riduce al minimo shock termico ai tessuti cerebrali, la cautela è necessaria quando si versa fuso agarosio su cervelli freddi. L'effetto di shock termico al tessuto da incasso agarosio era impercettibile durante l'intera registrazione cella.
Geneticamente codifica fotosensibile Uaas in neuroni in coltura e in vivo, esemplificato da Pirk qui, offrirà una tecnica optogenetic per controllare varie attività proteine neuronali con la luce nel loro ambiente nativo. Il protocollo attuale presenta una procedura passo-passo per eseguire espressione Pirk e attivazione esperimenti in cultura neuronale in vitro e nel cervello di roditori in vivo, che rappresentano il primo sviluppo di successo del sistema di SAU per l'uso nel cervello dei mammiferi. Ha potenziale di beneficiare di ricerca di molte proteine naturali, come pure il loro coinvolgimento in malattie. Ad esempio, α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic acido (AMPA) recettori e recettori N-metil-D-aspartato (NMDA) condividono strutture transmembrana simili con canali Kir2.1. Sarebbe pertanto possibile applicare la metodologia Pirk a questi canali ionici ligando-dipendenti. Inoltre, la tecnica Pirk potrebbe anche essere utilizzato per affrontare la fisiopatologia delle malattie genetiche Kir2.1 correlate, come la sindrome di Andersen e la sindrome cardiaca breve QT 35,36. Oltre a "block and release" Cys via CMN più aminoacidi come tirosina, serina, lisina, glutammato, aspartato e glicina sono stati gabbia con differenti gruppi photoreleasable 37. Così, le strategie simili possono essere usod a foto-regolare questi aminoacidi nei neuroni in vitro e in vivo. Inoltre, il controllo ottico reversibile può essere realizzato con azobenzene contenenti Uaas, e tali Uaas sono state ora geneticamente codificato in E. coli e cellule di mammifero 38,39.
In sintesi, questo protocollo presenta un metodo generale per controllare l'attività delle proteine neuronali nelle impostazioni native di luce. In confronto ad altri metodi optogenetic coinvolgono proteine o domini sensibili opsin-famiglia e altra luce, questo metodo utilizza geneticamente codificato sensibile alla luce Uaas e cambia un solo residuo. Pertanto, dovrebbe avere la minima interferenza alla funzione, il traffico e localizzazione della proteina bersaglio in esame. Alta site-selettività può essere ottenuta anche con questi Uaas luce sensibile geneticamente codificati per fornire una maggiore flessibilità e specificità per ricerca molecolare dettagliata. Questo protocollo fornisce anche la prima comprehensive, facile da seguire la procedura come integrare con successo Uaas in proteine nei neuroni in vitro e in vivo. Ottiche di controllo delle proteine generali tramite geneticamente codificato Uaas nei neuroni in vitro e in vivo ha un grande potenziale di beneficiare della scienza sia di base e traslazionale, e questo protocollo potrebbe contribuire a promuovere la sua applicazione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 | |
| Dissecting Knife - Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 | |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 | |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 | |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | ||
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
References
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