Abstract
Coxiella burnetii, o agente causador da febre Q, é uma bactéria intracelular obrigatório. Ensaios de diagnóstico baseado em PCR, têm sido desenvolvidos para a detecção de C. ADN burnetii em culturas de células e amostras clínicas. PCR exige equipamento especializado e treinamento extensivo usuário final e, portanto, não é adequado para o trabalho de rotina, especialmente em uma área de recursos limitados. Nós desenvolvemos um ensaio de amplificação isotérmica mediada por ciclo (LAMP) para detectar a presença de C. burnetii em amostras de doentes. Este método é realizado em uma única temperatura de cerca de 60 ° C em um banho-maria ou bloco de aquecimento. A sensibilidade deste ensaio de LAMP é muito semelhante a PCR com um limite de detecção de cerca de 25 cópias por reacção. Este relatório descreve a preparação de reacção, utilizando reagentes liofilizados e visualização dos resultados utilizando azul hydroxynaphthol (HNB) ou uma lâmpada de UV com corante fluorescente intercalante na reacção. Os reagentes LAMP foram lyophilized e armazenado à temperatura ambiente (TA) durante um mês sem perda de sensibilidade de detecção. Este ensaio LAMP é particularmente robusto, porque a preparação da mistura de reacção não envolve etapas complexas. Este método é ideal para uso em ambientes de recursos limitados onde a febre Q é endêmica.
Introduction
A pequena bactéria gram-negativa Coxiella burnetii é o agente causador da febre Q, que é uma zoonose em todo o mundo. Devido à distribuição mundial da febre Q ea alta infectividade do C. burnetii, pessoal militar e civil dos Estados Unidos desdobradas no exterior estão em risco de serem infectados nas áreas endêmicas.
febre Q manifesta de duas formas: infecções agudas e crónicas. Febre Q aguda apresenta-se com sintomas semelhantes aos da gripe, hepatite ou pneumonia, e geralmente é uma doença autolimitada, com uma taxa de mortalidade baixa. Febre Q crónica, embora menos prevalente, muitas vezes resulta em endocardite, que tem uma taxa de mortalidade muito maior se não tratada 1,2. Portanto, o diagnóstico precoce para orientar um tratamento adequado é fundamental para o atendimento ao paciente. Reacção em cadeia da polimerase (PCR) e PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ensaios foram desenvolvidos para a detecção de C. DNA burnetii em culturas de células e amostras clínicas 3-5 </ Sup>. Ambos PCR e qPCR são caros e muitas vezes não é facilmente disponível em áreas com recursos limitados para o trabalho de rotina.
Originalmente descrito por Notomi 6, amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) oferece um método de amplificação de DNA alternativa. LAMP utiliza ADN-polimerase Bst ADN para a síntese de deslocamento de cadeia, juntamente com conjuntos de iniciadores especialmente concebidos para que reconhecem, pelo menos, seis regiões independentes do gene alvo. A vantagem mais significativa de LAMP é que a amplificação ocorre sob condições isotérmicas. Por conseguinte, apenas um banho de água, ou um bloco de aquecimento da incubadora é necessária. Este método tem sido utilizado para detectar vários agentes patogénicos rickettsiais 7-9. A visualização dos produtos de ADN amplificados por electroforese em gel é o método mais preciso que pode diferenciar a partir de verdadeiros positivos falsos positivos devido à amplificação não específica. No entanto, os procedimentos envolvidos na electroforese em gel não são práticos para ar de recursos limitadoseas. Vários métodos alternativos foram desenvolvidos para detectar os produtos de reacção. Estes alternativa, tal como turbidez derivado de pirofosfato de magnésio formação 10 ou utilizando um corante fluorescente intercalante a ser visualizado sob luz UV 11,12 são mais favoráveis do que a execução de um gel. Os reagentes LAMP foram estáveis durante um mês quando armazenada a 25 ° C e 37 ° C, que são temperatura ambiente em países tropicais e sub-tropicais onde a febre Q é endémica 13.
Um ensaio de LAMP foi desenvolvido no nosso laboratório para detectar a presença de C. burnetii em amostras de plasma 14. Descrevemos aqui um protocolo simples para a preparação da mistura de reacção a partir de LAMP os reagentes liofilizados. Os reagentes liofilizados são estáveis durante um mês quando armazenada à temperatura ambiente. Quando combinado com um método fácil visualização, este é um método ideal para utilizar para a detecção de C. burnetii em um ambiente de recursos limitados.
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Protocol
1. Preparar diluições de DNA plasmídico como padrão para a Reacção LAMP
- Utilizar um espectrofotómetro para determinar a densidade óptica (OD) a 260 nm para determinar o plasmídeo (contendo IS1111a gene alvo de C. burnetii RSA 493) a concentração de ADN. Um OD 260 de 1 é igual a 50 ug / ul de ADN.
- Converter a quantidade de DNA de plasmídeo no número de cópias. Uma vez que o tamanho do plasmídeo é 6330 pb, o peso molecular deste plasmídeo é de 4,1 x 10 6 g (6,330 pb x 649 g / BP). A concentração do ADN do plasmídeo é 34,2 ng / mL (tal como determinado a partir do passo 1.1). 1 ul desta amostra de ADN contém 34,2 ng de ADN plasmídico, o equivalente a 5 x 10 9 cópias (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 6,02 x 10 gx 23) de ADN.
- Adicionar 10 ul de ADN de plasmídeo (5 x 10 9 cópias / mL) a 90 uL de água para uma diluição de 10 vezes para fazer uma amostra de ADN de 5 x 10 8 cópias / ul.
- Repetir o passo 1.3 para preparar amostras de ADN de 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, e 5 x 10 0 cópias / ul.
2. Prepare Template DNA a partir de amostras de Reacção LAMP
- Realizar a extracção do ADN a partir de amostras de plasma humano, utilizando um kit de ADN de mini-comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Usar um total de 200 ul de amostra para a extracção e eluir o DNA extraído num volume de 20 ul.
3. Prepare 2x Tampão LAMP Reaction
- Misturar 200 mL de 10x tampão de Pol, 320 ul de 5 M trimetilglicina, 12 ul de 1 M de MgSO4, 280 uL de mistura de dNTP (10 mM cada) e 188 ul de água para perfazer 1 ml de tampão de 2x LAMP. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos.
4. Execute lâmpada padrão Reaction
- Misture 12,5 ul de 2x LATampão PM (tal como preparado no passo 3; Tris-HCl 40 (pH 8,8), KCl 20 mM, MgSO mM 16 4, 20 mM de (NH 4) 2 SO 4, 0,2% de Triton X-100, trimetilglicina 1,6 M, 1,4 mistura de dNTP mM), 1,2 ul de mistura de iniciadores, 1 mL de polimerase de ADN Bst (8 U / ul) e 5,3 ul de água para tornar a mistura de reacção (20 ul) num tubo de PCR de 0,2 ml.
- Adicionar 5 uL de ADN (do passo 1 ou 2) para a mistura reaccional de 20 ul e misturar bem.
- Primeiro tubo e incubar a 60 ° C durante 60 min num banho-maria ou bloco de aquecimento. Esta é a temperatura de reacção óptima previamente determinada.
- Adicionar 5 uL de tampão de carga de gel de 10x para terminar a reacção.
- Carga de 5 ul dos produtos de reacção a um gel de agarose a 2% corado com intercalando mancha de ácido nucleico.
- Executar gel a 100 V durante 35 min em tampão 1 x TBE.
- Visualize os resultados por luz UV.
5. Execute Reaction LAMP com Reconstituídoreagentes
- Misturar 125 ul de Tampão 10 x Pol, 200 mL de 5 M trimetilglicina, 7,5 ul de 1 M de MgSO4, 667,5 ul de água para perfazer 1 ml de tampão de reconstituição. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos.
- Retire os tubos que contêm os reagentes liofilizados a partir do saco de folha de alumínio selado. Não utilize os tubos se o saco de folha de alumínio não está vedada ou se ele estiver danificado.
- Adicionar 20 ul de tampão de reconstituição em cada tubo para ressuspender reagentes liofilizados.
- Misture pipetando tampão cima e para baixo 5 vezes. Dê uma olhada para garantir que os reagentes liofilizados são completamente re-suspensa. O pó branco deve desaparecer no tubo.
- Adicionam-se 5 ul de molde de ADN (do passo 1 ou 2) para os reagentes reconstituídos e misturar bem.
- Primeiro tubo e incubar a 60 ° C durante 60 min num banho-maria ou bloco de aquecimento.
- Adicionar 5 uL de tampão de carga de gel de 10x para terminar a reacção.
- Carga de 5 ul de reacçãoprodutos para um gel de agarose a 2% corado com corante intercalante ácido nucleico.
- Executar gel a 100 V durante 35 min em tampão 1 x TBE.
- Visualize os resultados por luz UV.
6. Execute LAMP Reação com Reconstituição tampão contendo HNB ou fluorescente intercalando Dye
- Misturar 125 mL de 10x Pol de Amortecimento, 200 mL de 5 M trimetilglicina, 7,5 ul de 1 M de MgSO4, 7,5 ul de HNB 20 mM (ou 12,5 ul de 100x corante fluorescente intercalante) e 660 uL (ou 655 ul) de água para fazer 1 ml de tampão de reconstituição. Misture por pulso-vórtex durante 10 segundos.
- Use o tampão reconstituído preparado na seção 6 para repetir os passos 5.2 - 5.6.
- Visualize os resultados por a olho nu (reacção contendo HNB) ou uma luz UV (reacção contendo corante de intercalação fluorescente).
7. Realizar em tempo real Reaction LAMP com Scanner Tubo
- Adicionam-se 5 ul de DNA para o reconstitutreagentes ed contendo corante de intercalação fluorescente, perto do tubo e inseri-lo para o scanner tubo.
- Ajuste da temperatura de incubação a 60 ° C. Medir a fluorescência a 520 nm durante 60 min.
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Representative Results
Os reagentes liofilizados LAMP no interior do tubo de 0,2 ml contém polimerase de ADN Bst, iniciadores e os dNTP. 20 ul de tampão de reconstituição é utilizado para re-suspender os reagentes liofilizados. A Figura 1 mostra os resultados da reacção LAMP em géis de agarose com reagentes recém-preparados e reagentes liofilizados. O reagente liofilizado não reduz a sua actividade. Reacções LAMP preparados por ambos os reagentes pode detectar 25 cópias de ADN molde. A Figura 2 mostra a detecção dos produtos da reacção com HNB ou corante intercalante fluorescente presente na reacção. A adição de HNB para a reacção produz uma mudança de cor visuais de púrpura para azul com 25, 50 e 100 cópias de matriz de ADN presentes nas reacções. A inclusão de corante intercalante fluorescente na reacção mostra um forte sinal de fluorescência com luz UV, quando 25, 50, e 100 cópias de moldes de ADN estão presentes. Um scanner de tubo foi utilizadanesse estudo para a detecção em tempo real. Esta máquina pode executar 8 reacções simultaneamente. A Figura 3 mostra o uso do scanner tubo para monitorizar os sinais de fluorescência em tempo real com a presença intercalante corante fluorescente. Os sinais de fluorescência são acima da linha de base após 14, 18, 21, e 23 min com 10 6, 10 4, 10 3, e 100 cópias de DNA molde nas reacções.
Figura 1. LAMP resulta em agarose gel com reagentes recém-preparados (A) e liofilizado Reagentes (B). As misturas de reacção foram incubadas a 60 ° C durante 60 min. (A) A pista 1, 100 pb escada; Pista 2 - 3, 4-5, 6-7 e 8-9 são reacções com 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10, e não há cópias de DNA plasmídeo. (B) A pista 10 - 11, 12 - 13, 14-15, e 16-17 são reaCÇÕES com 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10 e 0 cópias de DNA plasmídeo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Métodos para detectar os produtos da lâmpada. HNB (A) ou fluorescente corante de intercalação (B) foram utilizados para detectar produtos lâmpada. As reacções foram realizadas a 60 ° C durante 60 min. Pista 1 a 5, reações com 0, 10, 25, 50 e 100 cópias de plasmídeo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. detecção em tempo real de luz de produtos. As reacções foram realizadas a 60 ° C durante 60 min. Reações com cópias de plasmídeo 10 6 (preto), 10 4 (vermelho), 10 3 (verde), 100 (amarelo), 10 (azul), 1 (laranja) e 0 (marrom e castanho claro). Três detecções foram realizados de forma independente. Eles foram altamente reprodutível. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Anteriormente, foi desenvolvido um ensaio LAMP sensível e específico visando o elemento de inserção IS1111a 14. O elemento IS1111 foi selecionado porque ele é altamente conservado entre as diferentes estirpes de C. burnetii e o seu elevado número de cópias (7-110) em que as bactérias (Klee 2006). Os nossos resultados mostraram que a lâmpada pode detectar cerca de 25 cópias do elemento IS1111, que pode correlacionar-se com tão pouco como uma única cópia cromossómica de ADN Coxiella. Neste estudo, a DNA polimerase Bst, primers lâmpada e dNTPs foram liofilizadas e embalado em um saco de papel de alumínio compactado. A sensibilidade destes reagentes liofilizados permanece em 25 cópias; semelhante aos reagentes recém-preparados para pelo menos um mês quando armazenada à temperatura ambiente. É muito importante para garantir que o saco de folha de alumínio está devidamente selada antes de abrir. Não utilize os tubos se o saco de folha de alumínio não está vedada ou se ele estiver danificado. Isto pode causar a re-hidratação óf os reagentes liofilizados, que conduz à perda da sua reactividade. O outro passo essencial é a re-suspensão dos reagentes liofilizados com tampão de reconstituição. A reação LAMP não funcionará corretamente com reagentes que não são totalmente re-suspensão. Por causa das elevadas concentrações de sal do tampão de reacção e elevada viscosidade da solução trimetilglicina, eles não podem ser liofilizados com êxito com DNA polimerase Bst, iniciadores LAMP, e dNTPs. Um passo especial é necessário para preparar o tampão de reconstituição com esses componentes. Potencialmente, a reacção pode ser testado LAMP a baixas concentrações de sal, com baixa ou nenhuma trimetilglicina. Se houver uma condição de reacção que tem a mesma sensibilidade de detecção, mas com baixo teor de sal e baixa concentração trimetilglicina, o reagente liofilizado só precisa de ser reconstituído com água. Isto vai simplificar ainda mais os passos de reacção.
Recentemente, Wang et al. 15 em comparação em dozeensaios LAMP -house com a isotérmica kit Mix Master comercializado e encontrou os ensaios in-house tem resultados falso-positivos. Em nosso laboratório, nós desenvolvemos vários ensaios LAMP para a detecção de bactérias diferentes e nunca ter encontrado resultados falso-positivos nesses ensaios in-house. Além disso, nos estágios iniciais do desenvolvimento do método LAMP, os ensaios foram testados com tanto internamente preparadas mistura principal e comercializado mistura principal e nenhuma diferença foi observada na sensibilidade e especificidade dos ensaios.
Nosso estudo também apresenta vários métodos que não só podem detectar os produtos de lâmpada sem abrir os tubos de reacção para diminuir a probabilidade de contaminação laboratorial cruz, mas também têm um tempo de processo mais curto para ler resultados se comparam ao método de eletroforese em gel. A vantagem de utilizar estes métodos de detecção irá aumentar grandemente a nossa capacidade de realizar o ensaio e rapidamente diagnosticar um indivíduo com C. burnetii
Ao contrário dos métodos baseados em PCR, onde é necessário um termociclador, um bloco de aquecimento, banho-maria ou incubadora mantendo uma temperatura constante de cerca de 60 ° C é tudo o que é necessário para o ensaio de LAMP. Isso faz com que o ensaio particularmente adequado na configuração de recursos limitados. Ao contrário do ensaio inicial LAMP, polimerase Bst ADN, iniciadores LAMP, e dNTPs necessitam de ser armazenados a -20 ° C. Estes reagentes liofilizados podem ser armazenados à temperatura ambiente o que torna ainda mais útil para um cenário de recursos limitados onde a febre Q é endêmica. O estudo de estabilidade a longo prazo dos reagentes liofilizados, a 4 ° C, 25 ° C, e 37 ° C, está actualmente em curso. No futuro, gostaríamos de demonstrar que este ensaio da lâmpada utilizando reagentes liofilizados pode detectar C. burnetii com sensibilidade semelhante àde PCR em uma configuração remota.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela Naval Medical Research Center, a pesquisa unidade de trabalho 6000.RAD1.J.A0310. As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não reflecte necessariamente a política oficial ou a posição do Departamento da Marinha, Departamento de Defesa, ou do Governo dos Estados Unidos. Wei-Mei Ching é um funcionário do governo dos EUA. Este trabalho foi preparado como parte de seus deveres oficiais. Título 17 USC §105 prevê que «proteção dos direitos autorais sob este título não está disponível para qualquer obra do Governo dos Estados Unidos. ' Título 17 USC §101 define uma obra governo dos Estados Unidos como um trabalho preparado pelo membro do serviço militar ou funcionário do governo dos EUA como parte de suas funções oficiais dessa pessoa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10x Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000x, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000x, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
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