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Immunology and Infection

की जांच के लिए Lyophilized लूप की मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन अभिकर्मकों का विकास Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53839
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1, 1
1Viral and Rickettsial Diseases Department, Naval Medical Research Center

Abstract

Coxiella burnetii, एजेंट क्यू बुखार के कारण, एक लाचार intracellular जीवाणु है। पीसीआर आधारित नैदानिक ​​assays सी का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है सेल संस्कृतियों और नैदानिक ​​नमूनों में burnetii डीएनए। पीसीआर विशेष उपकरणों और व्यापक अंत उपयोगकर्ता के प्रशिक्षण की आवश्यकता है, और इसलिए, यह नियमित काम विशेष रूप से एक संसाधन विवश क्षेत्र में के लिए उपयुक्त नहीं है। हम एक पाश की मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (दीपक) परख सी की मौजूदगी का पता लगाने के लिए विकसित किया है रोगी के नमूनों में burnetii। इस पद्धति का एक पानी के स्नान या हीटिंग ब्लॉक में लगभग 60 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर एक भी किया जाता है। इस चिराग परख की संवेदनशीलता प्रतिक्रिया प्रति के बारे में 25 प्रतियों की एक सीमा का पता लगाने के साथ पीसीआर के समान है। इस रिपोर्ट में यह प्रतिक्रिया lyophilized अभिकर्मकों और hydroxynaphthol नीला (एचएनबी) या प्रतिक्रिया में फ्लोरोसेंट intercalating डाई के साथ एक यूवी लैंप का उपयोग कर परिणाम के दृश्य का उपयोग करने की तैयारी का वर्णन है। दीपक अभिकर्मकों lyophili थेजेड और संवेदनशीलता का पता लगाने की हानि के बिना एक महीने के लिए कमरे के तापमान (आर टी) में संग्रहीत। इस चिराग परख विशेष रूप से मजबूत है क्योंकि प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करने के लिए जटिल कदम को शामिल नहीं करता है। इस विधि में संसाधन सीमित सेटिंग में उपयोग जहां क्यू बुखार स्थानिक है के लिए आदर्श है।

Introduction

छोटे ग्राम नकारात्मक जीवाणु Coxiella burnetii क्यू बुखार है, जो दुनिया भर में एक जॉनोसिस है की प्रेरणा का एजेंट है। क्यू बुखार के दुनिया भर में वितरण और सी के उच्च संक्रामकता के कारण burnetii, विदेशों में तैनात अमेरिकी सैन्य और असैनिक कर्मियों स्थानिक क्षेत्रों में संक्रमित होने का खतरा होता है।

तीव्र और जीर्ण संक्रमण: क्यू बुखार के दो रूपों में प्रकट होता है। एक्यूट क्यू बुखार फ्लू जैसे लक्षण, हेपेटाइटिस, या निमोनिया के साथ खुद को प्रस्तुत करता है, और आमतौर पर एक खुद को सीमित एक कम मृत्यु दर के साथ बीमारी है। जीर्ण क्यू बुखार, जबकि कम प्रचलित है, अक्सर अन्तर्हृद्शोथ है, जो एक बहुत अधिक मृत्यु दर है अगर अनुपचारित छोड़ दिया 1,2 में यह परिणाम है। इसलिए, शीघ्र निदान का मार्गदर्शन करने के लिए एक उचित इलाज के लिए रोगी की देखभाल के लिए महत्वपूर्ण है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) assays सी का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है सेल संस्कृतियों और नैदानिक ​​नमूनों 3-5 <में burnetii डीएनए/ Sup>। दोनों पीसीआर और qPCR महंगा है और अक्सर आसानी से नियमित काम के लिए संसाधन विवश क्षेत्रों में उपलब्ध नहीं हैं।

मूलतः Notomi 6 से वर्णित है, लूप की मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (दीपक) एक वैकल्पिक डीएनए प्रवर्धन विधि प्रदान करता है। दीपक विशेष रूप से डिजाइन प्राइमर सेट है कि लक्ष्य जीन की कम से कम छह स्वतंत्र क्षेत्रों को पहचान के साथ-साथ कतरा विस्थापन डीएनए संश्लेषण के लिए Bst डीएनए पोलीमरेज़ उपयोग करता है। दीपक की सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि प्रवर्धन इज़ोटेर्माल स्थितियों के कारण होती है। इसलिए, केवल एक पानी के स्नान, हीटिंग ब्लॉक या एक मशीन की आवश्यकता है। इस विधि के कई rickettsial रोगजनकों 7-9 पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। जेल वैद्युतकणसंचलन से परिलक्षित डीएनए उत्पादों के दृश्य के लिए सबसे सही तरीका है जिसके अविशिष्ट प्रवर्धन के कारण झूठी सकारात्मक से सच सकारात्मक अंतर कर सकते है। हालांकि प्रक्रियाओं जेल वैद्युतकणसंचलन में शामिल संसाधन सीमित की गिरफ्तारी के लिए व्यावहारिक नहीं हैंईएएस। कई वैकल्पिक तरीकों प्रतिक्रिया उत्पादों का पता लगाने के लिए विकसित किए गए। ये विकल्प, जैसे मैग्नीशियम पाइरोफॉस्फेट गठन के 10 या एक फ्लोरोसेंट intercalating डाई का उपयोग करने से निकाली गई गंदगी को पराबैंगनी प्रकाश 11,12 के तहत कल्पना करने के लिए एक जेल चलाने की तुलना में अधिक अनुकूल हैं। जब 25 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है, जो उष्णकटिबंधीय और उप उष्णकटिबंधीय देशों में परिवेश तापमान रहे हैं, जहां क्यू बुखार स्थानिक 13 है दीपक अभिकर्मकों एक महीने के लिए स्थिर थे।

एक दीपक परख हमारी प्रयोगशाला में विकसित किया गया था सी की मौजूदगी का पता लगाने के लिए प्लाज्मा के नमूने 14 में burnetii। यहाँ हम lyophilized अभिकर्मकों से दीपक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन। lyophilized अभिकर्मकों एक महीने के लिए स्थिर जब आरटी पर संग्रहीत कर रहे हैं। जब एक आसान दृश्य विधि के साथ संयुक्त, इस सी का पता लगाने के लिए उपयोग करने के लिए एक आदर्श तरीका है एक संसाधन सीमित सेटिंग में burnetii।

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Protocol

1. दीपक रिएक्शन के लिए मानक के रूप में प्लास्मिड डीएनए dilutions तैयार

  1. 260 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने के लिए डीएनए एकाग्रता प्लाज्मिड (सी burnetii आरएसए 493 का लक्ष्य जीन से युक्त IS1111a) निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग करें। 1 के एक आयुध डिपो के 260 डीएनए के 50 माइक्रोग्राम / μl के लिए equates।
  2. नकल संख्या में प्लास्मिड डीएनए की मात्रा परिवर्तित। चूंकि प्लाज्मिड का आकार 6330 बीपी है, इस प्लाज्मिड की आणविक वजन 4.1 x 10 6 ग्राम (6330 बीपी x 649 जी / बीपी) है। प्लाज्मिड के डीएनए एकाग्रता 34.2 एनजी / μl (1.1 कदम से निर्धारित रूप में) है। इस डीएनए नमूने के 1 μl डीएनए के 5 एक्स 10 9 प्रतियां (34.2 x 10 -9 जी / 4.1 x 10 6 GX 6.02 x 10 23) को equating, प्लास्मिड डीएनए के 34.2 एनजी शामिल हैं।
  3. 5 एक्स 10 8 प्रतियों की एक डीएनए नमूने बनाने के लिए एक 10 गुना कमजोर पड़ने के लिए पानी के 90 μl के लिए प्लास्मिड डीएनए (5 एक्स 10 9 प्रतियां / μl) के 10 μl जोड़ें / μl।
  4. दोहराएँ कदम 1.3, 5 10 x 7 के डीएनए के नमूने तैयार करने के लिए 5 एक्स 10 6, 5 एक्स 10 5, 5 एक्स 10 4, 5 एक्स 10 3, 5 एक्स 10 2, 5 एक्स 10 1, और 5 एक्स 10 0 प्रतियां / μl।

2. दीपक रिएक्शन के लिए नमूने से डीएनए खाका तैयार

  1. एक वाणिज्यिक डीएनए मिनी निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार किट का उपयोग मानव प्लाज्मा नमूनों से डीएनए निष्कर्षण प्रदर्शन। निकासी के लिए 200 μl नमूना की कुल प्रयोग करें और एक 20 μl मात्रा में निकाले डीएनए elute।

3. 2x दीपक रिएक्शन बफर तैयार

  1. 10x पोल बफर के 200 μl, 5 मीटर trimethylglycine के 320 μl, 1 मीटर MgSO 4, dNTP मिश्रण के 280 μl (10 मिमी) और पानी के 188 μl 2x दीपक बफर के 1 मिलीलीटर बनाने के लिए 12 μl मिक्स। 10 सेकंड के लिए पल्स-vortexing द्वारा मिक्स।

4. मानक दीपक प्रतिक्रिया प्रदर्शन

  1. 2x ला के 12.5 μl मिक्ससांसद बफर (चरण 3 में तैयार के रूप में, 40 मिमी Tris एचसीएल (8.8 पीएच), 20 मिमी KCl, 16 मिमी MgSO 4, 20 मिमी (एनएच 4) 2 अतः 4, 0.2% ट्राइटन X-100, 1.6 मीटर trimethylglycine, 1.4 मिमी dNTP मिश्रण), प्राइमर मिश्रण के 1.2 μl, BST डीएनए पोलीमरेज़ (8 यू / μl) के 1 μl, और पानी की 5.3 μl एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण (20 μl) बनाने के लिए।
  2. 20 μl प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए 5 (या 2 चरण 1 से) डीएनए की μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से।
  3. बंद ट्यूब और एक पानी के स्नान या हीटिंग ब्लॉक में 60 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। इस इष्टतम प्रतिक्रिया पहले से निर्धारित तापमान है।
  4. प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए 10x जेल लोड हो रहा बफर के 5 μl जोड़ें।
  5. लोड 5 एक 2% agarose न्यूक्लिक एसिड दाग intercalating के साथ दाग जेल की प्रतिक्रिया उत्पादों की μl।
  6. 1x TBE बफर में 35 मिनट के लिए 100 वी पर जेल चला।
  7. पराबैंगनी प्रकाश से परिणाम कल्पना।

5. पुनर्गठन के साथ दीपक प्रतिक्रिया प्रदर्शनअभिकर्मकों

  1. 10x पोल बफर के 125 μl, 5 मीटर trimethylglycine के 200 μl, 1 एम MgSO 4 के 7.5 μl मिक्स, पानी के 667.5 μl पुनर्गठन बफर के 1 मिलीलीटर बनाने के लिए। 10 सेकंड के लिए पल्स-vortexing द्वारा मिक्स।
  2. ट्यूब जो सीलबंद एल्यूमीनियम पन्नी बैग से lyophilized अभिकर्मकों शामिल निकालें। नलियों अगर एल्यूमीनियम पन्नी बैग सील नहीं किया गया है का उपयोग न करें या इसे क्षतिग्रस्त है।
  3. lyophilized अभिकर्मकों फिर से निलंबित करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में पुनर्गठन बफर के 20 μl जोड़ें।
  4. बफर ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा मिक्स। यकीन lyophilized अभिकर्मकों पूरी तरह से फिर से निलंबित कर बनाने के लिए एक नज़र रखना। सफेद पाउडर ट्यूब में गायब हो जाना चाहिए।
  5. पुनर्गठन अभिकर्मकों के लिए (चरण 1 या 2 से) डीएनए टेम्पलेट के 5 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से।
  6. बंद ट्यूब और एक पानी के स्नान या हीटिंग ब्लॉक में 60 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए 10x जेल लोड हो रहा बफर के 5 μl जोड़ें।
  8. लोड प्रतिक्रिया के 5 μlएक 2% agarose न्यूक्लिक एसिड दाग intercalating के साथ दाग जेल के लिए उत्पादों।
  9. 1x TBE बफर में 35 मिनट के लिए 100 वी पर जेल चला।
  10. पराबैंगनी प्रकाश से परिणाम कल्पना।

6. पुनर्गठन बफर एचएनबी या फ्लोरोसेंट intercalating डाई युक्त साथ दीपक प्रतिक्रिया प्रदर्शन

  1. 10x पोल बफर के 125 μl, 5 मीटर trimethylglycine के 200 μl, 1 एम के 7.5 μl MgSO 4, 20 मिमी एचएनबी (या 100x फ्लोरोसेंट intercalating डाई की 12.5 μl) और 660 μl (या 655 μl) पानी की 7.5 μl मिक्स पुनर्गठन बफर के 1 मिलीलीटर बनाते हैं। 10 सेकंड के लिए पल्स-vortexing द्वारा मिक्स।
  2. 5.6 - धारा 6 में तैयार कदम 5.2 दोहराने के लिए पुनर्गठन बफर का प्रयोग करें।
  3. नग्न आंखों से परिणाम (एचएनबी युक्त प्रतिक्रिया) या एक यूवी प्रकाश (फ्लोरोसेंट intercalating डाई युक्त प्रतिक्रिया) कल्पना।

7. प्रदर्शन करना ट्यूब स्कैनर के साथ वास्तविक समय दीपक रिएक्शन

  1. reconstitut करने के लिए डीएनए μl 5 जोड़ेएड फ्लोरोसेंट intercalating डाई, करीब युक्त ट्यूब और ट्यूब स्कैनर के लिए इसे डालने अभिकर्मकों।
  2. 60 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन तापमान सेट करें। 60 मिनट के लिए 520 एनएम पर प्रतिदीप्ति उपाय।

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Representative Results

0.2 मिलीलीटर ट्यूब के अंदर lyophilized दीपक अभिकर्मकों Bst डीएनए पोलीमरेज़, प्राइमरों, और dNTPs में शामिल है। पुनर्गठन बफर के 20 μl फिर से निलंबित lyophilized अभिकर्मकों के लिए प्रयोग किया जाता है। चित्रा 1 हौसले से तैयार अभिकर्मकों और lyophilized अभिकर्मकों के साथ agarose जैल पर दीपक प्रतिक्रिया परिणाम दिखाता है। lyophilized अभिकर्मक अपनी गतिविधि को कम नहीं करता। दीपक दोनों अभिकर्मकों द्वारा तैयार डीएनए टेम्पलेट। चित्रा 2 की 25 प्रतियां पता लगा सकते हैं प्रतिक्रियाओं एचएनबी या फ्लोरोसेंट intercalating डाई प्रतिक्रिया में वर्तमान के साथ प्रतिक्रिया उत्पादों का पता लगाने से पता चलता है। प्रतिक्रिया के लिए एचएनबी के अलावा एक दृश्य रंग डीएनए टेम्पलेट के 25, 50 और 100 प्रतियां प्रतिक्रियाओं में वर्तमान के साथ नीले रंग के लिए बैंगनी से परिवर्तन पैदा करता है। प्रतिक्रिया में फ्लोरोसेंट intercalating डाई का समावेश पराबैंगनी प्रकाश के साथ एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत जब डीएनए टेम्पलेट्स के 25, 50, और 100 प्रतियां मौजूद हैं पता चलता है। एक ट्यूब स्कैनर का इस्तेमाल किया गया थावास्तविक समय का पता लगाने के लिए इस अध्ययन में। इस मशीन 8 प्रतिक्रियाओं एक साथ प्रदर्शन कर सकते हैं। ट्यूब स्कैनर का उपयोग कर फ्लोरोसेंट intercalating डाई उपस्थिति के साथ वास्तविक समय में प्रतिदीप्ति संकेतों पर नजर रखने के लिए 3 पता चलता है। प्रतिदीप्ति संकेतों के बाद 14, 18, ​​21 आधारभूत ऊपर हैं, और 10 6 के साथ 23 मिनट, 10 4, 10 3, और प्रतिक्रियाओं में डीएनए टेम्पलेट की 100 प्रतियां।

आकृति 1
हौसले से तैयार अभिकर्मकों (ए) और Lyophilized अभिकर्मकों (बी) के साथ agarose जेल पर चित्रा 1. दीपक परिणाम। प्रतिक्रिया मिश्रण 60 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे। (ए) लेन 1, 100 बीपी सीढ़ी; 2 लेन - 3, 4 - 5, 6 - 7 और 8 - 9 2.5 x 10 3 के साथ प्रतिक्रियाओं हैं 2.5 x 10 2, 2.5 x 10, और प्लास्मिड डीएनए का कोई प्रतियां। (बी) के लेन 10 - 11, 12 - 13, 14 - 15, और 16 - 17 इसकी वजह हैं2.5 x 10 3 के साथ ctions, 2.5 एक्स 10 2, 2.5 x 10, और प्लास्मिड डीएनए 0 प्रतियां। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. तरीके दीपक उत्पादों का पता लगाने। एचएनबी (ए) या ​​फ्लोरोसेंट intercalating डाई (बी) दीपक उत्पादों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया। प्रतिक्रियाओं 60 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर किए गए। करने के लिए 5 लेन 1, के साथ प्रतिक्रियाओं 0, 10, प्लाज्मिड के 25, 50, और 100 प्रतियां। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र तीन। वास्तविक समय दीपक उत्पादों की जांच। प्रतिक्रियाओं 60 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर किए गए। 10 6 (काला), 10 4 (लाल), 10 3 (हरा), 100 (पीला), 10 (ब्लू), 1 (नारंगी) और 0 (भूरा और हल्के भूरे रंग) प्लाज्मिड की प्रतियों के साथ प्रतिक्रियाओं। तीन पता लगाने के लिए स्वतंत्र रूप से प्रदर्शन किया गया। वे अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इससे पहले, हम एक संवेदनशील और विशिष्ट दीपक परख प्रविष्टि तत्व IS1111a 14 को निशाना बनाने का विकास किया। IS1111 तत्व का चयन किया गया है क्योंकि यह अत्यधिक सी के विभिन्न प्रकारों के बीच में संरक्षित है burnetii और बैक्टीरिया में प्रतियों की अपनी उच्च संख्या (110 के लिए 7) (क्ली 2006)। हमारे परिणाम है कि दीपक IS1111 तत्व है, जो Coxiella डीएनए के रूप में छोटे रूप में एक गुणसूत्र की नकल करने के लिए सहसंबंधी सकता है के बारे में 25 प्रतियों का पता लगा सकते दिखाया। इस अध्ययन में, BST डीएनए पोलीमरेज़, दीपक प्राइमरों, और dNTPs lyophilized और एक ज़िपित एल्यूमीनियम पन्नी बैग में पैक कर रहे थे। इन lyophilized अभिकर्मकों की संवेदनशीलता 25 प्रतियों में रहता है; कम से कम एक महीने के लिए हौसले से तैयार अभिकर्मकों के लिए इसी तरह जब आरटी पर संग्रहीत। यह यकीन है कि एल्यूमीनियम पन्नी बैग ठीक से इसे खोलने से पहले बंद है बनाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। नलियों अगर एल्यूमीनियम पन्नी बैग सील नहीं किया गया है का उपयोग न करें या इसे क्षतिग्रस्त है। इस पुनर्जलीकरण ओ कारण हो सकता हैlyophilized अभिकर्मकों जो अपने जेट का नुकसान होता है च। अन्य महत्वपूर्ण कदम पुनर्गठन बफर के साथ lyophilized अभिकर्मकों की फिर से निलंबन है। दीपक प्रतिक्रिया अभिकर्मकों कि पूरी तरह से फिर से निलंबित नहीं कर रहे हैं के साथ ठीक से काम नहीं करेगा। क्योंकि प्रतिक्रिया बफर और trimethylglycine समाधान के उच्च चिपचिपाहट की उच्च सांद्रता नमक की, वे सफलतापूर्वक Bst डीएनए पोलीमरेज़, दीपक प्राइमरों, और dNTPs साथ lyophilized नहीं किया जा सकता। एक विशेष कदम उन घटकों के साथ पुनर्गठन बफर तैयार करने के लिए आवश्यक है। संभावित दीपक प्रतिक्रिया कम या कोई trimethylglycine के साथ कम नमक सांद्रता में परीक्षण किया जा सकता है। अगर वहाँ एक प्रतिक्रिया हालत ही संवेदनशीलता का पता लगाने, लेकिन कम नमक और कम trimethylglycine एकाग्रता के साथ किया है, lyophilized अभिकर्मक केवल पानी के साथ पुनर्गठन किया जाना चाहिए। यह आगे प्रतिक्रिया कदम सरल होगा।

हाल ही में, वांग एट अल। 15 में बारह तुलनाव्यावसायिक इज़ोटेर्माल मास्टर मिक्स किट के साथ -house दीपक assays और पाया घर में assays झूठी सकारात्मक परिणाम है। हमारी प्रयोगशाला में, हम अलग अलग बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए कई दीपक assays विकसित किया है और कभी नहीं पाया है इन-घर assays में झूठी सकारात्मक परिणाम है। इसके अलावा, दीपक पद्धति के विकास की शुरुआत चरणों में, assays दोनों घर में तैयार मास्टर मिश्रण और commercialized मास्टर मिश्रण के साथ परीक्षण किया गया है और कोई फर्क assays 'संवेदनशीलता और विशिष्टता में मनाया गया।

हमारे अध्ययन से भी कई तरीके है कि न केवल प्रयोगशाला पार संक्रमण की संभावना को कम करने के लिए प्रतिक्रिया ट्यूबों खोलने के बिना दीपक उत्पादों का पता लगा सकते हैं, लेकिन यह भी एक छोटी प्रक्रिया में समय परिणामों जेल वैद्युतकणसंचलन विधि से तुलना करें पढ़ने के लिए प्रस्तुत करता है। इन तरीकों का पता लगाने का उपयोग कर के लाभ बहुत जल्दी परख प्रदर्शन और सी के साथ एक व्यक्ति का निदान करने की हमारी क्षमता में वृद्धि होगी burnetii

पीसीआर आधारित विधियों जहां एक thermocycler की जरूरत है, एक हीटिंग ब्लॉक, नहाने के पानी या इनक्यूबेटर के चारों ओर 60 डिग्री सेल्सियस एक निरंतर तापमान बनाए रखने के विपरीत सब है कि दीपक परख के लिए आवश्यक है। इस परख विशेष रूप से संसाधन सीमित सेटिंग में उपयुक्त बनाता है। मूल दीपक परख, BST डीएनए पोलीमरेज़, दीपक प्राइमरों, और dNTPs के विपरीत -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा होने की जरूरत है। ये lyophilized अभिकर्मकों कमरे के तापमान है जो यह भी एक संसाधन सीमित की स्थापना, जहां क्यू बुखार स्थानिक है के लिए और अधिक उपयोगी बनाता है पर संग्रहित किया जा सकता है। 4 डिग्री सेल्सियस, 25 डिग्री सेल्सियस, और 37 डिग्री सेल्सियस पर lyophilized अभिकर्मकों की दीर्घकालिक स्थिरता अध्ययन वर्तमान में चल रही है। भविष्य में, हम को दिखाना है कि lyophilized अभिकर्मकों का उपयोग इस चिराग परख सी पता लगा सकते हैं चाहते हैं संवेदनशीलता के साथ burnetii है कि इसी तरहपीसीआर के दूरदराज के एक सेटिंग में।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध नौसेना चिकित्सा अनुसंधान केन्द्र, अनुसंधान कार्य इकाई 6000.RAD1.J.A0310 द्वारा समर्थित किया गया। इस लेख में व्यक्त विचार लेखक के हैं और इनका सरकारी नीति या नौसेना, रक्षा विभाग, या अमेरिकी सरकार ने विभाग की स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं करते। वी-मेई चिंग अमेरिकी सरकार के एक कर्मचारी है। इस काम के लिए उसे सरकारी कर्तव्यों के भाग के रूप में तैयार किया गया था। शीर्षक 17 यूएससी §105 कि 'इस शीर्षक के अंतर्गत कॉपीराइट संरक्षण के संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार किसी भी काम के लिए उपलब्ध नहीं है।' प्रदान करता है शीर्षक 17 यूएससी §101 उस व्यक्ति के सरकारी कर्तव्यों के भाग के रूप में सैन्य सेवा के सदस्य या अमेरिकी सरकार के कर्मचारी द्वारा तैयार एक काम के रूप में एक अमेरिकी सरकार के काम को परिभाषित करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LAMP primers Eurofins MWG operon 10 nmol, salt free Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase New England Biolabs M0275L 8 units/ml
10x Thermo pol buffer New England Biolabs B9004S
dNTP mixture New England Biolabs N0447L 10 mM each
Betaine Sigma-Aldrich B0300 5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M3409-1ML 1 M
10x Bluejuice Invitrogen 10816-015 gel loading buffer
SYBR green Invitrogen S7585 10,000x, visualize products in tubes
GelRed Phenix Research Products RGB-4103 10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents Gene Reach
Hydroxynaphthol blue Fluka 33936-10G
ESEQuant tube scanner Qiagen real-time detection

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References

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संक्रमण अंक 110 Lyophilization दीपक इज़ोटेर्माल, क्यू बुखार डीएनए का पता लगाने
की जांच के लिए Lyophilized लूप की मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन अभिकर्मकों का विकास<em&gt; Coxiella burnetii</em
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Chen, H. W., Ching, W. M. The… More

Chen, H. W., Ching, W. M. The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii. J. Vis. Exp. (110), e53839, doi:10.3791/53839 (2016).

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