Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53839
Automatic Translation
1, 1
1Viral and Rickettsial Diseases Department, Naval Medical Research Center

Abstract

Burnetii Coxiella, סוכן גרימת הקדחת Q, הוא חיידק תאי לחייב. מבחני אבחון מבוסס PCR פותחו לאיתור ג DNA burnetii בתרביות דגימות קליניות. PCR דורש ציוד מיוחד והכשרת משתמש קצה נרחבת, ולכן, זה לא מתאים לעבודה שיגרתית במיוחד באזור המוגבל במשאבים. פתחנו הגברת isothermal בתיווך לולאה (LAMP) assay כדי לזהות את נוכחותו של ג burnetii בדגימות המטופל. שיטה זו מבוצעת בטמפרטורה יחידה סביב 60 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום. הרגישות של assay LAMP זה דומה מאוד PCR עם גבול גילוי של כ -25 עותקים לכל תגובה. דו"ח זה מתאר את הכנת התגובה באמצעות ריאגנטים lyophilized ויזואליזציה של התוצאות באמצעות כחול hydroxynaphthol (HNB) או מנורת UV עם צבע intercalating פלורסנט התגובה. ריאגנטים LAMP היו lyophilized ו לאחסן בטמפרטורת החדר (RT) במשך חודש ללא הפסד של רגישות זיהוי. assay LAMP זהו חזק במיוחד משום הכנת תערובת התגובה אינה כרוך צעדים מורכבים. שיטה זו היא אידיאלית לשימוש הגדרות משאב מוגבל שבו קדחת Q הוא אנדמי.

Introduction

החיידק גראם שליליים קטנים Coxiella burnetii הוא הגורם הסיבתי של קדחת Q, שהינה זואונוסיס ברחבי העולם. בשל ההפצה העולמית של קדחת Q ואת ההדבקה גבוהה של ג burnetii, ארה"ב אנשי צבאיים ואזרחיים בפריסה רב לאומית נמצאים בסיכון להידבק בתחומי אנדמיים.

קדחת Q מבטאת בשתי צורות: זיהומים אקוטיים וכרוניים. Q-חום חריפה מציג את עצמו עם תסמינים דמויי שפעת, דלקת כבד, או דלקת ריאות, והוא בדרך כלל מחלה מעצמם עם שיעור תמותה נמוך. Q-חום כרוני, בעוד פחות נפוץ, לעתים קרובות תוצאות אנדוקרדיטיס, אשר יש שיעור תמותה גבוה בהרבה אם נותר 1,2 המטופל. לכן, אבחון מוקדם כדי להנחות את הטיפול מתאים הוא קריטי עבור טיפול בחולים. מבחני תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בזמן אמת PCR כמותי (qPCR) פותחו לאיתור ג DNA burnetii בתרביות דגימות קליניות 3-5 </ Sup>. שני PCR ו qPCR הם יקרים ולעתים קרובות לא זמינים באזורים מוגבל משאב לעבודה שגרתית.

במקור שתאר Notomi 6, הגברת isothermal בתיווך לולאה (LAMP) מציעה שיטת הגברת DNA חלופית. LAMP משתמשת DNA פולימרז BST לסינתזת גדיל DNA עקירה יחד עם סטים פריימר ומעוצבים שמזהים לפחות לשישה אזורים עצמאיים של גן המטרה. היתרון המשמעותי ביותר של LAMP הוא הגברה מתרחשת בתנאי isothermal. לכן, רק באמבט מים, בלוק חימום או באינקובטור נדרש. שיטה זו נעשה שימוש כדי לזהות פתוגנים כמה ריקציאלי 7-9. ויזואליזציה של מוצרי ה- DNA מוגברים על ידי ג'ל אלקטרופורזה היא השיטה המדויקת ביותר שיכול להבדיל חיוביות אמיתית תוצאות חיוביות שגויות עקב הגברה ספציפית. עם זאת בהליכי ג'ל אלקטרופורזה אינם מעשיים עבור ar משאב מוגבלEAS. מספר שיטות חלופיות שפותחו כדי לגלות את תוצרי התגובה. חלופיים אלה, כגון עכירות נגזר היווצרות מגנזיום pyrophosphate 10 או באמצעות צבע intercalating פלורסנט להיות דמיינו תחת אור UV 11,12 הם נוחים יותר פועל ג'ל. ריאגנטים LAMP היו יציבים במשך חודש, כאשר הם מאוחסנים על 25 מעלות צלזיוס ו -37 מעלות צלזיוס, אשר בטמפרטורות סביבה במדינות טרופיות ותת טרופיות שבו הקדחת Q היא 13 אנדמיים.

Assay LAMP פותח במעבדה שלנו כדי לזהות את נוכחותו של ג burnetii בדגימות פלזמה 14. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט להכנת תערובת התגובה LAMP מן ריאגנטים lyophilized. ריאגנטים lyophilized יציבים במשך חודש אחד, כאשר הם מאוחסנים ב RT. בשילוב עם שיטת הדמיה קלה, זוהי שיטה אידיאלית לשימוש לאיתור ג burnetii בסביבת משאב מוגבל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

.1 כן פלסמיד דנ"א דילולים כתקן עבור תגובת LAMP

  1. השתמש ספקטרופוטומטר למדידת צפיפות אופטית (OD) ב 260 ננומטר, כדי לקבוע את (IS1111a גן המטרה המכיל של ג burnetii RSA 493) פלסמיד ריכוז ה- DNA. OD של 260 של 1 משווה ל 50 מיקרוגרם / μl של ה- DNA.
  2. המר את כמות ה- DNA פלסמיד לתוך מספר עותק. מאז בגודל של הפלסמיד הוא 6,330 נ"ב, המשקל המולקולרי של פלסמיד זה הוא 4.1 x 10 6 גרם (6,330 נקודות בסיס x 649 ג '/ נ"ב). ריכוז ה- DNA של הפלסמיד הוא 34.2 ng / μl (כפי שנקבע משלב 1.1). 1 μl של דגימת DNA זה מכיל 34.2 ng של DNA פלסמיד, שהשוותה ל 5 x 10 9 עותקים (34.2 x 10 -9 גרם / 4.1 x 10 6 GX 6.02 x 10 23) של ה- DNA.
  3. הוסף 10 μl של ה- DNA פלסמיד (5 x 10 9 עותקים / μl) עד 90 μl של מים עבור דילול של פי 10 לבצע דגימת DNA של 5 x 10 8 עותקים / μl.
  4. חזור על שלב 1.3 להכין דגימות DNA של 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, ו -5 x 10 0 עותקים / μl.

2. הכן את ה- DNA תבנית ממדגמים עבור תגובת LAMP

  1. בצע מיצוי דנ"א מדגים מפלזמה אנושית באמצעות ערכת מיני DNA מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש סך של 200 מדגם μl להפקת elute DNA חילוץ בהיקף 20 μl.

3. כן חיץ תגובת LAMP 2x

  1. מערבבים 200 μl של 10x Pol הצפת, 320 μl של 5 M trimethylglycine, 12 μl של 1 M MgSO 4, 280 μl של תערובת dNTP (10 מ"מ כל אחד) ו 188 μl של מים כדי להפוך 1 מ"ל של חיץ 2x LAMP. מערבבים על ידי הדופק-vortexing במשך 10 שניות.

4. בצע התגובה הסטנדרטית LAMP

  1. מערבבים 12.5 μl של 2x LAחיץ MP (כפי מוכן בשלב 3, 40 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 KCl מ"מ, 16 מ"מ 4 MgSO, 20 מ"מ (NH 4) 2 4 SO, 0.2% Triton X-100, 1.6 M trimethylglycine, 1.4 מ"מ dNTP תערובת), 1.2 μl של תמהיל פריימר, 1 μl של פולימראז BST DNA (8 U / μl), ו -5.3 μl של מים כדי להפוך תערובת התגובה (20 μl) בצינור 0.2 מ"ל PCR.
  2. הוסף 5 μl של ה- DNA (משלב 1 או 2) לתערובת התגובה 20 μl ומערבבים היטב.
  3. צינור סגור לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמבט מים או בלוק חימום. זוהי טמפרטורת התגובה האופטימלית נקבעה בעבר.
  4. הוסף 5 μl של 10x חיץ ג'ל העמסה כדי לסיים את התגובה.
  5. μl טען 5 של תוצרי התגובה כדי ג'ל 2% agarose מוכתם intercalating כתם חומצות גרעין.
  6. הפעל הג'ל על 100 וולט במשך 35 דקות במאגר 1x TBE.
  7. דמיינו את התוצאות על ידי אור UV.

5. בצע תגובת LAMP עם מחדשריאגנטים

  1. מערבבים 125 μl של 10x Pol הצפת, 200 μl של 5 M trimethylglycine, 7.5 μl של 1 M MgSO 4, 667.5 μl של מים כדי להפוך 1 מ"ל של חיץ הכינון מחדש. מערבבים על ידי הדופק-vortexing במשך 10 שניות.
  2. הסר צינורות המכילים חומרים כימיים lyophilized מהשקית רדיד אלומיניום האטומה. אין להשתמש צינורות אם השקית בנייר אלומיניום אינו אטום או אם הוא פגום.
  3. הוסף 20 μl של חיץ הכינון מחדש לתוך צינור אחד מחדש להשעות ריאגנטים lyophilized.
  4. מערבבים על ידי pipetting למעלה חיץ ולמטה 5 פעמים. תסתכל לוודא ריאגנטים lyophilized מחדש תלויים לחלוטין. האבקה הלבנה צריכה להיעלם בצינור.
  5. הוסף 5 μl של תבנית ה- DNA (משלב 1 או 2) אל ריאגנטים מחדש ומערבבים היטב.
  6. צינור סגור לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמבט מים או בלוק חימום.
  7. הוסף 5 μl של 10x חיץ ג'ל העמסה כדי לסיים את התגובה.
  8. טען 5 μl של תגובהמוצרים ג'ל 2% agarose מוכתם intercalating כתם חומצות גרעין.
  9. הפעל הג'ל על 100 וולט במשך 35 דקות במאגר 1x TBE.
  10. דמיינו את התוצאות על ידי אור UV.

6. בצע תגובת LAMP עם הצפת כינון המכילה HNB או פלורסנט intercalating דיי

  1. מערבבים 125 μl של 10x Pol הצפת, 200 μl של 5 M trimethylglycine, 7.5 μl של 1 M 4 MgSO, 7.5 μl של 20 מ"מ HNB (או 12.5 μl של 100x לצבוע intercalating פלורסנט) ו 660 μl (או 655 μl) של מים לעשות 1 מ"ל של חיץ הכינון מחדש. מערבבים על ידי הדופק-vortexing במשך 10 שניות.
  2. השתמש החיץ מחדש מוכן בסעיף 6 לחזור על השלבים 5.2 - 5.6.
  3. דמיינו את התוצאות על ידי בעין בלתי המזוינת (תגובה המכילה HNB) או אור UV (תגובה המכילה לצבוע intercalating פלורסנט).

7. בצעו תגובת LAMP בזמן אמת עם סורק Tube

  1. הוסף 5 μl DNA אל reconstitutריאגנטים ed המכיל לצבוע intercalating פלורסנט, צינור קרוב ולהכניס אותו לסורק צינור.
  2. טמפרטורת דגירת גדר ב 60 ° C. למדוד את הקרינה ב 520 ננומטר במשך 60 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ריאגנטים LAMP lyophilized בתוך הצינור 0.2 מ"ל מכיל DNA פולימרז BST, תחל ו dNTPs. 20 μl של חיץ הכינון מחדש משמש מחדש להשעות את ריאגנטים lyophilized. איור 1 מציג את תוצאות התגובה LAMP על ג'לים agarose עם ריאגנטים מוכן טרי ריאגנטים lyophilized. מגיב lyophilized לא לצמצם את פעילותו. התגובות LAMP שהכין ריאגנטים שניהם יכולים לזהות 25 עותקים של תבנית ה- DNA. תרשים 2 מציג את זיהוי של תוצרי התגובה עם HNB או לצבוע intercalating פלורסנט נוכח התגובה. תוספת של HNB לתגובה מייצרת שינוי צבע חזותי מסגול לכחול עם 25, 50 ו -100 עותקים של תבנית ה- DNA נוכח התגובות. ההכללה לצבוע intercalating פלורסנט התגובה מראה אות קרינה חזקה עם אור UV כאשר 25, 50, ו 100 עותקים של תבניות DNA נוכחים. סורק צינור שמשבמחקר זה לגילוי בזמן אמת. מכונה זו ניתן לבצע 8 תגובות בו זמנית. איור 3 מראה באמצעות סורק צינור לפקח על אותות הקרינה בזמן אמת עם נוכחות לצבוע intercalating פלורסנט. האותות הקרינה מעל הבסיס אחרי 14, 18, ​​21, ו -23 דק 'עם 10 6, 10 4, 10 3, ו -100 עותקים של תבנית ה- DNA בתגובות.

איור 1
תוצאות באיור 1. LAMP על Agarose ג'ל עם ריאגנטים מוכן טרי (א) ו ריאגנטים Lyophilized (B). תערובות התגובה הודגרו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. (א) ליין 1, סולם נ"ב 100; ליין 2 - 3, 4 - 5, 6 - 7 ו -8 - 9 הן תגובות עם 2.5 x 10 3, 2.5 x 10 2, 2.5 x 10, ואין עותקים של DNA פלסמיד. (ב) ליין 10 - 11, 12 - 13, 14 - 15, ו -16 - 17 הם Reactions עם 2.5 x 10 3, 2.5 x 10 2, 2.5 x 10, ו -0 עותקים של DNA פלסמיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. שיטות לאבחון מוצרים LAMP. HNB (א) או לצבוע intercalating פלורסנט (B) שימשו כדי לזהות מוצרים LAMP. תגובות בוצעו על 60 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. ליין 1 עד 5, תגובות עם 0, 10, 25, 50, ו 100 עותקים של פלסמיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. איתור strong> בזמן האמת של מוצרי LAMP. תגובות בוצעו על 60 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. תגובות עם 10 6 (שחור), 10 4 (אדום), 10 3 (ירוק), 100 (צהוב), 10 (כחול), 1 (כתום) 0 (חום חום בהיר) עותקים של פלסמיד. שלוש לתגליות בוצעו באופן עצמאי. הם היו מאוד לשחזור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבר, פיתחנו assay LAMP רגיש וספציפי מיקוד אלמנט הכניסה IS1111a 14. מרכיב IS1111 נבחר משום שהיא נשמרת מאוד בקרב הזנים השונים של C. burnetii ומספר גבוהים של עותקים (7 עד 110) החיידקים (קליי 2006). תוצאותינו הראו כי LAMP יכול לזהות כ -25 עותקים של אלמנט IS1111, אשר עשוי לתאם קטנה כמו עותק כרומוזומליות אחד Coxiella DNA. במחקר זה, DNA פולימרז BST, פריימרים LAMP, ו dNTPs היו lyophilized ו ארוז בשקית נייר אלומיניום מכווצת. הרגישות של ריאגנטים lyophilized אלה נשאר 25 עותקים; בדומה ריאגנטים המוכן הטרי עבור חודש אחד לפחות, כאשר הם מאוחסנים ב RT. חשוב מאוד לוודא את השקית בנייר האלומיניום אטומה כמו שצריך לפני פתיחתו. אין להשתמש צינורות אם השקית בנייר אלומיניום אינו אטום או אם הוא פגום. דבר זה עלול לגרום o התייבשותf ריאגנטים lyophilized אשר מובילה לאובדן של תגובתיות שלה. השלב הקריטי השני הוא מחדש ההשעיה של ריאגנטים lyophilized עם חיץ הכינון מחדש. תגובת LAMP לא תעבוד כראוי עם ריאגנטים שאינם מחדש תלויים לחלוטין. בגלל ריכוזי מלח גבוהים של חיץ התגובה צמיגות גבוהה של הפתרון trimethylglycine, הם לא יכולים להיות lyophilized בהצלחה עם DNA פולימרז BST, פריימרים LAMP, ו dNTPs. צעד מיוחד נדרש כדי להכין את חיץ הכינון מחדש עם רכיבים אלה. פוטנציאלי תגובת LAMP ניתן לבדוק בריכוזי מלח נמוכים עם נמוך או ללא trimethylglycine. אם קיים מצב תגובה הנגרמת מאותה רגישות זיהוי אבל עם דלת מלח וריכוז trimethylglycine נמוך, מגיב lyophilized רק צריך להיות מחדש עם מים. זה יהיה עוד יותר לפשט את צעדי התגובה.

לאחרונה, וואנג et al. 15 לעומת שנים עשרמבחני LAMP האוס עם ערכת מיקס מאסטר isothermal הממוסחרת ומוצאים את המבחנים בתוך הבית יש תוצאות חיוביות שגויות. במעבדה שלנו, פיתחנו כמה מבחני LAMP לצורך זיהוי של חיידקים שונים ומעולם לא נמצאו תוצאות חיוביות שגויות מבחני בתוך הבית אלה. יתר על כן, בשלבים הראשונים של התפתחות שיטת LAMP, המבחנים נבדקו בשני תמהיל אב שהוכן ללא צורך במיקור חוץ תערובת אמן ממוסחר ואין הבדל נצפה הרגיש והסגולי "המבחנים.

מחקרנו גם מציג מספר שיטות שלא רק יכול לזהות את מוצרי LAMP מבלי לפתוח את צינורות התגובה כדי להקטין את הסבירות של זיהום במעבדת צלב אלא גם יש זמן תהליך קצר יותר לקרוא תוצאות להשוות לשיטת ג'ל אלקטרופורזה. היתרון של שימוש בשיטות איתור אלה ישפר במידה רבה את יכולתנו לבצע את assay במהירות לאבחן אדם עם ג burnetii

בניגוד לשיטות המבוססות PCR שבו thermocycler נדרש, בלוק חימום, אמבט מים או באינקובטור שמירה על טמפרטורה קבועה של כ -60 מעלות צלזיוס הוא כל מה שנדרש עבור assay LAMP. זה הופך את assay מתאים במיוחד בסביבת משאב מוגבל. בניגוד assay LAMP המקורי, DNA פולימרז BST, פריימרים LAMP, ו dNTPs צריך להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. ריאגנטים lyophilized אלה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר מה שהופך אותו אפילו יותר שימושי עבור הגדרת משאב מוגבל שבו קדחת Q הוא אנדמי. המחקר היציב לטווח הארוך של ריאגנטים lyophilized ב 4 ° C, 25 ° C, 37 ° C הוא כרגע מתמשך. בעתיד, היינו רוצים להוכיח כי assay LAMP זה באמצעות ריאגנטים lyophilized יכול לזהות C. burnetii ברגישות דומה לזהשל PCR בסביבה מרחוק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי צי מחקר רפואי מרכז, יחידת עבודת מחקר 6000.RAD1.J.A0310. הדעות המובאות במאמר זה הן של הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את המדיניות הרשמית או עמדת מחלקת הצי, משרד ההגנה, או ממשלת ארצות הברית. ויי-מיי ג'ינג הינו עובד של ממשלת ארה"ב. עבודה זו הוכנה במסגרת תפקידיהם הרשמיים שלה. כותרת 17 USC §105 קובע כי "הגנה על זכויות יוצרים תחת הכותרת הזו אינה זמינה עבור כל עבודה של ממשלת ארצות הברית." הכותרת 17 USC §101 מגדיר יצירת ממשלת ארה"ב כיצירה שהכינה חבר או עובדים שירות צבאי של ממשלת ארה"ב כחלק תפקידיו הרשמיים של אותו האדם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LAMP primers Eurofins MWG operon 10 nmol, salt free Sequence designed by customer
Bst DNA polymerase New England Biolabs M0275L 8 units/ml
10x Thermo pol buffer New England Biolabs B9004S
dNTP mixture New England Biolabs N0447L 10 mM each
Betaine Sigma-Aldrich B0300 5 M, Trimethylglycine
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M3409-1ML 1 M
10x Bluejuice Invitrogen 10816-015 gel loading buffer
SYBR green Invitrogen S7585 10,000x, visualize products in tubes
GelRed Phenix Research Products RGB-4103 10,000x, visualize products in gels
Lyophilized reagents Gene Reach
Hydroxynaphthol blue Fluka 33936-10G
ESEQuant tube scanner Qiagen real-time detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
  2. Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
  3. Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
  4. Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
  5. Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
  6. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
  7. Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
  8. Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
  9. Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
  10. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
  11. Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
  12. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
  13. Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
  14. Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
  15. Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).

Tags

זיהום גיליון 110 Lyophilization LAMP איזו תרמים, קדחת Q DNA גילוי
התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H. W., Ching, W. M. The… More

Chen, H. W., Ching, W. M. The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii. J. Vis. Exp. (110), e53839, doi:10.3791/53839 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter