Abstract
Coxiella burnetii, l'agente che causa la febbre Q, è un batterio intracellulare obbligato. Saggi diagnostici basati sulla PCR sono stati sviluppati per la rilevazione C. DNA burnetii in colture cellulari e campioni clinici. PCR richiede attrezzature specializzate ed estesa formazione degli utenti finali, e quindi non è adatto per il lavoro di routine specialmente in una zona risorse limitate. Abbiamo sviluppato un saggio loop-mediata di amplificazione isotermica (LAMP) per rilevare la presenza di C. burnetii in campioni di pazienti. Questo metodo viene effettuata ad una sola temperatura di circa 60 ° C in un bagnomaria o riscaldamento. La sensibilità di questo test LAMP è molto simile a PCR con un limite di rilevazione di circa 25 copie per reazione. La relazione descrive la preparazione della reazione con reagenti liofilizzati e visualizzazione dei risultati usando blu di idrossinaftolo (HNB) o una lampada UV con colorante fluorescente intercalante nella reazione. I reagenti LAMP erano lyophilized e conservato a temperatura ambiente (RT) per un mese senza perdita di sensibilità di rilevazione. Questo test è particolarmente robusta LAMP perché la preparazione della miscela di reazione non comporta complessi passaggi. Questo metodo è ideale per l'utilizzo in ambienti con risorse limitate, dove la febbre Q è endemica.
Introduction
Il piccolo batterio Gram-negativi Coxiella burnetii è l'agente eziologico della febbre Q, che è una zoonosi in tutto il mondo. A causa della distribuzione a livello mondiale di febbre Q e l'alta infettività di C. burnetii, militari e civili personale statunitense dispiegate all'estero sono a rischio di infezione nelle zone endemiche.
La febbre Q si manifesta in due forme: infezioni acute e croniche. Acuta febbre Q si presenta con sintomi simil-influenzali, l'epatite, o polmonite, ed è di solito una malattia autolimitante con un basso tasso di mortalità. Cronica febbre Q, mentre meno diffuso, si traduce spesso in endocardite, che ha un tasso di mortalità molto più alto se non trattata 1,2. Pertanto, la diagnosi precoce per guidare un trattamento appropriato è fondamentale per la cura del paziente. Reazione a catena della polimerasi (PCR) e in tempo reale PCR quantitativa (qPCR) test sono stati sviluppati per la rilevazione C. DNA burnetii in colture cellulari e campioni clinici 3-5 </ Sup>. Sia PCR e qPCR sono costose e spesso non facilmente disponibili in aree con risorse limitate per il lavoro di routine.
Originariamente descritto da Notomi 6, l'amplificazione isotermica loop-mediata (LAMP) offre un metodo alternativo amplificazione del DNA. LAMP utilizza polimerasi Bst DNA per la sintesi del DNA filone spostamento lungo con i set di primer appositamente progettati che riconoscono almeno sei regioni indipendenti del gene bersaglio. Il vantaggio più significativo di LAMP è che l'amplificazione avviene in condizioni isoterme. Pertanto, è necessario solo un bagno d'acqua, blocco di riscaldamento o di un incubatore. Questo metodo è stato utilizzato per rilevare diversi patogeni rickettsie 7-9. Visualizzazione dei prodotti di DNA amplificati mediante elettroforesi su gel è il metodo più accurato che può differenziare i veri positivi da falsi positivi a causa di amplificazione non specifica. Tuttavia le procedure necessarie per elettroforesi su gel non sono pratici per ar risorse limitateEAS. Diversi metodi alternativi sono stati sviluppati per rilevare i prodotti di reazione. Queste alternative, come torbidità derivante dalla formazione di magnesio pirofosfato 10 o utilizzando un colorante intercalante fluorescente da visualizzare sotto luce UV 11,12 sono più favorevoli di esecuzione di un gel. I reagenti LAMP erano stabile per un mese se conservato a 25 ° C e 37 ° C, che sono temperature ambientali nei paesi tropicali e sub-tropicali, dove la febbre Q è endemica 13.
Un test LAMP stato sviluppato nel nostro laboratorio per rilevare la presenza di C. burnetii in campioni di plasma 14. Qui si descrive un protocollo semplice per la preparazione della miscela di reazione LAMP dai reagenti liofilizzati. I reagenti liofilizzati sono stabili per un mese se conservati a RT. Quando combinato con un metodo di visualizzazione facile, questo è un metodo ideale da utilizzare per la rilevazione C. burnetii in un ambiente risorse limitate.
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Protocol
1. Preparare plasmidi DNA diluizioni come standard per LAMP Reazione
- Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica (OD) a 260 nm per determinare il plasmide (contenente gene target IS1111a di C. burnetii RSA 493) concentrazione di DNA. Un OD 260 di 1 equivale a 50 mg / mL di DNA.
- Convertire la quantità di DNA plasmide nel numero di copie. Poiché la dimensione del plasmide è 6.330 bp, il peso molecolare di questo plasmide è 4,1 x 10 6 g (6.330 bp x 649 g / bp). La concentrazione di DNA del plasmide è 34,2 ng / ml (come determinato dal punto 1.1). 1 ml di questo campione di DNA contiene 34,2 ng di DNA plasmide, pari a 5 x 10 9 copie (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 gx 6,02 x 10 23) di DNA.
- Aggiungere 10 ml di DNA plasmidico (5 x 10 9 copie / ml) a 90 ml di acqua per una diluizione di 10 volte per fare un campione di DNA di 5 x 10 8 copie / ml.
- Ripetere passaggio 1.3 per preparare campioni di DNA di 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1 e 5 x 10 0 copie / ul.
2. Preparare modello di DNA da campioni per la lampada di reazione
- Eseguire l'estrazione del DNA da campioni di plasma umano utilizzando un kit mini DNA commerciale secondo il protocollo del produttore. Utilizzare un totale di 200 campioni microlitri per l'estrazione ed eluire DNA estratto in un volume di 20 ml.
3. Preparare 2x Buffer LAMP Reazione
- Mescolare 200 ml di 10x Pol Buffer, 320 ml di 5 M trimetilglicina, 12 ml di 1 M MgSO 4, 280 ml di miscela dNTP (10 mm ciascuno) e 188 microlitri di acqua per fare 1 ml di tampone 2x LAMP. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi.
4. Eseguire lampada standard di reazione
- Mescolare 12,5 ml di 2x LATampone MP (come preparato al punto 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO 4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M trimetilglicina, 1.4 mM miscela dNTP), 1,2 ml di miscela di primer, 1 ml di polimerasi Bst DNA (8 U / ml), e 5,3 l di acqua per fare miscela di reazione (20 ml) in un tubo di 0,2 ml PCR.
- Aggiungere 5 ml di DNA (dal punto 1 o 2) alla miscela di reazione di 20 microlitri e mescolare bene.
- Chiudere tubo e incubare a 60 ° C per 60 minuti in un bagnomaria o riscaldamento. Questa è la temperatura di reazione ottimale determinata in precedenza.
- Aggiungere 5 ml di 10x tampone di caricamento del gel di interrompere la reazione.
- Carico 5 microlitri di prodotti di reazione di un gel di agarosio al 2% colorato con intercalanti macchia dell'acido nucleico.
- Eseguire gel a 100 V per 35 min in tampone 1x TBE.
- Visualizzare i risultati di raggi UV.
5. Eseguire Reazione lampada con ricostituitoreagenti
- Mescolare 125 ml di 10x Pol Buffer, 200 ml di 5 M trimetilglicina, 7,5 ml di 1 M MgSO 4, 667.5 ml di acqua per fare 1 ml di tampone di ricostituzione. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi.
- Rimuovere i tubi che contengono i reagenti liofilizzati dal sacchetto di alluminio sigillato. Non utilizzare i tubi se la borsa foglio di alluminio non è sigillato o se è danneggiato.
- Aggiungere 20 ml di tampone di ricostituzione in ciascuna provetta per risospendere reagenti liofilizzati.
- Mescolare pipettando tampone su e giù per 5 volte. Date un'occhiata per assicurarsi che i reagenti liofilizzati sono completamente ri-sospesi. La polvere bianca dovrebbe scomparire nel tubo.
- Aggiungere 5 ml di DNA stampo (dal punto 1 o 2) per i reagenti ricostituiti e mescolare bene.
- Chiudere tubo e incubare a 60 ° C per 60 minuti in un bagnomaria o riscaldamento.
- Aggiungere 5 ml di 10x tampone di caricamento del gel di interrompere la reazione.
- Carico 5 ml di reazioneprodotti ad un gel di agarosio al 2% colorato con intercalanti macchia dell'acido nucleico.
- Eseguire gel a 100 V per 35 min in tampone 1x TBE.
- Visualizzare i risultati di raggi UV.
6. Eseguire LAMP Reazione con tampone di ricostituzione contenenti HNB o fluorescente intercalante Dye
- Mescolare 125 ml di 10x Pol Buffer, 200 ml di 5 M trimetilglicina, 7,5 ml di 1 M MgSO 4, 7,5 ml di 20 mm HNB (o 12,5 ml di 100x fluorescente intercalante colorante) e 660 ml (o 655 ml) di acqua a fare 1 ml di tampone di ricostituzione. Miscelare impulso-vortex per 10 secondi.
- Utilizzare il buffer ricostituito preparato nella sezione 6 di ripetere i passi 5.2 - 5.6.
- Visualizzare i risultati ad occhio nudo (reazione contenente HNB) o una luce UV (reazione contenente colorante intercalante fluorescente).
7. Eseguire in tempo reale reazione lampada con tubo Scanner
- Aggiungere 5 microlitri DNA alla reconstitutreagenti ED contenenti colorante fluorescente intercalante, chiudere il tubo e inserirlo allo scanner tubo.
- Impostare temperatura di incubazione a 60 ° C. Misurare la fluorescenza a 520 nm per 60 min.
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Representative Results
I reagenti LAMP liofilizzati all'interno del tubo 0,2 ml contiene polimerasi Bst DNA, primer, e dNTP. 20 microlitri di tampone di ricostituzione è usato per risospendere i reagenti liofilizzati. La Figura 1 mostra i risultati di reazione LAMP su gel di agarosio con reagenti appena preparati e reagenti liofilizzati. Il reagente liofilizzato non riduce la sua attività. Reazioni LAMP preparati da entrambi i reagenti in grado di rilevare 25 copie del DNA stampo. Figura 2 mostra la rilevazione dei prodotti di reazione con HNB o colorante fluorescente intercalante presenti nella reazione. Aggiunta di HNB alla reazione produce un cambiamento di colore visiva dal viola al blu con 25, 50 e 100 copie di DNA stampo presenti nelle reazioni. L'inclusione di colorante intercalante fluorescente nella reazione mostra un segnale di fluorescenza forte con la luce UV quando 25, 50, e 100 copie di modelli di DNA sono presenti. Uno scanner tubo è stato usatoin questo studio per il rilevamento in tempo reale. Questa macchina in grado di eseguire 8 reazioni simultaneamente. La figura 3 mostra l'utilizzo dello scanner tubo di monitorare i segnali di fluorescenza in tempo reale con fluorescente presenza colorante intercalante. I segnali di fluorescenza sono sopra il basale dopo 14, 18, 21, e 23 min con 10 6, 10 4, 10 3, e 100 copie di DNA stampo nelle reazioni.
Figura 1. LAMP Risultati su agarosio gel con i reagenti appena preparati (A) e liofilizzati reagenti (B). Miscele di reazione sono state incubate a 60 ° C per 60 min. (A) Corsia 1, 100 bp ladder; Corsia 2 - 3, 4 - 5, 6 - 7 e 8 - 9 sono reazioni con 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10, e copie di DNA plasmidico. (B) Corsia 10 - 11, 12 - 13, 14 - 15 e 16 - 17 sono reaZIONI con 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10 e 0 copie di DNA plasmide. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. metodi per rilevare LAMP prodotti. HNB (A) o colorante intercalante fluorescente (B) sono stati usati per individuare i prodotti LAMP. Le reazioni sono state effettuate a 60 ° C per 60 min. Corsia 1 a 5, reazioni con 0, 10, 25, 50, e 100 copie di plasmide. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. rilevazione in tempo reale di LAMP prodotti. Le reazioni sono state effettuate a 60 ° C per 60 min. Reazioni con 10 6 (nero), 10 4 (rosso), 10 3 (verde), 100 (giallo), 10 (blu), 1 (arancione) e 0 (marrone e marrone chiaro) copie del plasmide. Tre i rilevamenti sono stati eseguiti in modo indipendente. Erano altamente riproducibile. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In precedenza, abbiamo sviluppato un saggio LAMP sensibile e specifico mira l'elemento di inserimento IS1111a 14. L'elemento IS1111 è stato scelto perché è altamente conservata tra i diversi ceppi di C. burnetii e il suo alto numero di copie (7-110) nei batteri (Klee 2006). I nostri risultati hanno mostrato che LAMP può rilevare circa 25 copie dell'elemento IS1111, che può correlare il meno una copia cromosomale di Coxiella DNA. In questo studio, polimerasi Bst DNA, primer lampada e dNTP state liofilizzate e confezionati in un sacchetto di carta stagnola con zip. La sensibilità di questi reagenti liofilizzati rimane a 25 copie; simile ai reagenti appena preparati per almeno un mese se conservato a temperatura ambiente. E 'molto importante assicurarsi che la borsa foglio di alluminio è adeguatamente sigillato prima di aprirlo. Non utilizzare i tubi se la borsa foglio di alluminio non è sigillato o se è danneggiato. Ciò può causare la reidratazione of i reagenti liofilizzati che porta alla perdita della sua reattività. L'altro punto critico è la risospensione dei reagenti liofilizzati con tampone di ricostituzione. La reazione lampada non funziona correttamente con i reagenti che non sono completamente ri-sospesi. A causa delle alte concentrazioni di sale del tampone di reazione e l'alta viscosità della soluzione trimetilglicina, non possono essere liofilizzate successo con polimerasi Bst DNA, primer LAMP, e dNTP. Un passo speciale è necessaria per preparare il buffer di ricostituzione con tali componenti. Potenzialmente la reazione lampada può essere testato a basse concentrazioni di sale a basso o nullo trimetilglicina. Se vi è una condizione reazione che ha la stessa sensibilità di rilevamento, ma con bassa concentrazione di sale e bassa trimetilglicina, il reagente liofilizzato deve solo essere ricostituito con acqua. Ciò semplificare ulteriormente le fasi di reazione.
Recentemente, Wang et al. 15 rispetto dodicisaggi LAMP-house con il commercializzato isotermico kit Master Mix ed ha trovato le analisi in-house sono risultati falsi-positivi. Nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato diversi saggi lampada per la rilevazione di batteri diversi e non hanno mai trovato risultati falsi positivi in questi test in-house. Inoltre, nelle fasi iniziali dello sviluppo del metodo LAMP, i saggi sono stati testati sia in-house preparato mix master e master mix commercializzato e nessuna differenza è stata osservata nella sensibilità e specificità dei saggi '.
Il nostro studio presenta anche diversi metodi che non solo in grado di rilevare i prodotti LAMP senza aprire le provette di reazione per diminuire la probabilità di contaminazione incrociata di laboratorio, ma hanno anche un tempo di processo più breve per leggere risultati si raffrontano con metodo gel elettroforesi. Il vantaggio di utilizzare questi metodi di rilevamento permetterà di migliorare notevolmente la nostra capacità di eseguire rapidamente il test e diagnosticare un individuo con C. burnetii
A differenza dei metodi basati sulla PCR in cui è necessario un termociclatore, un blocco di riscaldamento, bagno d'acqua o incubatore mantenendo una temperatura costante di circa 60 ° C è tutto ciò che è necessario per il test LAMP. Questo rende il saggio particolarmente adatto in ambiente risorse limitate. A differenza del saggio originale LAMP, polimerasi Bst DNA, primer lampada e dNTP devono essere conservati a -20 ° C. Questi reagenti liofilizzati possono essere conservati a temperatura ambiente, il che rende ancora più utile per un ambiente di risorse limitate, dove la febbre Q è endemica. Lo studio di stabilità a lungo termine dei reagenti liofilizzati a 4 ° C, 25 ° C e 37 ° C è attualmente in corso. In futuro, vorremmo dimostrare che questo test LAMP utilizzando reagenti liofilizzati in grado di rilevare C. burnetii con sensibilità simile a quelladi PCR in un ambiente remoto.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal Naval Medical Research Center, la ricerca unità di lavoro 6000.RAD1.J.A0310. Le opinioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente la politica ufficiale o la posizione del Dipartimento della Marina, Dipartimento della Difesa, o il governo degli Stati Uniti. Wei-Mei Ching è un dipendente del governo degli Stati Uniti. Questo lavoro è stato preparato come parte dei suoi doveri d'ufficio. Titolo 17 USC §105 prevede che 'La protezione del copyright sotto questo titolo non è disponibile per qualsiasi lavoro del governo degli Stati Uniti.' Titolo 17 USC §101 definisce un lavoro del governo degli Stati Uniti come un lavoro preparato dal membro del servizio militare o dipendente del governo degli Stati Uniti, come parte delle funzioni ufficiali di quella persona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10x Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000x, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000x, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
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