Abstract
Coxiella burnetii, l'agent responsable de la fièvre Q, est une bactérie intracellulaire obligatoire. Des dosages diagnostiques basées sur la PCR ont été développées pour détecter C. ADN burnetii dans des cultures de cellules et d' échantillons cliniques. PCR nécessite un équipement spécialisé et une formation approfondie de l'utilisateur final, et par conséquent, il ne convient pas pour le travail de routine en particulier dans une zone de ressources limitées. Nous avons mis au point une boucle à médiation par une amplification isotherme (LAMP) essai pour détecter la présence de C. burnetii dans des échantillons de patients. Ce procédé est effectué à une seule température d'environ 60 ° C dans un bain-marie ou un bloc chauffant. La sensibilité de ce dosage de la lampe est très similaire à la PCR avec une limite de détection d'environ 25 copies par réaction. Ce rapport décrit la préparation de la réaction en utilisant des réactifs lyophilisés et la visualisation des résultats en utilisant le bleu hydroxynaphthol (HNB) ou une lampe UV avec colorant fluorescent intercalant dans la réaction. Les réactifs LAMP étaient lyophilized et conservé à température ambiante (TA) pendant un mois, sans perte de sensibilité de détection. Ce test LAMP est particulièrement robuste car la préparation du mélange réactionnel ne comporte pas d'étapes complexes. Cette méthode est idéale pour une utilisation dans des environnements à ressources limitées où la fièvre Q est endémique.
Introduction
Le petit Gram négatif bactérie Coxiella burnetii est l'agent causal de la fièvre Q, qui est une zoonose dans le monde entier. En raison de la distribution mondiale de la fièvre Q et la forte infectivité de C. burnetii, les militaires et les civils américains déployés à l' étranger sont à risque d'être infectés dans les zones endémiques.
La fièvre Q se manifeste sous deux formes: les infections aiguës et chroniques. La fièvre Q aiguë se présente avec des symptômes semblables à la grippe, l'hépatite, ou la pneumonie, et est habituellement une maladie auto-limitation avec un faible taux de mortalité. La fièvre Q chronique, alors que moins répandue, se traduit souvent par une endocardite, qui a un taux de mortalité beaucoup plus élevé si non traitée 1,2. Par conséquent, le diagnostic précoce pour guider un traitement approprié est essentiel pour les soins aux patients. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) et en temps réel de PCR quantitative (qPCR) essais ont été développés pour détecter C. ADN burnetii dans des cultures cellulaires et des échantillons cliniques 3-5 </ Sup>. Les deux PCR et qPCR sont coûteuses et souvent pas facilement disponibles dans les zones de ressources limitées pour le travail de routine.
Initialement décrit par Notomi 6, isothermes amplification de boucle médiée (LAMP) offre une méthode d'amplification d' ADN alternative. Lampe utilise l' ADN polymerase Bst pour la synthèse d'ADN par déplacement de brin ainsi que des ensembles d' amorces spécialement conçues qui reconnaissent au moins six régions indépendantes du gène cible. L'avantage le plus important de lampes est que l'amplification se produit dans des conditions isothermes. Par conséquent, seul un bain d'eau, bloc chauffant ou un incubateur est nécessaire. Cette méthode a été utilisée pour détecter plusieurs pathogènes rickettsies 7-9. La visualisation des produits d'ADN amplifiés par électrophorèse sur gel est la méthode la plus précise qui permet de différencier les vrais positifs de faux positifs dus à une amplification non spécifique. Toutefois, les procédures impliquées dans l'électrophorèse sur gel ne sont pas pratiques pour les ar des ressources limitéeseas. Plusieurs méthodes ont été développées pour détecter les produits de la réaction. Ces alternatives, telles que la turbidité dérivée de la formation de pyrophosphate de magnésium 10 ou à l' aide d' un colorant fluorescent intercalant pour être visualisé sous lumière UV 11,12 sont plus favorables que l' exécution d' un gel. Les réactifs LAMP ont été stables pendant un mois lorsqu'il est conservé à 25 ° C et 37 ° C, qui sont des températures ambiantes dans les pays tropicaux et sub-tropicales où la fièvre Q est endémique 13.
Un essai de lampe a été développé dans notre laboratoire pour détecter la présence de C. burnetii dans des échantillons de plasma 14. Nous décrivons ici un protocole simple pour la préparation du mélange réactionnel de lampe à partir des réactifs lyophilisés. Les réactifs lyophilisés sont stables pendant un mois lorsqu'il est conservé à température ambiante. Lorsqu'il est combiné avec une méthode de visualisation facile, ceci est une méthode idéale à utiliser pour détecter C. burnetii dans un cadre de ressources limitées.
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Protocol
1. Préparer ADN plasmidique Dilutions comme standard pour LAMP Réaction
- Utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique (DO) à 260 nm pour déterminer le plasmide (contenant IS1111a du gène cible de C. burnetii RSA 493) la concentration d'ADN. Une DO260 de 1 correspond à 50 pg / pl d'ADN.
- Convertir la quantité d'ADN plasmidique dans le nombre de copies. Étant donné que la taille du plasmide est de 6330 pb, le poids moléculaire de ce plasmide est de 4,1 x 10 6 g (6,330 bp x 649 g / pb). La concentration d'ADN du plasmide est de 34,2 ng / pl (tel que déterminé à l'étape 1.1). 1 ul de cet échantillon d'ADN contient 34,2 ng d'ADN de plasmide, ce qui équivaut à 5 x 10 9 copies (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 x 10 6,02 gx 23) de l' ADN.
- Ajouter 10 ul d'ADN plasmidique (5 x 10 9 copies / pl) à 90 pl d'eau pour une dilution de 10 fois pour obtenir un échantillon d'ADN de 5 x 10 8 copies / ul.
- Répétez l' étape 1.3 pour préparer des échantillons d' ADN de 5 x 10 7, 5 x 10 6 à 5 x 10 5 5 x 10 4 à 5 x 10 3 à 5 x 10 2 à 5 x 10 1 et 5 x 10 0 copies / ul.
2. Préparer Modèle d'ADN à partir d'échantillons pour LAMP Reaction
- Réaliser une extraction d'ADN à partir d'échantillons de plasma humain en utilisant un kit d'ADN de mini-utilitaire selon le protocole du fabricant. Utilisez un total de 200 échantillons ul pour l'extraction et éluer l'ADN extrait dans un volume de 20 pi.
3. Préparer 2x tampon de réaction LAMP
- Mélanger 200 pi de 10x Pol Buffer, 320 pi de 5 M trimethylglycine, 12 pi de 1 M MgSO 4, 280 pi de mélange de dNTP (10 mM chacun) et 188 pi d'eau pour faire 1 ml de tampon 2x LAMP. Mélanger par impulsions tourbillonnement pendant 10 secondes.
4. Effectuez standard LAMP Réaction
- Mélanger 12,5 pl de 2x LATampon MP (tel que préparé à l' étape 3; 40 mM de Tris-HCl (pH 8,8), KCl 20 mM , du sulfate de magnésium 16 4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% de Triton X-100, 1,6 M triméthylglycine, 1,4 mM de mélange de dNTP), 1,2 pi de mélange d' amorces, 1 pi d'ADN polymerase Bst (8 U / ul) et 5,3 ul d'eau pour rendre le mélange réactionnel (20 ul) dans un tube PCR de 0,2 ml.
- Ajouter 5 pi d'ADN (de l'étape 1 ou 2) au mélange de réaction de 20 ul et bien mélanger.
- Fermer le tube et incuber à 60 ° C pendant 60 min dans un bain d'eau ou d'un bloc de chauffage. Ceci est la température de réaction optimale déterminée au préalable.
- Ajouter 5 ul de 10 x tampon de charge de gel pour terminer la réaction.
- Charge 5 pi de produits de réaction sur un gel d'agarose 2% coloré avec intercalation colorant d'acide nucléique.
- Exécutez gel à 100 V pendant 35 min dans un tampon 1x TBE.
- Visualisez les résultats par la lumière UV.
5. Effectuez LAMP Réaction avec ReconstituéRéactifs
- Mélanger 125 pi de tampon 10x Pol, 200 pi de 5 M triméthylglycine, 7,5 ul de 1 M MgSÛ4, 667,5 pi d'eau pour faire 1 ml de tampon de reconstitution. Mélanger par impulsions tourbillonnement pendant 10 secondes.
- Retirer les tubes qui contiennent les réactifs lyophilisés du sachet en feuille d'aluminium scellée. Ne pas utiliser les tubes si le sac de papier d'aluminium ne soit pas scellé ou si elle est endommagée.
- Ajouter 20 pi de tampon de reconstitution dans chaque tube pour remettre en suspension les réactifs lyophilisés.
- Mélanger par pipetage tampon de haut en bas 5 fois. Jetez un coup d'oeil pour vous assurer que les réactifs lyophilisés sont complètement remis en suspension. La poudre blanche devrait disparaître dans le tube.
- Ajouter 5 ul de matrice d'ADN (de l'étape 1 ou 2) pour les réactifs reconstitués et bien mélanger.
- Fermer le tube et incuber à 60 ° C pendant 60 min dans un bain d'eau ou d'un bloc de chauffage.
- Ajouter 5 ul de 10 x tampon de charge de gel pour terminer la réaction.
- Charge 5 pi de réactionproduits à un gel d'agarose à 2% coloré avec intercalation colorant d'acide nucléique.
- Exécutez gel à 100 V pendant 35 min dans un tampon 1x TBE.
- Visualisez les résultats par la lumière UV.
6. Effectuer LAMP Réaction avec tampon de reconstitution contenant HNB ou fluorescent intercalant Dye
- Mélanger 125 ul de 10 x Pol tampon, 200 ul de 5 M triméthylglycine, 7,5 ul de 1 M MgSO 4, 7,5 pi d'mM HNB 20 (ou 12,5 pi de 100x colorant fluorescent intercalant) et 660 ul (ou 655 pi) d'eau à faire 1 ml de tampon de reconstitution. Mélanger par impulsions tourbillonnement pendant 10 secondes.
- Utilisez le tampon reconstitué préparé à l'article 6 de répéter les étapes 5.2 - 5.6.
- Visualisez les résultats par l'oeil nu (réaction contenant HNB) ou une lumière UV (réaction contenant colorant fluorescent intercalant).
7. Effectuer en temps réel LAMP Réaction avec Tube Scanner
- Ajouter 5 ul ADN à la reconstitutréactifs és contenant colorant fluorescent intercalant, fermer le tube et l'insérer dans le scanner de tube.
- Régler la température d'incubation à 60 ° C. Mesurer la fluorescence à 520 nm pendant 60 min.
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Representative Results
Les réactifs LAMP lyophilisés l' intérieur du tube de 0,2 ml contient Bst ADN polymérase, des amorces et des dNTP. 20 ul de tampon de reconstitution est utilisée pour remettre en suspension les réactifs lyophilisés. La figure 1 montre les résultats de la réaction LAMP sur des gels d' agarose avec des réactifs fraîchement préparés et des réactifs lyophilisés. Le réactif lyophilisé ne réduit pas son activité. Les réactions de LAMP préparées par les réactifs permettant de détecter 25 copies de l' ADN matrice. La figure 2 montre la détection des produits de réaction avec HNB ou fluorescent intercalant colorant présent dans la réaction. Addition de HNB à la réaction produit un changement visuel de couleur du violet au bleu avec 25, 50 et 100 copies de matrice d'ADN présents dans les réactions. L'inclusion de colorant fluorescent intercalant dans la réaction montre un signal de forte fluorescence à la lumière UV quand 25, 50 et 100 copies de matrices d'ADN sont présents. Un scanner de tube a été utilisédans cette étude pour la détection en temps réel. Cette machine peut effectuer 8 réactions simultanément. La figure 3 montre l' utilisation du scanner de tube pour surveiller les signaux de fluorescence en temps réel avec fluorescent présence intercalation de colorant. Les signaux de fluorescence sont supérieurs à la ligne de base après 14, 18, 21 et 23 min avec 10 6, 10 4, 10 3 et 100 copies de matrice d'ADN dans les réactions.
Figure 1. Résultats LAMP sur gel d' agarose avec des réactifs fraîchement préparée (A) et lyophilisé réactifs (B). Les mélanges réactionnels ont été incubés à 60 ° C pendant 60 min. (A) Lane 1, 100 pb échelle; Lane 2 - 3, 4 - 5, 6 - 7 et 8 - 9 sont des réactions avec 2,5 x 10 3 2,5 x 10, 2, 2,5 x 10, et pas de copies d'ADN de plasmide. (B) Voie 10 - 11, 12 - 13, 14 - 15 et 16 - 17 sont reactions avec 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2,5 x 10, et 0 copies d'ADN plasmidique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Méthodes pour détecter LAMP produits. HNB (A) ou colorant fluorescent intercalant (B) ont été utilisés pour détecter les produits LAMP. Les réactions ont été effectuées à 60 ° C pendant 60 min. Lane 1 à 5, réactions avec 0, 10, 25, 50 et 100 copies du plasmide. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 3. Détection en temps réel des produits LAMP. Les réactions ont été réalisées à 60 ° C pendant 60 min. Les réactions avec 10 6 (noir), 10 4 (rouge), 10 3 (vert), 100 (jaune), 10 (bleu), 1 (orange) et 0 (brun et brun clair) copies du plasmide. Trois détections ont été réalisées de façon indépendante. Ils étaient hautement reproductibles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Auparavant, nous avons développé un test LAMP sensible et spécifique ciblant l'élément d'insertion IS1111a 14. L'élément IS1111 a été choisi parce qu'il est hautement conservée entre les différentes souches de C. burnetii et son nombre élevé de copies (7-110) dans les bactéries (Klee 2006). Nos résultats ont montré que la lampe peut détecter environ 25 copies de l'élément IS1111, qui peut en corrélation avec aussi peu que une copie chromosomique de Coxiella ADN. Dans cette étude, l' ADN polymérase Bst, amorces LAMP et dNTP ont été lyophilisés et emballés dans un sac en papier d'aluminium zippé. La sensibilité de ces réactifs lyophilisés reste à 25 exemplaires; semblables aux réactifs fraîchement préparées pendant au moins un mois lorsqu'il est stocké à température ambiante. Il est très important de vous assurer que le sac de papier d'aluminium est correctement scellé avant de l'ouvrir. Ne pas utiliser les tubes si le sac de papier d'aluminium ne soit pas scellé ou si elle est endommagée. Cela peut provoquer la réhydratation of réactifs lyophilisés ce qui conduit à la perte de sa réactivité. L'autre étape essentielle est la re-suspension des réactifs lyophilisés avec un tampon de reconstitution. La réaction de LAMP ne fonctionnera pas correctement avec des réactifs qui ne sont pas entièrement remis en suspension. En raison des concentrations élevées en sel du tampon de réaction et la viscosité élevée de la solution de triméthylglycine, ils ne peuvent pas être lyophilisé avec succès avec l' ADN polymérase de Bst, les amorces de la lampe, et des dNTP. Une étape particulière est nécessaire pour préparer le tampon de reconstitution avec ces composants. Potentiellement la réaction de LAMP peut être testée à des concentrations faibles en sel avec peu ou pas trimethylglycine. S'il existe une condition de réaction qui a la même sensibilité de détection, mais avec une faible concentration en sel et triméthylglycine faible, le réactif lyophilisé ne doit être reconstituée avec de l'eau. Cela permettra également de simplifier les étapes de réaction.
Récemment, Wang et al. 15 comparé douzeessais LAMP -House avec le kit isothermes commercialisé Master Mix et a trouvé les tests internes ont des résultats faussement positifs. Dans notre laboratoire, nous avons développé plusieurs essais LAMP pour la détection de bactéries différentes et n'a jamais trouvé des résultats faussement positifs dans ces tests en interne. En outre, dans les premiers stades du développement de la méthode LAMP, les essais ont été testés à la fois en interne préparé master mix et master mix commercialisé et aucune différence n'a été observée dans la sensibilité et la spécificité des tests.
Notre étude présente également plusieurs méthodes qui peuvent non seulement détecter les produits LAMP sans ouvrir les tubes de réaction pour diminuer la probabilité de contamination laboratoire de croix, mais ont aussi un temps de traitement plus court pour lire les résultats se comparent à la méthode d'électrophorèse sur gel. L'avantage d'utiliser ces méthodes de détection permettra d' améliorer grandement notre capacité à effectuer rapidement le dosage et diagnostiquer un individu avec C. burnetii
Contrairement aux méthodes basées sur la PCR où un thermocycleur est nécessaire, un bloc de chauffage, bain d'eau ou incubateur maintenant une température constante d'environ 60 ° C est tout ce qui est nécessaire pour le test LAMP. Cela rend le dosage particulièrement adapté dans un cadre de ressources limitées. Contrairement à l'essai d' origine LAMP, Bst ADN polymérase, amorces LAMP et dNTPs doivent être stockés à -20 ° C. Ces réactifs lyophilisés peuvent être stockés à température ambiante ce qui le rend encore plus utile pour un cadre de ressources limitées où la fièvre Q est endémique. L'étude de stabilité à long terme des réactifs lyophilisés, à 4 ° C, 25 ° C et 37 ° C, est actuellement en cours. À l'avenir, nous aimerions démontrer que ce test LAMP en utilisant des réactifs lyophilisés peut détecter C. burnetii avec une sensibilité similaire à cellede la PCR dans un cadre à distance.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par Naval Medical Research Center, unité de recherche de travail 6000.RAD1.J.A0310. Les opinions exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement la politique ou la position officielle du ministère de la Marine, Département de la Défense, ou le gouvernement des États-Unis. Wei-Mei Ching est un employé du gouvernement des États-Unis. Ce travail a été préparé dans le cadre de ses fonctions officielles. Titre 17 USC §105 prévoit que «la protection des droits d'auteur sous ce titre ne sont pas disponibles pour tous les travaux du gouvernement des États-Unis.» Titre 17 USC §101 définit un travail du gouvernement des États-Unis comme un travail préparé par un membre du service militaire ou employé du gouvernement américain dans le cadre de fonctions officielles de cette personne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10x Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000x, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000x, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al.
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
