Introduction
Glycolipider, glycoproteiner, proteoglycaner og glykosaminoglycaner udgør de fire vigtigste klasser af komplekse, heterogene kulhydrater kollektivt kendt som glykaner. Som allestedsnærværende og integrerede dele af plasmamembranen, glycocalyx, og ekstracellulær matrix og væsker, glycaner deltage i så forskellige biokemiske processer som endocytose, intracellulær transport, cellemotilitet, signaltransduktion, molekylær genkendelse, receptoraktivering, celleadhæsion, værtspatogene interaktion , intercellulære kommunikation, immunosurveillance, og immunrespons indvielse. 1 til stede i næsten alle områder af livet, enzymer kaldet glycosyltransferaser der bygger glycan polymerer handle i tandem med glycosidhydrolaser (også kendt som glykosidaser, som nedbryder glycaner) at opføre, remodel, og i sidste ende producere færdigbehandlet glycan polymerer 2. Selv om hver glycosyltransferase kan operere på forskellige glycokonjugater, en glycosyltransferasegenerelt skabes en linkage- og anomer-specifik glycosidbinding ved at overføre monosaccharidet del af en bestemt aktiveret nukleotid sukker donor (f.eks BNP-fucose) til en bestemt kategori af nukleofile acceptorer (f.eks et lipid, polypeptid, nukleinsyre, eller dyrkning oligosaccharid). Det er blevet anslået, at mere end 50% af proteiner (især membran og sekretoriske proteiner) er posttranslationelt modificeret ved glykosylering 3 Rudimentære kombinatoriske beregninger giver en forståelse for den betydelige variation, alsidighed, og specificitet indrømmes glycoproteiner ved glykosylering.; for eksempel, hvis et polypeptid substrat har kun 10 glycosyleringssteder og hvert sted kan danne en glycosidbinding med 1 af kun 3 forskellige monosaccharid reducerende ender, så i princippet den endelige glycoprotein kan antage 3 10 = 59.049 forskellige identiteter. I glycoproteiner, glycosidbindinger almindeligvis dannes med sidekæden nitrogen of asparaginrester i sekvensen Asn-X-Ser / Thr (X kan være enhver aminosyre bortset fra prolin), hvilket gav N -glycans 2 og sidekæde-hydroxyler af serin og threoninrester til opnåelse O -glycans 4. Sammensætningen af en celles glycome (dvs. dens supplement af glycosylering produkter) er unik og begrænset, fordi, med få undtagelser, glycosyltransferaser udviser streng donor, acceptor, og kobling specificitet. 5 vigtige og rigelige blodplasma glycoproteiner lider afvigende glycosylering som en downstream konsekvens for unormal glycosyltransferase ekspression og aktivitet på grund af mange patologiske tilstande, især cancer og inflammatoriske sygdomme. 6-24
Hovedsageligt på grund af epigenetiske faktorer, den glycome er betydeligt mere forskelligartet, dynamisk og kompleks end proteom og transkriptomet. 25,26 Mens ca. 1% af det mammale genom koder formationen, modifikations- ogsamling af glykaner, til 27 glycosylerings foregår på en ikke-template-drevet måde-en markant kontrast polypeptid og nukleinsyre biosyntese. Samspillet mellem den relative mængde og aktivitet af glycosyleringsenzymer og sådanne miljømæssige faktorer som næringsstoffer og forløber tilgængelighed i sidste ende bestemmer naturen, sats, og omfanget af glycosylering. 5,28 embryogenese (f.eks, beslutsomhed og differentiering), cellulær aktivering, og progression gennem cellecyklus indflydelse genekspression (dvs. transkription og translation) og ændre identiteten og mængden af tilgængelige glycosyltransferaser, hvis aktivitet er den umiddelbare opstrøms determinant af cellens glycan profil. Fordi (nogle af) proliferative, lim, og invasive egenskaber af kræftceller ligner almindelige embryogene celler, specifikke ændringer i glycan biosynteseveje (f.eks forløber ophobning, dereguleret udtryk, aberrant modifikation, strukturel trunkering, eller en ny formation) tjener som universelle kræft biomarkører, der indikerer forskellige stadier af tumordannelse, progression, migration og invasion 29 Selv glykosylering er meget kompleks, åbenbart kun få ændringer i glykosylering kan aktivere carcinogenese og metastase.; tilsyneladende, visse "afvigende" glycosylering produkter faktisk gavne kræftceller ved at give dem mulighed for at unddrage sig immune anerkendelse og overleve de krav, migration i ugæstfrie intravaskulære og metastatiske miljøer. 28,30,31 Ikke overraskende har eksperimenter vist, at forstyrre eller forhindre mønstre af ændret genekspression og afvigende glycan dannelse kan standse tumorigenese. 29 ikke desto mindre afvigende glycaner påvist i en biovæske prøve (fx urin, spyt, og blodplasma eller serum) kan ikke være direkte indikatorer for kræft (eller anden sygdom), men snarere nedstrøms resultaterne af subtile endnu betydeligændringer i immunsystemet eller kvantificerbare forgreninger af en skadelig tilstand i et uforudsigeligt organ. 32
Selv om de giver universel oplysninger om glycome, mange molekylære interaktion-baserede Glycomics teknikker (f.eks lektin / antistof arrays og metaboliske / kovalente mærkning) afhænger af påvisning af hele glykanstrukturer og giver ikke detaljeret strukturel information om de enkelte glykaner. I skærende kontrast, kan massespektrometri (MS) hjælpe med at identificere og kvantificere de enkelte glykanstrukturer og afslører sådanne strukturel information som bindingssteder til polypeptid kerner. Dereguleret ekspression eller aktivitet af kun én glycosyltransferase kan starte en kaskade af skadelige molekylære begivenheder i flere glycosyleringsveje. Fordi hver glycosyltransferase kan operere på mere end én glycokonjugat substrat og på tværs af forskellige voksende glycan polymerer, deregulerede biosyntetiske kaskader giver uforholdsmæssignelt øgede mængder af kun én glycan produkt men flere heterogene klasser af afvigende glycaner i intra- eller ekstracellulære væsker. 33 Sådanne unikke afvigende glycaner betragtes undertiden upraktisk som biomarkører for kræft eller andre glycan-affektive patologier fordi sammenlignet med den store pool af velreguleret glycaner, disse afvigende glycaner udgør en meget lille fraktion, der kan ofte forblive upåviselig selv af sådanne meget følsomme teknikker som massespektrometri. For eksempel i intra- og ekstracellulære legemsvæsker, kan den brede protein-koncentration spektrum (som strækker sig otte størrelsesordener) forhindre detektering af knappe glycoproteiner, der er maskeret af de mere udbredte arter. 32 Herudover bestemmelse glycosyltransferase aktivitet er fortsat en betydelig praktisk og teoretisk udfordring, fordi mange glycosyltransferaser er fraværende i kliniske kropsvæsker eller bliver inaktive ex vivo. Trods vanskeligheden ved consistently påvisning og kvantificering ultra-små mængder af unikke hele glykaner, har udøvere af massespektrometri gjort enorme fremskridt i retning af at ansætte intakte glycaner som kliniske markører. Vi har for nylig udviklet en komplementær tilgang til analyse af intakte glycaner at ansætte GC-MS, letter påvisning af alle konstituerende gren-point og sammenkædning-specifikke monosaccharider ( "glycan knuder"), der tilsammen give unikke til hver glycan og i mange sager direkte tjene som molekylære surrogater, der kvantificerer den relative aktivitet af den skyldige glycosyltransferase (s).
Siden sin første rapporterede direkte anvendelse til glycan analyse i 1958, har gaskromatografi (GC) bevist en kraftfuld teknik til at analysere pr-methylerede mono- og disaccharider, 34 bestemme deres anomericity og absolut konfiguration, og adskille dem til efterfølgende massespektrometrisk analyse. 35 mellem 1984 og 2007, Ciucanu og kollegerindført og raffineret en fast-fase glycan permethylering teknik, der beskæftigede natriumhydroxid og iodmethan, efterfulgt af væske / væske ekstraktion af permethylerede glycaner ved hjælp af vand og chloroform. 35,36 Mellem 2005 og 2008, Kang og medarbejdere integreret en tidsbesparende tur -søjle tilgang til permethylering trin. 37,38 i 2008 Goetz forskergruppen udtænkt en kvantitativ fastfase permethylering glycan-profilering metoden ved hjælp matrix-assisteret laser desorption-ionisering (MALDI) massespektrometri til at sammenligne og potentielt skelne invasive og non -invasive brystkræftceller, 39 derefter, i 2009, Goetz teamet kombineret enzymatiske og teknikker kemiske udslip at spalte O -glycans fra intakte glycoproteiner i et stærkt alkalisk fastfase permethylering ordningen 40 Selv om Goetz procedure lettet samtidig permethylering og kemiske udslip. af O -glycans, blev det kun anvendes på forhånd isoleret glycoproteiner. Vi ændret denne teknik i 2013 og tilpasset det til hele ufraktionerede kropsvæsker og homogeniserede vævsprøver ved inkorporering trifluoreddikesyre (TFA) hydrolyse, reduktion, og acetylering trin. 33 Disse yderligere trin også frigive glycaner fra glycolipider og N-forbundet glycaner fra glycoproteiner og konvertere dem i delvist denatureret alditolacetater (PMAAs, figur 1), hvis særprægede methylering-og-acetyleringsniveauer mønstre lettere ved GC-MS og entydigt karakterisere de indgående glycan knudepunkter i den oprindelige intakt glycan polymer 41 (figur 2). 33 i sidste ende, dette procedure producerer en sammensat portræt af alle glycaner i en kompleks biovæske baseret på direkte, relativ kvantificering af unikke glycan funktioner som "kerne fucosylering", "6-sialylering", "halverer GlcNAc", og "beta 1-6 forgrening" - hver stammer fra en enkelt GC-MS chromatographic højdepunkt. Denne artikel præsenterer yderligere optimering af permethylering, acetylering, isolation og oprydning etaper sammen med forbedringer i den tilstand af relativ kvantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Advarsel: Undgå hud / øjenkontakt med nogen af de anvendte reagenser i dette eksperiment. Ved eksponering skylles grundigt det berørte område med vand og straks søge lægehjælp.
1. permethylering og Glycan Extraction
- kolonne Fremstilling
- Få så mange mikrofuge spinkolonne enheder som de prøver, der skal analyseres. Break og tag plast reservoir rør caps. Placer en mikrofuge mini filter i hvert reservoir rør. Placer de samlede mikrofugerør spin-søjler (indeholdende mini filtre) i et mikrocentrifugerør rack.
- Opnå en bestand af natriumhydroxid (NaOH) kugler (20-40 mesh). Overfør nogle NaOH til en lille vejer båd eller, hvis luftfugtigheden er årsag sammenklumpning, en varm porcelæn mørtel som arbejdslager af NaOH. Undgå at bruge klumper af NaOH eller knust / pulveriseret NaOH-perler.
Advarsel: NaOH er en potent toksin og ætsende base. Skyl udsat hud / øjnene med vand i 15 min. ThorougHly rense arbejdsbord efter afslutning af forsøget. - Ved hjælp af en lille skovl eller spatel, overføre NaOH perler fra arbejdslager at fylde mikrofugerør mini filtre med NaOH op til første ydre facet (~ 5 mm under randen). Tryk de fyldte mikrofugerør filtre på bænken-top til at pakke / kondensere NaOH perlerne.
Bemærk: I hele dette eksperiment, for at minimere overdreven vandabsorption ved hygroskopiske NaOH perler, opretholde niveauet af eventuelle tilsatte væsker (f.eks, acetonitril, dimethylsulfoxid, analytopløsning) over overfladen af NaOH søjlepakningen og begrænse direkte kontakt med luft. - Få en bestand af acetonitril (ACN). Overfør ~ 350 pi ACN til hver NaOH-pakket mikrofuge mini filter. Hold NaOH neddykket under ACN og fjerne store luftbobler ved omrøring med et tip-krympet gel-loading pipettespids.
Advarsel: Acetonitril er et brandfarligt irriterende. - Kolonne Centrifugering
- Arrangere mikrofugerør kolonnerne symmetrisk inde i en centrifuge; bruge en balance rør om nødvendigt. Undgå at spilde NaOH granulat inde i centrifugen. Luk centrifugen låg.
- Centrifuger søjler (indeholdende NaOH og ACN) for ~ 15 sekunder ved 2.400 x g.
- Ved afslutningen af centrifugering, fjerne mikrofuger kolonner fra centrifugen, og kassér ACN til et farligt affaldsbeholder. Hold NaOH kolonnen pakning intakt.
- Tilføj ~ 350 pi dimethylsulfoxid (DMSO) til hver NaOH-pakket mikrofuge mini filter. Hold NaOH neddykket under DMSO og fjerne eventuelle store luftbobler med en pipettespids. Som tidligere beskrevet, centrifugeres kolonner for ~ 15 sekunder ved 2.400 x g, og kassér DMSO samtidig holde NaOH pakning intakt.
Advarsel: DMSO er et mutagen og lokalirriterende og er let absorberes gennem huden. - Sæt alle mikrofugerør mini filtre med propperne indgår i spin-filterkit. Overfør ~ 350 pi DMSO til hver NaOH-pakket mikrofuge mini filter og bruge en 200 pi pipettespids for at fjerne luftbobler i NaOH pakning, således at DMSO når ud til alle regioner inden derefter NaOH pakning. Undgå knusning eller uforholdsmæssigt skrabe NaOH-perler; NaOH pulver er uønsket. Afslut dette trin så hurtigt som muligt.
- Fremstilling af Plasma Quality Control (QC) Prøve (s)
Bemærk: For at sikre ensartede resultater på tværs af eksperimentelle partier, overveje at bruge mindst en portion af en prøve taget fra en stor, homogen masse samling af det biologiske materiale af interesse, der skal analyseres i hvert parti. For eksempel, hvis analyse blodplasma, bruge alikvot (er) af en bulk samling af blodplasma som QC prøve (r) i hvert parti. Proces QC prøverne på samme måde som ukendte prøver.- Centrifuger en bestand prøve af QC plasma i 4 min ved ~ 10.000 × g. Under centrifugering, kan nogle high-density bundfald afregne til the bunden og nogle lave bundfald densitet kan flyde til toppen af plasmaet. Undgå både når du fjerner portion (er) af plasma.
- Fortsæt til "1.3) Sample Preparation" nedenfor. Derefter vende tilbage til dette trin efter plasma centrifugering er færdig.
- Udtag 9 pi centrifugeret QC plasma og overføre den til en hensigtsmæssigt mærket 1,5 ml polypropylen reagensglas udstyret med en snap-lukket låg (i det følgende benævnt "1,5-ml plastreagensglas"). Tilsæt 1 pi deioniseret vand til hver alikvot; om ønsket, bruge dette som en bærer for intern standard (s).
- Tilføj 270 pi DMSO til denne plasma kontrol. Vortex for at sikre fuldstændig opløsning.
- Prøvefremstilling
- Få så mange 1,5-ml plastik- reagensglas som antallet af biologiske (analyt) prøver.
- Overførsel 9 pi af hver biologisk (analyt) prøve til den tilsvarende 1,5-ml plastreagensglas. Overfør 1 pi deioniseret vand og 270 pi DMSO til hvert prøverør.
- Kraftigt blandes (f.eks vortex og / eller flere gange pipette op og ned) prøverne for at sikre fuldstændig opløsning i DMSO.
Forsigtig: Udfør følgende trin inde i en emhætte. Anvendt i de følgende trin, iodmethan (CH3 I), dichlormethan (CH2C! 2, alias methylenchlorid) og chloroform (CHCl3, trichlormethan), er flygtige væsker, der kan opløse visse typer plast (fx nitril) . Vær sikker på at bruge opløsningsmidler handsker. På grund af deres viskositet og højt damptryk lavt, kan disse reagenser dryppe fra en pipettespids under overførsel. Minimer tab reagens og potentiel eksponering ved at holde stamopløsningen støder op til det modtagende fartøj. - Overføre tilstrækkelig samlet volumen på iodmethan til et lille, rent rør. Hver analyt prøve vil kræve 105 pi iodmethan. Overførsel ~ 500 pi dichlormethan i anothis rent rør. For at forhindre sprøjte tilstopning, skylles sprøjten med dichlormethan umiddelbart efter iodmethan overførsel.
Advarsel: lodmethan er lysfølsom, flygtig, og potent toksin kan skade centralnervesystemet eller forårsager død ved indånding eller indtagelse. Dichlormethan er et potentielt kræftfremkaldende, reproduktiv mutagen, og potent irriterende i stand til at skade flere organer eller forårsager døden. - Brug en analytisk sprøjte for at tilføje 105 pi iodmethan til hver analyt prøve. Cap analyt rør straks at minimere iodmethan fordampning. Grundigt vortexes og om nødvendigt, kortvarigt centrifugeres alle prøver at sikre, at ingen væske tilbage i hætten. Enhver farveændring (fx til brun, lilla eller gul) signalerer iodmethan nedbrydning, hvilket kan bringe følgende permethylering reaktion.
- Skyl den analytiske sprøjte anvendes til at overføre iodmethan med dichlormethan mindst 3 gange. Dette vil forhindre det from tilstopning. Aflever denne skylning, sammen med ekstra iodmethan og dichlormethan i en organisk beholder farligt affald. Anbring brugte reagensglas i en farlig affaldsbeholder.
- Få et nyt sæt af 2 ml plastik reservoir rør. Fjern snap-caps, hvis det ønskes.
- Tag de mikrofugerø mini filtre. Centrifuger unplugged kolonner for 15 sek ved 2400 × g, og derefter kassere reservoiret rør sammen med DMSO spildevand.
- Re-plug de centrifugerede spin-søjler, og placere dem inde i nye reservoir rør. Nummer hver tur søjle og dens tilsvarende reservoir rør med samme antal stikprøver. Sørg for, at mini filterindsatse er stramme; potentiel udsivning kan påvirke det næste trin. Minimere tiden mellem at fjerne DMSO fra spin-søjler og overførsel af analyt prøver onto spin-søjler.
- permethylering
- Overføres kvantitativt hver prøveopløsning til dets tilsvarende NaOH-perle-fyldte mikrofugerør spin-column. Brug en 1000-pi pipettespids til dette trin. Efter overførsel, crimp ~ 2 mm fra enden af en 200 pi spids og lade den stå i kolonnen indhold til brug som en omrører. Gentag for alle prøver.
Bemærk: Den lave viskositet af iodmethan kan forårsage prøvetab da analytten løsning kan dryppe fra pipettespidsen under overførslen. Hold prøverøret og spin-søjle ved siden af hinanden med den ene hånd, og hurtigt overføres prøveopløsningen med den anden hånd. - Tillad permethylering reaktionen forløbe i 11 min. Omrør hver prøve mindst 4-5 gange i denne periode. For at lette effektiv permethylering, som opstår på overfladen af NaOH perler, bruge tip-krympet gel-loading pipettespidser som omrørere til forsigtigt blande kolonne indhold. Aggressiv blanding kan punktere spin filter, pulverisere og suspendere NaOH-perler (som kan reducere effektiviteten af efterfølgende væske / væske ekstraktion), og / eller forårsage prøvetab (som sample-gennemblødt NaOH granulat kan flyde fra kolonnen).
- Som forberedelse til den efterfølgende væske / væske-ekstraktion trin fremstilles en tilstrækkelig mængde 0,5 M natriumchlorid (NaCl) opløsning i en 0,2 M natriumphosphatpuffer (pH 7,0), der skal opbevares ved stuetemperatur. Hver prøve vil kræve i alt ~ 12 ml NaCl-opløsning for alle tre cyklusser af væske / væske-ekstraktion.
- Ved afslutningen af 11-min permethylering periode, men straks forsigtigt trække stikket kolonnerne og centrifugeres dem i 15 sek ved 2400 × g. Kassér stikkene.
- Overføres kvantitativt hver prøveopløsning til dets tilsvarende NaOH-perle-fyldte mikrofugerør spin-column. Brug en 1000-pi pipettespids til dette trin. Efter overførsel, crimp ~ 2 mm fra enden af en 200 pi spids og lade den stå i kolonnen indhold til brug som en omrører. Gentag for alle prøver.
- Fjern omgående spin-søjler fra centrifugen og placere dem i et nyt sæt af tomme spin-reservoir rør, hvorefter gennemstrømningen opløsning indeholdende frisk permethylerede glycaner bag. Smid ikke noget.
- Så hurtigt som muligt, tilsættes 300 ul acetonitril (ACN) til de tørre, NaOH-fyldte spin-filtre. Centrifuger spin filtrene i 30 sekunder ved 9.600 x g.
- immediately derefter overføre den vigtigste permethylering opløsning (dvs. opløsningen, der blev inkuberet med NaOH perler til 11 minutter og derefter spundet gennem spin filter over i et centrifugerør før tilsætning af 300 pi ACN i det foregående trin) for at silaniseret 13 x 100 mm reagensglas 42 indeholdende 3,5 ml 0,2 M natriumphosphatpuffer indeholdende 0,5 M NaCl, pH 7,0 og bland (vortex) omgående. Undgå at overføre enhver solid hvid rest i dette trin. Gør dette for hver prøve før man går videre til næste trin.
- Straks overførsel (kombinere) ACN spin-igennem i hvert reservoir rør til (med) resten af væskeprøven i sin respektive silaniseret glasrør og blandes (vortex) omgående. Igen, undgå at overføre enhver solid hvid rest i dette trin. Cap, ryste, og vortex glasrør. Gentag for hver prøve. Kassér NaOH søjler og Pasteur-pipetter i passende affaldsbeholdere.
- Væske / væske Extraktion og Glycan Oprensning
- Inde i stinkskab, tilsættes 1,2 ml chloroform til hver prøve. Umiddelbart derefter cap de silaniserede glasrør og kraftigt blande indholdet.
- Pre-varme metal blokke til ca. 75 ° C i en fordampning manifold. Brug varme blokke med brønde, der kan rumme de 13 mm × 100 mm glasrør.
- Få et nyt sæt silaniserede Pasteur-pipetter, ikke-silaniserede Pasteur-pipetter og silaniserede reagensglas med hætter.
Advarsel: Chloroform (CHCl3) er et irritationsmoment, mutagen og potentielle kræftfremkaldende i stand til at trænge gennem nogle typer af handsker. - Kort fortalt centrifuge (~ 3000 x g) prøve-holdige glasrør for at adskille de vandige og organiske lag.
- Anvende et ikke-silaniseret Pasteur pipette til at udtrække nok af det øverste vandige lag, således at ~ 3 mm af det vandige lag forbliver over bunden organiske lag.
- Tilsættes 3,5 ml af en 0,5M NaCl-opløsning i en 0,2 M natriumphosphatpuffer (pH 7) til hvert glasrør, energisk mix, og kort centrifuge (~ 3000 x g). Som i det foregående trin (1.4.3), bruge et ikke-silaniseret Pasteur pipette at ekstrahere det vandige lag.
- Gentag det foregående trin (1.4.4), men lade ~ 1 ml af det vandige lag.
- Brug en ren silaniseret Pasteur pipette til at overføre det organiske lag til en ren og passende mærket silaniseret 13 × 100 mm reagensglas. Undgå af vandet ved at udtrække på følgende måde:
- Hold både de nuværende og nye silaniseret reagensglas støder op til hinanden i den ene hånd. Med den anden hånd, trykker pipetten pære til at skabe bobler under indsættelse pipetten ned gennem det vandige lag.
- Inde i organiske lag, stop skabe bobler, og hold pipetten pære konstant at lade de organiske og vandige lag for at stabilisere og skille igen. Derefter frigiver langsomt pæren til at trække så meget af organic lag som muligt uden nogen af vandet.
- Hurtigt hæve pipettespidsen gennem den vandige fase, og modstå den naturlige refleks på lidt frigiver pæren (hvilket resulterer i tilbagetrækning nogle af vandet) og samtidig øge pipetten ud af røret.
- Hurtigt overføre letflydende organiske lag til det tilstødende nyt rør. Enhver af vandet vil være synlige som små væskedråber på toppen af den ekstraherede organiske fase i de nye glasrør. Hvis vandigt / NaCl forurening er synlig, skal den fjernes med en pipette; centrifugere hvis nødvendigt at samle de vandige dråber i en enkelt dråbe.
- Bortskaf gamle rør, pipetter og vandige og organiske affaldsløsninger. Vask og genbruge glasrør caps.
- Tør alle prøver under en blid og konstant strøm af kvælstof i en forvarmet fordampning manifold ved 75 ° C i ~ 5 minutter inde i et stinkskab. At sikre fordampningskøling under alle tør-down steps, skal en blid og konstant strøm af nitrogen forstyrre væskeoverfladen uden sprøjt eller sprøjte væsken. Fjern prøver fra fordampning manifold efter fuldstændig tørring af den endelige prøve. Hvide pletter i bunden af en tørret glasrør indikerer puffer / NaCl kontaminering.
- Pause proceduren her, hvis der ikke er tilstrækkelig tid tilbage i dag at fuldføre TFA hydrolysetrin. Midlertidigt (dvs. natten over) opbevares tørre prøver ved -20 ° C. For at fortsætte proceduren efter opbevaring, fjerne prøverne fra -20 ° C fryser og give dem mulighed for at varme helt, før hætten tages.
- Mens prøver varm, som forberedelse til trifluoreddikesyre (TFA) hydrolyse (næste trin), indstille varmekappe, således at temperaturen af det flydende indhold reagensglas vil nå 121 ° C. Forbered TFA løsning fra TFA lager (se Trin 2.1 nedenfor).
2. Trifluoreddikesyre (TFA) Hydrolyse
3. Reduktion 4. Acetylering (udført i et stinkskab) 5. Gas Chromatography - massespektrometri (GC-MS) 6. Data Analysis
Forsigtig: Natriumborhydrid (NaBH4) er et hygroskopisk, der reagerer med vand toksin og potent irriterende at udsætninger-ved kontakt med vand-meget brandfarlig dampe, der forårsager alvorlige forbrændinger ved kontakt indånding, indtagelse eller øjne / hud.
Forsigtig: Ammoniumhydroxid (NH4 OH) er en ætsende irriterende og toksin stand til at forårsage alvorlige forbrændinger og uoprettelig organskade ved kontakt indånding, indtagelse eller øjne / hud. Skyl de berørte områder med vand i 30 min, og forhindre, at offeret mod gnidning eller skrabe de ramte områder.
Bemærk: For at skelne luftbobler fra væskedråber, vippe reagensglasset. Kun væskedråber vil flytte efter vipning, men det omvendte er ikke altid rigtigt: Hvis en boble ikke bevæger sig, kan det stadig være en (meget lille) flydende dråbe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En komplet ionstrøm kromatogram (TIC), der viser succesfuld permethylering, hydrolyse, reduktion og acetylering af humant blodplasma prøver i forhold til tilfælde, hvor to kritiske permethylering trin blev udført forkert er vist i figur 3.
Absolute Udbytte af HexNAcs forhold til hexoser:
N -acetylhexosamine (HexNAc) delvist denatureret alditolacetater (PMAAs) tendens til at have lavere udbytte end hexoser. 43 For at estimere absolutte udbytte af HexNAcs forhold til hexoser, seks 10-pg prøver af N -acetyllactosamine (en Gal1-4GlcNAc disaccharid) i 10 pi vand blev analyseret. TIC toparealer for terminal galactose (t-Gal) og 4-GlcNAc blev integreret. Procentdelen af 4-GlcNAc i forhold til den totale mængde af t-Gal og 4-GlcNAc var 11,3 ± 0,7%(SEM). Selv HexNAc udbytter er reproducerbar (se nedenfor), at denne værdi er meget mindre end den teoretiske værdi på 0,5 angiver, at udbyttet af HexNAcs er fundamentalt lavere end for hexoser. (The HexNAc teoretiske udbytte er 0,5 fordi N -acetyllactosamine er en 1:. 1 hexose-HexNAc disaccharid)
Intra- og interserielle reproducerbarhed:
Intra- og interassay reproducerbarhed for alle glycan knuder bidrager mindst 1% af den samlede hexose eller HexNAc signal er givet i tabel 1. Disse data blev overtaget af 3 separate analytikere på 3 forskellige dage, ved hjælp af den samme bestand af EDTA plasma. Autosampler stabilitetsdata i henhold til denne optimerede protokol for de 18 mest rigelige glykan knudepunkter i humant plasma (dvs. dem med> 1% af den samlede hexose eller HexNAc signal) er tilvejebragt i figur 4.
Andre bemærkelsesværdige observationer:
Mens optimere permethylering metodologi, fandt vi, at det ikke er nødvendigt at forhindre adsorption af vand ved NaOH perlerne før første vask med acetonitril. Vi fandt også, at tilstedeværelsen af en lille mængde vand under den endelige acetyleringstrin i kombination med en kort periode med opvarmning med eddikesyreanhydrid uden TFA hjælper til at lette fuldstændig reaktion. Endelig er den høje opløsningsevne af tid-of-flight (TOF) massespektrometri er ikke nødvendig for en vellykket glycan node analyse: De første resultater baseret på parallel injektion af det samme sæt af prøver på en GC-TOF-MS og en traditionel transmission kvadrupol -baseret GC-MS opereret i måling af udvalgte ioner (SIM) mode demonstrerer lignende resultater i form af den endelige normaliserede hexose og HexNAc relative mængder.
er.within-side = "1"> 
. Figur 1. Molekylær overblik over den globale glycan methylering analyse procedure En O-forbundet glycan er illustreret; som frigives i den permethylering proces, som er blevet tilpasset fra Goetz. 40 Efter permethylering og hydrolyse, er monosaccharider reduceres og fremspirende hydroxylgrupper "mærket" ved acetylering. Det unikke mønster af methylering og acetylering i de endelige delvist methylerede alditolacetater (PMAAs) svarer til den unikke "glycan node" i det oprindelige intakte polymer og tilvejebringer den molekylære basis for separation og kvantificering ved GC-MS. N-bundet og glycolipid glycaner frigives som lift-mærket monosaccharider løbet sur hydrolyse. Tilpasset fra Borges et al. 33 med tilladelse.> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Conceptual overblik over analytisk begreb. En opreguleret glycosyltransferase (f.eks GnT-V) bevirker en forøgelse i mængden af en specifik, entydigt knyttet glycan monosaccharidrest (a 2,6-bundet mannose "node" i dette eksempel) -som, gennem den efterfølgende virkning af andre glycosyltransferaser, kan føre til dannelse af en blanding af heterogene hel-glycanstrukturer ved lavt kopital hver-som alle kan være vanskeligt at påvise og kvantificere i rutinemæssige måde. Analytisk samle sammen de "glycan knuder" fra blandt alle de afvigende glykanstrukturer giver en mere direkte surrogat måling af GnT-V-aktivitet end nogen enkelt intakte glycan. Samtidig måling af N -, O -, og lipid koblet "Glyc an knudepunkter "i hele biospecimens som beskrevet her (og oprindeligt andetsteds 33) udgør et begrebsmæssigt hidtil ukendte middel til at påvise og overvåge glycan-affektive sygdomme, såsom cancer. Faktiske ekstraherede ionchromatogrammer fra 10 mikroliter blod plasmaprøver vist. Numbers støder op til monosaccharidrester i glykanstrukturer indikerer den position, hvor den højere rest er knyttet til den nedre rest. Hvis der ikke linkage positioner er angivet i kromatogrammet annotation remanensen enten er i den terminale stilling eller frit i opløsning (fx glucose). Alle rester . undtagen sialinsyre link nedad via deres 1-stillingen; sialinsyrereceptorer links nedad via sin 2-stillingen Split i kromatogram viser ændring i ekstraherede ionchromatogrammer: m / z 117 129 for hexose rester og m / z 116 + 158 for N - acetylhexosamin (HexNAc) rester. Tilpasset fra Borges et al. 33 med tilladelse.61 / 53961fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative resultater. Total ionstrøm kromatogrammer (tics) for glycan node analyse af det samme humant blod EDTA-plasma prøve, hvori A) prøven blev behandlet korrekt, B) den hvide rest i permethylering løsning, der blev spundet gennem NaOH søjlen blev båret ind i efterfølgende blanding til væske / væske-ekstraktion, og C) den permethylering løsning, der blev spundet gennem NaOH søjlen sattes til phosphatbuffer men ikke blandes grundigt før tilsætning af chloroform til væske / væske-ekstraktion. Legend tilvejebragt i figur 2. Klik hførend at se en større version af dette tal.
Figur 4. Autosampler Stabilitet. Autosampler stabilitet i løbet af 48 timer for de 18 mest rigelige glykan knuder i humant plasma. På 22 timer blev prøven helt tørret og rekonstitueret i 120 pi acetone. Hver klynge af datapunkter repræsenterer fire på hinanden følgende injektioner af den samme prøve. Sorte linjer omfatter ± 15% af den gennemsnitlige normaliserede værdi for hver glycan node. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Intra- og interassay reproducerbarhed. Værdierne repræsenterer% CV af den samlede hexose eller total HexNAc-normaliserede individuelle glycan knudepunkter. Alle glycan knudepunkter bidrager mindst 1% af den samlede hexose eller HexNAc signal er angivet. Data blev erhvervet af 3 separate analytikere på 3 forskellige dage, ved hjælp af den samme bestand af EDTA plasma. N = 6 prøver pr parti. Klik her for at downloade denne tabel som et Excel-regneark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generelt vellykket produktion af delvist methylerede alditolacetater (PMAAs) fra hexoser er fyldt med færre vanskeligheder og er mere robust end vellykket produktion af N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Den nøjagtige mekanisme bag dette fænomen, da det spiller i hvert trin i denne procedure er ukendt, men skal forholde sig til den unikke kemi af N-acetyl-gruppen (i stedet for hydroxylgruppen), der er unik for HexNAcs forhold til hexoser. Mekanismen bag dette fænomen som den vedrører syrehydrolyse er forklaret andetsteds. 43 Kort sagt kapaciteten til N-methylacetamido at blive positivt ladet under syrehydrolyse gør glycosidbindingen resistente over for syrehydrolyse. Dette forklarer det lave udbytte af HexNAc forhold til hexose (11,3% af den samlede HexNAc + hexose signal, snarere end 50% af total) som beskrevet ovenfor til analyse af N -acetyllactosamine. Især denne relativt lower udbyttet af HexNAcs ikke gør dem vanskelige at opdage i komplekse kropsvæsker og væv, eller udelukke facile påvisning af glycan noder stammer fra store, komplekse glykaner (f.eks 2,4-Man, 2,6-Man, 3,4,6 -Man og 3,4-GlcNAc, figur 2). 33 i betragtning af den måde, hvorpå Xlc toparealerne for glycan knudepunkter er normaliseret (trin 6.3), så længe den relative udbytte af hver individuel HexNAc forbliver foreneligt i forhold til andre HexNAcs ( som den gør, se tabel 1), nyttig information om de relative mængder af de forskellige HexNAcs mellem forskellige prøver kan opnås. Dette gælder for hexoser så godt. Desuden har vi tidligere vist, at forholdene mellem hexoser til HexNAcs vise konsekvent kvantitativ adfærd og 33 - et fænomen, som overvåges kontinuerligt via inkorporering af QC prøve (r) i hver batch.
Den måde, hvorpå permethylering udføres har den største indflydelse pådet samlede udbytte og reproducerbarhed HexNAc PMAAs. Især bør der udvises stor forsigtighed helt at undgå eksponering af permethyleret glykaner til alkalisk vandige betingelser. To vigtige skridt i denne henseende er 1) forlader alle hvidt bundfald i spin-gennem-løsninger bag (trin 1.3.13 og 1.3.14), og 2) umiddelbart blande spin-through løsninger, når de er tilføjet til fosfatbuffer ( trin 1.3.13 og 1.3.14). En buffer snarere end simpel saltopløsning er inkluderet i denne fase og for de følgende væske / væske-ekstraktion skridt til at forhindre utilsigtet alkalinisering af den vandige opløsning. Vi formoder, at acetylgruppen af det methylerede og acetylerede 2-aminogruppen af HexNAcs under alkaliske betingelser kan undergå hydrolyse, hvilket resulterer i en mere polær sekundær amin, som nedsætter den samlede ekstraktionseffektiviteten af den tilknyttede glycan i chloroform.
Den mest let genkendelige træk ved forgæves permethylerede HexNAcs erintensiteten af 4-bundet GlcNAc (4-GlcNAc) kromatografisk top forhold til dem for 6-Gal, 3,6-Man, og baseline intensitet baggrunden under sidste kolonne bake-out (figur 3). Når den absolutte overflod af 4-GlcNAc PMAA er lav, dens normaliseret overflod i forhold til alle andre HexNAcs har også tendens til at være lav, med en ledsagende forøgelse (mest mærkbart) 3,4-GlcNAc.
Et par ændringer designet til at optimere samlede udbytte og assay robusthed er blevet gjort siden vores første offentliggørelse beskriver denne analytiske tilgang 33 En af disse ændringer er den måde, hvorpå de integrerede udvindes ionchromatogrammer (Xics) er normaliseret:. For overskuelighedens skyld, vi nu opdele arealet af hver enkelt hexose XIC med summen af alle hexose XIC områder; Ligeledes er det område af hver enkelt HexNAc XIC divideret med summen af alle HexNAc XIC områder. Som det ses i tabel 1, samlet interassay / inter-analytiker reproducibilhed for alle glycan noder, der bidrager til> 1% af deres respektive hexoseenheder eller HexNAc signal gennemsnit 13% CV.
Til vores viden, er dette det eneste inkarnation af ægte bottom-up Glykobiologi hvor glykaner først brudt ned og derefter deres komponenter analyseret at konstruere en kvantitativ prøve hele portræt af glycan sammensætning. Her, i stedet for traditionel enzymatisk frigivelse, den permethylering proces ikke-reduktivt eliminerer (udslip) O -bundne glycaner fra deres respektive proteiner, 40, mens N-forbundet glykaner er frigivet under sur hydrolyse. 33 Som en supplerende tilgang til traditionelle top-down Glykobiologi denne tilgang er i stand til at samle unikke glycan funktioner af interesse såsom "kerne fucosylering", "6-sialylering", "halverer GlcNAc", og "beta 1-6 forgrening" i enkelte analytiske signaler (se, 4,6-GlcNAc , 6-Gal, 3,4,6-Man og 2,6-Man knuder i figur 2, respectively). I traditionelle top-down tilgange, er funktioner som disse, der i sidste ende er afhængige af de unikke aktiviteter af en eller to centrale glycosyltransferaser 33 typisk fordelt på dusinvis af intakte glykaner og kan nogle gange være vanskeligt eller umuligt at løse (f.eks 3-sialyleringen vs. 6-sialylering) på grund af degenereringen af nogle intakte glycan masser. Desuden har bottom-up tilgang præsenteres her demonstreret indledende løfte i ikke-invasivt afsløre lungekræft. 33 Yderligere undersøgelser i gang for at validere disse første konklusioner samt yderligere, endnu ikke offentliggjorte resultater vedrørende påvisning af andre former for kræft.
Den største begrænsning af den fremgangsmåde, der er beskrevet her, er, at det er begrænset, hvad angår dets detektionsgrænser, hvis den skulle anvendes til at pre-isolerede glycoproteiner. Baseret på upublicerede analyser af de enkelte glycan standarder uden bærerprotein, kvantificeringsgrænserne for individuelle glycaner synes at ligge i den lave mikrogram interval. Disse er på ingen måde lave LOQs i absolutte tal, men dette faktum betyder ikke noget i forhold til den oprindeligt tilsigtede omfang af analysen, der ikke er designet til, og har ikke behov for at opnå lave LOQs (mindst til de formål, der er beskrevet her, og i vores tidligere publikation 33). Faktisk humant plasma / serum indeholder glycoproteiner i 10'erne af koncentration mg / ml området-hvilket betyder, at til analyse af blodplasma / serum vi kun injicere ~ 1/100 th af den endelige prøvevolumen og opdele 40 ud af 41 dele at små mængder til spilde i GC injektoråbning. Uden denne praksis kan nogle af de glycan knudepunkter mætte detektoren. kan ikke registreres picomol mængder glycoproteiner, der kan producere tilstrækkelige intakte glycan signaler ved konventionel top-down MALDI-MS eller LC-MS tilgange med denne tilgang. Yderligere forfining af metoden er i gang for at afhjælpe denne begrænsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium hydroxide beads | 367176 | Sigma-Aldrich | 20-40 mesh, reagent grade 97% |
| 0.9 ml Spin column | 69705 | Pierce division of ThermoFisher Scientific | Includes plugs and polyethylene frits |
| GC-MS autosampler vial (silanized)* | C4000-9 | ThermoFisher Scientific | Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps |
| 1.5 ml polypropylene test tubes | 05-402-25 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| 2 ml polypropylene test tubes | 05-408-138 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D8418 | Sigma-Aldrich | BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0% |
| Iodomethane | I8507 | Sigma-Aldrich | Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99% |
| Acetonitrile | A955-4 | ThermoFisher Scientific | Optima LC/MS |
| Microcentrifuge | 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424 |
| 13 x 100 glass test tube (silanized)* | 53283-800 | VWR | 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish |
| Caps for glass test tubes | 14-930-15D | ThermoFisher Scientific | Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner. |
| Sodium chloride | S7653 | Sigma-Aldrich | >99.5% pure |
| Chloroform | 4440-08 | Macron Fine Chemicals | |
| Trifluoroacetic acid | 299537 | Sigma-Aldrich | 99% purified by redistillation for protein sequencing |
| Sodium borohydride | 71321 | Fluka Analytical | 99% |
| Ammonium hydroxide solution | 320145 | Sigma-Aldrich | NH3 content: 28.0-30.0% |
| Methanol | AH230-4 | Honeywell Burdick & Jackson | HPLC grade |
| Acetic acid | 320099 | Sigma-Aldrich | 99.70% |
| Plastic vacuum desiccator | Any model of adequate size | FoodSaver | |
| Acetic anhydride | 539996 | Sigma-Aldrich | 99.50% |
| Dichloromethane | D143SK-4 | ThermoFisher Scientific | Stabilized HPLC grade |
| Acetone | 9006-03 | J.T.Baker | Baker Analyzed |
| Heated evaporation manifold (main unit) | pi18823 | ThermoFisher Scientific | Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function |
| Heated evaporation manifold (overhead evaporator) | pi18826 | ThermoFisher Scientific | ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module |
| Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold | pi18816 | ThermoFisher Scientific | Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep) |
| Gas chromatograph | Model A7890 | Agilent | Equipped with CTC PAL autosampler |
| Mass spectrometer | GCT Premier (Time-of-Flight) | Waters | |
| Split-mode liner (deactivated / silanized) | 5183-4647 | Agilent | Containing a small plug of silanized glass wool |
| DB-5ms GC column | 122-5532 | Agilent | 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness |
| Chlorotrimethylsilane | 95541 | Sigma-Aldrich | |
| Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" wide; 230 mm plate size |
| *Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator. | |||
References
- Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
- Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans (2009).
- Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
- Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).
- Rini, J., Esko, J., Varki, A. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).
- Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).
- An, H. J., et al. Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer. J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).
- Kanoh, Y., et al. Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression. Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).
- Kyselova, Z., et al. Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer. J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).
- Okuyama, N., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation. Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).
- Zhao, J., et al. Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera. J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).
- Comunale, M. A., et al. Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma. J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).
- Goldman, R., et al. Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis. Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).
- Aurer, I., et al. Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma. Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).
- Abd Hamid, U. M., et al. A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression. Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).
- Kyselova, Z., et al. Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles. Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).
- Hongsachart, P., et al. Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma. Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).
- Arnold, J. N., et al. Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer. J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).
- Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).
- Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival. Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).
- Chen, G., et al. Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer. J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).
- Takeda, Y., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer. Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).
- Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
- Mehta, A. S., et al. Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis. J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).
- Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation. Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).
- Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. Genomics and epigenomics of the human glycome. Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Tuccillo, F. M., et al. Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43. Biomed Res Int. , (2014).
- Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).
- Brockhausen, I. Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions. EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).
- Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens. Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).
- Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography. J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).
- Ciucanu, I., Caprita, R. Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis. Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).
- Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).
- Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis. Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).
- Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).
- Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells. Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).
- Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity. Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).
- Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).
- Seed, B.
- Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen. Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).
