Abstract
El poder de la genética de Drosophila cada vez más se está aplicando a las preguntas de la señalización de la hormona y el metabolismo y para el desarrollo de modelos de enfermedades humanas en este organismo. Se necesitan métodos sensibles para mediciones de los parámetros tales como las tasas metabólicas para conducir la comprensión de la fisiología y la enfermedad en los animales pequeños, tales como la mosca de la fruta. El método descrito aquí se evalúa la oxidación de combustible en un pequeño número de moscas adultas alimentadas alimentos que contienen cantidades traza de 14 sustratos de C marcado tales como glucosa o ácidos grasos. Después de que el período de alimentación y cualquier manipulaciones experimentales adicionales, las moscas se transfieren a tubos cortos cubiertos con malla, que luego se colocan en viales de vidrio que contienen papel de filtro saturado con KOH que las trampas exhalados, radiomarcado CO 2 genera a partir de la oxidación de sustratos radiomarcados como bicarbonato de potasio, KHCO3. Esta bicarbonato radiomarcado se mide por recuento de centelleo. Esto es aqenfoque CUANTITATIVA, reproducible y sencilla para el estudio de oxidación del combustible. La utilización de la glucosa marcada radiactivamente, ácidos grasos o aminoácidos permite la determinación de la contribución de estas diferentes fuentes de combustible para el metabolismo energético en diferentes condiciones, como la alimentación y el ayuno y en diferentes fondos genéticos. Esto complementa otros enfoques utilizados para medir en el metabolismo energético vivo y debe favorecer la comprensión de la regulación metabólica.
Introduction
El trabajo en el organismo modelo Drosophila melanogaster ha contribuido en gran medida a la comprensión de los principios genéticos, los procesos de desarrollo, el crecimiento, el envejecimiento, el comportamiento, la inmunidad y la enfermedad humana 1,2. Un sinnúmero de planteamientos biológicos genéticos y celulares en Drosophila ha impulsado el progreso en estas áreas. Sin embargo, el estudio del metabolismo en la mosca de la fruta ha desarrollado más lentamente, debido en gran parte a las dificultades en la medición de parámetros metabólicos en un animal tan pequeño. El interés en el uso de Drosophila como modelo para el estudio de enfermedades humanas tales como la diabetes y para la comprensión de la contribución del metabolismo y crecimiento a diversas patologías ha empujado el campo para desarrollar y adaptar las técnicas metabólicas para este organismo 3,4.
Los métodos fiables están ahora disponibles para la medición de una serie de parámetros metabólicos en la mosca de la fruta. Por ejemplo, es sencillo para evaluar la ingesta de alimentos
La medición del total de la producción de CO 2, especialmente cuando se combina con la medición del consumo de O2, proporciona información valiosa sobre el metabolismo de la energía en todo el cuerpo. Sin embargo, esta medida no se identifica el nutriente que se oxida para la producción de trifosfato de adenosina (ATP). Tres clases principales de nutrientes pueden entrar en el ciclo del ácido cítrico después de la conversión a acetil CoA: hidratos de carbono, ácidos grasos y proteínas. La glucosa-6-fosfato, derivado de la glucosa en la dieta o glucógeno almacenado, se puede convertir en piruvato que se descarboxila por piruvato deshidrogenasa para formar acetil CoA. Degradación de los ácidos grasos derivados de la dieta o de los triglicéridos almacenados por los rendimientos de oxidación ß-acetil CoA que entra entonces en el ciclo del ácido cítrico. Finalmente, Una mayoría de los aminoácidos puede entrar en el ciclo del ácido cítrico después de la conversión a piruvato, acetil CoA reductasa o ácido cítrico intermediarios del ciclo tales como alfa-cetoglutarato.
contribución-nutriente específico para el metabolismo energético durante basal y condiciones estimuladas se puede controlar mediante el uso de trazadores radiactivos. El protocolo que aquí se presenta está adaptado para su uso en Drosophila de un protocolo utilizado para evaluar la oxidación en las células cultivadas en cultivo de 12,13. En este enfoque, moscas de la fruta son alimentados con 14 sustratos C-radiomarcado metabólicos (hidratos de carbono, ácidos grasos o aminoácidos) en la dieta durante un corto (horas) o largos (días) de pulso, perseguido en alimentos sin etiqueta, y luego expuestos a una cámara que contiene hidróxido de potasio saturada con papel de filtro (KOH) para la captura de CO exhalado 2 como bicarbonato. bicarbonato radiomarcado se puede cuantificar mediante recuento de centelleo. Las diferencias en radiomarcado-producción de CO 2 entre el experimentoAL grupos de moscas pueden reflejar el uso de diferentes combustibles para la producción de ATP en el transcurso de una prolongada diferencias rápidos o intrínsecas en el metabolismo de combustible entre los genotipos, por ejemplo.
Protocol
1. Preparación de la mosca de los alimentos que contienen radiomarcados metabólicos Sustratos
- En un tubo de microcentrífuga, mezclar 1 - 2 Ci sustrato radiomarcado (D- [6- 14 C] -glucosa, D- [1- 14 C] -glucosa o ácido -palmitic [1- 14 C], 40 - 60 mCi / mmol) con 15 l de FD & C No. 1 colorante alimenticio azul y H2O para equivalen a un volumen total de 25 l.
PRECAUCIÓN: Carbono-14 es un emisor beta de baja energía y tiene un corto alcance en el aire. Sin embargo, tenga cuidado para evitar que se derrame de moléculas marcadas radiactivamente o ingestión accidental por el experimentador. Volar propina frascos de comida encima fácilmente; asegúrese de alojarlos en un recipiente que pueda evitar que se vuelque, especialmente cuando radiomarcador está en forma líquida (paso 1.2) o en los alimentos no solidificada (paso 1.4). Las moscas que están siendo alimentados o que han sido alimentados con sustratos radiomarcados comenzará a exhalar pequeñas cantidades de CO 2 radiomarcado. Estas moscas deben mantenerse en cajas de acrílico en las vitrinas de gases, y un pequeño plato de KOH can puede establecer en el cuadro para su uso como un depurador de CO 2. - Pipeta de todo el sustrato radiomarcado y la mezcla azul del colorante en el fondo de un frasco vacío de alimentos mosca (altura: 9,4 cm, ancho: 2,2 cm).
- estándar Heat vuela de alimentos en un horno de microondas hasta que la comida es sólo licuado (15 a 20 segundos a nivel de potencia alto para un vial que contiene 10 ml de la comida).
- Añadir alimentos 975 l fundido a la / mezcla colorante azul sustrato radiomarcado y rápidamente remolino, el seguimiento de la uniformidad del color azul para asegurar una mezcla completa.
- Permita que la comida se enfríe y solidifique por completo a temperatura ambiente durante 20 - 30 min.
2. Alimentar sustratos radiomarcados metabólico para moscas de la fruta para adultos
- Anestesie moscas adultas usando un aparato de anestesiante CO 2 que consiste en polietileno poroso fusionado a una base de acrílico y conectado a un tanque de CO 2 con un regulador de presión. El flujo de CO 2 en el aparato anestesiante a 5 L / min.
- anestesiar transferenciad vuela a viales que contienen radiomarcados, comida teñido de azul (n = 15 - 30 moscas por vial). Cap viales con tapón de espuma, y descansar en posición horizontal hasta que las moscas se despiertan. viales de transferencia a un recipiente con tapa acrílica (180 cm x 180 cm x 240 cm de alto).
- Para la alimentación a corto plazo, de hambre moscas durante 18 - 24 horas antes de transferir las moscas de la comida radiomarcado para un 2 -. Etapa de alimentación de 3 h L a paso el hambre es importante porque las moscas alimentadas no comen de forma fiable una nueva fuente de alimentos que se les presentan . Para la alimentación a largo plazo en el transcurso de 5 - 7 días, las moscas no tienen por qué tener hambre, pero el experimentador debe controlar el contenido de agua del alimento radiomarcado en los viales moscas se alojan en y utilizar una aguja y una jeringa para añadir agua a viales con la comida seca.
- Transferencia vuela a los alimentos sin etiqueta "pulsando" en un nuevo vial. Un periodo de caza inicial de 2 - 4 de hr permite moscas para limpiar las partículas de alimentos radiomarcados de sus cutículas y permite la digestión de radiomarcadored comida que queda en el intestino. Monitorear el progreso de los alimentos a través del intestino mediante inspección visual de las moscas para buscar abdómenes azules.
- Posteriormente, la transferencia vuela a diferentes tipos de alimentos (12 - 24 h en la comida estándar o agar al 1% para la medición de los efectos de la alimentación frente ayunas en la respiración) o la temperatura ambiente (12 - 96 horas a 18 ° C o 30 ° C durante genética manipulaciones utilizando GAL80 sensible a la temperatura (ts GAL80), por ejemplo).
Nota: La longitud de este período de caza variará con el experimento que se realiza. Por ejemplo, puede ser necesario una persecución de 96 horas a 30 ° C en experimentos utilizando GAL80 ts con el fin de activar completamente la expresión del transgen GAL4-dependiente.
3. Preparación del Aparato CO 2 -Recogida
- Montar materiales para la construcción de "volar" vainas, tubos cubiertas de malla que van a contener las moscas marcadas con ácido palmítico C-14, C-14 y la glucosa o that permanecerá abierto a la atmósfera. Cortar las 50 mm de 12 mm de tubos de polipropileno x 75 mm, dejando 25, tubos de fondo redondo mm de largo. Preparar 35 mm x 35 mm cuadrados de malla de nylon de 130 micras. También, obtener la cinta transparente en un dispensador de cinta.
- Montar materiales para los aparatos de CO 2 de -collection. Para cada mosca vaina, montar un vial 20 ml de centelleo de vidrio, un tapón de la parte superior de goma con un agujero fuera del centro, un centro bien para ser insertado a través del agujero en el tapón superior, GF grado / papel de filtro de microfibra de vidrio B (2,1 cm de diámetro círculo, 1 micras de poro). papel de filtro GF / B se utiliza debido a su alta resistencia en húmedo y alta capacidad de carga.
- Preparar 5% fresco KOH en el día de uso. Justo antes de la etapa 3.4, doblar y colocar el papel de filtro circular GF / B en el centro, así que se rosca a través del agujero del tapón superior de goma y saturarlo con 100 l de KOH al 5%. Consulte la Figura 1.
- Después de la incubación (s) en medios sin etiqueta, unanesthetize moscas con CO 2. Cepillo vuela en el tubo de corte de polipropileno, con tapa de malla de nylon, y el uso de cinta adhesiva transparente para adherirse a la malla tubo. Trabajar con rapidez para evitar que las moscas de despertar y escapar antes de que la malla se ha fijado de forma segura al tubo. Un número igual de moscas se debe utilizar en cada vaina de la mosca para un experimento particular; 10 - 20 moscas por vaina mosca producen suficiente radiomarcado-CO 2 para la medida por recuento de centelleo (paso 4.1 a continuación).
- La transferencia de la vaina de la mosca a un vial de centelleo de vidrio de 20 ml. Se tapa el vial de vidrio con el tapón de goma que sostiene la parte superior de un centro bien que contiene un papel de filtro GF / B-saturada de KOH. Doble la parte superior de ancho de la parte superior del tapón de caucho sobre el borde del vial de centelleo de vidrio. Consulte la Figura 1.
- viales de vidrio conjunto que contiene las moscas en una tapa, envase de acrílico, y se incuba durante períodos variables de tiempo (de 2 a 12 horas funciona bien).
4. Análisis de los resultados
- Ael final de la incubación, viales de vidrio Destape, y papel de filtro GF / B KOH saturada transferencia a un vial de centelleo de plástico de 6 ml que contenía 4 ml de cóctel de centelleo.
- Si es necesario, congelar las moscas en las vainas mosca en hielo seco y almacenar a -80 ° C para la determinación posterior de los sustratos almacenados. Tenga en cuenta que estas muestras son radiactivos y deben ser almacenados en consecuencia.
- Preparar viales de centelleo adicionales: uno que contiene un papel de filtro GF / B no utilizada para servir como fondo y una a dos otros que contiene 0,1 - 0,5 Ci sustrato radiomarcado para determinar cpm / Ci.
- Medir cpm para cada muestra utilizando un contador de centelleo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Calcula 14 pmol de CO 2 / cpm y 14 pmol de CO 2 por mosca por hora. Restar las cpm de fondo del valor de CPM para cada muestra. A partir de los datos de sustrato marcados radiactivamente ordenados, calcular la cpm / Ci de la muestra del fondo con corrección de contado.
- Utilizar elfabricante proporcionado por actividad específica y la concentración radioquímica del sustrato radiomarcado (por ejemplo, 50 Ci / mmol y 0,1 Ci / l, respectivamente) para calcular pmol / cpm. Utilizar este factor para convertir los datos de la mosca de la vaina antecedentes corregido de 14 cpm CO 2 / muestra a 14 pmol de CO 2 / muestra. Y se divide por el número de moscas y el número de horas en la vaina de la mosca.
Representative Results
La cantidad de exhalado y atrapado CO radiomarcado 2 que se produce a partir del metabolismo de un sustrato radiactivo debe correlacionarse con el número de moscas en una vaina de la mosca, así como la cantidad de tiempo que los animales pasan en el aparato de recogida de CO 2. Para probar esto, las moscas que estuvieron en ayunas durante 18 horas fueron alimentados con ácido palmítico marcado radiactivamente (0,02 Ci / alimentación l) durante 2 horas y después se ensayaron para la producción radiomarcado CO 2 en grupos de 12 o 25 animales por 3 o 6 incubaciones hr. La cantidad de CO2 producido por 25 moscas era casi el doble de la cantidad producida por 12 moscas, y la cantidad de cada grupo se duplicó cuando el tiempo de incubación se aumentó de 3 horas a 6 horas (Figura 2A). El 14 pmol de CO 2 / mosca / h era casi equivalentes en cada grupo.
El ayuno estimula la descomposición de los ácidos grasos por ß oxidation; Por lo tanto, la producción de CO2 a partir de la oxidación de ácidos grasos debe estar elevada en animales en ayunas en comparación con los animales alimentados. Para determinar si este era el caso, 18 horas en ayunas moscas fueron alimentados con ácido palmítico marcado radiactivamente durante 2 horas. Después de este pulso de alimentación corto, las moscas se dividieron en dos grupos y se transfieren a la alimentación de la mosca no marcado o 1% de agar durante 3 horas y después se transfirieron a volar vainas de 2 hr. En dos experimentos separados, moscas persiguió en agar producido CO significativamente más radiomarcado 2 en comparación con las moscas perseguidos en la comida (Figura 2B), lo que indica que la oxidación ß se incrementó en los animales en ayunas.
Figura 1. El aparato para recoger exhalado, radiomarcados CO2.
Las moscas que han consumido sustratos metabólicos son radiomarcadoscolocado en un "pod volar" (FP), un tubo de centrífuga de corte cubiertas con una malla (M). La vaina de la mosca se coloca en un vial de centelleo de vidrio de 20 ml y se tapó con un tapón superior de caucho (S) que contiene un agujero fuera del centro, a través del cual se coloca un centro bien (CW) que contiene papel de filtro GF / B saturado con 100 l 5% de KOH. Exhalado CO 2 reacciona con el KOH y está atrapada en el papel de filtro como bicarbonato. Atrapado, CO 2 radiomarcado puede ser cuantificada mediante recuento de centelleo del papel de filtro saturado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. 14 CO 2 Correlaciones de producción con el tiempo y el número de moscas en unaMosca de la vaina y responde a alimentación y de ayuno.
(A) La cantidad de 14 CO 2 producido en las moscas alimentadas palmitato radiomarcado se correlaciona con el número de moscas analizadas (n = 12 (barras blancas) o 25 (barras cerradas)) y el tiempo en una vaina de la mosca (3 o 6 horas ). Sobre una base per-mosca, moscas produjeron 0,99, 1,13, 1,10 y 1,01 pmol 14 CO 2 / hr (datos que figuran en el mismo orden de izquierda a derecha como los datos del gráfico).
(B) Las moscas que fueron perseguidos en agar oxidado más radiomarcado palmitato de que las moscas que fueron perseguidos en la comida. Los datos son de dos experimentos y se presentan como medios de desviación estándar, n = 16 - 17 moscas / grupo (experimento 1); n = 10 moscas / grupo (experimento 2). * P = 0,017, prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo describe un método para la medición de la oxidación de sustratos radiomarcados específicos en adultos Drosophila melanogaster. Esta técnica es sencilla, cuantitativo, reproducible y sensible, y complementa los métodos existentes que miden la producción total de CO 2 y el consumo de O 2, ya que puede ser utilizado para identificar el nutriente (s) que se oxida para la producción de ATP.
Medición de CO 2 liberado de la oxidación de sustratos radiomarcados específicos utilizando el método descrito aquí es complementaria a las técnicas que miden la producción total de CO 2. Total de producción de CO 2 (V CO2) permite la estimación de la tasa metabólica y, cuando se conoce total del consumo de O 2 (V O2), la tasa metabólica puede ser calculada y la fuente de combustible para la oxidación puede ser calculada de acuerdo a la relación de intercambio respiratorio (V CO2 / O2 = V RER). Cuandohidratos de carbono son el sustrato exclusivo, RER = 1, pero cuando los ácidos grasos son la fuente exclusiva, RER = 0,7, debido a la estequiometría de las reacciones de la glucosa y la oxidación de los lípidos. A falta de equipo para medir el consumo de oxígeno en Drosophila 14, no se puede identificar la fuente de combustible oxidativo. Sin embargo, por medio del etiquetado vuela con trazas de un sustrato radiactivo u otro y las tasas de medición de radiomarcado producción de CO 2, se pueden sacar conclusiones acerca de la capacidad de las moscas para oxidar un sustrato dado en diferentes momentos a lo largo de un estímulo o sobre los efectos de una dado mutación en la oxidación de combustible.
Hay una serie de pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, se debe tener cuidado cuando se utilizan materiales radiactivos para evitar derrames y contaminación de las áreas de investigación. En segundo lugar, cuando anestesiar las moscas durante los pasos 2.1 y 3.4, el experimentador debe trabajar con rapidez para evitar los efectos de CO 2 prolongadala exposición sobre el metabolismo y el comportamiento. Un grupo de 20 moscas puede ser anestesiado y se transfiere a un nuevo vial o en una vaina de mosca en 20 seg o menos. Cuando se transfieren desde un aparato de anestesia a un vial de alimentos, el vial debe descansar en su lado para evitar que las moscas anestesiadas de conseguir pegado en la superficie del alimento. Cuando las moscas son alimentos radiomarcado alimentado a lo largo de varios días como en el paso 2.2, el experimentador debe asegurar que la comida no se seque como las moscas son sensibles a la deshidratación.
El estado alimentado o en ayunas antes del marcaje, la elección de la etiqueta, la longitud de tiempo etiquetado, la longitud de tiempo en la vaina de la mosca, y el método de la anestesia son parámetros que pueden ser sometidos a la solución de problemas y la modificación utilizando esta técnica. En primer lugar, las moscas se somete a períodos cortos de etiquetado (2 - 3 h) no es probable que consumen cantidades importantes de alimentos radiomarcado a menos sometido a un periodo de ayuno de antemano. En segundo lugar, la elección del marcador cun afectar las conclusiones uno es capaz de dibujar sobre fenotipos metabólicos. Por ejemplo, radiomarcado producción de CO 2 a partir de D- [1- 14 C] -glucosa puede reflejar la oxidación a través del ciclo del ácido cítrico o la derivación de las pentosas fosfato, mientras radiomarcado producción de CO 2 de D- [6- 14 C] -glucosa refleja la oxidación a través del ciclo del ácido cítrico única 12,15,16. La alimentación de las moscas con un trazador radiomarcado para un aminoácido esencial 17,18 sería una buena estrategia para la evaluación de la oxidación de los aminoácidos derivados de proteínas. Finalmente, largos períodos de etiquetado con la glucosa radiomarcada también plantean la posibilidad de incorporación de este precursor en otras clases de moléculas, tales como los triglicéridos 19 y aminoácidos tales como alanina, que fácilmente interconvierte con piruvato. Esto se puede evaluar mediante la medición de radiactividad incorporada en estas diferentes clases de moléculas de 6. rad De hecho, las cohortes separadas de moscas pueden ser alimentadosiolabeled sustratos de la misma manera y luego se usa para los experimentos de la mosca de la vaina o la medición de radiomarcador que se almacena y se mantiene en glucógeno y triglicéridos en alimentación y de ayuno 6, por ejemplo. Otra estrategia es utilizar períodos de etiquetado corto que pueden revelar la oxidación de los nutrientes de la dieta radiomarcados sí mismos y no formas de almacenamiento de estos nutrientes. En tercer lugar, también es posible que dos grupos de moscas podrían tener tasas idénticas de 14 CO 2 producción de más de una determinada cantidad de tiempo, pero muy diferentes tasas inicialmente. Por lo tanto, la variación de la cantidad de tiempo que vuela pasar en la vaina de la mosca puede ser un parámetro importante para alterar la hora de evaluar la variación fenotípica. Por último, este protocolo exige el uso de un corto período de CO 2 anestesia cuando se ponen las moscas en el aparato mosca vaina. Es posible que los CO 2 anestesia pueden afectar la función metabólica en el transcurso del experimento mosca vaina. Una alternativa unaENFOQUE es utilizar anestesia nitrógeno que no afecta a la tasa metabólica 20.
Como con cualquier técnica que mide un sistema tan complejo como la oxidación de combustible y la tasa metabólica, el método descrito aquí tiene limitaciones. En primer lugar, es posible que vuela en diferentes grupos podrían consumir diferentes cantidades de comida radiomarcado y por lo tanto se introduzca la fase de recogida de CO 2 del ensayo con diferentes cantidades de partida de sustrato. Esto puede ser controlado para, en cierta medida llevando a cabo el experimento con muestras de gran tamaño y por la alimentación de las moscas en masa. Para períodos cortos de etiquetado, moscas con agallas de color azul similares se han consumido el marcador radiactivo y se puede llevar adelante a la porción de la persecución del experimento. La cantidad de radiomarcador que queda en un grupo de moscas también puede medirse al final del experimento y en cohortes independientes de moscas después del final de la alimentación y período de caza inicial. En segundo lugar, los niveles de actividad entregrupos de moscas en las vainas de moscas pueden ser diferentes. Esto tendrá que ser determinado experimentalmente y tenido en cuenta en la interpretación de los datos. En tercer lugar, esta técnica no mide la producción total de CO 2, sólo la producción de un alimento dietético específico o la forma (s) de almacenamiento de ese nutriente. Este protocolo no es un sustituto para, sino que es complementaria a las mediciones de VCO 2, ya que proporciona información diferente y adicional.
El método descrito aquí exhalado mide, CO radiomarcado 2 que es un producto de la oxidación de cantidades traza de sustratos metabólicos específicos. Mediante la variación de la etiqueta utilizada - glucosa, ácido graso, o ácido amino - uno puede diseñar experimentos cada vez más sofisticadas para evaluar las contribuciones de los diferentes sustratos a metabolismo en diferentes condiciones fisiológicas, tales como el hambre y en diferentes fondos genéticos. Las futuras aplicaciones de esta técnica incluyen la medición de metabolism en las etapas de larva y pupa de desarrollo, dos etapas del ciclo de vida de Drosophila que se caracterizan por condiciones extremas de almacenamiento de nutrientes y la descomposición, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20 ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | Fisher Scientific | 09-874-20 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
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