Abstract
ショウジョウバエ遺伝学の力はますますホルモンシグナル伝達および代謝の質問およびこの生物においてヒト疾患のモデルの開発に適用されています。このような代謝率などのパラメータの測定のための感度の高い方法は、ショウジョウバエなどの小動物に生理学や病気の理解を駆動するために必要とされています。ここで説明する方法は、グルコースまたは脂肪酸のような14 C標識基質の微量を含有する食品を給餌成体ハエの少数の燃料酸化を評価します。給餌期間及び追加の実験操作後、ハエは、放射性標識CO 2が炭酸水素カリウムのような放射性標識基質の酸化から生成された場合、トラップは呼気KOH飽和濾紙を含むガラスバイアルに配置されたメッシュでキャップ短いチューブに転送されますKHCO 3。この放射性標識された重炭酸塩をシンチレーション計数によって測定されます。これは水溶液であり、燃料酸化の研究のため、uantitative再現性、および簡単な方法。放射性標識グルコース、脂肪酸、またはアミノ酸の使用は、摂食および絶食等の異なる遺伝的背景における異なる条件下でのエネルギー代謝にこれらの異なる燃料源の寄与の決意を可能にします。これは、 生体内エネルギー代謝に測定するために使用される他のアプローチを補完し、代謝調節をさらに理解すべきです。
Introduction
モデル生物キイロショウジョウバエでの作業は、遺伝的原則、発生過程、成長、老化、行動、免疫およびヒト疾患1,2の理解に大きく貢献しています。 ショウジョウバエの遺伝的および細胞生物学的ア プローチの無数のは、これらの分野での進歩を牽引してきました。しかし、ショウジョウバエにおける代謝の研究は、このような小動物で代謝パラメーターを測定することの困難に大部分起因し、よりゆっくりと開発しました。糖尿病などのヒト疾患を研究するための成長と様々な病理への代謝の貢献を理解するためのモデルとしてショウジョウバエを用いての関心は、この生物3,4のための代謝技術を開発し、適応するためのフィールドをプッシュしています。
信頼性の高い方法は、今ショウジョウバエにおける代謝パラメータの数を測定するために利用可能です。例えば、食物摂取量を評価することは簡単です
特にO 2消費の測定に結合された総CO 2産生の測定は、全身のエネルギー代謝に貴重な洞察を提供します。しかし、この尺度は、アデノシン三リン酸（ATP）の生産のために酸化される栄養素を特定するものではありません。炭水化物、脂肪酸、およびタンパク質：栄養素の三つの主要なクラスは、アセチルCoAへの変換以下のクエン酸サイクルに入ることができます。食事グルコースまたは保存されたグリコーゲン由来のグルコース-6-リン酸は、アセチルCoAを形成するピルビン酸デヒドロゲナーゼによって脱炭酸されてピルビン酸に変換することができます。その後、クエン酸サイクルに入るアセチルCoAのβ-酸化利回りによって食事から、または保存されたトリグリセリドから誘導される脂肪酸の内訳。最後に、アミノ酸の大部分は、例えばα-ケトグルタル酸などのCoAまたはクエン酸サイクル中間体アセチル、ピルビン酸への変換以下のクエン酸サイクルに入ることができます。
基礎および刺激条件時のエネルギー代謝に栄養固有の貢献は、放射性トレーサーの使用を介して監視することができます。ここに提示プロトコルは、培養12,13で増殖させた細胞における酸化を評価するために使用されるプロトコルからショウジョウバエにおける使用のために適合されています。このアプローチでは、ショウジョウバエは、標識されていない食品に追わ（時間）または長い（日）短パルスのための食事中の14 C放射標識代謝基質（炭水化物、脂肪酸、またはアミノ酸）、供給され、その後にさらさチャンバ重炭酸塩としての呼気CO 2を捕捉するための水酸化カリウム（KOH） -飽和濾紙を含みます。放射性標識重炭酸塩は、シンチレーション計数によって定量することができます。実験の間、放射性標識-CO 2産生の違いハエのAl基は、例えば、遺伝子型との間の燃料代謝の長期高速または内因性の違いにわたってATP産生のための異なる燃料の使用を反映することができます。
Protocol
放射性標識代謝基質を含有するフライ食品の調製
- 2μCiの放射性標識された基質（D- -グルコース[6- 14 C] -グルコース、D- [1- 14 C]または[1- 14 C] -パルミチン酸、40 - - 60 mCiの/マイクロチューブでは、1を混ぜます総容量25μlと等しくなるように15μlのFD＆C第1の青色食用色素及びH 2 Oとのミリモル）。
注意：カーボン-14は、低エネルギーβ放射体であり、空気中の短距離を持っています。しかし、実験者によって、放射性標識分子または誤飲のこぼれを防止するために注意してください。食品のバイアルが簡単にひっくり返るフライ。放射性標識は、液体の形態（ステップ1.2）で、または未固化の食品（ステップ1.4）である場合は特に、転倒からそれらを防ぐことができますコンテナでそれらを収容するようにしてください。供給されているか、放射性標識された基質を供給してきたハエが、放射性標識CO 2の少量を吐き出すために開始されます。これらのハエは、ヒュームフードにアクリルボックスに保管し、KOH CAの小皿する必要がありますnはCO 2スクラバーとして使用するためのボックスで設定すること。 - ピペットで空のフライ食品のバイアルの底に放射性標識された基板と青色色素ミックスのすべて（高さ9.4センチ、幅2.2センチ）。
- （ - 食品10 mlを含む1つのバイアルのための高電力レベルで20秒15）食品が単に液化するまで加熱標準は、電子レンジで食品を飛びます。
- 青色の均一性を監視することは、完全な混合を確実にするために、旋回迅速に放射性標識された基板/青色色素ミックスに975μlの溶融食品を追加します。
- 30分 - 食品を冷却し、20室温で完全に固化することができます。
大人のショウジョウバエに放射性標識代謝基質を餌2
- 大人が多孔性ポリエチレンアクリルベースに融合し、圧力調整器とCO 2タンクに接続からなるCO 2麻酔装置を使用して飛ぶ麻酔。 5L /分で麻酔装置に流入CO 2。
- 転送麻酔（ - 1バイアルあたり30ハエのn = 15）dは、放射性標識、青染め食品を含むバイアルに飛びます。キャップフォームストッパー付きバイアル、およびハエが目を覚ますまで水平に置きます。蓋付きのアクリル容器に移すバイアル（180センチメートルのx 180センチメートル×240センチの高さ）。
- 2のための放射性標識された食品にハエを転送する前に24時間- -短期給餌のために、18のためのハエを飢えさせる。3時間の供給工程T彼飢餓ステップが重要です給餌ハエは確実に彼らに提示食品の新しいソースを食べていますので、 。 5にわたって長期的な給餌のために - 7日、ハエが飢餓状態にする必要はないが、実験者はハエが内に収納されているバイアル中の放射性標識された食品の水分含有量を監視し、バイアルに水を追加するために、針と注射器を使用する必要があります乾燥食品と。
- 転送は、新しいバイアルにそれらを「タップ」することによって標識されていない食品に飛びます。 2の最初の追跡期間 - 4時間はハエが彼らのキューティクルから放射性標識された食物粒子をきれいにすることを可能にし、放射性標識の消化を可能にします腸内に残っ編食品。青色の腹部を探すためにハエの目視検査により、腸を通る食物の進行状況を監視します。
- 18 Cまたは遺伝30℃で96時間 - または周囲温度 - （呼吸に摂食状態対絶食状態の効果を測定するための標準的な食品または1％寒天上で24時間12）（12続いて、転送が異なる食品の種類に飛びます操作のために、例えば 、温度感受性GAL80（GAL80 TS）を使用して）。
注：このチェイス期間の長さは、実行される実験に応じて変化します。 例えばのために、30℃で96時間の追跡が順にGAL80 TSを用いた実験で必要になる場合があり、完全にGAL4依存導入遺伝子の発現を活性化します。
CO 2 -コレクション装置の調製
- 14 C-グルコースまたは14 C-パルミチン酸および股関節で標識されたハエが含まれています"飛ぶポッド」、メッシュキャップチューブを構築するために材料を組み立てますトンは大気に開いたままになります。 25ミリメートル長、丸底チューブを残し、12ミリメートル×75ミリメートルのポリプロピレンチューブのトップ50ミリメートルをカット。 130μmのナイロンメッシュ35ミリメートル×35ミリメートルの正方形を準備します。また、テープディスペンサーに透明テープを得ます。
- CO 2 -collection装置のための材料を組み立てます。各ポッドを飛ぶために、20mlガラスシンチレーションバイアル、オフセンターホールを有するゴムトップストッパー、よくトップ栓に穴を通って挿入される中心、グレードGF / Bガラスマイクロファイバー濾紙（2.1センチメートル直径を組み立てます円、1μmの孔）。 GF / Bフィルター紙は、その高い湿潤強度、高負荷容量が使用されています。
- 使用日に5％のKOHの新鮮を準備します。ただ、ステップ3.4前に、中央に円形のGF / Bフィルター紙を折ると置くだけでなく、それはゴム製のトップ栓の穴に通され、5％KOHの100μlで、それを飽和します。 図1を参照してください。
- 標識されていない培地上でのインキュベーション（複数可）以下、Anesthetizeは、CO 2を飛びます。ブラシは、カットオフポリプロピレンチューブに飛ぶナイロンメッシュ付きキャップ、およびチューブにメッシュを接着する透明テープを使用しています。ハエが目を覚ますと、メッシュがしっかりチューブに貼付されている前にエスケープ回避するために、迅速に作業。ハエの等しい数は、特定の実験のためのポッドフライそれぞれに使用すべきです。 10 -フライポッドあたり20ハエはシンチレーション計数（下記ステップ4.1）による測定のために十分な放射性標識し-CO 2を生成します 。
- 20mlのガラスシンチレーションバイアルにフライポッドを転送します。キャップよくKOH飽和GF / B濾紙を含む中心保持ラバートップストッパー付きガラスバイアル。ガラスシンチレーションバイアルの唇の上にゴム製の上部ストッパーの広い上部を折ります。 図1を参照してください。
- セットガラス蓋付き、アクリル容器にハエを含有するバイアル、および時間（2〜12時間がうまく動作します）の様々な期間インキュベートします。
結果の4.分析
- に4 mlのシンチレーションカクテルを含む6 mLのプラスチックシンチレーションバイアルにインキュベーション、キャップを取るガラスバイアル、および転送KOH飽和GF / B濾紙の終わり。
- 必要な場合は、凍結保存された基板の後の決意のために-80℃のドライアイスや店舗のフライポッドで飛びます。これらのサンプルは放射性であり、従って、記憶されなければならないことに注意してください。
- 追加のシンチレーションバイアルを準備します。背景と0.1を含む2人に1として機能するように、未使用のGF / B濾紙を含む1 - CPM /μCiのを決定するために、0.5μCiの放射性標識された基質を。
- 製造業者のプロトコルに従ってシンチレーションカウンターを用いて各サンプルのCPMを測定します。
- 時間当たりフライ当たりピコモル14 CO 2 / CPMとピコモル14 CO 2を計算します。各サンプルのCPM値からバックグラウンドのcpmを引きます。きちんとした放射性標識された基板のデータから、バックグラウンド補正されたcpm /サンプルのμCiのがカウント計算します。
- 使用メーカー提供の比活性および放射性標識された基質の放射化学濃度（例えば、50μCiの/マイクロモルおよび0.1μCiの/μlで、それぞれ）ピコモル/ CPMを計算します。ピコモル14 CO 2 /サンプルに14 CO 2 /サンプルのcpmからバックグラウンド補正されたフライポッドデータを変換するために、この係数を使用します。その後、ハエの数とフライポッド内の時間の数で割ます。
Representative Results
放射性基質の代謝から生成される呼気および捕捉された放射性標識されたCO 2の量は、フライポッド内のハエの数だけでなく、動物はCO 2回収装置で過ごす時間の量と相関するはずです。これをテストするには、18時間絶食させたハエは2時間の放射性標識パルミチン酸（0.02μCiの/μlの食べ物）を与えた後、3または6時間のインキュベーションのために12または25匹の動物の群における放射性標識されたCO 2産生について試験しました。 25ハエによって生成したCO 2の量は12ハエによって生成ほぼ倍の量があって、各グループの量は、インキュベーション時間は、6時間（ 図2A）に3時間から増加したときに倍増しました。ピコモル14 CO 2 /フライ/ hrでは、各グループでほぼ同等でした。
断食がSS Oによって脂肪酸の分解を刺激しますxidation;したがって、脂肪酸の酸化からのCO 2の生産は、供給された動物と比較して絶食動物において上昇する必要があります。これが事実であったかどうかを判断するには、18-hrがハエは2時間、放射性標識パルミチン酸を供給した絶食しました。この短い給電パルス以下、ハエは2つのグループに分けた後、3時間の未標識のフライ食品または1％寒天に移し、次いで、2時間ポッドを飛ぶに移しました。二つの別々の実験では、ハエがß酸化は絶食動物で増加したことを示す、食品（図2B）に追わハエと比較して有意に多くの放射性標識産寒天CO 2に追わ。
図1. 呼気採取するための装置であって、放射性標識CO 2。
ある放射性標識された代謝基質を消費しているハエ「フライポッド」（FP）、メッシュ（M）でキャップされたカットオフ遠心管に入れました。フライポッドは、100μlの飽和GF / B濾紙を含有する中心ウェル（CW）に配置され、それを通して偏心孔を含むゴム上部ストッパ（S）で20mlガラスシンチレーションバイアルに入れ、蓋をされています5％KOH。吐き出されたCO 2は、KOHと反応し、重炭酸塩などの濾紙上に捕捉されます。追い込まれた、放射性標識されたCO 2は飽和濾紙のシンチレーション計数によって定量することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. 14 CO 2 生産時間と相関し、ハエの数連邦および絶食条件にフライポッドと応答します。
（A）ハエ2で製造供給された放射性標識したパルミチン酸は、試験したハエの数（N = 12（オープンバー）または25（クローズドバー））とフライポッド（3または6時間に費やされる時間と相関する14 COの量）。あたりオンザフライ基づき、ハエは0.99、1.13、1.10および1.01ピコモル14 CO 2 /時間（グラフデータとして右の順に同じ左に記載されているデータ）を生成しました。
（B）食品に追われたハエよりも、パルミチン酸より放射性標識された酸化寒天上で追跡したハエ。データは、2つの実験からであり、標準偏差として報告され、N = 16から17ハエ/グループ（実験1）。 N = 10ハエ/グループ（実験2）。 * P = 0.017、スチューデントのt検定。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、大人のキイロショウジョウバエにおける特定の放射性標識された基質の酸化を測定する方法を説明します。この手法は、簡単な定量的、再現可能かつ高感度であり、そしてATP産生のために酸化される栄養素（単数または複数）を同定するために使用することができるので、総CO 2産生およびO 2消費量を測定する既存の方法を補完します。
ここに記載された方法を用いて特定の放射性標識基質の酸化から遊離したCO 2の測定は、総CO 2産生を測定する技術に相補的です。総CO 2生成（VのCO2）は代謝率の推定を可能にし、合計O 2消費（V O2）が既知である場合、代謝率を算出することができ、酸化のための燃料源は、呼吸交換比（Vに基づいて推定することができますCO2 / V O2 = RER）。いつ炭水化物は排他的な基板、RER = 1であるが、脂肪酸は、グルコースと脂質酸化の反応の化学量論により、排他的なソース、RER = 0.7であるとき。 ショウジョウバエ 14内の酸素消費量を測定するための装置の不存在下で、酸化性燃料源を特定することができません。しかし、標識により1放射性基質または他の微量で飛ぶと、放射性標識CO 2生産の速度を測定、1は、刺激の間に異なる時点で与えられた基板を酸化するハエの能力について、またはAの効果について結論を出すことができます燃料酸化に変異を与えられました。
このプロトコルにおける重要なステップの数があります。流出および研究領域の汚染を避けるために、放射性物質を使用する場合、最初に注意を払うべきです。ステップ2.1と3.4の間にハエを麻酔ときに、第2、実験者は長期のCO 2の影響を避けるために迅速に取り組むべきです代謝や行動に暴露。 20ハエのグループは、麻酔をかけ、新しいバイアルに、または20秒以下でフライポッドに移すことができます。食品バイアルに麻酔装置から転送された場合、バイアルは、食品の表面に立ち往生から麻酔をかけたハエを防ぐために、その側に載置されるべきです。ハエは、ステップ2.2のように、数日間にわたって放射性標識された食品を供給している場合、実験者はハエが脱水に敏感であるとして、食品が乾燥しないようにしてください。
摂食または絶食状態標識前に、標識の選択、ラベリング時間の長さ、フライポッド内の時間の長さ、および麻酔の方法は、この技術を使用している場合、トラブルシューティングおよび修正を施すことができるパラメータです。まず、短い標識期間にさらさハエ（2から3時間）は、事前に絶食期間に供されない限り、放射性標識食品のかなりの量を消費する可能性は低いです。ラベルcの第二に、選択一つは、代謝表現型について描画することが可能である結論に影響を与えます。 D-からの放射性標識CO 2生産[6- 14 C] -グルコースが酸化を反映しているのに対し、例えばD-から、放射性標識されたCO 2の生産[1- 14 C] -グルコースは、クエン酸サイクルまたはペントースリン酸シャントを介して酸化を反映することができますクエン酸サイクルを通じてのみ12,15,16。必須アミノ酸17,18のための放射性標識トレーサーとハエを供給してタンパク質に由来するアミノ酸の酸化を評価するための良い戦略でしょう。最後に、放射性標識されたグルコースとの長い標識期間はまた、トリグリセリド19と、このような容易にピルビン酸と相互変換するアラニンなどのアミノ酸などの分子の他のクラスにこの前駆体の取り込みの可能性を提起します。これは、分子6のこれらの異なるクラスに組み込まれた放射能を測定することによって評価することができます。確かに、ハエの独立したコホートは、ラジアンを供給することができます。同様にして基板をiolabeledし、次いで、例えば、条件6を保存し、摂食中のグリコーゲン及びトリグリセリドのままであり、絶食されたフライポッド実験または放射性標識の測定に使用しました。別の戦略は、放射性標識された食事の栄養素自体ではなく、これらの栄養素の貯蔵形態の酸化を明らかにする可能性がある短い標識期間を使用することです。第三に、ハエの二つのグループが最初に一定時間以上14 CO 2生産の同一速度が、非常に異なる速度を有し得ることも可能です。したがって、フライポッドに費やす飛行時間の量を変化させることは、表現型の変化を評価する際に変更するための重要なパラメータです。最後に、このプロトコルは、フライポッド装置にハエを入れ、CO 2麻酔の短期間の使用を呼び出します。 CO 2麻酔フライポッド実験の過程で代謝機能に影響を与える可能性があります。代替Approachは代謝率20に影響を与えない窒素麻酔を使用することです。
燃料の酸化および代謝率のような複雑なシステムを測定する任意の技術と同様に、ここで説明した方法には限界があります。まず、基板の異なる出発量の分析のCO 2回収段階に入るであろう、従って、放射性標識、食品の様々な量を消費することができ、異なるグループに飛んでいる可能性があります。これは、大きなサンプルサイズとし、一括ハエを供給することにより、実験を行うことにより、ある程度のために制御することができます。短い標識期間については、同様の青色の根性が放射性標識を消費しているだろうし、実験のチェース部に繰り越すことができて飛びます。ハエのグループ内に残っている放射性標識の量はまた、実験の終了時および摂食初期追跡期間の終了後にハエの別々のコホートにおいて測定することができます。間の第2、活動レベルフライポッド内のハエのグループが異なる場合があります。これは、実験的に決定し、データを解釈するときに考慮されなければなりません。第三に、この技術は、特定の食物栄養またはその栄養素の貯蔵形態（複数可）からのみの生産を合計CO 2産生を測定しません。このプロトコルはに代わるものではありませんが、代わりに、それは別の、追加情報を提供するため、VCO 2の測定に相補的です。
方法ここに記載されている対策は、特定の代謝基質の微量の酸化物である放射性標識されたCO 2を吐き出さ。グルコース、脂肪酸、またはアミノ酸 - - 使用されるラベルを変えることによって一つは、飢餓などの異なる生理的条件下で、異なる遺伝的背景の代謝に異なる基質の寄与を評価するために、ますます洗練された実験を設計することができます。この技術の将来のアプリケーションは、metabolisの測定を含みます開発の幼虫と蛹の段階、それぞれの栄養貯蔵及び故障、極端なことを特徴とするショウジョウバエのライフサイクルの2段階でメートル。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20 ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | Fisher Scientific | 09-874-20 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
References
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