Abstract
果蝇遗传学的电源被越来越多地应用到激素信号和代谢的问题，并在对人类疾病模型在该生物体的发展。需要如代谢率的参数测量敏感的方法，以推动小动物生理和疾病的认识，例如果蝇。此处所描述的方法评估的燃料氧化饲喂含14 C标记的底物如葡萄糖或脂肪酸痕量食品成蝇小的数字。馈送周期以及任何其他实验操作后，蝇转移至网眼封短管，然后将其放置在含有KOH饱和滤纸的玻璃小瓶该陷阱呼出，从放射性标记的底物如碳酸氢钾的氧化产生的放射性标记的 CO 2， KHCO 3。此放射性标记的碳酸氢盐是通过闪烁计数来测量。这是AQ燃料氧化研究uantitative，重复性好，简单的方法。使用放射性标记的葡萄糖，脂肪酸，或氨基酸的允许这些不同的燃料源到能量代谢不同的条件，如进料和禁食和在不同的遗传背景下作出的贡献的判定。这补充用于体内能量代谢以测量其他方法和应进一步代谢调节的理解。
Introduction
在模式生物果蝇的工作已经到遗传原理，发展过程，成长，衰老，行为，免疫和人类疾病1,2的理解作出了巨大贡献。在果蝇遗传学和细胞生物学方法一无数在这些领域带动发展。然而，新陈代谢在果蝇的研究已经发展较为缓慢，在很大程度上是由于在测量这样的小动物代谢参数的困难。在使用果蝇作为研究人类疾病如糖尿病的模型和对于理解代谢的增长和各种病症的捐款的兴趣已经被推领域开发和适应代谢技术这种微生物3,4。
可靠的方法现已为多家在果蝇代谢参数的测量。例如，它是简单的评估食物摄取
总的 CO 2生产的测定中，特别是当与O 2的消耗测量耦合，提供了有价值的洞察全身能量代谢。然而，这一措施不标识养分被氧化为三磷酸腺苷（ATP）的生产。营养素的三大类可以进入三羧酸循环以下转化为乙酰辅酶A：碳水化合物，脂肪酸，和蛋白。葡萄糖-6-磷酸，从膳食葡萄糖或储存的糖原衍生，可以转换到由丙酮酸脱氢酶脱羧以形成乙酰CoA丙酮酸盐。通过β-氧化收率乙酰CoA该再进入三羧酸循环从饮食或从存储的甘油三酯的脂肪酸击穿。最后上，大多数氨基酸可进入三羧酸循环以下转化为丙酮酸，乙酰辅酶A或三羧酸循环的中间产物如α-酮戊二酸。
基底和刺激条件期间能量代谢特定营养贡献可以通过使用放射性示踪剂的进行监测。这里介绍的协议适于在果蝇使用从用于评估在培养12,13生长的细胞氧化的协议。在这种方法中，果蝇是在饮食很短的时间（小时）馈14 C-放射性标记的代谢底物（碳水化合物，脂肪酸，或氨基酸）或长（天）脉冲，追赶上未标记食品，然后暴露于包含氢氧化钾（KOH） -饱和滤纸用于捕集呼出的CO 2的碳酸氢钠室中。放射性标记的碳酸氢盐可以通过闪烁计数进行定量。在实验的放射性-CO 2的生产差异苍蝇的人团可以反映使用不同的燃料的对ATP产量超过在燃料代谢基因型之间延长的快速或固有的差别的过程中，例如。
Protocol
1.飞食品制备含有放射性标记代谢底物
- 在离心管中，混合1 - 2微居里放射性标记的底物（D- [6- 14 C]葡萄糖，D- [1- 14 C]葡萄糖或[1- 14 C] -棕榈酸，40 - 60居里/毫摩尔）与1月15日微升FD＆C号蓝色食用染料和H 2 O等于25微升的总体积。
注意：碳14是一种低能量β发射体，并具有在空气中很短的范围内。但是，要小心防止放射性标记分子或实验者意外摄取的溢出。飞食品瓶翻倒容易;一定要容纳它们的容器中，这将防止其翻倒，特别是当放射性标记是液体形式（步骤1.2），或在未凝固食品（步骤1.4）。正在馈送或已被馈送放射标记底物将开始呼气少量的放射性标记的 CO 2的苍蝇。这些苍蝇应保存在亚克力箱在通风柜，和一小碟KOH的CaN为在用作CO 2洗涤器的框设置。 - 吸管所有放射性标记的底物和蓝色染料混合到一个空的飞食品小瓶的底部（高度：9.5厘米，宽2.2厘米）。
- 热标准飞食物在微波炉中，直至食物被刚液化（15 - 在功率电平高于含有10ml食品之一药瓶20秒）。
- 加入975微升熔融食品放射性标记的基板/蓝染料混合，迅速漩涡，监测蓝色的均匀性，以确保完全混合。
- 允许食物冷却，并在室温完全固化20 - 30分钟。
2.饲喂放射性标记代谢底物，以成人果蝇
- 麻醉成年使用由稠合到丙烯酸基和连接到与压力调节器的 CO 2罐多孔聚乙烯的在 CO 2麻醉装置苍蝇。以5升/分钟流动的 CO 2进入麻醉装置。
- 麻醉转移ð飞往含有放射性标记，蓝染食品瓶（N = 15 - 每瓶30苍蝇）。盖小瓶泡沫塞，水平休息，直到苍蝇醒过来。转移小瓶带盖容器压克力（180厘米×180厘米×240厘米高）。
- 转移苍蝇放射性标记的食物2前24小时- -短期饲养，饿死18苍蝇。3小时供给工序吨他饥饿步骤非常重要，因为美联储苍蝇就不能可靠地吃呈现给他们食物的新来源。对于长期馈送超过5的过程中 - 第7天，苍蝇不需要饿死，但实验者应监测放射性标记的食品在苍蝇都装在小瓶中的水含量，并使用针和注射器，以水添加到小瓶带干粮。
- 通过转移“窃听”他们到一个新的小瓶飞往未标记的食物。 2最初的追逐时期 - 4小时允许苍蝇从他们的角质层清除放射性标记的食物颗粒，并允许放射性标记的消化ED剩余的食物在肠道。显示器通过苍蝇的视觉检查肠道的食物进度寻找蓝色腹部。
- 随后，转飞到不同的食品种类（12 - 标准的食品或1％，琼脂24小时的的影响测量与喂养对呼吸空腹状态）或环境温度（12 - 96小时在18℃或30℃遗传使用温度敏感GAL80（GAL80 TS），对例如操作）。
注意：此追期间的长度将与正在执行的实验而变化。为例如 ，在30℃下的96小时追逐可能有必要在使用GAL80 TS为了实验充分激活GAL4依赖性转基因表达。
3. 二氧化碳 -Collection装置的制备
- 组装将包含标有14的C-葡萄糖或14 C-棕榈酸和Tha苍蝇材料建造“飞行舱”，网皑皑管ŧ将继续开放到大气中。切断为12毫米×75毫米的聚丙烯管的前50毫米，留下25毫米长，圆底管。准备130微米的尼龙网35毫米×35平方毫米。此外，获得的胶带分配器透明胶带。
- 集合， 二氧化碳 -collection设备材料。对于每个飞荚，组装20毫升玻璃闪烁瓶中，橡胶顶端止动件与偏心孔，以及通过孔在顶部塞子被插入一个中心，级GF / B玻璃微纤维滤纸（2.1厘米直径的圈，1微米孔径）。 GF / B滤纸的使用，因为它的高的湿强度和高承载能力。
- 上使用的当天制备5％的KOH的新鲜。只是步骤3.4之前，折叠和圆形GF / B滤纸放入中心孔即通过橡胶顶端止动件的孔螺纹并用100μl5％的KOH的饱和它。参见图1。
- 继未标记的媒体，一个孵化（S）nesthetize苍蝇与二氧化碳 。刷机飞入截止聚丙烯管，顶盖采用尼龙网，并用透明胶带坚持网格管。迅速开展工作，以避免苍蝇醒来，并在逃跑前网已经牢固地安装在管。苍蝇的数量不变应在每个飞荚特定实验中使用; 10 -每荚飞蝇20产生足够的放射性-CO 2通过闪烁计数（下面的步骤4.1）测量。
- 传送飞吊舱20毫升玻璃闪烁瓶中。帽与橡胶顶端止动件保持孔含有KOH饱和GF / B滤纸的中央的玻璃小瓶。折叠橡胶顶端止动件的宽顶部在玻璃闪烁小瓶的唇。参见图1。
- 包含在一个带盖，丙烯酸容器蝇集玻璃小瓶中，孵育的时间（2〜12小时工作良好）不同时期。
4.结果分析
- 在温育后，摘帽玻璃小瓶中，转移的KOH饱和GF / B滤纸上含有4毫升闪烁鸡尾酒6毫升的塑料闪烁小瓶的端部。
- 如果需要，冻结干冰，并存储在飞荚苍蝇在-80℃存储基板后确定。请注意，这些样品是放射性的，并且必须相应地存储。
- 另外准备闪烁瓶：含有未GF / B滤纸作为背景之一，含0.1差一分二点别人 - 0.5微居里放射性基板，以确定CPM /微居里。
- 测量使用根据制造商的方案用闪烁计数器每个样品的cpm。
- 计算皮摩尔14 CO 2 / CPM和皮摩尔14 CO 2的每飞行每小时。减去每个样品的CPM值背景CPM。从整齐的放射性基板的数据，计算出背景校正CPM /样品微居里计数。
- 使用制造商提供的特定活性和放射性标记的底物的放射化学浓度（例如，50微居里/微摩尔和0.1微居里/微升，分别）来计算皮摩尔/ CPM。使用此因素的背景校正飞行荚数据CPM 14 CO 2 /采样转换为皮摩尔14 CO 2 /样品。然后通过昆虫的数量和hr的在飞荚数分裂。
Representative Results
呼出和截留的放射性标记的 CO 2是从放射性底物代谢中产生的量应与苍蝇在苍蝇荚数量以及时间的动物中的CO 2的收集装置花费的金额相关联。为了测试这一点，禁食18小时，即蝇饲喂放射性标记的棕榈酸（0.02微居里/微升食品）2小时，然后用于放射标记的CO 2的生产在12或25只动物的组进行3或6小时的孵育测试。 的 CO 2的25个蝇产生的量几乎加倍12苍蝇产生的量，并为每个组的数量增加了一倍，当孵育时间从3小时提高到6小时（ 图2A）。在皮摩尔14 的 CO 2 /飞/小时，各组中几乎相等。
空腹由ßØ刺激脂肪酸的分解xidation;因此从脂肪酸氧化的 CO 2生产中应在禁食动物可升高与馈动物相比。为了确定这是否是的情况下，18小时禁食蝇饲喂放射性标记的棕榈酸2小时。以下这个短馈送脉冲，苍蝇分为两组，并转移到未标记的飞食品或1％琼脂3小时，然后转移到飞吊舱2小时。在两个独立的实验中，苍蝇追赶琼脂上产生显著更放射性标记的 CO 2与追赶上的食物（图2B）蝇相比，表明SS氧化反应在禁食动物增加。
图1. 该装置用于收集呼出，放射性标记的 CO 2。
过去那种消耗放射性代谢底物的苍蝇放入“飞荚”（FP），截止离心管目（M）封端。飞荚放入20ml的玻璃闪烁小瓶中并加盖用含有偏心孔包含用100μl饱和GF / B滤纸的橡胶顶塞（S），通过它被置于一个中心孔（CW） 5％的KOH。呼出的 CO 2与氢氧化钾反应，被捕获在滤纸上作为碳酸氢盐。困，放射性标记的二氧化碳可以通过饱和滤纸闪烁计数定量。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 时间 14 CO 2 生产相关，蝇在数飞波德与应对美联储和禁食条件。
（A）在果蝇产生的14 CO 2的供给放射性棕榈酸的量与测试苍蝇的数目有关（N = 12（空心柱）或25（闭合条））和时间在苍蝇荚花（3或6小时）。在每个飞基础，苍蝇产生0.99，1.13，1.10和1.01皮摩尔14 的 CO 2 /小时（在相同的左列向右顺序作为图形数据的数据）。
（二）被追赶上的琼脂氧化更多放射性比棕榈追了关于食物，苍蝇苍蝇。数据来自两个实验和报告为装置标准偏差，N = 16 - 17蝇/组（实验1）;每组10只苍蝇/组（实验2）。 * P = 0.017，学生t检验。 请点击此处查看该图的放大版本。
Discussion
这个协议描述了测量在成年果蝇特定放射性标记底物的氧化的方法。这种技术是直接的，定量的，可再现的和敏感的，并且它补充了测量总的 CO 2生产和O 2消耗，因为它可被用来识别被氧化为ATP产生的养分（多个）的现有方法。
使用这里描述的方法的特定的放射性标记底物的氧化释放的CO 2的测量是该测量总的 CO 2的生产技术是互补的。总的 CO 2生产（ⅤCO 2）允许代谢率的估计，并且当总的 O 2消耗（V 02）是已知的，代谢率可以计算和用于氧化燃料源可以基于所述呼吸交换率估计（Ⅴ CO2 / V O2 = RER）。什么时候碳水化合物是独占的衬底，RER = 1，但是，当脂肪酸是异源，RER = 0.7，由于葡萄糖和脂质氧化的反应的化学计量。在没有设备来测量在果蝇 14氧消耗，氧化燃料源不能被识别。然而，通过标记与一种放射性底物或另一种痕量和放射性标记的CO 2的生产的测量速率苍蝇，人们可以得出关于苍蝇的刺激过程中或约的效果以氧化在不同时间点的给定基底的能力的结论鉴于燃油氧化突变。
有许多在该协议的关键步骤。首先，应注意使用放射性物质，以避免泄漏和研究领域的污染作出。二，麻醉过程中的步骤2.1和3.4苍蝇时，实验者应迅速工作，以避免长时间的 CO 2的效果曝光的代谢和行为。 A组20苍蝇可麻醉并转移至新的小瓶或到20秒或更小的飞吊舱。当从麻醉设备转移到食物小瓶中，小瓶应当在其一侧被休息以防止麻醉蝇从卡住对食品的表面上。当苍蝇在数天的过程中馈放射性标记食品如在步骤2.2中，实验者应确保该食品不干透苍蝇是脱水敏感。
进食或禁食状态之前标签，标签的选择，标记的时间长度，时间在飞荚长度，和麻醉的方法是可以使用这种技术时，可以进行故障诊断和修正参数。首先，苍蝇经过短标签周期（2 - 3小时）不太可能，除非经受禁食期间提前消费的食品放射量显著。第二，标记C的选择有影响的结论之一就是能够得出代谢表型。例如，从D-放射性标记的CO 2的生产[1- 14 C]葡萄糖能反映通过柠檬酸循环或戊糖磷酸分流氧化，而 从D-放射性标记的 CO 2的生产[6- 14 C]葡萄糖反映氧化通过三羧酸循环只有12,15,16。馈送带放射性标记的示踪物的苍蝇为一种必需氨基酸17,18将是评估从蛋白质衍生的氨基酸氧化的好策略。最后，用放射性标记的葡萄糖冗长标记周期也提高到其它类分子，如甘油三酯19和氨基酸，如丙氨酸，易于与丙酮酸interconverts该前体中掺入的可能性。这可通过测量放射性掺入这些不同类分子6的进行评估。事实上，苍蝇独立的同伙可以喂拉德以相同的方式iolabeled基底，然后用于存储和在馈保持在糖原和甘油三酯和禁食条件6，例如苍蝇荚果实验或放射性标记的测量。另一个策略是使用有可能揭示本身放射性标记的膳食的营养成分的氧化和这些营养素不存储形式的短标记周期。第三，它也有可能是蝇两组可具有14 CO 2的产量超过给定的时间量的相同速率，但很不同的速率最初。因此，不同的时间是拥有在飞荚花费的金额可以是评估表型变异时改变的重要参数。最后，该协议要求使用二氧化碳麻醉苍蝇把成飞荚设备时短时间的。这是可能的CO 2的麻醉可能影响代谢功能在飞荚实验过程。另一种一接近角是使用氮麻醉不影响代谢速率20。
与测量这样一个复杂的系统，燃料的氧化和代谢速率的任何技术，这里所描述的方法具有局限性。首先，它可能是在不同的组可以消耗不同量的放射性标记的食品苍蝇，这将与衬底的不同起始量进入该测定的CO 2的收集阶段。这可以通过执行与大样本实验和饲养苍蝇成群加以控制在一定程度。短标签时期，过得有类似蓝色的胆量都将消耗的放射性标记，可以结转到实验的追逐部分。剩余的一组蝇中的放射性标记的量也可以在实验结束时，并在进料和初始追逐期间结束后的苍蝇单独队列测量。第二，之间的活动水平在飞豆荚苍蝇基团可以不同。这将必须通过实验来确定，并解释数据时加以考虑。第三，该技术不测量总CO 2的生产，只是从一个特定的食物营养或营养的存储形式（多个）的生产。这个协议是不进行更换，而是对VCO 2的测量互补，因为它提供了不同的和额外的信息。
这里所描述的方法测量呼出，放射性标记的 CO 2是特定的代谢底物的痕量的氧化的产物。通过改变所用的标记 - 葡萄糖，脂肪酸，或氨基酸 - 可以设计越来越复杂的实验，以评估不同的基材的代谢不同的生理条件如饥饿和在不同的遗传背景下做出的贡献。这种技术的未来应用包括metabolis测量米发展的幼虫和蛹的阶段， 果蝇的生命周期为特征的营养分别储存和分解，极端的两个阶段。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20 ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | Fisher Scientific | 09-874-20 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
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