Abstract
ड्रोसोफिला आनुवंशिकी की शक्ति तेजी से हार्मोन संकेत और चयापचय के सवाल करने के लिए और इस जीव में मानव रोग के मॉडल के विकास के लिए लागू किया जा रहा है। इस तरह के चयापचय दर के रूप में मानकों के मापन के लिए संवेदनशील तरीकों जैसे फल मक्खी के रूप में शरीर विज्ञान और छोटे जानवरों में बीमारी की समझ ड्राइव करने के लिए आवश्यक हैं। विधि यहाँ वर्णित जैसे ग्लूकोज या फैटी एसिड के रूप में 14 सी-लेबल substrates की मात्रा का पता लगाने युक्त खाना खिलाया वयस्क मक्खियों की कम संख्या में ईंधन ऑक्सीकरण का आकलन है। खिला अवधि और किसी भी अतिरिक्त प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के बाद, मक्खियों जाल के साथ छाया हुआ लघु ट्यूब, जो तब उस जाल exhaled KOH संतृप्त फिल्टर पेपर युक्त कांच की शीशियों में रखा जाता है करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, radiolabeled सीओ 2 पोटेशियम बिकारबोनिट के रूप में radiolabeled substrates के ऑक्सीकरण से उत्पन्न, KHCO 3। यह radiolabeled बिकारबोनिट जगमगाहट गिनती से मापा जाता है। इस AQ हैईंधन ऑक्सीकरण के अध्ययन के लिए, uantitative प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और सरल दृष्टिकोण। radiolabeled ग्लूकोज, फैटी एसिड, या एमिनो एसिड का इस्तेमाल इस तरह के भोजन और उपवास के रूप में और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में अलग अलग परिस्थितियों में ऊर्जा चयापचय के लिए इन विभिन्न ईंधन के स्रोतों के योगदान के निर्धारण की अनुमति देता है। यह अन्य विवो ऊर्जा चयापचय में मापने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण का पूरक है और चयापचय विनियमन की समझ को आगे करना चाहिए।
Introduction
मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में काम आनुवंशिक सिद्धांतों, विकास की प्रक्रिया, विकास, उम्र बढ़ने, व्यवहार, प्रतिरक्षा और मानव रोग 1,2 को समझने के लिए बहुत योगदान दिया। ड्रोसोफिला में आनुवंशिक और सेल जैविक दृष्टिकोण के असंख्य इन क्षेत्रों में प्रगति को प्रेरित किया है। हालांकि, फल मक्खी में चयापचय के अध्ययन, और धीरे धीरे विकसित किया गया है इस तरह के एक छोटे से जानवर में चयापचय मापदंडों को मापने में कठिनाइयों के बड़े हिस्से में कारण। ड्रोसोफिला मधुमेह जैसे मानव रोगों के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में प्रयोग में और वृद्धि और विभिन्न विकृतियों के लिए चयापचय के योगदान को समझने के लिए ब्याज क्षेत्र को विकसित करने और इस जीव 3,4 के लिए चयापचय तकनीक अनुकूल करने के लिए धक्का दिया गया है।
विश्वसनीय तरीके अब फल मक्खी में चयापचय मानकों के एक नंबर की माप के लिए उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए, यह भोजन का सेवन आकलन करने के लिए सीधा है
कुल सीओ 2 उत्पादन की माप, खासकर जब हे 2 खपत की माप के साथ मिलकर, पूरे शरीर को ऊर्जा चयापचय में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हालांकि, इस उपाय के पोषक तत्व की पहचान नहीं करता adenosine triphosphate (एटीपी) के उत्पादन के लिए ऑक्सीकरण जा रहा है। कार्बोहाइड्रेट, फैटी एसिड, प्रोटीन और पोषक तत्वों के तीन प्रमुख वर्गों साइट्रिक एसिड चक्र निम्नलिखित रूपांतरण एसिटाइल को सीओए में प्रवेश कर सकते हैं। ग्लूकोज-6-फॉस्फेट, आहार ग्लूकोज या संग्रहीत ग्लाइकोजन से निकाली गई, पाइरूवेट कि पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज द्वारा decarboxylated है एसिटाइल सीओए के लिए फार्म के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। सीओए एसिटाइल एसएस ऑक्सीकरण पैदावार कि तब साइट्रिक एसिड चक्र में प्रवेश करती द्वारा आहार से या संग्रहीत ट्राइग्लिसराइड्स से निकाली गई फैटी एसिड का टूटना। आखिरकार, अमीनो एसिड के बहुमत ऐसे अल्फा-ketoglutarate के रूप में सीओए या साइट्रिक एसिड चक्र मध्यवर्ती एसिटाइल, पाइरूवेट के लिए रूपांतरण के बाद साइट्रिक एसिड चक्र में प्रवेश कर सकते हैं।
बेसल और उत्तेजित शर्तों के दौरान ऊर्जा चयापचय को पोषक तत्वों से विशिष्ट योगदान रेडियोधर्मी ट्रेसर के उपयोग के माध्यम से नजर रखी जा सकती है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल संस्कृति 12,13 में विकसित कोशिकाओं में ऑक्सीकरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल एक प्रोटोकॉल से ड्रोसोफिला में उपयोग के लिए अनुकूलित है। इस दृष्टिकोण में, फल मक्खियों एक छोटी (घंटे) के लिए आहार में फेड 14 सी-radiolabeled चयापचय substrates (कार्बोहाइड्रेट, फैटी एसिड, या एमिनो एसिड) या लंबे समय (दिन) नाड़ी, लेबल हटाया गया भोजन पर पीछा किया, और फिर एक को उजागर कर रहे हैं चैम्बर बिकारबोनिट के रूप में exhaled सीओ 2 को फँसाने के लिए युक्त पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (KOH) -saturated फिल्टर पेपर। Radiolabeled बिकारबोनिट जगमगाहट गिनती द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। Radiolabeled-सीओ 2 प्रयोग के बीच उत्पादन में मतभेदमक्खियों के अल समूहों जीनोटाइप के बीच ईंधन चयापचय में एक लंबे समय तक तेज या आंतरिक मतभेदों के पाठ्यक्रम पर एटीपी के उत्पादन के लिए विभिन्न ईंधन के प्रयोग, उदाहरण के लिए प्रतिबिंबित कर सकते हैं।
Protocol
1. मक्खी भोजन की तैयारी युक्त radiolabeled मेटाबोलिक Substrates
- एक microfuge ट्यूब में, मिश्रण 1 - 2 μCi radiolabeled सब्सट्रेट (डी [6 14 सी] -glucose, डी [1- 14 सी] -glucose या [1- 14 सी] -palmitic एसिड, 40 - 60 एमसीआई / 15 μl एफडी और सी नंबर 1 नीले रंग के साथ भोजन mmol) और एच 2 ओ 25 μl की कुल मात्रा के बराबर करने के लिए।
चेतावनी: कार्बन -14 एक कम ऊर्जा बीटा emitter है और हवा में एक छोटी श्रृंखला है। हालांकि, radiolabeled अणुओं या प्रयोगकर्ता द्वारा आकस्मिक घूस की spilling रोकने के लिए ध्यान रखना। मक्खी भोजन शीशियों आसानी से नोक पर; या उन्हें एक कंटेनर है कि उन्हें ढोने से रोकने के लिए, खासकर जब radiolabel तरल रूप में है में घर के लिए यकीन है कि (1.2 चरण) unsolidified भोजन (1.4 कदम) में हो। मक्खियों कि खिलाया जा रहा है या radiolabeled substrates तंग आ गया है radiolabeled सीओ 2 की छोटी मात्रा में साँस छोड़ते शुरू हो जाएगा। इन मक्खियों धूआं डाकू में एक्रिलिक बक्से में रखा जाना चाहिए, और कोह सीए के एक छोटे पकवानn सीओ 2 रंडी के रूप में उपयोग के लिए बॉक्स में सेट किया। - Pipet radiolabeled सब्सट्रेट और एक खाली शीशी मक्खी भोजन के तल में नीले रंग की डाई मिश्रण के सभी (ऊंचाई: 9.4 सेमी, चौड़ाई: 2.2 सेमी)।
- हीट मानक एक माइक्रोवेव ओवन में भोजन के लिए उड़ान भरने जब तक खाना बस तरलीकृत है (15 - शक्ति स्तर भोजन के 10 मिलीग्राम से युक्त एक शीशी के लिए उच्च से कम 20 सेकंड)।
- radiolabeled सब्सट्रेट / नीले रंग की डाई मिश्रण करने के लिए 975 μl पिघला हुआ भोजन जोड़ें और जल्दी से चक्कर आने, निगरानी नीले रंग की एकरूपता पूरा मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए।
- 30 मिनट - खाद्य शांत और 20 के लिए आरटी पर पूरी तरह से जमना करने की अनुमति दें।
2. दूध पिलाने radiolabeled मेटाबोलिक एडल्ट फल मक्खियों को Substrates
- असंवेदनता वयस्क सीओ 2 anesthetizing एक एक्रिलिक आधार करने के लिए जुड़े हुए हैं और एक दबाव नियामक के साथ एक सीओ 2 टैंक से जुड़े झरझरा पॉलीथीन से मिलकर तंत्र का उपयोग करते हुए मक्खियों। 5 एल / मिनट पर सीओ 2 प्रवाह anesthetizing तंत्र में।
- स्थानांतरण Anesthetize(- शीशी प्रति 30 मक्खियों एन = 15) डी radiolabeled, नीले रंगे भोजन युक्त शीशियों के लिए मक्खियों। एक फोम डाट के साथ कैप शीशियों, और क्षैतिज आराम जब तक मक्खियों जगा। एक lidded एक्रिलिक कंटेनर को हस्तांतरण शीशियों (180 सेमी x 180 सेमी x 240 सेमी उच्च)।
- एक 2 के लिए radiolabeled भोजन करने के लिए मक्खियों स्थानांतरित करने से पहले 24 घंटा - - अल्पकालिक खिलाने के लिए, 18 के लिए मक्खियों को भूखा। 3 घंटा खिला कदम टी वह भुखमरी कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि फेड मक्खियों मज़बूती से भोजन का एक नया स्रोत उन्हें प्रस्तुत नहीं खाऊँगा । 5 के पाठ्यक्रम पर लंबे समय तक खिलाने के लिए - 7 दिन, मक्खियों भूखे नहीं किया जा जरूरत है, लेकिन प्रयोगकर्ता शीशियों मक्खियों में रखे जाते हैं में radiolabeled भोजन के पानी की सामग्री की निगरानी और शीशियों के लिए पानी जोड़ने के लिए एक सुई और सिरिंज का उपयोग करना चाहिए सूखे भोजन के साथ।
- स्थानांतरण उन्हें एक नई शीशी में "दोहन" द्वारा लेबल हटाया गया भोजन के लिए मक्खियों। 2 के एक प्रारंभिक चेस अवधि - 4 घंटा मक्खियों उनकी cuticles से radiolabeled खाद्य कणों को साफ करने की अनुमति देता है और radiolabel के पाचन परमिटएड भोजन पेट में शेष है। मक्खियों के दृश्य निरीक्षण से पेट के माध्यम से भोजन की प्रगति की निगरानी नीले पेट के लिए देखने के लिए।
- बाद में, हस्तांतरण विभिन्न प्रकार के भोजन के लिए मक्खियों 96 घंटा के आनुवंशिक के लिए 18 सी या 30 सेल्सियस पर - - 12 या परिवेश तापमान ((12 के प्रभाव की माप के लिए मानक खाना या 1% अगर पर 24 घंटा श्वसन पर उपवास राज्य बनाम खिलाया) जोड़तोड़, तापमान के प्रति संवेदनशील GAL80 (GAL80 टीएस) का उपयोग कर उदाहरण के लिए)।
नोट: इस लक्ष्य का पीछा अवधि की लंबाई प्रयोग किया जा रहा है साथ अलग अलग होंगे। उदाहरण के लिए, 30 सी में एक 96 घंटा के लक्ष्य का पीछा क्रम में GAL80 टीएस का उपयोग करते हुए प्रयोगों में आवश्यक हो सकता है पूरी तरह से GAL4 निर्भर transgene अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए।
3. सीओ 2 -Collection तंत्र की तैयारी
- निर्माण "फली मक्खी" के लिए सामग्री, जाल से ढकी ट्यूबों कि 14 सी ग्लूकोज या 14 सी-पामिटिक एसिड और Tha के साथ लेबल मक्खियों में शामिल होंगे इकट्ठाटी वातावरण के लिए खुला रहेगा। 12 मिमी x 75 मिमी polypropylene ट्यूबों के शीर्ष 50 मिमी कट, 25 मिमी लंबे, दौर तली नलियों को छोड़कर। 35 मिमी x 35 130 माइक्रोन नायलॉन जाल का मिमी चौकों तैयार करें। इसके अलावा, एक टेप मशीन में पारदर्शी टेप प्राप्त करते हैं।
- सीओ 2 -collection apparatuses के लिए सामग्री इकट्ठा करो। प्रत्येक फली के लिए उड़ान भरने के लिए, एक 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी, एक बंद केंद्र छेद के साथ एक रबर शीर्ष डाट, एक केंद्र अच्छी तरह से शीर्ष डाट में छेद के माध्यम से डाला जाएगा, ग्रेड GF / बी कांच microfiber फिल्टर पेपर (2.1 सेमी व्यास इकट्ठा वृत्त, 1 माइक्रोन ताकना)। GF / बी फिल्टर पेपर इसकी उच्च गीला शक्ति और उच्च लोड क्षमता की वजह से किया जाता है।
- उपयोग के दिन पर 5% KOH ताजा तैयार करें। बस 3.4 कदम से पहले, गुना और केंद्र में अच्छी तरह से है कि रबर शीर्ष डाट के छेद के माध्यम से पिरोया है में परिपत्र GF / बी फिल्टर पेपर जगह और 5% KOH के 100 μl के साथ तर। 1 चित्रा को देखें।
- लेबल हटाया गया मीडिया, एक पर ऊष्मायन (एस) के बादnesthetize सीओ 2 के साथ मक्खियों। ब्रश कटऑफ polypropylene ट्यूब, नायलॉन जाल के साथ टोपी में मक्खियों, और ट्यूब के लिए जाल पालन करने के लिए पारदर्शी टेप का उपयोग करें। जल्दी से काम मक्खियों जागने और पहले जाल सुरक्षित ट्यूब से चिपका कर दिया गया है भागने से बचने के लिए। मक्खियों की संख्या बराबर एक विशेष प्रयोग के लिए प्रत्येक मक्खी फली में इस्तेमाल किया जाना चाहिए; 10 - मक्खी फली प्रति 20 मक्खियों जगमगाहट गिनती (नीचे 4.1 कदम) द्वारा माप के लिए पर्याप्त radiolabeled-सीओ 2 का उत्पादन।
- एक 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी के लिए उड़ान भरने फली स्थानांतरण। रबर शीर्ष डाट अच्छी तरह KOH संतृप्त GF / बी फिल्टर पेपर युक्त एक केंद्र जोत के साथ कांच की शीशी टोपी। कांच जगमगाहट शीशी के होंठ पर रबर शीर्ष डाट की व्यापक शीर्ष मोड़ो। 1 चित्रा को देखें।
- सेट गिलास एक lidded, एक्रिलिक कंटेनर में मक्खियों युक्त शीशियों, और समय (2 से 12 मानव संसाधन अच्छी तरह से काम करता है) के समय में परिवर्तन के लिए सेते हैं।
4. परिणाम का विश्लेषण
- परऊष्मायन, खुलना कांच की शीशियों, और एक 6 मिलीलीटर की प्लास्टिक जगमगाहट 4 मिलीलीटर जगमगाहट कॉकटेल युक्त शीशी के लिए स्थानांतरण KOH संतृप्त GF / बी फिल्टर पेपर के अंत।
- यदि आवश्यक हो, संग्रहीत substrates के बाद के निर्धारण के लिए -80 सेल्सियस पर सूखी बर्फ और दुकान पर मक्खी फली में मक्खियों फ्रीज। ध्यान दें कि इन नमूनों में रेडियोधर्मी कर रहे हैं और तदनुसार संग्रहीत किया जाना चाहिए।
- / सीपीएम निर्धारित करने के लिए μCi 0.5 μCi radiolabeled सब्सट्रेट - अप्रयुक्त GF / बी फिल्टर पेपर युक्त पृष्ठभूमि के रूप में सेवा करने के लिए एक और एक से दो 0.1 युक्त दूसरों: अतिरिक्त जगमगाहट शीशियों तैयार करें।
- निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक जगमगाहट काउंटर का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए सीपीएम को मापने।
- प्रति घंटे की गणना pmol 14 सीओ 2 / सीपीएम और pmol 14 सीओ 2 मक्खी प्रति। प्रत्येक नमूना के लिए सीपीएम मूल्य से पृष्ठभूमि सीपीएम घटाएँ। साफ radiolabeled सब्सट्रेट डेटा से, गणना पृष्ठभूमि को सही सीपीएम / नमूना के μCi गिना।
- उपयोगनिर्माता-प्रदान की विशिष्ट गतिविधि और radiolabeled सब्सट्रेट के radiochemical एकाग्रता (उदाहरण के लिए, 50 μCi / μmol और 0.1 μCi / μl, क्रमशः) pmol / सीपीएम की गणना करने के लिए। इस पहलू का प्रयोग सीपीएम 14 सीओ 2 / नमूना से pmol 14 सीओ 2 / नमूना के लिए पृष्ठभूमि को सही मक्खी फली डेटा परिवर्तित करने के लिए। फिर मक्खियों की संख्या और मक्खी फली में मानव संसाधन की संख्या से विभाजित।
Representative Results
Exhaled और फंस radiolabeled सीओ 2 की मात्रा कि एक रेडियोधर्मी सब्सट्रेट के चयापचय से उत्पादन किया है एक मक्खी फली में मक्खियों की संख्या के साथ-साथ समय की राशि जानवरों सीओ 2 संग्रह तंत्र में खर्च के साथ संबंध स्थापित करना चाहिए। इस परीक्षण के लिए, मक्खियों है कि 18 घंटे के लिए उपवास कर रहे थे 2 घंटे के लिए radiolabeled पामिटिक एसिड (0.02 μCi / μl खाद्य) खिलाया गया और फिर 3 या 6 घंटा incubations के लिए 12 या 25 पशुओं के समूह में radiolabeled सीओ 2 उत्पादन के लिए परीक्षण किया। सीओ 2 की मात्रा को 25 मक्खियों द्वारा उत्पादित लगभग दोगुनी राशि 12 मक्खियों द्वारा उत्पादित था, और प्रत्येक समूह के लिए राशि दोगुनी जब ऊष्मायन समय 6 घंटा (2A चित्रा) के लिए 3 घंटा से वृद्धि हुई थी। Pmol 14 सीओ 2 / मक्खी / घंटा प्रत्येक समूह में लगभग बराबर था।
उपवास एसएस ओ द्वारा फैटी एसिड के टूटने को उत्तेजित करता हैxidation; इसलिए सीओ फैटी एसिड ऑक्सीकरण से 2 उत्पादन खिलाया जानवरों के साथ तुलना उपवास पशुओं में ऊंचा किया जाना चाहिए। इस मामले था कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, 18 घंटे की उपवास मक्खियों 2 घंटे के लिए radiolabeled पामिटिक एसिड खिलाया गया। इस छोटे से खिला नाड़ी के बाद, मक्खियों को दो समूहों में विभाजित किया गया है और 3 घंटे के लिए लेबल हटाया गया मक्खी भोजन या 1% अगर को हस्तांतरित और फिर 2 घंटे के लिए फली उड़ान भरने के लिए स्थानांतरित कर दिया। दो अलग-अलग प्रयोगों में, अगर उत्पादन काफी अधिक radiolabeled सीओ 2 भोजन (चित्रा 2 बी) पर पीछा किया मक्खियों के साथ तुलना पर पीछा किया मक्खियों, यह दर्शाता है कि एसएस ऑक्सीकरण उपवास पशुओं में वृद्धि की गई थी।
चित्रा 1. exhaled इकट्ठा करने के लिए उपकरण, radiolabeled सीओ 2।
मक्खियों कि radiolabeled चयापचय substrates भस्म हो रहे हैंएक "मक्खी फली" (एफपी), एक कटऑफ अपकेंद्रित्र ट्यूब मेष (एम) के साथ छाया में रखा। मक्खी फली एक 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी में रखा गया है और एक रबर शीर्ष डाट (एस) एक बंद केंद्र छेद युक्त, जिसके माध्यम से एक केंद्र अच्छी तरह से (सीडब्ल्यू) रखा गया है कि GF / बी फिल्टर पेपर 100 μl के साथ संतृप्त होता है के साथ छाया हुआ है 5% KOH। Exhaled सीओ 2 KOH के साथ प्रतिक्रिया करता है और बिकारबोनिट के रूप में फिल्टर पेपर पर फंस गया है। फंसा, radiolabeled सीओ 2 संतृप्त फिल्टर पेपर की जगमगाहट गिनती द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. समय के साथ 14 सीओ 2 उत्पादन संबद्ध है और मक्खियों की संख्या एक मेंफ्लाई फली और फेड और उपवास परिस्थितियों का जवाब।
(ए) radiolabeled palmitate तंग आ चुके 14 सीओ 2 मक्खियों में उत्पादित की राशि का परीक्षण किया मक्खियों की संख्या के साथ संबद्ध (एन = 12 (खुला सलाखों) या 25 (बंद सलाखों)) और समय एक मक्खी फली में खर्च (3 या 6 घंटा )। एक प्रति-मक्खी आधार पर मक्खियों 0.99, 1.13, 1.10 और 1.01 pmol 14 सीओ 2 / घंटा (ग्राफ डेटा के रूप में सही क्रम के लिए एक ही बाएँ में सूचीबद्ध डेटा) का उत्पादन किया।
(बी) मक्खियों कि मक्खियों कि भोजन पर पीछा कर रहे थे की तुलना में अधिक radiolabeled palmitate ऑक्सीकरण अगर पर पीछा कर रहे थे। डेटा दो प्रयोगों से कर रहे हैं और रिपोर्ट कर रहे हैं मानक विचलन का मतलब है के रूप में, एन = 16 - 17 मक्खियों / समूह (प्रयोग 1); एन = 10 मक्खियों / समूह (प्रयोग 2)। * पी = 0.017, छात्र की टी परीक्षण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
इस प्रोटोकॉल वयस्क ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में विशिष्ट radiolabeled substrates के ऑक्सीकरण को मापने के लिए एक विधि का वर्णन है। इस तकनीक को सरल मात्रात्मक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और संवेदनशील है, और यह मौजूदा तरीकों कि कुल सीओ 2 उत्पादन और ओ 2 की खपत को मापने क्योंकि यह पोषक तत्व (s) एटीपी के उत्पादन के लिए किया जा रहा ऑक्सीकरण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का पूरक है।
सीओ 2 का मापन विधि यहाँ वर्णित का उपयोग कर विशिष्ट radiolabeled substrates के ऑक्सीकरण से मुक्त तकनीक है कि कुल सीओ 2 उत्पादन को मापने के लिए पूरक है। कुल सीओ 2 उत्पादन (वी सीओ 2) चयापचय दर के आकलन की अनुमति देता है और, जब कुल हे 2 खपत (वी ओ 2) में जाना जाता है, चयापचय दर की गणना की जा सकती है और ऑक्सीकरण के लिए ईंधन के स्रोत श्वसन विनिमय अनुपात के आधार पर अनुमान लगाया जा सकता है (वि सीओ 2 / वी ओ 2 = RER)। कबकार्बोहाइड्रेट अनन्य सब्सट्रेट, RER = 1 हैं, लेकिन फैटी एसिड अनन्य स्रोत, RER = 0.7, ग्लूकोज और लिपिड ऑक्सीकरण की प्रतिक्रियाओं के stoichiometry के कारण होते हैं। उपकरण ड्रोसोफिला 14 में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए के अभाव में, ऑक्सीडेटिव ईंधन के स्रोत की पहचान नहीं की जा सकती है। हालांकि, लेबलिंग एक रेडियोधर्मी सब्सट्रेट से या किसी अन्य की मात्रा और radiolabeled सीओ 2 उत्पादन की मापने दरों का पता लगाने के साथ मक्खियों द्वारा, एक निष्कर्ष मक्खियों की क्षमता के लिए एक प्रोत्साहन के दौरान या किसी के प्रभाव के बारे में अलग अलग समय बिंदुओं पर एक दिया सब्सट्रेट oxidize करने के बारे में आकर्षित कर सकते हैं ईंधन ऑक्सीकरण पर उत्परिवर्तन दिया।
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर रहे हैं। सबसे पहले, ध्यान जब रेडियोधर्मी सामग्री का उपयोग फैल और अनुसंधान के क्षेत्रों के संक्रमण से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। दूसरा, जब कदम 2.1 और 3.4 के दौरान मक्खियों anesthetizing, प्रयोगकर्ता जल्दी से काम करना चाहिए लंबे समय तक सीओ 2 के प्रभाव से बचने के लिएचयापचय और व्यवहार पर जोखिम। 20 मक्खियों के एक समूह anesthetized और एक नई शीशी या 20 सेकंड या उससे कम में एक मक्खी फली में स्थानांतरित किया जा सकता है। जब एक खाद्य शीशी के लिए एक संज्ञाहरण तंत्र से स्थानांतरित, शीशी भोजन सतह पर अटक रही से anesthetized मक्खियों को रोकने के लिए अपने पक्ष पर विश्राम किया जाना चाहिए। मक्खियों 2.2 कदम के रूप में कई दिनों के पाठ्यक्रम पर फेड radiolabeled भोजन कर रहे हैं, प्रयोगकर्ता बीमा होना चाहिए कि खाना बाहर सूखा नहीं है के रूप में मक्खियों निर्जलीकरण के प्रति संवेदनशील हैं।
फेड या उपवास राज्य लेबलिंग करने से पहले, लेबल की पसंद है, लेबलिंग समय की लंबाई, मक्खी फली में समय की लंबाई, और संज्ञाहरण की विधि मानकों को जब इस तकनीक का उपयोग कि समस्या निवारण और संशोधन के लिए किए जा सकते हैं। (- 3 घंटा 2) radiolabeled भोजन के महत्वपूर्ण मात्रा में उपभोग करने के लिए जब तक कि पहले से एक उपवास अवधि के अधीन संभावना नहीं है सबसे पहले, लघु अवधि के लेबलिंग के अधीन मक्खियों। दूसरा, लेबल ग की पसंदएक निष्कर्ष एक चयापचय phenotypes के बारे में आकर्षित करने के लिए सक्षम है प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, डी से radiolabeled सीओ 2 उत्पादन [1- 14 सी] -glucose, साइट्रिक एसिड चक्र या pentose फॉस्फेट अलग धकेलना के माध्यम से ऑक्सीकरण प्रतिबिंबित कर सकते हैं, जबकि डी से radiolabeled सीओ 2 उत्पादन [6 14 सी] -glucose ऑक्सीकरण को दर्शाता है साइट्रिक एसिड चक्र के माध्यम से ही 12,15,16। दूध पिलाने की एक radiolabeled दरियाफ्त के साथ मक्खियों एक आवश्यक अमीनो एसिड 17,18 के लिए प्रोटीन से निकाली गई अमीनो एसिड के ऑक्सीकरण का आकलन करने के लिए एक अच्छी रणनीति होगी। अंत में, radiolabeled ग्लूकोज के साथ लंबी अवधि के लेबलिंग भी इस तरह के ट्राइग्लिसराइड्स 19 और ऐसे alanine, जो आसानी से पाइरूवेट साथ interconverts के रूप में अमीनो एसिड के रूप में अणुओं के अन्य वर्गों में इस अग्रदूत को शामिल करने की संभावना बढ़ा। इस अणुओं 6 के इन विभिन्न वर्गों में शामिल रेडियोधर्मिता मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। दरअसल, मक्खियों की अलग साथियों खिलाया जा सकता है रेडएक ही तरीके से substrates iolabeled और फिर उड़ फली प्रयोगों या radiolabel की माप है कि संग्रहीत है और फेड में ग्लाइकोजन और ट्राइग्लिसराइड्स में रहता है और उपवास की स्थिति 6, उदाहरण के लिए के लिए इस्तेमाल किया। एक और रणनीति छोटी-लेबलिंग समय है कि खुद को radiolabeled आहार में पोषक तत्वों की ऑक्सीकरण और इन पोषक तत्वों की नहीं भंडारण रूपों को प्रकट करने की संभावना है का उपयोग है। तीसरा, यह भी संभव है मक्खियों के दो समूहों के 14 से समय की एक निश्चित राशि से अधिक सीओ 2 उत्पादन के समान दरों, लेकिन बहुत अलग दरों शुरू हो सकता है। इसलिए, समय की राशि मक्खी फली में खर्च मक्खियों कि बदलती जब प्ररूपी भिन्नता का आकलन करने को बदलने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर हो सकता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल सीओ 2 संज्ञाहरण जब मक्खी फली तंत्र में मक्खियों डालने की एक छोटी अवधि के उपयोग के लिए कहता है। ऐसा नहीं है कि सीओ 2 संज्ञाहरण मक्खी फली प्रयोग के पाठ्यक्रम पर चयापचय समारोह को प्रभावित कर सकता है संभव है। एक वैकल्पिक एकpproach नाइट्रोजन संज्ञाहरण जो चयापचय दर 20 प्रभावित नहीं करता है का उपयोग करने के लिए है।
किसी भी तकनीक है कि ईंधन ऑक्सीकरण और चयापचय दर के रूप में इस तरह के एक जटिल प्रणाली के उपाय के साथ के रूप में, विधि यहाँ वर्णित सीमाएँ हैं। सबसे पहले, यह है कि विभिन्न समूहों radiolabeled भोजन के विभिन्न मात्रा में उपभोग कर सकता है में उड़ता है और इस प्रकार सब्सट्रेट के विभिन्न मात्रा के साथ शुरू परख के सीओ 2 संग्रह चरण में प्रवेश करेगा संभव है। यह बड़ा नमूना आकार के साथ प्रयोग के प्रदर्शन से और सामूहिक रूप से मक्खियों खिलाने से कुछ हद तक नियंत्रित किया जा सकता। लघु अवधि के लिए लेबलिंग, मक्खियों समान नीले रंग का हिम्मत के साथ radiolabel का सेवन किया जाएगा और प्रयोग के लक्ष्य का पीछा हिस्से को आगे बढ़ाया जा सकता है। मक्खियों के एक समूह में शेष radiolabel की राशि भी प्रयोग के अंत में और खिलाने और प्रारंभिक चेस अवधि की समाप्ति के बाद मक्खियों के अलग-अलग साथियों में मापा जा सकता है। दूसरा, के बीच गतिविधि का स्तरमक्खी फली में मक्खियों के समूहों के अलग हो सकता है। इस प्रयोगात्मक निर्धारित है और जब डेटा की व्याख्या ध्यान में रखा जाना पड़ेगा। तीसरा, इस तकनीक की कुल सीओ 2 उत्पादन, केवल एक विशेष आहार पोषक तत्व या कि पोषक तत्व के भंडारण के रूप (एस) से उत्पादन उपाय नहीं है। इस प्रोटोकॉल के लिए एक प्रतिस्थापन नहीं है, लेकिन इसके बजाय VCO 2 की माप के लिए पूरक है, क्योंकि यह अलग है और अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है।
विधि यहाँ वर्णित exhaled, radiolabeled सीओ 2 विशिष्ट चयापचय substrates की मात्रा का पता लगाने के ऑक्सीकरण का एक उत्पाद है कि उपाय। ग्लूकोज, फैटी एसिड, या एमिनो एसिड - - लेबल इस्तेमाल किया अलग करके एक तेजी से परिष्कृत प्रयोगों ऐसे भुखमरी के रूप में और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर अलग-अलग शारीरिक शर्तों के तहत चयापचय के लिए विभिन्न substrates के योगदान का आकलन करने के लिए डिजाइन कर सकते हैं। इस तकनीक का भविष्य अनुप्रयोगों metabolis के माप शामिलविकास के लार्वा और पोटा संबंधी चरणों, ड्रोसोफिला जीवन चक्र है कि पोषक तत्व भंडारण और टूटने, क्रमशः के चरम की विशेषता है की दो चरणों में हूँ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20 ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | Fisher Scientific | 09-874-20 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
References
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