Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الجينوم التحرير في Published: June 20, 2016 doi: 10.3791/54113
Automatic Translation
1, 2, 3
1Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 3Department of Biology, University of Maryland

Summary

الطفرات التي تستهدف الجين هو ممكن الآن في مجموعة واسعة من الكائنات الحية باستخدام تقنيات التحرير الجينوم. هنا، علينا أن نظهر بروتوكول لالطفرات الجينية المستهدفة باستخدام النسخ المنشط مثل nucleases المستجيب (TALENs) في Astyanax mexicanus، وهي من الأنواع من الأسماك التي تشمل الأسماك السطحية وcavefish.

Introduction

فهم الأساس الجيني للتطور سمة هو هدف البحث النقدي من علماء البيولوجيا التطورية. وقد تم إحراز تقدم كبير في تحديد مواضع الكامنة وراء تطور الصفات وإبراز الجينات المرشحة ضمن هذه المكاني (على سبيل المثال 1-3). ومع ذلك، وظيفيا اختبار دور هذه الجينات قد ظلت تتحدى العديد من الكائنات الحية تستخدم لدراسة تطور الصفات ليست حاليا لين العريكة وراثيا. ظهور تقنيات التحرير الجينوم ازداد الى حد كبير manipulability الجيني للمجموعة واسعة من الكائنات الحية. وقد استخدمت النسخ nucleases مثل المنشط المستجيب (TALENs) وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (CRISPRs) لتوليد الطفرات المستهدفة في الجينات في عدد من الكائنات الحية (على سبيل المثال 4-11). هذه الأدوات، وتطبيقها على نظام ذات الصلة تطويريا، لديها القدرة على إحداث ثورة في طريقة البيولوجيا التطورية الدراسة الأساس الجيني للتطور.

Astyanax mexicanus هي نوع من الأسماك التي توجد في شكلين: أ (الأسماك السطحية) شكل السطح التي تعيش في النهر ومتعددة الأشكال التي تعيش في كهف (cavefish) أ. mexicanus cavefish تطورت من أسلاف الأسماك السطحية (استعرضت في 12). وقد تطورت سكان cavefish في عدد من الصفات بما في ذلك فقدان العينين، وانخفاض أو فقدان تصبغ، وأعداد متزايدة من براعم الذوق وneuromasts الجمجمة، وتغييرات في السلوك مثل فقدان السلوك المدرسي، وزيادة العدوان، والتغيرات في تغذية الموقف وفرط الأكل 13 -19. Cavefish والأسماك السطحية interfertile، وقد أجريت تجارب رسم الخرائط الوراثية لتحديد الجينات مواضع والمرشح لصفات كهف 1،20-26. وقد تم اختبار بعض الجينات المرشحة لدور وظيفي في المساهمة في الصفات كهف في ثقافة الخلية 1،19، في الكائنات نموذج من الأنواع الأخرى 21 أو overexpression 27 أو ضربة قاضية عابرة شالغناء morpholinos 28 في A. mexicanus. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب له حدود. القدرة على توليد أليل متحولة من هذه الجينات في A. mexicanus أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفتها في تطور cavefish. وهكذا، A. mexicanus هو كائن حي المرشح المثالي لتطبيق تكنولوجيات تحرير الجينوم.

نحن هنا الخطوط العريضة لطريقة لتحرير الجينوم في A. mexicanus باستخدام TALENs. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم فسيفساء حقن الأسماك مؤسس للالظواهر ولعزل خطوط السمك مع الطفرات مستقرة في الجينات التي تهم 29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وكانت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة من قبل لجنة الحيوان الرعاية المؤسسية واستخدم في جامعة ولاية ايوا وجامعة ميريلاند.

1. TALEN التصميم

  1. المدخلات المطلوبة تسلسل الهدف لتصميم الموقع TALEN. (على سبيل المثال: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). إدخال اختيار أطوال مجموعة هل / تكرار.
    1. نسخ التسلسل الجيني في المربع المسمى "تسلسل".
    2. ضمن علامة التبويب "توفير مخصص فاصل / RVD أطوال" تحديد طول الفاصل وطول المصفوفة.
      ملاحظة: أطوال فاصل من 15 زوج قاعدي وتكرار أطوال مجموعة من 15-17 تعمل بشكل جيد وجعل التجمع أقل تعقيدا.
  2. اختيار زوج TALEN. TALEN أزواج يتمحور حول الفريد موقع انزيم التقييد تسمح التنميط الجيني بواسطة انزيم تقييد هضممنتج PCR.
  3. الاشعال تصميم لتضخيم المنطقة المحيطة الجينومية الموقع المستهدف TALEN باستخدام موقع على شبكة الانترنت مثل Primer3 30-32. عندما التنميط الجيني مع انزيم التقييد، الاشعال تصميم لتضخيم منطقة تحتوي على موقع انزيم التقييد مرة واحدة فقط. فمن المستحسن أن هذه المنطقة يتم تضخيمه والتسلسل قبل البناء TALEN لتحديد أي الأشكال الموجودة في A. mexicanus السكان المختبر لاستخدامها ل microinjection.

2. الجمعية TALEN (معدلة من بروتوكول TALEN كيت) 33،34

للحصول على تفاصيل إضافية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، انظر البروتوكول 34.

  1. إعداد وتسلسل البلازميدات اللازمة من عدة TALEN وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. إعداد # 1 ردود الفعل لردود الفعل ألف وباء وتشمل تكرار-متغير diresidues (RVDs) 1-10 وpFUS_A ناقلات جهة في رد الفعل A. تشمل RVDs 11- (N-1) وعشرناقلات ه جهة pFUS_B (N-1) في رد الفعل B حيث N هو العدد الإجمالي للRVDs في TALEN.
    1. إضافة إلى كل رد فعل: 1 ميكرولتر من كل تحتوي على البلازميد كل RVD (100 نانوغرام / ميكرولتر)، وناقلات الوجهة (100 نانوغرام / ميكرولتر)، 1 ميكرولتر بسه أنا انزيم التقييد، 1 ميكرولتر الأبقار مصل الزلال (BSA) (2 ملغ / مل )، 1 ميكرولتر يغاز، 2 ميكرولتر من العازلة 10X يغاز و x ميكرولتر من الماء لحجم ما مجموعه 20 ميكرولتر. على سبيل المثال، انظر الجدول 1.
      ملاحظة: يمكن أيضا ردود فعل نصف استخدامها.
    2. وضع ردود الفعل في thermocycler وتشغيل دورة: 10X (37 ° C / 5 دقائق + 16 ° C / 10 دقيقة) + 50 ° C / 5 دقائق + 80 ° C / 5 دقائق.
  3. احتضان ردود الفعل مع نوكلياز. إلى كل رد فعل إضافة 1 ميكرولتر 25 ملي ATP و 1 ميكرولتر نوكلياز. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. تحويل ردود الفعل.
    1. تحويل 2.5 ميكرولتر من كل التفاعل إلى 25 ميكرولتر كيميائيا الخلايا المختصة.
      ملاحظة: محلية الصنع ج المختصةملتعلمي اللغة اإلنكليزية يمكن استخدامها. ومع ذلك، يمكن خلايا بكفاءة منخفضة يؤدي إلى عدم وجود المستعمرات.
      1. مزيج 2.5 ميكرولتر من رد الفعل مع 25 ميكرولتر من الخلايا المختصة كيميائيا. احتضان على الجليد لمدة خمس دقائق. احتضان الخلايا لمدة 30 ثانية في 42 درجة مئوية.
      2. وضع أنابيب على الجليد لمدة 2 دقيقة. إضافة 125 ميكرولتر من مرق سوبر الأمثل مع القمع مقيضة (SOC). هزة الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا تحولت على لوحات LB مع السبيكتينوميسين (50 ميكروغرام / مل)، X-غال والآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). تنمو O / N عند 37 درجة مئوية.
  5. اختيار 2-3 مستعمرات بيضاء لكل رد فعل وتحقق من مستعمرة PCR باستخدام بادئات pCR8_F1 وpCR8_R1 (الجدول 2).
    1. جعل مزيج الرئيسي من الكواشف. على سبيل المثال، انظر الجدول 3.
    2. اختيار مستعمرة وتشويه صورتها في الجزء السفلي من أنبوب PCR، ومن ثم وضع ما تبقى من مستعمرة إلى 2 مل LB مع السبيكتينوميسين(50 ميكروغرام / مل). ضع 15 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في أنبوب مع مستعمرة.
    3. تشغيل البرنامج PCR التالية (الجدول 4)
    4. فحص PCR (تشغيل وحدة التخزين بالكامل) على هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي. فإن استنساخ الصحيحة لها الفرقة في الحجم المتوقع فضلا عن تشويه وسلم من العصابات. للحصول على مثال مسحة المناسبة، انظر 34،33.
    5. تنمو 2 مل الثقافات من الحيوانات المستنسخة الصحيحة في LB سائل الإعلام O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز.
  6. Miniprep البلازميدات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  7. تسلسل للتحقق من تسلسل TALEN مع pCR8_F1 وpCR8_R1. اتبع الأساليب المذكورة سابقا (35).
  8. استخدام الحيوانات المستنسخة الصحيحة التحقق من التسلسل، إعداد رد فعل # 2 (مجموعة TALEN)، والتي سوف تضع RVDs من ناقلات ألف وباء وRVD النهائي في ناقلات الوجهة.
    1. إعداد مزيج لرد فعل 2 (جدول رقم 5).
      ملاحظة: هاردود الفعل LF يمكن استخدامها.
    2. وضع ردود الفعل في thermocycler وتشغيل البرنامج التالي: 37 ° C / 10 دقيقة + 16 ° C / 15 دقيقة + 37 ° C / 15 دقيقة + 80 ° C / 5 دقائق.
  9. تحويل ردود الفعل.
    1. تحويل 2.5 ميكرولتر من كل التفاعل إلى 25 ميكرولتر كيميائيا الخلايا المختصة.
      1. مزيج 2.5 ميكرولتر من رد الفعل مع 25 ميكرولتر من الخلايا المختصة كيميائيا. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. حرارة صدمة الخلايا لمدة 30 ثانية في 42 درجة مئوية.
      2. وضع أنابيب على الجليد. إضافة 125 ميكرولتر من شركة نفط الجنوب. وضع أنابيب في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا تحولت على لوحات LB مع الأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل)، X-غال وIPTG. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية.
  10. اختيار 1-3 مستعمرات بيضاء لكل رد فعل وتحقق من مستعمرة PCR باستخدام بادئات TAL_F1 وTAL_R2 (الجدول 2).
    1. جعل حل البلمرة mastermix والمياه والاشعال كماهو موضح في الجدول 3. اختيار مستعمرة وتشويه صورتها في الجزء السفلي من أنبوب PCR، ومن ثم وضع ما تبقى من مستعمرة إلى 2 مل LB مع الأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل). ضع 15 ميكرولتر من الحل في أنبوب مع مستعمرة.
    2. تشغيل البرنامج PCR (الجدول 6).
    3. فحص PCR على هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي. فإن استنساخ الصحيحة لها رتوش وسلم من العصابات. للحصول على مثال مسحة المناسبة، انظر 34،33.
    4. تنمو 2 مل الثقافات من الحيوانات المستنسخة الصحيحة في LB سائل الإعلام O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز.
  11. Miniprep البلازميدات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  12. تسلسل للتحقق من تسلسل TALEN مع TAL_F1 وTAL_R2 التالية الأساليب المذكورة سابقا 35.

3. مرنا النسخ من TALENs

  1. هضم 4 ميكروغرام من القالب التحقق من التسلسل مع 2 ميكرولتر الحويصلة أنا لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. تشغيل 2 ميكرولتر من البلازميد هضمها I-ساك على هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي. سوف البلازميدات التي يتم هضمها بشكل صحيح عرض شريط واحد.
  2. تنقية المتبقية البلازميد هضمها I-الحويصلة بعد PCR بروتوكول عدة تنقية. يغسل مرتين مع محلول الغسيل قبل شطف. أزل إلى 30 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه.
  3. اتبع بروتوكول قياسي لإنتاج T3 مرنا.
    1. إعداد ردود الفعل نصف باستخدام 0.5 ميكروغرام من قالب خطي (المعد أعلاه). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    2. إضافة 0.5 ميكرولتر من الدناز (موجودة في الطقم)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. تنقية مرنا، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. أزل إلى 30 nuclease خالية من المياه ميكرولتر.
  5. تشغيل هلام الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي للتحقق من مرنا.
    1. تنظيف الجهاز هلام مع منتج للقضاء على التلوث ريبونوكلياز وإعداد جل 1.2٪.
    2. مزيج 1 مرنا ميكرولتر + 4 &# 181؛ ل nuclease خالية من الماء + 5 ميكرولتر glyoxyl تحميل صبغ. احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الأنابيب ومكان على الجليد قبل تشغيل هلام.
  6. للتحقق من تركيز باستخدام طريقة قياس تركيز الأحماض النووية وتخزين الحمض النووي الريبي في aliquots في -80 درجة مئوية. اختر حجم قسامة مثل أن الحمض النووي الريبي لا المجمدة / إذابة أكثر من مرة.
    ملاحظة: تركيزات 500-1،000 نانوغرام / يتم الحصول عليها عادة نيكولا لانغ. RNA مع تركيز أقل ويمكن استخدام طويلة كما يتم الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي (وفقا لتقييم الفرقة بدلا من مسحة على هلام).

4. حقن Astyanax mexicanus الأجنة مع TALEN مرنا

  1. إعداد أدوات للحقن.
    1. صب لوحات الحقن عن طريق سكب 1.2٪ الاغاروز في أسماك المياه (المياه مكيفة مع بيكربونات الصوديوم وملح البحر إلى 7.4 درجة الحموضة والموصلية 700 ميكرو ثانية) في طبق بتري. وضع قالب (قطعة من البلاستيك مع توقعات لجعل الآبار للأسماكالبيض) داخل الطبق. إزالة العفن عندما تصلب الاغاروز وتخزينها في 4 درجات مئوية. لمزيد من التفاصيل على القالب يرى 36.
    2. سحب الإبر لحقن باستخدام مجتذب إبرة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: مناسب طول الإبرة مهم للحقن. والإبر التي هي فترة طويلة جدا أن تكون مرنة جدا لحقن. فإن بروتوكول للإبر سحب تختلف مع المعدات المستخدمة لسحب الإبر. ويرد مثال على الإبرة المناسبة في الشكل 1. بالنسبة للمعدات لدينا، وسحب الإبر التي هي 5-6 سم في الطول، ويكون قطرها الخارجي في غيض من حوالي 0.011 مم عندما كسر. ومع ذلك، يجب أن تكون محسوبة الإبر (الخطوة 4.3.4) لتحديد عرض الافتتاح. يمكن العثور على البرنامج المثال لسحب الإبر في الجدول 7.
    3. إعداد الماصات الزجاجية لنقل الأجنة عن طريق كسر ماصة بحيث تكون الفتحة كبيرة بما يكفي لبيضة بالمرور. لهب نهاية كسر حتىلم يعد حاد.
      ملاحظة: من المهم استخدام الماصات الزجاجية والزجاج السلطانيات عند العمل مع أ. البيض mexicanus والأجنة لأنها لزجة، وستلتزم البلاستيك.
  2. اجمع 1-خلية المرحلة البيض.
    1. سلالة أ. mexicanus التالية البروتوكولات القياسية 37.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم الحفاظ على الأسماك على 14 ضوء: دورة الظلام 10 واستخدام الوقت Zeitgerber (ZT) مع ZT0 أضواء على وZT14 كما الأنوار، لدينا تفرخ الأسماك السطحية بين ZT15 وZT19. يجب تحديد وقت التبويض بدقة لكل مختبر على حدة.
    2. تفريخ من قبل فرط السمك لمدة 3-4 أيام قبل التزاوج ووضع الأسماك في المياه العذبة. رفع درجة فهرنهايت درجة الحرارة 2. ملاحظة: لدينا درجة حرارة الماء الأولية ما يقرب من 74 درجة فهرنهايت.
    3. جمع بيض الأسماك السطحية في الظلام، والتحقق من كل 15 دقيقة للحصول على البيض في المرحلة 1 خلية. ويمكن الحصول على مئات من البيض من زوج واحد من الأسماك السطحية.
    4. جمعالبيض في أوعية زجاجية لمنع الالتصاق على السطوح البلاستيكية والفرز لعزل الأجنة في مرحلة 1 خلية قبل الحقن من خلال مراقبة البيض تحت المجهر وجمع البيض التي هي خلية واحدة. إبقاء البيض في المياه العذبة النظام (خزان المياه وتستضيف الأسماك البالغة، التي تمت معالجتها للدرجة الحموضة والموصلية).
  3. حقن TALEN مرنا.
    1. ضخ كميات مختلفة من إجمالي مرنا (كميات متساوية من كل TALEN في الزوج) لتحديد تركيز الأمثل للحقن على سميتها والكفاءة تختلف من زوج TALEN. تبدأ عن طريق حقن مجموع تركيزات مرنا التي هي 400-800 ص. تمييع والجمع بين مرنا لتركيزات المطلوب لحقن 1.5 نيكولا لانغ.
    2. الحمل تضعف مرنا في الجزء الخلفي من الإبرة وإرفاق الإبرة إلى حاقن الصغرى.
    3. كسر إبرة باستخدام ملقط.
    4. معايرة الإبرة. على سبيل المثال، إخراج 10 مرات وجمع قطرة مما أدى إلى الشعيرات الدموية الصغيرة. لمدة 10 × 100 المتاح 1.081؛ ل، 32 مم الشعرية الصغيرة، ينبغي أن انخفاض ملء الشعرية الصغيرة إلى 0.5 ملم مقابل 1.5 نيكولا لانغ حقن / 1. ضبط الوقت الحقن والضغط حسب الحاجة.
    5. ادخال الإبرة في خلية واحدة وحقن مرنا. حقن مرنا مباشرة في الخلية، وليس في صفار البيض.
    6. جمع الأجنة المحقونة في أوعية زجاجية. إبقاء الأجنة في 23-25 ​​درجة مئوية. إزالة الأجنة الميتة (الأجنة التي أصبحت غائما وغير منتظمة الشكل) بانتظام خلال الأيام القليلة الأولى بعد الحقن. أعداد قياسية من الأجنة الميتة والمشوهة من سيطرة (uninjected) وألواح حقن.
      ملاحظة: زيادة تركيز مرنا يمكن أن يؤدي إلى زيادة السمية والتشوه / فاة الأجنة. وبالتالي، يجب أن تكون متوازنة سمية مقابل الكفاءة لتحديد أفضل تركيز مرنا لحقن.

5. النمط الظاهري مؤسس الأسماك وتقييم TALEN الكفاءة

  1. التضحية الأجنة وفقا لبروتوكول الحيوان المؤسسي.
    ملاحظة: نحن الموت ببطءالأجنة عن طريق السريع تقشعر لها الأبدان على الجليد.
  2. جمع الأجنة إلى 0.8 ميكرولتر PCR أنابيب الشريط باستخدام ماصة نقل.
    ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها التنميط الجيني على الأجنة الفردية أو برك من الأجنة.
  3. استخراج الحمض النووي.
    1. مكان الأجنة في 100 ميكرولتر 50 هيدروكسيد الصوديوم ملم (هيدروكسيد الصوديوم)، واحتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم تبرد إلى 4 درجة مئوية.
    2. إضافة 10/01 حجم ال (10 ميكرولتر) من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة (8).
  4. إجراء PCR على المنطقة باستخدام بادئات مصممة في الخطوة 1.3 (انظر الجداول 8 و 9 لبروتوكولات العينة). لأجنة الفردية 1 ميكرولتر من الحمض النووي غير كافية للتفاعل PCR.
  5. هضم المنتج PCR الناتج مع انزيم التقييد المناسب وتشغيل جل الاغاروز 1.5٪ من قبل الكهربائي.
    1. على سبيل المثال، لالتنميط الجيني موضع عيني جلدي المهق 2 (oca2) في حقن الأجنة هضم المنتج PCR باستخدام انزيم التقييد فرقة البحث وأنا بإضافة 00.5 ميكرولتر من فرقة البحث الأول مباشرة إلى 12.5 ميكرولتر من رد فعل PCR الانتهاء، يحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تشغيل عسر الهضم والمنتج هضمها على هلام. انزيم التقييد عصابات المقاومة (أي العصابات التي لا تهضم) تشير إلى أن الطفرات المستحثة TALEN-هي موجودة (الشكل 2).
  6. (اختياري) حساب معدل الطفرات مئوية خلال تحديد نسبة مئوية من الناتج تقطيعه عن طريق تحليل الصور من المواد الهلامية في فيجي 38 باستخدام أداة تحليل هلام لحساب قيمة كثافة كل فرقة كما هو موضح سابقا (29).
  7. تحديد تسلسل من الأليلات الطافرة التي كتبها TA استنساخ هلام تنقية تقييد انزيم الفرقة متحولة مقاومة وتسلسل الحيوانات المستنسخة.
    1. هلام تنقية تقييد انزيم الفرقة متحولة مقاومة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. استنساخ TA الفرقة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. اختيار المستعمرات والنمو في 1.5 مل LB O / N عند 37 درجة مئوية في هزالحاضنة.
    2. الثقافات Miniprep باتباع إرشادات الشركة المصنعة. إرسال الحمض النووي لتسلسل.
    3. باستخدام برنامج مثل القرد، محاذاة متواليات متحولة إلى تسلسل wildtype.
      1. نسخ ولصق كل من متواليات إلى ملفات القرد. اختيار "محاذاة اثنين من سلاسل" أداة من قائمة "أدوات".
      2. تحديد اثنين من تسلسل الحمض النووي باستخدام القوائم المنسدلة.
        ملاحظة: تكملة العكسي للتسلسل المستنسخة قد تحتاج لاستخدامها اعتمادا على اتجاه ذهب PCR في ناقلات الاستنساخ. إذا كان تسلسل لا محاذاة، كرر الخطوات من التحقق من مربع "القس كوم" في خانة "محاذاة الحمض النووي".
  8. تقييم الأسماك مؤسس للالظواهر في مرحلة مناسبة واستخدام الأساليب المناسبة لالنمط الظاهري المتوقع 29 (على سبيل المثال، الشكل 3). وستستند أساليب phenotyping على النمط الظاهري المتوقع لهذا الجين المستهدف من قبل الباحث باستخدام protocرأ.

6. الشاشة لنقل سلالة الجرثومية

ملاحظة: أ. mexicanus تصل إلى مرحلة النضج الجنسي في 4-8 أشهر.

  1. عبور الأسماك مؤسس الناضجة جنسيا لنوع الأسماك البرية.
  2. الأجنة الشاشة أو الأسماك البالغة باستخدام الأساليب في الخطوات 5،1-5،7 (الشكل 4). وبالنسبة للأسماك الكبار، وقطعة من الذيل يمكن أن يثقب بعد التخدير.
    1. تخدير الأسماك غمر الأسماك في حل من تريكين (حمض 3-أمينو إيثيل استر) للحد من التوتر خلال لقطة الزعانف. وبعد لقطة الزعانف، والسماح الأسماك للتعافي في المياه العذبة. الأسماك تتعافى بسرعة؛ مراقبة الا بعد ان تعافى (تسبح عادة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TALEN حقن زوج تؤدي إلى الملزم للRVDs إلى النيوكليوتيدات الحمض النووي محددة وبالتالي dimerization من المجالات FokI، مما أدى إلى انقطاع في الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة 39 التي يمكن اصلاحها من خلال نهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ). في كثير من الأحيان يدخل NHEJ الأخطاء التي تؤدي إلى الإدراج أو الحذف (indels). Indels يمكن تحديدها عن طريق تضخيم المنطقة المحيطة بالموقع المستهدف TALEN وهضم amplicon الناتج مع انزيم التقييد الذي يمر في المنطقة هل TALEN. والأليلات دون INDEL هضم بينما الأليلات التي تحتوي على indels أن تغيير تسلسل الهدف انزيم التقييد لن الهضم، وإنتاج فرقة مقاومة انزيم التقييد (الشكل 2).

يمكن حقن TALEN أن يؤدي إلى طفرات الجينات biallelic في A. mexicanus 29. وهكذا، يمكن تقييم بعض الظواهر في الأسماك مؤسس. إلى سبيل المثال، قمنا بتقييم تصبغ في الأسماك السطحية حقن TALENs تستهدف oca2، الجين يفترض أن تكون مسؤولة عن المهق في السكان البيضاء متعددة من cavefish 1،28. لقد وجدنا بقع البيضاء في الأسماك oca2 حقن TALEN-غير موجودة في الأسماك uninjected 29 (الشكل 3).

بالنسبة لكثير من التجارب، فمن المستحسن أن يكون خطوط متحولة من الأسماك لتقييم الظواهر. الأسماك مؤسس مع أليل متحولة تنتقل يمكن تحديد التنميط الجيني ذرية من الصلبان من الأسماك مؤسس لنوع الأسماك البرية (الشكل 4).

شكل 1
الشكل 1. إبرة لحقن مرنا. صورة لmicropipette قبل التعرض للكسر تستخدم لحقن TALEN مرنا في الأجنة الخلية واحدة._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
تم فحص الشكل 2. كفاءة TALEN لOca2 306 المنتجات بي بي PCR من اكسون 9 من oca2 في mexicanus Astyanax عن خسارة موقع انزيم التقييد عندما تم حقن كميات مختلفة من TALEN مرنا 29. تم هضمها amplicon من جنين السيطرة في الوقت الذي كان جزء من amplicon مقاومة لتقييد هضم في برك من 10 TALEN حقن الأجنة. تقييد هضم انزيم العصابات مقاومة من أجنة يحقن مع TALEN مرنا استهدف وقد ثبت oca2 لاحتواء indels 29. لاحظ أن زيادة تركيزات مرنا حقن النتائج في زيادة كفاءة TALEN (المزيد الحمض النووي عسر الهضم). الممرات مع "-" وعسر الهضم، والممرات مع "+" هي digesتيد مع انزيم التقييد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. Phenotyping الأسماك مؤسس لإجراء تغييرات في تصبغ. (A) مراقبة سطح uninjected أ. mexicanus. (ب) تصحيح تفتقر melanophores في الأسماك السطحية مؤسس حقن 400 جزء من الغرام TALEN مرنا تستهدف oca2 (السهم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. انتقال سلالة الجرثومية من mutatio TALEN التي يسببهاNS 306 نقطة أساس المنتجات PCR من اكسون 9 من oca2 في A. تم فحص mexicanus عن خسارة موقع انزيم التقييد في برك من 10 F 1 الأسماك من الأسماك مؤسس حقن. تم هضمها amplicon من جنين السيطرة في الوقت الذي كان جزء من amplicon مقاومة لتقييد هضم في برك من 10 F 1 الأجنة. تقييد هضم انزيم عصابات المقاومة وقد ثبت من F oca2 1 الصورة لاحتواء indels 29. الممرات مع "-" وعسر الهضم، والممرات مع "+" ويتفاعل مع انزيم التقييد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

رد فعل ل Reactiعلى B
كمية كاشف كمية كاشف
4 ميكرولتر ماء 10 ميكرولتر ماء
1 ميكرولتر pFUS_A 1 ميكرولتر pFUS_B4
1 ميكرولتر BsaI 1 ميكرولتر BsaI
1 ميكرولتر BSA 1 ميكرولتر BSA
1 ميكرولتر يغاز 1 ميكرولتر يغاز
2 ميكرولتر عازلة 10X يغاز 1 ميكرولتر عازلة 10X يغاز
1 ميكرولتر pNH1 1 ميكرولتر pNG1
1 ميكرولتر pNH2 1 ميكرولتر pHD2
1 ميكرولتر pNG3 1 ميكرولتر pNH3
1 ميكرولتر pHD4 1 ميكرولتر pNI4
1 ميكرولتر pHD5
1 ميكرولتر pHD6
1 ميكرولتر pNG7
1 ميكرولتر pHD8
1 ميكرولتر pNG9
1 ميكرولتر pHD10

الجدول 1. مثال التجمع رد فعل A و B لTALEN تحتوي على RVDs NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.

اسم التمهيدي تسلسل (5'-3 ')
pCR8_F1 ttgatgcctggcagttccct
pCR8_R1 cgaaccgaacaggcttatgt
TAL_F1 ttggcgtcggcaaacagtgg
TAL_R2 ggcgacgaggtggtcgttgg

الجدول 2. الاشعال PCR لمستعمرة PCR، من 34.

كاشف كمية
طق mastermix، 2X 50 ميكرولتر
pCR8_F1 التمهيدي،10 UM 4 ميكرولتر
pCR8_R1 التمهيدي، 10 أم 4 ميكرولتر
nuclease خالية من المياه 42 ميكرولتر
* ضبط مزيج الرئيسي إذا تم استخدام طق مختلفة

الجدول مزيج 3. ماستر 100 ميكرولتر (15 ميكرولتر / رد فعل) لمستعمرة PCR 1.

خطوة درجة الحرارة (° C) الوقت (ثانية)
1 95 120
2 95 30
3 55 30
4 72 105
5 انتقل إلى الخطوة 2 لمدة 30 دورات
6 72 300

الجدول 4. برنامج PCR لمستعمرة PCR 1.

كمية كاشف تركيز
12 ميكرولتر ماء
1 ميكرولتر ناقلات و 100 نانوغرام / ميكرولتر
1 ميكرولتر متجه B 100 نانوغرام / ميكرولتر
1 ميكرولتر ناقلات جهة pT3Ts-GT 50 نانوغرام / ميكرولتر
1 ميكرولتر RVD النهائي (بلر-RVD) 100 نانوغرام / ميكرولتر
1 ميكرولتر Esp3I
1 ميكرولتر يغاز
2 ميكرولتر عازلة 10X يغاز

الجدول 5. بروتوكول لردود الفعل التجمع الثانية.

خطوة درجة الحرارة (° C) الوقت (ثانية)
1 95 120
2 95 30
3 55 30
4 72 180
5 انتقل إلى الخطوة 2 لمدة 30 دورات
6 72 300

الجدول 6. برنامج PCRلمستعمرة PCR 2.

حرارة 290
سحب 150
سرعة 100
مرة 150
هذه المعايير هي ليلهب / براون Micropipette بولير نموذج P-97 باستخدام خيوط الحوض الصغير

الجدول 7. إبرة العينة سحب البرنامج.

كاشف كمية
طق mastermix، 2X 12.5 ميكرولتر
الجينات التمهيدي إلى الأمام معين، 10 ميكرومتر 1 μل
الجينات التمهيدي العكسي معين، 10 ميكرومتر 1 ميكرولتر
nuclease خالية من المياه 9.5 ميكرولتر
الحمض النووي 1 ميكرولتر
* ضبط مزيج الرئيسي إذا تم استخدام طق مختلفة

8. بروتوكول عينة طاولة الجينات PCR محددة.

خطوة درجة الحرارة (° C) الوقت (ثانية)
1 95 120
2 95 30
3 56 30
4 72 60
5 الذهاب إلى sفاتر 2 لمدة 35 دورات
6 72 300
* ضبط درجة الحرارة الصلب وتمديد الوقت لالاشعال محددة وحجم المنتج PCR

جدول برنامج PCR 9. عينة لالجيني PCR محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد خطت خطوات واسعة في السنوات الأخيرة نحو فهم الأساس الجيني للتطور الصفات. بينما الجينات المرشحة الكامنة وراء تطور في عدد من الصفات تم تحديدها، إلا انه لا يزال تحديا لاختبار هذه الجينات في الجسم الحي بسبب عدم وجود قابلية الإستطراق الجيني للأنواع الأكثر إثارة للاهتمام من الناحية التطورية. نحن هنا الإبلاغ عن طريقة لتحرير الجينوم في A. mexicanus، استخدمت الأنواع لدراسة تطور الحيوانات الكهف. دراسات الخرائط الجينية 1،21،23 ونهج الجين مرشح 19،40 حددت عددا من الجينات المرشحة للتطور الصفات في شكل كهف أ. mexicanus. نشر مؤخرا من الجينوم cavefish 41 يوفر أداة قوية إضافية لتحديد الجينات مرشح للتطور الصفات الكهف. اختبار وظيفة العديد من هذه الجينات المرشحة يتطلب تقنيات للحد من التعبير الجيني. الخيار الحالي الوحيد للدراسةجي خفض التعبير الجيني في A. mexicanus هو عن طريق استخدام morpholinos. ومع ذلك، ضربة قاضية morpholino الجينات هي عابرة، تقتصر على بضعة أيام بعد الإخصاب، وغير مفيدة لدراسة الصفات في الحيوانات البالغة، مثل الاختلافات السلوكية بين كهف الكبار والأسماك السطحية مثل التعليم المدرسي 17، فرط الأكل 19 و جذب الاهتزاز السلوك 42. جيل من فقدان الأليلات ظيفة الجينات، مثل تلك التي يمكن إجراؤها باستخدام TALENs، ستكون حاسمة لاختبار دور الجينات المرشحة لهذه الصفات.

وقد تم تطوير طرق سهلة التجميع من أزواج TALEN 33 وبروتوكول مفصلة لهذا الأسلوب هو متاح 34. وكان محسن هذا البروتوكول للاستخدام الزرد التي كتبها بيدل وآخرون. 7، وذلك باستخدام ناقلات المقصد النهائي مختلفة، pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-GT). هذا ناقلات يسمح نسخ من TALEN مرنا للحقن في الأجنة الزرد الخلية واحدة.وقد استخدمنا هذه الطريقة التجمع المعدلة، وأوضح في التفاصيل هنا، لتجميع وتدوين TALENs للحقن في A. mexicanus. لقد وجدنا أنه عندما يحقن السطح وحيدة الخلية أ. الأجنة mexicanus، كما هو موضح في هذا البروتوكول، ونحن يمكن أن تتحول أ. الجينات mexicanus 29. للبحث في المستقبل على الجينات المرشحة غير الوارد وصفها في هذا البروتوكول، وتسلسل يمكن العثور عليها في الجينوم cavefish 41 و تستخدم لتحديد المواقع المستهدفة TALEN.

حاسمة لحقن الناجحة هي ذات جودة عالية TALEN مرنا. وهكذا، والتحقق من جودة RNA عن طريق تشغيل كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي على هلام قبل الحقن مهم (الخطوة 3.6). غيرها من الاحتياطات للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، مثل تجميد قسامات لتجنب يذوب التجميد (الخطوة 3.7)، والحفاظ على ظروف معقمة باستخدام أنابيب المياه النظيفة وريبونوكلياز خالية ونصائح أثناء الحقن (الخطوة 4)، ينبغي أن تؤخذ. خطوة حاسمة إضافية للأسماك حقن رفع لتنظيف الأجنة الميتة بعد الحقن، والأجنة الميتة يمكن أن تؤثر على نوعية المياه بسرعة. وبالتالي، فإننا إزالة الأجنة الميتة في صباح اليوم التالي الحقن، وبشكل دوري خلال الأيام القليلة القادمة بعد الحقن للحفاظ على الأجنة الحية صحية (الخطوة 4.3.6).

TALEN الطفرات في mexicanus Astyanax يمكن أن تكون فعالة للغاية. ومع ذلك، والكفاءة تختلف تبعا للزوج TALEN حقن 29. زيادة تركيزات مرنا يمكن أن يؤدي إلى زيادة السمية والتشوه وفاة الأجنة المحقونة. وهكذا، سمية مقابل الكفاءة يجب أن يتم اختبار ومتوازنة لتحديد تركيز الأمثل للمرنا لحقن. لكفاءة عالية أزواج TALEN، يمكن تقييم الظواهر في الأسماك مؤسس حقن. على سبيل المثال، أدى حقن TALENs تستهدف oca2 في بقع البيضاء في الأسماك السطحية 29 (الشكل 3). لصفات أو جينات أخرى، ومع ذلك، قد يكون تقييم الظواهر في الأسماك مؤسس صعبة بسببلبمهارة من النمط الظاهري أو انخفاض كفاءة الزوج TALEN حقن. وهكذا، على العديد من التطبيقات، سيكون من المستحسن لتوليد طفرات الخط الجرثومي في الجينات في المصالح لتحليل دور الجينات مرشح في حيوان غير الفسيفساء. الحصول على انتقال سلالة الجرثومية من الطفرات المستحثة TALEN في A. mexicanus ممكنة 29 (الشكل 4). وبالتالي، يمكن تطبيق هذه التقنية لتقييم الجينات المرشحة الأخرى.

وجود عدد قليل من القيود على أداء التلاعب الجيني في mexicanus Astyanax في هذا الوقت. السطحية وسلالة cavefish في الظلام، في وقت متأخر من الليل. في المختبر حيث أنه من غير الممكن لعكس دورة الظلام الخفيفة، يجب على الباحثين تأتي في وقت متأخر من الليل لأداء الحقن، كما أنه من الأهمية بمكان لحقن مباشرة بعد وضع البيض. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم جمع الأجنة الأسماك السطحية في الظلام، وضوء سيؤثر على وضع البيض.

تقنيات أخرى، في particuلار النظام / كاس كريسبر (استعرضت في 43)، وجود لتحرير الجينوم، ومن المرجح أن تكون قابلة للتطبيق A. mexicanus. في الواقع، بروتوكولات لدليل الحمض النووي الريبي التجمع موجودة التي هي سريعة وسهلة 44 وذكرت بروتوكول هنا يمكن تعديلها لكريسبر / حقن كاس. بالإضافة إلى ذلك، يتم بسرعة يجري تطوير تطبيقات جديدة لتحرير الجينوم، وكثير من هذه قد تكون مفيدة للأ. الباحثون mexicanus. على سبيل المثال، في الطفرات دقيقة الزرد بذلت في الجينات من الاهتمام من قبل coinjecting TALENs مع بنسبة ضئيلة الذين تقطعت بهم السبل واحدة تحتوي على طفرة 7. هذه التقنية يمكن أن تكون مفيدة لتقييم دور الأليلات كهف في توليد الظواهر الكهف، مثل دور طفرة مغلطة في بعض الأليلات مغارة mc4r في الاختلافات في التمثيل الغذائي لوحظ بين cavefish وسطح الأسماك 19. كما استخدمت TALENs لتوليد الأليلات من الجينات عبر إعادة التركيب مثلي التي تعبر عن علامات الفلورسنت طأنماط ن مماثلة إلى مواضع الذاتية 45. ويمكن استخدام هذه الأساليب في A. mexicanus لتقييم مجموعات فرعية من الخلايا أو الجينات مرشح. وقد استخدم النظام / كاس كريسبر في الزرد للحصول على أنسجة محددة الجينات خروج المغلوب 46. هذه التقنيات، وتطبيقها على أ. mexicanus، يمكن أن تكون مفيدة لتقييم الأساس الجيني للعمليات مثل فقدان العين في cavefish. عدسة يلعب دورا حاسما في عملية فقدان العين في cavefish 47، ويمكن استخدامها في كريسبر نظام / كاس الأنسجة محددة لتقييم دور الجينات المرشحة لفقدان العين تحديدا في عدسة مقابل الأنسجة الأخرى للعين. ويمكن استخدام هذه التقنيات والجينوم التحرير الأخرى في A. mexicanus في الدراسات المستقبلية للإجابة على تساؤلات جدية حول تطور الصفات الكهف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة علم الوراثة والتنمية وبيولوجيا الخلية وجامعة ولاية أيوا والمعاهد الوطنية للصحة منحة EY024941 (WJ) .Dr. قدم جيفري Essner تعليق على المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Thermocycler
Injection station
Gel apparatus
Needle puller
Nanodrop
Name Company Catalog Number Comments
Supplies
Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated
Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 Addgene Kit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) Fisher BP9724-500
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller Fisher BP1426-500
Teknova TET-15 in 50% EtOH Teknova (ordered through Fisher) 50-843-314
Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents Fisher BP2957-1
Super Ampicillin (1,000x solution) DNA Technologies 6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) FERR0941
IPTG, Fisher BioReagents Fisher BP1620-1
Petri dishes Fisher 08-757-13
BsaI New England Biolabs (ordered through Fisher) 50-812-203 Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
BSA New England Biolabs provided with restriction enzymes
10x T4 ligase buffer Promega (ordered through Fisher) PR-C1263
GoTaq Green Master mix Promega (ordered through Fisher) PRM7123 Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly
Quick ligation kit New England Biolabs (ordered through Fisher) 50-811-728 We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions
One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli Invitrogen C4040-06 Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used
Esp 3I Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) FERER0451
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase Epicentre (Ordered through Fisher) NC9046399
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose BioExpress E-3119-125
Sac I Promega (Ordered through Fisher) PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit Ambion AM1348M
Rneasy MinElute Cleanup Kit Qiagen 74204
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye  Ambion (ordered through Fisher) AM8551
Eliminase Decon (ordered through Fisher) 04-355-32
Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets Fisher 13-678-6B
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Microcaps Drummond Scientific Company 1-000-0010
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Eppendorf (ordered through Fisher) E5242956003
Sodium hydroxide Fisher S318-500
Tris base Fisher BP152-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
  2. Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
  3. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  4. Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
  5. Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
  6. Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
  7. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  8. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  9. Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
  10. Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136 (2014).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evol Biol. 12, 105 (2012).
  13. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  14. Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
  15. Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
  16. Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
  17. Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
  18. Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
  19. Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  20. Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
  21. Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326 (2009).
  22. Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108 (2012).
  23. Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281 (2013).
  24. Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
  25. Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
  26. Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
  27. Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
  28. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823 (2013).
  29. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370 (2015).
  30. Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
  31. Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
  32. Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
  33. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82 (2011).
  34. Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
  35. Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
  36. Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
  37. Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
  38. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  39. Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
  40. Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647 (2014).
  41. McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307 (2014).
  42. Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  43. Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
  44. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  45. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  46. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  47. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 112،
الجينوم التحرير في<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; استخدام النسخ المنشط مثل المستجيب Nucleases (TALENs)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kowalko, J. E., Ma, L., Jeffery, W.… More

Kowalko, J. E., Ma, L., Jeffery, W. R. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). J. Vis. Exp. (112), e54113, doi:10.3791/54113 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter