Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הגנום עריכה Published: June 20, 2016 doi: 10.3791/54113
Automatic Translation
1, 2, 3
1Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 3Department of Biology, University of Maryland

Summary

ג'ין-מיקוד mutagenesis ניתן כיום במגוון רחב של אורגניזמים באמצעות טכניקות עריכה הגנום. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול mutagenesis גן ממוקד באמצעות מפעיל שעתוק כמו nucleases המפעיל (TALENs) ב Astyanax mexicanus, זן של דגים הכולל דגי שטח cavefish.

Introduction

הבנת הבסיס הגנטי של אבולוצית תכונה היא מטרת מחקר ביקורתית של ביולוגים אבולוציוניים. התקדמות ניכרת כבר עשתה בזיהוי לוקוסים שבבסיס האבולוציה של תכונות ואיתור גני מועמדים בתוך לוקוסים אלה (למשל 1-3). עם זאת, מבחינה תפקודית לבחינת התפקיד של הגנים הללו נותר מאתגרים כמו אורגניזמים רבים המשמשים ללימוד האבולוציה של תכונות אינן כיום גנטי צייתניות. הופעתו של טכנולוגיות עריכת הגנום גדלה מאוד manipulability הגנטי של מגוון רחב של אורגניזמים. Nucleases מפעיל מפעיל דמוי תמלול (TALENs) ומקובצים interspaced בקביעות חזרות palindromic קצר (CRISPRs) שימשו כדי ליצור מוטציות ממוקדות בגנים בכמה אורגניזמים (למשל 4-11). כלים אלה, הוחלו על מחשב רלוונטי מבחינה אבולוציונית, יש פוטנציאל לחולל מהפכה באופן שבו ביולוגים אבולוציוניים ללמוד את הבסיס הגנטי של אבולוציה.

Astyanax mexicanus הוא מין של דג כי קיים בשתי צורות:. צורת משטח שוכני נהר (דגי שטח) וצורות המערה שוכני מרובים (cavefish) א cavefish mexicanus התפתח מאבותיהם דגי משטח (הנסקרת ב 12). אוכלוסיות של cavefish התפתחו מספר תכונות לרבות אובדן העיניים, להפחית או אובדן פיגמנטציה, גדל מספרם של בלוטות הטעם ואת neuromasts גולגולתי, ושינויים בהתנהגות כגון אובדן של התנהגות לימוד, תוקפנות מוגברת, שינויים האכלה ביציבה hyperphagia 13 -19. Cavefish ודגי שטח הם interfertile, וניסויי מיפוי גנטיים בוצעו לזיהוי גני לוקוסים ומועמד עבור תכונות מערות 1,20-26. כמה גני מועמדים נבדקו עבור תפקיד פונקציונלי בתרומת תכונות במערת תרבית תאי 1,19, באורגניזמים מודל של מינים אחרים 21 או על ידי ביטוי יתר 27 או מציאה חולפת uלשיר morpholinos 28 ב א mexicanus. עם זאת, כל אחת מהשיטות הללו יש מגבלות. היכולת ליצור אללים מוטנטים של גנים אלה א mexicanus הוא קריטי להבנת תפקידם באבולוציה של cavefish. לכן, א mexicanus הוא אורגניזם מועמד אידיאלי עבור יישום של טכנולוגיות עריכת הגנום.

כאן אנו מתארים שיטה לעריכה הגנום א mexicanus באמצעות TALENs. שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך דגי מייסד מוזרק פסיפס עבור פנוטיפים ו לבידוד קווי דג עם מוטציות יציבות בגני עניין 29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הנהלים כל חיה היו בהתאם להנחיות של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת אייווה ואוניברסיטת מרילנד.

1. עיצוב Talen

  1. הקלט הרצוי רצף היעד לאתר אינטרנט עיצוב Talen. (לדוגמא: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). קלט נבחר spacer / חוזר אורכי מערך.
    1. העתק את רצף הגנום לתוך התיבה שכותרתה "רצף".
    2. בכרטיסייה "ספק Spacer אישית / RVD אורכי" לבחור את אורך spacer ואורך המערך.
      הערה: אורכי spacer של 15 זוגות בסיסים וחזור אורכי מערך של 15-17 העבודה היטב ולעשות הרכבה פחות מורכבת.
  2. בחר זוג Talen. זוגות Talen תוכנן סביב אתר אנזים הגבלה ייחודי לאפשר genotyping על ידי אנזים הגבלה מעכלמוצר ה- PCR.
  3. פריימרים עיצוב כדי להגביר את האזור הגנומי המקיפה את אתר היעד Talen באמצעות אתר אינטרנט כגון Primer3 30-32. כאשר genotyping עם אנזים הגבלה, יחל עיצוב כדי להגביר אזור שמכיל אתר אנזים ההגבלה רק פעם אחת. מומלץ שהאזור הזה מוגבר רצף לקראת בניית Talen לזהות כל פולימורפיזם נוכח א אוכלוסיית מעבדת mexicanus לשמש microinjection.

2. האסיפה Talen (שונה מן הפרוטוקול קיט Talen) 33,34

לפרטים ופתרון בעיות נוספות, ראה פרוטוקול 34.

  1. כן ורצף פלסמידים הדרושים מתוך הערכת Talen פי הוראות היצרן.
  2. הגדרת # 1 תגובות לתגובות A ו- B. כלול repeat-משתנה diresidues (RVDs) 1-10 ואת pFUS_A וקטור יעד א התגובה כלול RVDs 11- (N-1) ו היעד וקטור דואר pFUS_B (N-1) בתגובה B כאשר N הוא המספר הכולל של RVDs ב Talen.
    1. הוסף כל תגובה: 1 μl של כל פלסמיד המכיל כל RVD (100 ng / μl), וקטור היעד (100 ng / μl), 1 μl Bsa אני אנזים הגבלה, 1 μl שור סרום אלבומין (BSA) (2 מ"ג / מ"ל ), אנזים μl 1, 2 μl של חיץ x 10x אנזים μl של מים בהיקף כולל של 20 μl. לדוגמה, ראה טבלה 1.
      הערה: תגובות חצי יכולות לשמש גם.
    2. מניחים תגובות ב thermocycler ולהפעיל את מחזור: 10x (37 ° C / 5 דקות + 16 ° C / 10 דק ') + 50 ° C / 5 דקות + 80 ° C / 5 דקות.
  3. דגירת התגובות עם nuclease. לתגובה כל להוסיף 1 μl 25 מ"מ ATP ו 1 nuclease μl. דגירת תגובות על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
  4. Transform תגובות.
    1. Transform 2.5 μl של כל תגובה ל -25 μl תאים מוסמכים כימי.
      הערה: ג מוסמכות תוצרת ביתניתן להשתמש אמות. עם זאת, תאים עם יכולת נמוכה יכול לגרום חוסר מושבות.
      1. מערבבי 2.5 μl של התגובה עם 25 μl של תאים מוסמכים כימי. לדגור על קרח במשך חמש דקות. דגירת התאים למשך 30 שניות על 42 מעלות צלזיוס.
      2. מניחים את הצינורות על קרח במשך 2 דקות. להוסיף 125 μl של מרק סופר אופטימל עם דיכוי Catabolite (SOC). לנער את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. פלייט 100 μl של תאים טרנספורמציה לצלחות LB עם spectinomycin (50 מיקרוגרם / מ"ל), X-gal ו איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). לגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. פיק 2-3 מושבות לבנות עבור כל תגובה ולבדוק ידי מושבת PCR באמצעות פריימרים pCR8_F1 ו pCR8_R1 (טבלה 2).
    1. הכן תערובת מאסטר של חומרים כימיים. לדוגמה, ראה טבלה 3.
    2. פיק מושבה ולמרוח אותו לתוך החלק התחתון של צינור PCR, ולאחר מכן הניח את שרידי המושבה לתוך 2 מ"ל LB עם spectinomycin(50 מיקרוגרם / מ"ל). מניחים 15 μl של מיקס מאסטר לתוך הצינור עם המושבה.
    3. הפעל את תכנית ה- PCR הבאה (לוח 4)
    4. בדוק את ה- PCR (להפעיל את כל נפח) על ג'ל 1.5% agarose על ידי אלקטרופורזה. המשובטים הנכונים יהיו להקה בגודל הצפוי וכן למרוח וסולם של להקות. דוגמא המריחה המתאימה, ראה 34,33.
    5. לגדול 2 מיליליטר תרבויות של השיבוטים הנכונים O תקשורת LB / N ב 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת.
  6. Miniprep פלסמידים פי הוראות היצרן.
  7. רצף לבדוק רצף Talen עם pCR8_F1 ו pCR8_R1. עקוב שיטות שתוארו קודם לכן 35.
  8. באמצעות השיבוטים הנכונים מאומתים על ידי רצף, להגדיר את התגובה # 2 (ערכת Talen), אשר יעמיד את RVDs מן וקטורי A ו- B ואת RVD הסופי לתוך וקטור היעד.
    1. הכן תערובת תגובה 2 (לוח 5).
      הערה: Haניתן להשתמש תגובות LF.
    2. מניחים את התגובות ב thermocycler ולהפעיל את התוכנית הבאה: 37 ° C / 10 דק '+ 16 ° C / 15 דק' + 37 ° C / 15 דק '+ 80 ° C / 5 דקות.
  9. Transform תגובות.
    1. Transform 2.5 μl של כל תגובה ל -25 μl תאים מוסמכים כימי.
      1. מערבבי 2.5 μl של התגובה עם 25 μl של תאים מוסמכים כימי. דגירה על קרח למשך 5 דקות. מחממים לזעזע את התאים למשך 30 שניות על 42 מעלות צלזיוס.
      2. מניחים את הצינורות על הקרח. להוסיף 125 μl של SOC. מניחים את הצינורות בתוך חממה רועד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. פלייט 100 μl של תאים טרנספורמציה לצלחות LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל), X-gal ו IPTG. לגדול O / N ב 37 ° C.
  10. פיק 1-3 מושבות לבנות עבור כל תגובה ולבדוק ידי מושבת PCR באמצעות פריימרים TAL_F1 ו TAL_R2 (טבלה 2).
    1. בצע פתרון של פולימראז mastermix, מים פריימרים כמוכמתואר בטבלה 3. פיק מושבה ולמרוח אותו לתוך החלק התחתון של צינור PCR, ולאחר מכן הניח את שרידי המושבה לתוך 2 מ"ל LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל). מניחים 15 μl של פתרון לתוך הצינור עם המושבה.
    2. הפעל את תוכנית ה- PCR (לוח 6).
    3. בדוק את ה- PCR על ג'ל 1.5% agarose על ידי אלקטרופורזה. המשובטים הנכונים יהיו מריחות וסולם של להקות. דוגמא המריחה המתאימה, ראה 34,33.
    4. לגדול 2 מיליליטר תרבויות של השיבוטים הנכונים O תקשורת LB / N ב 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת.
  11. Miniprep פלסמידים פי הוראות היצרן.
  12. רצף לבדוק רצף Talen עם TAL_F1 ו TAL_R2 הבאים השיטות שתוארו קודם לכן 35.

3. mRNA תמלול של TALENs

  1. תקציר 4 מיקרוגרם של תבנית מאומת רצף עם 2 μl Sac לי עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. הפעל 2 μl של פלסמיד מתעכל לי Sac על ג'ל agarose 1.5% על ידי אלקטרופורזה. פלסמידים כי מתעכלים כראוי יציג להקה אחת.
  2. לטהר את Sac הנותרים פלסמיד I-מתעכל בעקבות פרוטוקול ערכת טיהור PCR. שטפו פעמיים עם הפתרון לשטוף לפני elution. Elute לתוך 30 μl מים nuclease חינם.
  3. בצע את הפרוטוקול הסטנדרטי לייצור mRNA T3.
    1. הגדרת תגובות במחצית באמצעות 0.5 מיקרוגרם של תבנית לינארית (מוכן לעיל). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    2. הוסף 0.5 μl של DNase (כלול בערכה) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  4. לטהר את ה- mRNA, בעקבות הוראות היצרן. Elute לתוך 30 מים μl nuclease חינם.
  5. הפעל ג'ל agarose 1.5% על ידי אלקטרופורזה כדי לבדוק את ה- mRNA.
    1. נקו את מנגנון ג'ל עם מוצר כדי למנוע זיהום RNase ואת להכין ג'ל 1.2%.
    2. מערבבים 1 mRNA μl + 4 &# 181; l nuclease ללא מים + 5 μl טעינת glyoxyl לצבוע. דגירת דגימות ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. צנטריפוגה צינורות בקצרה ומניחים על קרח לפני הפעלת הג'ל.
  6. בדוק את הריכוז באמצעות שיטה לכימות ריכוזי חומצת גרעין ולאחסן רנ"א aliquots ב -80 מעלות צלזיוס. בחר גודל aliquot כך RNA הוא לא קפוא / מופשר יותר מפעם אחת.
    הערה: ריכוזים של 500-1,000 ng / NL בדרך כלל מתקבלת. RNA עם ריכוז נמוך יותר יכול לשמש עוד בתור שלמות RNA נשמרת (כפי שהוערך על ידי להקה ולא למרוח על הג'ל).

4. להזריק Astyanax עוברים mexicanus עם Talen mRNA

  1. כן כלים להזרקה.
    1. יוצקים צלחות הזרקת ידי שפיכת agarose 1.2% במים דגים (מים ממוזגים עם סודיום ביקרבונט ומלח ים pH 7.4 ומוליכות 700 מיקרו-שניות) לתוך צלחת פטרי. מניחים תבנית (חתיכת פלסטיק עם תחזיות לעשות בארות לדגיםביצים) בתוך הצלחת. הסר את התבנית כאשר agarose קשיח ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לפרטים על העובש לראות 36.
    2. משוך מחטים להזרקה באמצעות חולץ מחט על פי הוראות היצרן.
      הערה: אורך המחט מתאים חשוב לקבל זריקה. מחטים כי הם יותר מדי זמן תהיינה גמישות מדי זריקות. הפרוטוקול עבור מחטים משייכות ישתנה בהתאם לציוד המשמש למשוך מחטים. דוגמא מחט מתאים מוצגת באיור 1. עבור הציוד שלנו, אנחנו נוציא מחטים כי הם 5-6 סנטימטר אורך, ויש להם קוטר חיצוני בקצה של כ 0.011 מ"מ כאשר שבור. עם זאת, צריך להיות מכויל מחטים (שלב 4.3.4) כדי לקבוע רוחב הפתיחה. תוכנית לדוגמה עבור משיכת מחטים ניתן למצוא בלוח 7.
    3. כן טפטפות זכוכית עבור עוברים על ידי שבירת פיפטה כך הפתח גדול מספיק עבור ביצה לעבור. להבת הסוף נשבר עדזה כבר לא חד.
      הערה: חשוב להשתמש טפטפות זכוכית וקערות זכוכית כשעובדים עם א ביצים ועובר mexicanus כפי שהם דביקים ידבקו פלסטיק.
  2. איסוף ביצי שלב 1 תאים.
    1. בריד א mexicanus הבא פרוטוקולים סטנדרטיים 37.
      הערה: לדוגמה, אם הדגים נשמרים על 14 אור: חושך מחזור 10 ושימוש זמן Zeitgerber (ZT) עם ZT0 כמו האורות ZT14 כמו באורות כבויים, שרצים דגים השטח שלנו בין ZT15 ו ZT19. זמן השרצה מדויק צריך להיקבע עבור כל מעבדת פרט.
    2. להשרות השרצה ידי האכלת יתר דגים במשך 3-4 ימים לפני ההזדווגות והצבת דגים למים מתוקים. הרם את F ° טמפרטורה 2. הערה: טמפרטורת המים הראשונית שלנו היא כ -74 מעלות צלסיוס.
    3. איסוף ביצי דגי משטח בחושך, בדיקה כל 15 דקות כדי להשיג ביצים בשלב התא 1. מאות ביצים ניתן להשיג זוג אחד של דגים לפני השטח.
    4. לאסוףביצים בקערות זכוכית כדי למנוע הידבקות כדי משטחי פלסטיק ולמיין לבודד עוברים בשלב 1 תאים לפני ההזרקה ידי התבוננות ביצים תחת המיקרוסקופ ואיסוף ביצים שאינן תא בודד. שמור ביצים במי מערכת טריות (מכל מים שבו דגים בוגרים הם שוכנו, אשר טופלו על pH ומוליכות).
  3. להזריק Talen mRNA.
    1. להזריק כמויות שונות של mRNA הכולל (כמויות שוות של כל Talen בצמד) כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי להזרקה כמו רעילות ויעילות להשתנות לפי זוג Talen. התחל על ידי הזרקה בריכוזים של mRNA הכולל כי הם 400-800 pg. לדלל ולשלב mRNA לריכוזים רצויים להזרקת 1.5 nl.
    2. טען בדילול mRNA לחלק האחורי של המחט ולצרף את המחט אל-מזרק מיקרו.
    3. לשבור את המחט באמצעות מלקחיים.
    4. כייל את המחט. לדוגמה, להוציא 10 פעמים ולאסוף כך ירידת נימי מיקרו. במשך 10 x 100 הפנויה 1.081; l, 32 נימי מיקרו מ"מ, הירידה צריך למלא את נימי מיקרו 0.5 מ"מ עבור 1.5 הזרקת NL / 1. התאם את זמן ההזרקה ולחץ לפי צורך.
    5. הכנס את המחט לתוך התא הבודד ולהזריק את ה- mRNA. להזריק את ה- mRNA ישירות לתוך התא, לא בחלמון.
    6. איסוף עוברים מוזרק בקערות זכוכית. שמור עובר על 23-25 ​​מעלות צלזיוס. הסר עוברים מתים (עוברי כי לְהִתְעַנֵן בעל צורה בלתי מוגדרת) בקביעות בימים הראשונים לאחר ההזרקה. מספר שיא של עוברים מתים ומעוותים משליטה (uninjected) וצלחות מוזרקות.
      הערה: ריכוז mRNA מוגבר עלול להוביל רעילות מוגברת עיוות / מוות של עוברים. לכן, רעיל לעומת יעילות חייב להיות מאוזן כדי לקבוע את הריכוז הטוב ביותר של mRNA להזריק.

דגי מייסד הפנוטיפ 5. הערכה יעילה Talen

  1. להקריב עובר על פי פרוטוקול חיה מוסדי.
    הערה: אנו להרדיםהעובר על ידי מהיר מצמרר על קרח.
  2. איסוף עוברים לתוך צינורות רצועת 0.8 μl PCR בעזרת פיפטה ההעברה.
    הערה: Genotyping יכול להתבצע על עוברי אדם או ברכות של עוברים.
  3. תמצית ה- DNA.
    1. עוברים מקום לתוך 100 μl 50 הידרוקסיד מ"מ נתרן (NaOH) ו לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן לצנן עד 4 מעלות צלזיוס.
    2. להוסיף 1/10 נפח ה (10 μl) של 1 M טריס- HCl pH 8.
  4. בצע PCR על האזור באמצעות פריימרים המיועדים בשלב 1.3 (ראה לוחות 8 ו -9 בפרוטוקולים מדגמים). עבור עוברי בודדים 1 μl של ה- DNA הוא מספיק עבור תגובת PCR.
  5. לעכל את מוצר ה- PCR המתקבל עם אנזים ההגבלה המתאים ולהפעיל ג'ל agarose 1.5% על ידי אלקטרופורזה.
    1. לדוגמה, עבור genotyping לבקנות 2 oculocutaneous (oca2) מוקד בעוברים מוזרק לעכל את מוצר ה- PCR באמצעות אנזים הגבלה בסר לי על ידי הוספת 0.5 Μl של בסר I היישר 12.5 μl של תגובת PCR הושלמה, דוגרים על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. הפעל את מעוכלים והמוצר מתעכל על ג'ל. הגבלת להקות עמידות אנזים (כלומר, להקות שאינו לעכל) עולות כי מוטציות נגרמות Talen נוכח (איור 2).
  6. (אופציונאלי) לחשב את שיעור אחוז המוטציה על ידי קביעת האחוז מהתוצר נימול על ידי ניתוח תמונות של ג'לים פיג'י 38 באמצעות כלי ניתוח ג'ל לחישוב שווי האינטנסיביות של כל להקה כפי שתואר לעיל 29.
  7. לקבוע את הרצף של אללים מוטנטים ידי ת"א שיבוט להקת המוטציה העמידה אנזים הגבלה מטוהרת ג'ל וסדר שיבוטים.
    1. ג'ל לטהר את הגבלת אנזים להקת מוטציה עמידה בעקבות הוראות היצרן. ת"א לשכפל את הלהקה בעקבות הוראות היצרן. פיק מושבות ולגדול ב 1.5 מיליליטר LB O / N ב 37 מעלות צלזיוס רועדותמַדגֵרָה.
    2. תרבויות Miniprep בעקבות הוראות היצרן. שלח את ה- DNA עבור סידור.
    3. באמצעות תוכנית כגון APE, יישר את רצפי מוטנטי על פני רצף wildtype.
      1. העתק והדבק את שני הרצפים לתוך קבצי APE. בחר באפשרות "יישור שני רצפים" מתפריט "כלים".
      2. ציין שני רצפי DNA באמצעות התפריטים הנפתחים.
        הערה: השלמה הפוכה של רצף משובטים ייתכן שיהיה צורך להשתמש בהתאם לכיוון PCR נכנס וקטור שיבוט. אם רצפים לא ליישר, חזור על שלבים סימון התיבה "Rev-Com" בתיבת "יישר DNA".
  8. מייסד דגי ערך במשך פנוטיפים בשלב מתאים ושימוש בשיטות מתאימות עבור הפנוטיפ הצפוי 29 (לדוגמא, איור 3). שיטות phenotyping יתבסס על הפנוטיפ הצפוי הגן ממוקד על ידי החוקר באמצעות protocol.

6. מסך עבור הילוכים germline

הערה: א mexicanus מגיע לבגרות מינית בגיל 4-8 חודשים.

  1. לחצות לבגרות מינית מייסד דגי דגי סוג ברים.
  2. עובר מסך או דגים בוגרים בשיטות בצעדים 5.1-5.7 (איור 4). עבור דגים בוגרים, חתיכת הזנב יכול להיות מקוטע הבאים הרדמה.
    1. להרדים דגים על ידי השריית הדג בתמיסה של tricaine (אתיל אסתר חומצה 3-aminobenzoic) כדי להפחית את הלחץ במהלך גזיר סנפיר. בעקבות גזיר סנפיר, לאפשר דגים להתאושש במים מתוקים. דגים להתאושש במהירות; להתבונן עד שהם התאוששו (שוחים בדרך כלל).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זריקות זוג Talen לגרום מחייב של RVDs כדי דנ"א ספציפי ובכך dimerization של תחומי FokI, וכתוצאה מכך הפסקות גדילים כפולות 39 אשר ניתן לתיקון באמצעות קצה שאינו הומולוגי שהצטרף (NHEJ). NHEJ לעתים קרובות מציג שגיאות שיוצרות תוספות או השמטות (indels). Indels ניתן לזהות על ידי הגברה באזור המקיף את אתר היעד Talen ושמע את amplicon וכתוצאה עם אנזים הגבלה שחותך בתוך האזור spacer Talen. אללים ללא indel יהיו לעכל תוך אללים המכילים indels המשנה את רצף יעד אנזים הגבלה לא לעכל, ייצור להקה עמידה אנזים הגבלה (איור 2).

זריקות Talen יכול לגרום סביר מוטציות גנטיות biallelic ב א mexicanus 29. לכן, כמה פנוטיפים ניתן להעריך בדגים מייסדים. ל למשל, בדקנו פיגמנטציה בדגי משטח הזריקו TALENs מיקוד oca2, הגן שאמור להיות אחראי לבקנות באוכלוסיות מרובות הלבקן של 1,28 cavefish. מצאנו טלאים לבקן ב Talen מוזרק דגים oca2 לא נוכח דגים uninjected 29 (איור 3).

בניסויים רבים, רצוי יש קווים מוטנטים של דגים להערכת פנוטיפים. מייסד דגים עם אללים מוטנטים מועברים ניתן לזהות על ידי genotyping צאצאים מן הצלבים של דגי מייסד לדגי סוג ברים (איור 4).

איור 1
מחט באיור 1. להזרקת mRNA. תצלום של micropipette לפני שנשבר המשמש להזרקת Talen mRNA לעוברים חד-תאיים."Target =" _upload / 54,113 / 54113fig1large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
יעילות איור 2. Talen עבור Oca2. 306 נ"ב PCR מוצרים אקסון 9 של oca2 ב mexicanus Astyanax נבחנו בגין אובדן באתר אנזים הגבלה כאשר כמויות שונות של Talen mRNA הוזרקו 29. Amplicon מעובר מלא היה מתעכל בעוד שחלק של amplicon היה עמיד הגבלה לעכל בבריכות של 10 Talen המוזרקים עוברים. הגבלת אנזים לעכל להקות עמידות מעובר הזריק Talen mRNA ממוקד oca2 הוכח מכיל indels 29. שים לב ריכוזי גובר של mRNA מוזרק תוצאות התייעלות Talen (DNA המעוכל יותר). Lanes עם "-" הם לא מעוכלים, נתיבים עם "+" הם digesטד עם אנזים הגבלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
מייסד דגים איור 3. phenotyping עבור שינויי פיגמנטציה. (א) לשלוט א משטח uninjected mexicanus. (ב) תיקון חסר melanophores ב דג מייסד משטח הזריקו 400 pg Talen mRNA מיקוד oca2 (חץ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
שידור germline איור 4. Talen המושרה mutatioננו-שניות. 306 נ"ב מוצרי ה- PCR מן אקסון 9 של oca2 ב א mexicanus נבחנו בגין אובדן באתר אנזים הגבלה בתוך שלוליות של 10 דגים F 1 מתוך דגים מייסד מוזרק. Amplicon מעובר מלא היה מתעכל בעוד שחלק של amplicon היה עמיד הגבלה לעכל בבריכות של 10 עוברים F 1. הגבלת אנזים לעכל להקות עמידות מ oca2 F 1 s הוכח מכיל indels 29. Lanes עם "-" הם לא מעוכלים, נתיבים עם "+" מתעכלים עם אנזים הגבלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תגובה Reactiעל B
כמות מֵגִיב כמות מֵגִיב
4 μl מַיִם 10 μl מַיִם
1 μl pFUS_A 1 μl pFUS_B4
1 μl BsaI 1 μl BsaI
1 μl BSA 1 μl BSA
1 μl אנזים 1 μl אנזים
2 μl חיץ 10x האנזים 1 μl חיץ 10x האנזים
1 μl pNH1 1 μl pNG1
1 μl pNH2 1 μl pHD2
1 μl pNG3 1 μl pNH3
1 μl pHD4 1 μl pNI4
1 μl pHD5
1 μl pHD6
1 μl pNG7
1 μl pHD8
1 μl pNG9
1 μl pHD10

דוגמה בטבלה 1. עצרת התגובה ו- B עבורTalen המכיל RVDs NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.

שם פריימר רצף (5'-3 ")
pCR8_F1 ttgatgcctggcagttccct
pCR8_R1 cgaaccgaacaggcttatgt
TAL_F1 ttggcgtcggcaaacagtgg
TAL_R2 ggcgacgaggtggtcgttgg

פריימרים טבלה 2. PCR עבור המושבה PCR, מ -34.

מֵגִיב כמות
mastermix תקי, 2x 50 μl
פריימר pCR8_F1,10 אום 4 μl
פריימר pCR8_R1, 10 אום 4 μl
nuclease ללא מים 42 μl
* התאמת תמהיל מאסטר אם תקי שונה משמש

לוח 3. מיקס מאסטר עבור 100 μl (15 μl / תגובה) עבור המושבה 1 PCR.

שלב טמפרטורה (° C) זמן (שניות)
1 95 120
2 95 30
3 55 30
4 72 105
5 עבור לשלב 2 במשך 30 מחזורים
6 72 300

תוכנית לוח 4. PCR עבור המושבה PCR 1.

כמות מֵגִיב ריכוז
12 μl מַיִם
1 μl וקטור 100 ng / μl
1 μl וקטור B 100 ng / μl
1 μl יעד וקטור pT3Ts-GT 50 ng / μl
1 μl RVD הסופי (PLR-RVD) 100 ng / μl
1 μl Esp3I
1 μl אנזים
2 μl חיץ 10x האנזים

פרוטוקול לוח 5. לתגובות הרכבה שניות.

שלב טמפרטורה (° C) זמן (שניות)
1 95 120
2 95 30
3 55 30
4 72 180
5 עבור לשלב 2 במשך 30 מחזורים
6 72 300

תוכנית לוח 6. PCRעבור המושבה 2 PCR.

חוֹם 290
מְשׁוֹך 150
מְהִירוּת 100
זְמַן 150
פרמטרים אלה הם עבור P-97 דגם Flaming / בראון micropipette פולר באמצעות נימת שוקת

מחט לדוגמא טבלה 7. משיכת התוכנית.

מֵגִיב כמות
mastermix תקי, 2x 12.5 μl
פריימר הגן קדימה ספציפי, 10 מיקרומטר 1 μl
פריימר הגן ההפוך ספציפי, 10 מיקרומטר 1 μl
nuclease ללא מים 9.5 μl
DNA 1 μl
* התאמת תמהיל מאסטר אם תקי שונה משמש

פרוטוקול לדוגמא טבלה 8. עבור הגן הספציפי PCR.

שלב טמפרטורה (° C) זמן (שניות)
1 95 120
2 95 30
3 56 30
4 72 60
5 עבור אל היםTEP 2 במשך 35 מחזורים
6 72 300
* להתאים טמפרטורת חישול וסיומת זמן פריימרים ספציפיים וגודל מוצר PCR

לוח 9: תוכנית ה- PCR לדוגמא עבור גן ספציפי PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צעדים גדולים נעשו בשנים האחרונות כלפי בהבנת הבסיס הגנטי של האבולוציה של תכונות. בעוד גני מועמדים שבבסיס האבולוציה של מספר התכונות זוהו, היא נותרה מאתגרת לבדוק גנים אלה in vivo בשל חוסר העקיבות גנטית של מינים המעניינים ביותר מבחינה אבולוציונית. כאן אנו מדווחים על שיטה לעריכה הגנום א mexicanus, זן לשמש כדי לחקור את האבולוציה של בעלי חיים במערה. מיפוי גנטי לומד 1,21,23 ו גן מועמד גישות 19,40 זיהה מספר גני מועמדים לאבולוציה של תכונות בצורת המערה של א mexicanus. הפרסום האחרון של הגנום cavefish 41 מספק כלי רב עצמה נוספת לזיהוי גני מועמדים לאבולוציה של תכונות מערות. בדיקת התפקוד של רבי גני המועמדים אלה דורש טכניקות להפחתת ביטוי גנים. האפשרות הנוכחית בלבד ללימודing ביטוי גנים מופחת א mexicanus היא על ידי השימוש של morpholinos. עם זאת, מציאת גן morpholino היא חולפת, מוגבלת שלאחר הפריה כמה ימים, והוא לא שימושי לחקר תכונות בבעלי חיים בוגרים, כגון בדלים התנהגותיים בין מערה המבוגרת ודגי משטח כמו לימוד 17, hyperphagia 19 ורעידות משיכת התנהגות 42. דור של אובדן אללים פונקציה של גנים, כמו אלה שיכולים להתבצע באמצעות TALENs, יהיה קריטי לבחינת התפקיד של גני מועמדים עבור תכונות אלה.

שיטות פותחו עבור הרכבה קלה של זוגות Talen 33 ואת הפרוטוקול המפורט עבור שיטה זו זמינה 34. פרוטוקול זה מותאם לשימוש דג זברה על ידי בדל et al. 7, באמצעות וקטור יעד סופי שונה, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-GT). וקטור זה מאפשר שעתוק של Talen mRNA להזרקה לתוך עוברי דג הזברה חד-תאיים.השתמשנו בשיטת הרכבה השונה הזו, הסביר בפירוט כאן, כדי להרכיב לתמלל TALENs להזרקה לתוך א mexicanus. מצאנו כי כאשר מזריקים א משטח חד תאיים עוברים mexicanus, כמתואר בתוך פרוטוקול זה, נוכל לעבור מוטציה א גני mexicanus 29. למחקר עתידי על גני מועמדים לא תארו בפרוטוקול זה, ניתן למצוא רצפים בגנום cavefish 41 והשתמשו כדי לזהות אתרי יעד Talen.

קריטי עבור זריקות מוצלחות הוא mRNA Talen באיכות גבוהה. לפיכך, בדיקת איכות RNA על ידי הפעלת כמות קטנה של RNA על ג'ל לפני ההזרקה חשוב (שלב 3.6). אמצעי זהירות אחר עבור שלמות RNA שמירה, כמו הקפאת aliquots להימנע מפשיר הקפאה (שלב 3.7), ושמירה על תנאים סטריליים באמצעות צינורות וטיפי מים RNAse ללא נקיים במהלך זריקות (שלב 4), יש לנקוט. צעד קריטי נוסף לדגים מוזרקים מעלה הואמנקה את עוברים מתים לאחר הזרקה, כמו עוברים מתים עלולים לפגום באיכות מים במהירות. לכן, אנו מסירים עוברים מתים בבוקר הזריקות הבאות ולאחר מהעת לעת בימים הקרובים בעקבות זריקות לשמור עובר לחיות בריאות (שלב 4.3.6).

Mutagenesis Talen ב mexicanus Astyanax יכול להיות יעיל ביותר; עם זאת, יעילות משתנה בהתאם זוג Talen מוזרק 29. ריכוזי mRNA מוגברים עלולים להוביל רעילות מוגברת עיוות ומותו של עוברים מוזרקים. לכן, רעילות לעומת יעילות חייב להיבדק מאוזנת כדי לקבוע את ריכוז אופטימלי של mRNA להזריק. עבור זוגות Talen היעילים ביותר, פנוטיפים ניתן להעריך בדגים מייסדים מוזרקים. לדוגמא, הזרקת oca2 מיקוד TALENs הביאה טלאים לבקן במשטח דגים 29 (איור 3). עבור תכונות או גנים אחרים, לעומת זאת, הערכה של פנוטיפים מייסד דגים עשויה להיות מאתגר בשלכדי מרומזות פנוטיפ או יעילות נמוכה של זוג Talen מוזרק. לכן, עבור יישומים רבים זה יהיה רצוי ליצור מוטציות germline בתוך גן של עניין לניתוח עצם את התפקיד של גן מועמד בתוך חיה הלא-פסיפס. קבלת שידור germline של מוטציות-induced Talen ב א mexicanus אפשרי 29 (איור 4). לכן, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת להעריך גני מועמדים אחרים.

כמה מגבלות לביצוע מניפולציות גנטיות mexicanus Astyanax להתקיים בשלב זה. Surface להתרבות cavefish בחושך, בשעת לילה מאוחרת. במעבדה שבה לא ניתן לעצור את מעגל חשוך אור, החוקרים חייבים לבוא מאוחר בלילה כדי לבצע זריקות, כפי שהוא קריטי להזריק מיד לאחר ההשרצה. בנוסף, חשוב לאסוף עוברי דגי משטח בחושך, כמו אור ישפיע השרצה.

טכניקות אחרות, ב particuLar מערכת CRISPR / קאש (הנסקרת ב 43), קיים לעריכה הגנום יהיה ישים סביר א mexicanus. ואכן, פרוטוקולים להרכבת RNA מדריך קיימים כי הם מהירים וקלים 44 והפרוטוקול דיווח כאן יכול להיות שונה להזרקת CRISPR / קאש. בנוסף, יישומים חדשים לעריכה הגנום מפותחים במהירות, ורבים מהם עשויים להיות שימושיים עבור א חוקרי mexicanus. לדוגמא, ב מוטציות מדויקות דג זברה נעשה בתוך גן של עניין על ידי coinjecting TALENs עם אוליגו תקוע יחיד המכיל מוטציה 7. טכניקה זו יכולה להיות שימושית על מנת לאמוד את התפקיד של אללים המערה ביצירת פנוטיפים מערה, כגון תפקידה של מוטצית missense ב אללים מערה המסוים של mc4r בהפרשי במטבוליזם נצפו בין דגי cavefish ומשטח 19. TALENs גם שמש להפקת אללים של גנים באמצעות רקומבינציה הומולוגי המבטאים סמני ניאון in דפוסים דומים הלוקוסים אנדוגניים 45. שיטות אלה יכולים לשמש ב א mexicanus להעריך תת קבוצות של תאים או ביטוי של גנים מועמדים. מערכת CRISPR / קאש נעשה שימוש דג זברה להשיג נוקאאוט גנטי רקמות ספציפיות 46. טכניקות אלו, להחיל א mexicanus, יכול להיות שימושי כדי להעריך את הבסיס הגנטי של תהליכים כגון אובדן עין cavefish. העדשה משחקת תפקיד קריטי בתהליך של אובדן עין cavefish 47 ומערכת CRISPR ספציפי רקמות / קאש יכול לשמש כדי להעריך את התפקיד של גני מועמדים עבור אובדן עין במיוחד בעדשה לעומת ברקמות אחרות של העין. יכולות להיות מנוצלות אלה וטכניקות הגנום עריכה אחרות א mexicanus במחקרים עתידיים לענות על שאלות קריטיות על האבולוציה של תכונות מערות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי המחלקה לגנטיקה, פיתוח ביולוגיה של התא ו איווה סטייט ועל ידי EY024941 מענק NIH (WJ) .Dr. ג'פרי Essner ספק הערות על כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Thermocycler
Injection station
Gel apparatus
Needle puller
Nanodrop
Name Company Catalog Number Comments
Supplies
Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated
Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 Addgene Kit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) Fisher BP9724-500
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller Fisher BP1426-500
Teknova TET-15 in 50% EtOH Teknova (ordered through Fisher) 50-843-314
Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents Fisher BP2957-1
Super Ampicillin (1,000x solution) DNA Technologies 6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) FERR0941
IPTG, Fisher BioReagents Fisher BP1620-1
Petri dishes Fisher 08-757-13
BsaI New England Biolabs (ordered through Fisher) 50-812-203 Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
BSA New England Biolabs provided with restriction enzymes
10x T4 ligase buffer Promega (ordered through Fisher) PR-C1263
GoTaq Green Master mix Promega (ordered through Fisher) PRM7123 Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly
Quick ligation kit New England Biolabs (ordered through Fisher) 50-811-728 We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions
One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli Invitrogen C4040-06 Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used
Esp 3I Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) FERER0451
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase Epicentre (Ordered through Fisher) NC9046399
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose BioExpress E-3119-125
Sac I Promega (Ordered through Fisher) PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit Ambion AM1348M
Rneasy MinElute Cleanup Kit Qiagen 74204
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye  Ambion (ordered through Fisher) AM8551
Eliminase Decon (ordered through Fisher) 04-355-32
Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets Fisher 13-678-6B
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Microcaps Drummond Scientific Company 1-000-0010
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Eppendorf (ordered through Fisher) E5242956003
Sodium hydroxide Fisher S318-500
Tris base Fisher BP152-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
  2. Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
  3. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  4. Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
  5. Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
  6. Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
  7. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  8. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
  9. Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
  10. Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136 (2014).
  11. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  12. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evol Biol. 12, 105 (2012).
  13. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  14. Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
  15. Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
  16. Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
  17. Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
  18. Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
  19. Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  20. Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
  21. Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326 (2009).
  22. Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108 (2012).
  23. Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281 (2013).
  24. Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
  25. Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
  26. Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
  27. Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
  28. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823 (2013).
  29. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370 (2015).
  30. Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
  31. Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
  32. Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
  33. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82 (2011).
  34. Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
  35. Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
  36. Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
  37. Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
  38. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  39. Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
  40. Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647 (2014).
  41. McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307 (2014).
  42. Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  43. Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
  44. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  45. Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
  46. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  47. Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 112, Cavefish TALENs Talen עריכת הגנום
הגנום עריכה<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; שימוש תמלול Activator דמוי מפעיל nucleases (TALENs)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kowalko, J. E., Ma, L., Jeffery, W.… More

Kowalko, J. E., Ma, L., Jeffery, W. R. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). J. Vis. Exp. (112), e54113, doi:10.3791/54113 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter