Summary
Gene inriktning mutagenes är nu möjligt i ett brett spektrum av organismer med genomet redigeringstekniker. Här visar vi ett protokoll för målinriktad gen mutagenes med användning transkriptionsaktivator som effektor nukleaser (Talens) i Astyanax mexicanus, en fiskart som omfattar yta fisk och cavefish.
Introduction
Att förstå den genetiska grunden för drag utveckling är en kritisk forskning mål av evolutionsbiologer. Betydande framsteg har gjorts när det gäller att identifiera loci ligger till grund för utvecklingen av egenskaper och lokalisera kandidatgener inom dessa loci (t.ex. 1-3). Men funktionellt testa rollen av dessa gener har förblivit utmanande många organismer som används för att studera utvecklingen av egenskaper är för närvarande inte genetiskt lätthanterlig. Tillkomsten av genomet redigeringstekniker har i hög grad ökad genetisk manipulability av ett brett spektrum av organismer. Transkriptionsaktivator liknande effektor nukleaser (Talens) och klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPRs) har använts för att generera riktade mutationer i gener i ett antal organismer (till exempel 4-11). Dessa verktyg, som tillämpas på ett evolutionärt relevanta systemet har potential att revolutionera hur evolutionsbiologer studera den genetiska grunden för evolutionen.
Astyanax mexicanus är en fiskart som finns i två former: a. Flod bostad yta formen (ytan fisk) och flera grottlevande former (cavefish) A. mexicanus cavefish utvecklats från ytan fisk förfäder (översikt i 12). Populationer av cavefish har utvecklats ett antal egenskaper, inklusive förlust av ögon, minska eller förlust av pigmentering, ökat antal smaklökar och kraniala neuromasts, och förändringar i beteende såsom förlust av skolbeteende, ökad aggressivitet, förändringar i utfodring hållning och hyperfagi 13 -19. Cavefish och ytan fisk är interfertile, och genetiska kartläggningsexperiment har utförts för att identifiera loci och kandidatgener för grottdrag 1,20-26. Vissa gener har testats för en funktionell roll för att bidra till grott egenskaper i cellodling 1,19, i modellorganismer av andra arter 21 eller genom överuttryck 27 eller övergående knockdown usjunga morpholinos 28 i A. mexicanus. Emellertid har var och en av dessa metoder begränsningar. Förmågan att generera mutanta alleler av dessa gener i A. mexicanus är avgörande för att förstå deras funktion i utvecklingen av cavefish. Således, A. mexicanus är en idealisk kandidat organism för tillämpning av genomet redigering teknik.
Här redogör vi en metod för genom redigering i A. mexicanus använder Talens. Denna metod kan användas för att utvärdera mosaik injiceras grundare fisk för fenotyper och för att isolera rader av fisk med stabila mutationer i gener av intresse 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök var i enlighet med de riktlinjer för National Institutes of Health och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Iowa State University och University of Maryland.
1. Talen Design
- Input önskade målsekvensen till en Talen konstruktion webbplats. (Till exempel: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Ingång vald spacer / upprepade array längder.
- Kopiera genomsekvensen i boxen märkt "Sekvens".
- Inom "Ge Anpassad Spacer / RVD Längder" -fliken väljer distans längd och array längd.
Obs: Spacer längder av 15 baspar och upprepa array längder av 15-17 fungerar bra och gör monteringen enklare.
- Att välja talen par. Talen par uppbyggda kring ett unikt restriktionsenzymställe möjliggöra genotypning av restriktionsenzym smältaen PCR-produkt.
- Design primers för att förstärka den genomiska regionen som omger målstället talen med hjälp av en webbplats som Primer3 30-32. När genotypning med ett restriktionsenzym, till konstruktions primers förstärka en region som innehåller restriktionsenzymstället endast en gång. Det rekommenderas att denna region förstärks och sekvens före talen konstruktion för att identifiera eventuella polymorfismer föreligger i A. mexicanus lab population som skall användas för mikroinjektion.
2. Talen Assembly (Ändrad från talen Kit Protocol) 33,34
För ytterligare information och felsökning, se protokollet 34.
- Förbered och sekvensera nödvändiga plasmider från talen kit enligt tillverkarens anvisningar.
- Ställ in # 1 reaktioner för reaktioner A och B. Inkludera upprepa variabel diresidues (RVDs) 1-10 och destinationsvektor pFUS_A i reaktions A. Inkludera RVDs 11- (N-1) och the destinationsvektor pFUS_B (N-1) i Reaktions B där N är det totala antalet RVDs i Talen.
- Tillsätt till varje reaktion: 1 | il av varje plasmid innehållande var RVD (100 ng / | il), destinationsvektor (100 ng / | il), 1 pl Bsa I-restriktionsenzym, ett pl bovint serumalbumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 pl ligas, 2 ^ il 10 x ligasbuffert och x | il vatten för en total volym av 20 | il. Till exempel, se tabell 1.
Obs: Halv reaktioner kan också användas. - Placera reaktioner i en termocykler och kör cykeln: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min.
- Tillsätt till varje reaktion: 1 | il av varje plasmid innehållande var RVD (100 ng / | il), destinationsvektor (100 ng / | il), 1 pl Bsa I-restriktionsenzym, ett pl bovint serumalbumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 pl ligas, 2 ^ il 10 x ligasbuffert och x | il vatten för en total volym av 20 | il. Till exempel, se tabell 1.
- Inkubera reaktioner med nukleas. Till varje reaktion tillsätt 1 pl 25 mM ATP och 1 pl nukleas. Inkubera reaktioner vid 37 ° C under 1 timme.
- Omvandla Reactions.
- Omvandla 2,5 pl av varje reaktion i 25 ^ kemiskt kompetenta celler.
Obs: Hemlagad kompetent calnar kan användas. Däremot kan celler med låg kompetens resultera i brist på kolonier.- Blanda 2,5 | il av reaktionen med 25 | il av kemiskt kompetenta celler. Inkubera på is i fem minuter. Inkubera cellerna i 30 sek vid 42 ° C.
- Placera rören på is under 2 min. Lägg 125 pl Super Optimal buljong med katabolitrepression (SOC). Skaka rören vid 37 ° C under 1 timme.
- Plattan 100 | il av de transformerade celler på LB-plattor med spektinomycin (50 pg / ml), X-gal och isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG). Växa O / N vid 37 ° C.
- Omvandla 2,5 pl av varje reaktion i 25 ^ kemiskt kompetenta celler.
- Plocka 2-3 vita kolonier för varje reaktion och kontrollera genom koloni-PCR med användning av primrar pCR8_F1 och pCR8_R1 (tabell 2).
- Gör en huvudblandning av reagensen. Till exempel, se tabell 3.
- Välj en koloni och smeta det i botten av en PCR-rör, och sedan lägga resterna av kolonin i 2 ml LB med spektinomycin(50 | j, g / ml). Placera 15 | il av huvudblandning i röret med kolonin.
- Kör följande PCR-program (tabell 4)
- Kontrollera PCR (kör hela volymen) på en 1,5% agarosgel genom elektrofores. De korrekta klonerna kommer att ha ett band vid den förväntade storleken, liksom ett utstryk och en stege av band. För ett exempel på den lämpliga smear, se 34,33.
- Växa 2 ml kulturer av de korrekta klonerna i LB-medium O / N vid 37 ° C i en skakinkubator.
- Miniprep plasmiderna enligt tillverkarens anvisningar.
- Sekvens för att kontrollera Talen sekvens med pCR8_F1 och pCR8_R1. Följa tidigare beskrivna metoder 35.
- Med rätt kloner verifieras genom sekvensering, ställa in reaktions # 2 (talen kit), som kommer att placera RVDs från A- och B-vektorerna och den slutliga RVD i destinationsvektor.
- Förbereda blandning för reaktion 2 (tabell 5).
Notera: Half reaktioner kan användas. - Placera reaktionerna i en termocykler och kör följande program: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min.
- Förbereda blandning för reaktion 2 (tabell 5).
- Omvandla Reactions.
- Omvandla 2,5 pl av varje reaktion i 25 ^ kemiskt kompetenta celler.
- Blanda 2,5 | il av reaktionen med 25 | il av kemiskt kompetenta celler. Inkubera på is under 5 min. Värmechock cellerna under 30 sekunder vid 42 ° C.
- Placera rören på is. Lägg 125 | il av SOC. Placera rören i en skakinkubator vid 37 ° C under 1 timme.
- Plattan 100 | il av de transformerade celler på LB-plattor med ampicillin (100 | ig / ml), X-gal och IPTG. Växa O / N vid 37 ° C.
- Omvandla 2,5 pl av varje reaktion i 25 ^ kemiskt kompetenta celler.
- Plocka 1-3 vita kolonier för varje reaktion och kontrollera genom koloni-PCR med användning av primers TAL_F1 och TAL_R2 (tabell 2).
- Gör en lösning av polymeraset mastermix, vatten och primrar sombeskrivs i tabell 3. Välj en koloni och smeta det i botten av en PCR-rör, och sedan lägga resterna av kolonin i 2 ml LB med ampicillin (100 mikrogram / ml). Placera 15 | il av lösningen in i röret med kolonin.
- Kör PCR-program (tabell 6).
- Kontrollera PCR på en 1,5% agarosgel genom elektrofores. Korrekta kloner kommer att ha en utsmetning och en stege av band. För ett exempel på den lämpliga smear, se 34,33.
- Växa 2 ml kulturer av de korrekta klonerna i LB-medium O / N vid 37 ° C i en skakinkubator.
- Miniprep plasmiderna enligt tillverkarens anvisningar.
- Sekvens för att kontrollera Talen sekvens med TAL_F1 och TAL_R2 följande tidigare beskrivna metoder 35.
3. mRNA Transkription av Talens
- Smälta 4 mikrogram av sekvens verifierad mall med två l SacI under 2 h vid 37 ° C. Köra 2 pl av SacI omsatta plasmiden på en 1,5% agarosgel genom elektrofores. Plasmider som korrekt spjälkas visas ett enda band.
- Rena den återstående SacI omsatta plasmiden efter PCR-reningskit-protokollet. Tvätta två gånger med tvättlösningen före eluering. Eluera i 30 pl nukleasfritt vatten.
- Följ standardprotokoll för T3 mRNA produktion.
- Inrättat halv-reaktioner med användning 0,5 | j, g av lineariserad mall (framställd ovan). Inkubera vid 37 ° C under 2 h.
- Tillsätt 0,5 pl av DNas (ingår i satsen) och inkubera vid 37 ° C under 15 min.
- Rena den mRNA, enligt tillverkarens instruktioner. Eluera i 30 pl nukleasfritt vatten.
- Köra en 1,5% agarosgel genom elektrofores för att kontrollera mRNA.
- Rengör gel apparat med en produkt för att eliminera RNas föroreningar och förbereda en 1,2% gel.
- Blanda 1 pl mRNA + 4 &# 181; l nukleasfritt vatten + 5 pl glyoxyl laddningsfärg. Inkubera proverna vid 50 ° C under 30 minuter. Centrifugera rören kort och placera på is innan du kör gelén.
- Kontrollera koncentrationen med hjälp av en metod för att kvantifiera nukleinsyra-koncentrationer och lagra RNA i alikvoter vid -80 ° C. Välj en portion storlek så att RNA inte är frusen / tinas mer än en gång.
Obs: Halterna av 500-1000 ng / nl erhålles typiskt. RNA med en lägre koncentration kan användas så länge som RNA integritet bibehålls (såsom fastställts genom ett band snarare än en smutsfläck på gelén).
4. Injicera Astyanax mexicanus Embryon med talen mRNA
- Förbered verktyg för injektion.
- Pour injektion plattor genom att hälla 1,2% agaros i fisk vatten (rade med natriumbikarbonat och havssalt till pH 7,4 och konduktivitet 700 | iS vatten) i en petriskål. Placera en form (plastbit med projektioner för att göra brunnar för fiskägg) inuti skålen. Ta bort formen när agarosen har stelnat och förvara vid 4 ° C. För mer information om formen ser 36.
- Dra nålar för injektion med användning av en nål avdragare enligt tillverkarens instruktioner.
Obs: Lämplig nål längd är viktig för injektioner. Nålar som är för lång kommer att vara alltför flexibel för injektioner. Protokollet för drag nålar kommer att variera med den utrustning som används för att dra nålar. Ett exempel på en lämplig nål visas i figur 1. För vår utrustning, vi drar nålar som är 5-6 cm i längd, och har en ytterdiameter vid spetsen av cirka 0,011 mm när de delas. Dock bör nålar kalibreras (steg 4.3.4) för att bestämma öppningsbredd. Ett exempel program för att dra nålar kan hittas i tabell 7. - Förbered glaspipetter för embryoöverföring genom att bryta pipetten så att öppningen är tillräckligt stor för ett ägg att passera. Flamma den brutna änden tillsdet inte längre är skarpa.
Obs: Det är viktigt att använda glaspipetter och glasskålar när man arbetar med A. mexicanus ägg och embryon som de är klibbig och kommer att följa plast.
- Samla in en-cellstadiet ägg.
- Ras A. mexicanus följande standardprotokoll 37.
Obs: Till exempel, om fisken hålls på en 14 ljus: mörker-cykel 10 och med hjälp av Zeitgerber tid (ZT) med ZT0 som lampor på och ZT14 som lyser upp vår yta fiskyngel mellan ZT15 och ZT19. Exakt lektiden måste bestämmas för varje enskild labb. - Framkalla lek genom övergödning fisk för 3-4 dagar före parning och placera fisken i sötvatten. Höj temperaturen 2 ° C. Obs: Vår första vattentemperaturen är cirka 74 ° C.
- Samla yta fiskrom i mörkret, kontroll var 15 minuter för att erhålla ägg i en cellstadiet. Hundratals ägg kan erhållas från ett enda par av ytan fisk.
- Samlaägg i glasskålar för att förhindra att hålla sig till plastytor och sortera för att isolera embryon vid en cellstadiet före injektion genom att observera ägg under mikroskop och samla ägg som är en enda cell. Håll ägg i färskt vattensystem (tank vatten där vuxna fiskar är inrymda, som har behandlats för pH och ledningsförmåga).
- Ras A. mexicanus följande standardprotokoll 37.
- Injicera Talen mRNA.
- Injicera olika mängder av total mRNA (lika stora mängder av varje Talen i paret) för att bestämma den optimala koncentrationen för injektion som toxicitet och effektivitet varierar beroende på talen par. Börja med att injicera koncentrationer av total-mRNA som är 400-800 pg. Späd och kombinera mRNA till önskade koncentrationer för att injicera 1,5 nl.
- Belastning utspädd mRNA på baksidan av nålen och fäst nålen till en mikro-injektor.
- Bryt nålen med hjälp av pincett.
- Kalibrera nålen. Till exempel, mata 10 gånger och samla den resulterande nedgången i en mikro kapillär. För 10 x 100 engångs 1,081, l, 32 mm micro kapillär, bör droppen fylla mikro kapillär till 0,5 mm för 1,5 nl / en injektion. Justera insprutningstiden och tryck som behövs.
- Stick in nålen i en enda cell och injicera mRNA. Injicera mRNA direkt in i cellen, inte i äggulan.
- Samla injiceras embryon i glasskålar. Håll embryon vid 23-25 ° C. Ta bort döda embryon (embryon som blir grumlig och oregelbundet formade) regelbundet under de första dagarna efter injektion. Rekordmånga döda och deformerade embryon från kontroll (icke injicerad) och injicerade plattor.
Obs: Ökad mRNA koncentration kan leda till ökad toxicitet och deformitet / död av embryon. Därför måste toxicitet mot effektivitet balanseras för att bestämma den bästa koncentrationen av mRNA att injicera.
5. Fenotyp Grundare fisk och utvärdera talen Effektivitet
- Offra embryon enligt Institutional Animal protokoll.
Obs: Vi avlivaembryon genom snabb kylning på is. - Samla embryon i 0,8 pl PCR-band rör med hjälp av en pipett.
Notera: Genotypning kan utföras på enskilda embryon eller pooler av embryon. - Extrahera DNA.
- Place embryon i 100 | il 50 mM natriumhydroxid (NaOH) och inkubera vid 95 ° C under 30 min, kyl sedan till 4 ° C.
- Lägga 1/10: e volym (10 ^ il) av 1 M Tris-HCl pH 8.
- Utföra en PCR på regionen med användning av de primrar utformade i steg 1,3 (se Tabellerna 8 och 9 för provprotokoll). För enskilda embryon 1 pl av DNA är tillräcklig för PCR-reaktionen.
- Smälta den resulterande PCR-produkten med det lämpliga restriktionsenzymet och kör en 1,5% agarosgel genom elektrofores.
- Till exempel, för genotypning den oculocutaneous albinism 2 (OCA2) lokus i injicerade embryon smälta PCR-produkten med användning av restriktionsenzymet BSR I genom tillsats av 0.5 ^ Il BSR I direkt till 12,5 ul av den fullbordade PCR-reaktionen, inkubering vid 65 ° C under 2 h. Kör osmält och spjälkade produkten på en gel. Restriktionsenzymresistenta band (dvs band som inte smälta) visar att talen-inducerade mutationer är närvarande (figur 2).
- (Tillval) Beräkna procentmutationshastighet genom att bestämma andelen uncut produkt genom att analysera bilder av geler i Fiji 38 hjälp av gelanalys verktyg för att beräkna intensitetsvärdet för varje band som beskrivits tidigare 29.
- Bestämma sekvensen av mutanta alleler av TA kloning det gelrenade restriktionsenzymet resistent mutant bandet och sekvensering av kloner.
- Gel rena restriktionsenzym resistent mutant band enligt tillverkarens instruktioner. TA klona bandet enligt tillverkarens anvisningar. Plocka kolonier och växa i 1,5 ml LB-O / N vid 37 ° C i ett skakandeinkubator.
- Miniprep kulturer efter tillverkarens instruktioner. Skicka DNA för sekvensering.
- Med användning av ett program såsom APE, anpassa de mutantsekvenser till vildtypssekvensen.
- Kopiera och klistra in båda sekvenserna i APE-filer. Välj "Justera två sekvenser" verktyg från menyn "Verktyg".
- Ange de två DNA-sekvenser med hjälp av rullgardinsmenyerna.
Obs: Den omvända komplementet av den klonade sekvensen kan behöva användas beroende på den riktning PCR gick in i kloningsvektorn. Om sekvenserna inte justera, upprepa steg kontroll av "Rev-Com" rutan i "Justera DNA" rutan.
- Utvärdera grundare fisk för fenotyper vid lämpligt steg och med hjälp av lämpliga metoder för förväntade fenotypen 29 (till exempel, Figur 3). Metoder för fenotypning kommer att baseras på den förväntade fenotypen för genen måltavla forskaren använda protocol.
6. Skärm för könsceller Transmission
Notera: A. mexicanus blir könsmogna vid 4-8 månader.
- Korsa könsmogen grundare fisk till vild typ fisk.
- Skärm embryon eller vuxna fiskar med hjälp av metoder i steg 5.1-5.7 (Figur 4). För vuxna fiskar kan en bit av svansen ska klippas efter bedövning.
- Söva fisk genom att sänka ned fisken i en lösning av tricaine (3-aminobensoesyra-etylester) för att minska stress under fin klippning. Efter fin klippning, låt fisken att återhämta sig i sötvatten. Fisk återhämta sig snabbt; observera tills de har återhämtat sig (simmar normalt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Talen par injektioner resulterar i bindningen av RVDs till specifika DNA-nukleotider och därmed dimerisering av Fokl domäner, vilket resulterar i dubbelsträngade avbrott 39 som kan repareras genom icke-homolog sammanfogning (NHEJ). NHEJ introducerar ofta fel som resulterar i insättningar eller deletioner (InDels). InDels kan identifieras genom att amplifiera regionen som omger Talen målstället och smälta den resulterande amplikon med ett restriktionsenzym som skär inuti Talen spacerområdet. Alleler utan en Indel kommer smälta medan alleler innehållande InDels som ändrar restriktionsenzymet målsekvensen kommer inte smälta, som producerar en restriktionsenzym resistent band (Figur 2).
Talen injektioner kan sannolikt leda till bialleliska genmutationer i A. mexicanus 29. Således kan vissa fenotyper bedömas grundare fisk. För exempel utvärderade vi pigmentering i ytan fisk injicerade med Talens inriktning OCA2 genen hypotesen att ansvara för albinism i flera albino populationer av cavefish 1,28. Vi hittade albino fläckar i OCA2 talen-injicerade fisk inte förekommer i icke-injicerade fisk 29 (Figur 3).
För många experiment, är det önskvärt att ha mutanta linjer av fisk för utvärdering fenotyper. Grundare fisk med överförda muterade alleler kan identifieras genom genotypning avkomma från korsningar av grundaren fisk till vild typ fisk (Figur 4).
Figur 1. nål för att injicera mRNA. Fotografi av en mikropipett före bryts används för injicering Talen mRNA till encelliga embryon._upload / 54.113 / 54113fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Undersöktes figur 2. Talen effektivitet för OCA2. 306 bp PCR-produkter från exon 9 av OCA2 i Astyanax mexicanus ades för förlust av restriktionsenzymsätet när olika mängder av Talen mRNA injicerades 29. Amplikon från en styr embryo spjälkades medan en del av amplikonet var resistent mot restriktionsklyvning i pooler av 10 Talen injicerade embryon. Restriktionsenzym smälta resistenta band från embryon som injicerats med talen mRNA riktade OCA2 har visat sig innehålla InDels 29. Observera att ökande koncentrationer av mRNA injiceras resulterar i ökad talen effektivitet (mer osmält DNA). Lanes med "-" är osmält, körfält med "+" är DigesTed med restriktionsenzym. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Fenotypning grundare fisk för förändringar i pigmentering. (A) Kontroll oinjicerade yta A. mexicanus. (B) Patch saknar melanoforer i en grundare yta fisk injicerade med 400 pg Talen mRNA riktar OCA2 (pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. germline transmission av talen inducerad mutations. 306 bp PCR-produkterna från exon 9 av OCA2 i A. undersöktes mexicanus var för förlust av restriktionsenzymstället i pooler av 10 F 1 fisk från en injicerad grundare fisk. Amplikon från en styr embryo spjälkades medan en del av amplikonet var resistent mot restriktionsklyvning i pooler om 10 F 1 embryon. Restriktionsenzym smälta resistenta band från OCA2 F 1 s har visat sig innehålla InDels 29. Lanes med "-" är osmält, körfält med "+" klyvs med restriktionsenzym. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| reaktion A | Reactipå B | |||
| belopp | reagens | belopp | reagens | |
| 4 | j, l | vatten | 10 pl | vatten | |
| 1 pl | pFUS_A | 1 pl | pFUS_B4 | |
| 1 pl | Bsal | 1 pl | Bsal | |
| 1 pl | BSA | 1 pl | BSA | |
| 1 pl | ligas | 1 pl | ligas | |
| 2 ^ | 10 x ligasbuffert | 1 pl | 10 x ligasbuffert | |
| 1 pl | pNH1 | 1 pl | pNG1 | |
| 1 pl | pNH2 | 1 pl | pHD2 | |
| 1 pl | pNG3 | 1 pl | pNH3 | |
| 1 pl | pHD4 | 1 pl | pNI4 | |
| 1 pl | pHD5 | |||
| 1 pl | pHD6 | |||
| 1 pl | pNG7 | |||
| 1 pl | pHD8 | |||
| 1 pl | pNG9 | |||
| 1 pl | pHD10 | |||
Tabell 1. Exempel reaktionsaggregatet A och B för enTalen innehåller RVDs NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.
| primer namn | sekvens (5'-3 ') |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
Tabell 2. PCR-primers för kolonin PCR, från 34.
| reagens | belopp |
| Taq-mastermix, 2x | 50 ^ |
| pCR8_F1 primer,10 uM | 4 | j, l |
| pCR8_R1 primer, 10 uM | 4 | j, l |
| Nukleasfritt vatten | 42 | il |
| * Justera huvudblandning om en annan Taq används | |
Tabell 3. huvudblandning för 100 | il (15 | il / reaktion) för koloni-PCR 1.
| steg | temperatur (° C) | tid (sek) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 105 |
| 5 | Gå till steg 2 för 30 cykler | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabell 4. PCR-program för koloni-PCR 1.
| belopp | reagens | koncentration |
| 12 | il | vatten | |
| 1 pl | vektor A | 100 ng / | il |
| 1 pl | vektor B | 100 ng / | il |
| 1 pl | destinationsvektor pT3Ts-GT | 50 ng / | il |
| 1 pl | slutlig RVD (PLR-RVD) | 100 ng / | il |
| 1 pl | Esp3I | |
| 1 pl | ligas | |
| 2 ^ | 10 x ligasbuffert | |
Tabell 5. Protokoll för andra monterings reaktioner.
| steg | temperatur (° C) | tid (sek) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 180 |
| 5 | Gå till steg 2 för 30 cykler | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabell 6. PCR-programför kolonin PCR 2.
| värme | 290 |
| dra | 150 |
| hastighet | 100 |
| tid | 150 |
| Dessa parametrar gäller för en Flaming / Brown Mikropipett Puller Modell P-97 med hjälp av ett tråg filament | |
Tabell 7. Prov nål drar programmet.
| reagens | belopp |
| Taq-mastermix, 2x | 12,5 | il |
| genspecifik primer framåt, 10 ^ M | 1 μl |
| genspecifik omvänd primer, 10 uM | 1 pl |
| Nukleasfritt vatten | 9,5 | il |
| DNA | 1 pl |
| * Justera huvudblandning om en annan Taq används | |
Tabell 8. Prov protokoll för genspecifik PCR.
| steg | temperatur (° C) | tid (sek) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 56 | 30 |
| 4 | 72 | 60 |
| 5 | Gå till step 2 i 35 cykler | |
| 6 | 72 | 300 |
| * Justera glödgningstemperatur och förlängning tid för specifika primers och PCR-produkt storlek | ||
Tabell 9. Prov PCR-programmet för genspecifik PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stora framsteg har gjorts under de senaste åren mot att förstå den genetiska grunden för utvecklingen av egenskaper. Även kandidatgener ligger till grund för utvecklingen av ett antal egenskaper har identifierats, har det varit en utmaning att testa dessa gener in vivo på grund av bristen på genetisk spårbarhet mest evolutionärt intressanta arter. Här rapporterar vi en metod för genomet redigering i A. mexicanus, en art som används för att studera utvecklingen av grott djur. Genetisk kartläggning studier 1,21,23 och kandidatgen närmar 19,40 har identifierat ett antal kandidatgener för utvecklingen av egenskaper i grottan form av A. mexicanus. Den senaste offentliggörandet av cavefish genomet 41 ger en extra kraftfullt verktyg för att identifiera kandidatgener för utvecklingen av grottdrag. Testa funktionen hos många av dessa gener kräver tekniker för att minska genuttryck. Den enda aktuella alternativet för studiering minskat genuttryck i A. mexicanus är genom användning av morpholinos. Dock är morfolino gen knockdown övergående, begränsad till några dagar efter befruktningen, och är inte användbar för att studera egenskaper hos vuxna djur, såsom beteendeskillnader mellan vuxen grotta och yta fisk som skolgång 17, hyperfagi 19 och vibrations attraktion beteende 42. Generering av förlust av funktions alleler av gener, såsom de som kan göras med hjälp av Talens, kommer att vara kritisk för att testa rollen av kandidatgener för dessa egenskaper.
Metoder har utvecklats för enkel montering av talen par 33 och detaljerat protokoll för denna metod är tillgänglig 34. Detta protokoll var optimerad för zebrafisk användas av Bedell et al. 7, med användning av en annan slutdestination vektor, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-GT). Denna vektor möjliggör transkription av Talen mRNA för injektion i encelliga zebrafiskembryon.Vi har använt denna modifierade monteringsmetod, förklaras i detalj här, att montera och transkribera Talens för injektion i A. mexicanus. Vi fann att när det injiceras i encelliga yta A. mexicanus embryon, som beskrivs i detta protokoll, kan vi mutera A. mexicanus gener 29. För framtida forskning på kandidatgener som inte beskrivs i detta protokoll, kan sekvenser finns i cavefish genomet 41 och används för att identifiera Talen målplatser.
Kritisk för framgångsrika injektioner är hög kvalitet Talen mRNA. Således, kontroll för RNA-kvaliteten genom att köra en liten mängd av RNA på en gel före injektion är viktigt (steg 3,6). Andra försiktighetsåtgärder för att upprätthålla RNA integritet, såsom frysning portioner för att undvika frys tinar (steg 3,7), och bibehålla sterila förhållanden genom att använda rent vatten och RNas-fri rör och tips under injektioner (Steg 4), bör vidtas. Ett ytterligare viktigt steg för att höja injiceras fisk ärrensa döda embryon efter injektion, som döda embryon snabbt kan påverka vattenkvaliteten. Därför tar vi bort döda embryon morgonen efter injektioner, och med jämna mellanrum under de närmaste dagarna efter injektioner för att upprätthålla sunda levande embryon (steg 4.3.6).
Talen mutagenes i Astyanax mexicanus kan vara effektiv; Men effektivitet varierar beroende på talen paret injicerade 29. Ökade mRNA halter kan leda till ökad toxicitet och missbildning och död injicerade embryon. Därför måste toxicitet mot effektivitet testas och balanseras för att bestämma den optimala koncentrationen av mRNA att injicera. För högeffektiva talen par kan fenotyper bedömas injiceras grundare fisk. Till exempel, injektion av Talens inriktning OCA2 resulterade i albino fläckar i ytan fisk 29 (Figur 3). För andra egenskaper eller gener kan emellertid bedömningen av fenotyper i grundare fisk vara utmanande på grund avatt subtilt av fenotypen eller låga verkningsgrad Talen paret injiceras. Således, för många tillämpningar kommer det att vara önskvärt att generera nedärvda mutationer i en gen av intresse för analys av rollen av en kandidatgen i en icke-mosaik djur. Erhålla arvslinje överföring av talen-inducerade mutationer i A. mexicanus är möjligt 29 (Figur 4). Således kan denna teknik kunna användas för att utvärdera andra kandidatgener.
Några begränsningar för att prestera genetiska manipulationer i Astyanax mexicanus finns vid denna tidpunkt. Yta och cavefish ras i mörker, sent på natten. I ett laboratorium där det inte är möjligt att vända ljuset cykeln mörker, måste forskarna komma sent på natten för att utföra injektioner, eftersom det är viktigt att injicera omedelbart efter leken. Dessutom är det viktigt att samla in Ytan fiskembryon i mörker, eftersom ljus kommer att påverka leken.
Andra tekniker, i sär-lar det crispr / Cas-systemet (översikt i 43), finns för genom redigering och kommer sannolikt att vara tillämplig på A. mexicanus. I själva verket, protokoll för styr RNA montering finns som är snabb och enkel 44 och protokollet redovisas här kan modifieras för crispr / Cas injektion. Dessutom är nya tillämpningar för genomet redigering snabbt utvecklas, och många av dessa kan vara användbar för A. mexicanus forskare. Till exempel, i zebrafisk precisa mutationer har gjorts i en gen av intresse genom coinjecting Talens med en enkelsträngad oligo innehållande en mutation 7. Denna teknik kan vara användbar för att utvärdera rollen av grott alleler att generera grotta fenotyper, såsom den roll av en missense-mutation i vissa grott alleler av MC4R i skillnader i ämnesomsättningen som observerats mellan cavefish och yta fisk 19. Talens har också använts för att generera alleler av gener via homolog rekombination som uttrycker fluorescerande markörer in mönster som liknar den endogena loci 45. Dessa metoder skulle kunna användas i A. mexicanus att utvärdera undergrupper av celler eller uttryck av kandidatgener. Den crispr / Cas-systemet har använts i zebrafisk för att erhålla vävnadsspecifik gen knockout 46. Dessa tekniker, som tillämpas på A. mexicanus, skulle kunna vara användbar för att utvärdera den genetiska grunden för processer såsom ögon förlust i cavefish. Linsen spelar en kritisk roll i processen för ögat förlust i cavefish 47 och det vävnadsspecifika crispr / Cas system skulle kunna användas för att utvärdera rollen av kandidatgener för ögonförlust specifikt i linsen i förhållande till andra vävnader i ögat. Dessa och andra genomet redigeringstekniker kan utnyttjas i A. mexicanus i framtida studier för att svara på kritiska frågor om utvecklingen av grottdrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Institutionen för genetik, utveckling och cellbiologi och Iowa State University och av NIH bidrag EY024941 (WJ) .Dr. Jeffrey Essner lämnade synpunkter på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
References
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
- Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
- Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
- Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Gross, J. B.
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
- Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
- Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
- Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
- Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326 (2009).
- Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108 (2012).
- Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
- Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
- Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823 (2013).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
- Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82 (2011).
- Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
- Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
- Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
- Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647 (2014).
- McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).
