Summary
Ген-таргетинга мутагенез теперь можно в широком диапазоне организмов с использованием методов редактирования генома. Здесь мы демонстрируем протокол для целевого гена мутагенеза с использованием активатора транскрипции как эффекторных нуклеаз (Таленс) в Astyanax mexicanus, вид рыбы , которая включает в себя поверхности рыбы и cavefish.
Introduction
Понимание генетической основы эволюции признака является критической целью исследования эволюционных биологов. Значительный прогресс был достигнут в выявлении локусы , лежащие в основе эволюции признаков и точного определения генов - кандидатов в этих локусов (например 1-3). Тем не менее, функционально тестирование роль этих генов оставалась сложной, как многие организмы, используемые для изучения эволюции признаков в настоящее время не генетически сговорчивым. Появление редактирования генома технологий значительно повышенной генетической манипулируемости широкого спектра организмов. Активатор транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс) и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPRs) использовались для генерации целевых мутации в генах , в ряде организмов (например , 4-11). Эти инструменты, применяемые к эволюционно соответствующей системы, имеют потенциал, чтобы революционизировать способ эволюционные биологи изучения генетической основы эволюции,
Astyanax mexicanus является одним из видов рыб , которые существует в двух формах:. Река обитающие формы поверхности (поверхностная рыба) и несколько пещерных форм (cavefish) А. mexicanus cavefish эволюционировали от поверхности рыбы предков (обзор в 12). Популяции cavefish развили ряд признаков , включая потерю глаз, снижение или потеря пигментации, увеличение числа вкусовых почек и черепно - мозговых невромастами, а также изменения в поведении , такие как потеря стайного поведения, повышенной агрессивности, изменения в кормлении позы и гиперфагию 13 -19. Cavefish и поверхность рыбы скрещиваться, и генетические эксперименты картирования были проведены для выявления локусов и генов - кандидатов для пещерных признаков 1,20-26. Некоторые гены - кандидаты были проверены на функциональную роль в содействии пещерных черты в культуре клеток 1,19, в модельных организмах других видов 21 или сверхэкспрессией 27 или транзиторной нокдаун ˙Uпеть Morpholinos 28 в А. mexicanus. Тем не менее, каждый из этих методов имеет свои ограничения. Способность генерировать мутантные аллели этих генов в A. mexicanus имеет решающее значение для понимания их функции в эволюции cavefish. Таким образом, А. mexicanus является идеальным кандидатом для применения организм редактирования генома технологий.
Здесь мы опишем метод для редактирования генома в A. mexicanus использованием Таленс. Этот метод может быть использован для оценки мозаики впрыскивается основателя рыбы для фенотипов и выделения линий рыбы со стабильными мутациями в генах , представляющих интерес 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных были в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здоровья и были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных в Университете штата Айова и Университете штата Мэриленд по.
1. Talen Design
- Входной желаемый целевой последовательности для дизайна веб-сайта Talen. (Например: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Входные выбраны длины проставка / повторного массива.
- Скопируйте геномную последовательность в поле "Последовательность".
- На вкладке "Provide Custom разделительный / РВД Длины" выбрать длину разделителей и длину массива.
Примечание: длина распорки 15 пар оснований и повторить длины массива 15-17 хорошо работают и делают сборку менее сложным.
- Выберите пару Talen. Таленом пары, разработанные на основе уникального сайта рестрикции рестриктазы позволяют генотипирование с помощью фермента рестрикции перевариваниеПЦР-продукт.
- Дизайн праймеров для амплификации геномной области , окружающей целевой сайт Talen , используя веб - сайт , таких как Primer3 30-32. Когда генотипирование с помощью фермента рестрикции, дизайн праймеров для амплификации области, которая содержит фермент сайт рестрикции только один раз. Рекомендуется , чтобы этот регион усиливается и секвенировали до строительства Talen выявления любых полиморфизмов , присутствующих в A. mexicanus лаборатория население будет использоваться для микроинъекции.
2. Talen Ассамблеи (Modified из Talen Kit протокола) 33,34
Для получения дополнительной информации и устранения неполадок см протокола 34.
- Подготовить и последовательность необходимых плазмид из комплекта Talen в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Настройка # 1 реакции для реакций А и В. Включать повторить-переменной diresidues (RVDS) 1-10 и вектор назначения pFUS_A в реакции А. Включайте RVDS 11- (N-1) и ювектор е место назначения pFUS_B (N-1) в реакции B, где N является общее число RVDS в Talen.
- Добавить в каждую реакционную смесь : 1 мкл каждой плазмиды , содержащей каждый РВД (100 нг / мкл), вектор назначения (100 нг / мкл), 1 мкл БСА ограничительного фермента, 1 мкл бычьего сывороточного альбумина (БСА) (2 мг / мл ), 1 мкл лигаза 2 мкл 10х буфера дл лигазы, и х мкл воды при общем объеме 20 мкл. Например, таблица 1.
Примечание: Половина реакции также могут быть использованы. - Поместите реакции в амплификатор и запустить цикл: 10x (37 ° C / 5 мин + 16 ° C / 10 мин) + 50 ° C / 5 мин + 80 ° C / 5 мин.
- Добавить в каждую реакционную смесь : 1 мкл каждой плазмиды , содержащей каждый РВД (100 нг / мкл), вектор назначения (100 нг / мкл), 1 мкл БСА ограничительного фермента, 1 мкл бычьего сывороточного альбумина (БСА) (2 мг / мл ), 1 мкл лигаза 2 мкл 10х буфера дл лигазы, и х мкл воды при общем объеме 20 мкл. Например, таблица 1.
- Инкубируйте реакции с нуклеазы. Для каждой реакции добавляют 1 мкл 25 мМ АТФ и 1 мкл нуклеазы. Инкубируйте реакции при 37 ° С в течение 1 часа.
- Transform реакций.
- Transform 2,5 мкл каждой реакционной смеси в 25 мкл химически компетентных клеток.
Примечание: Самодельный компетентный сгезов может быть использован. Тем не менее, клетки с низкой компетенцией может привести к отсутствию колоний.- Смешайте 2,5 мкл реакционной смеси 25 мкл химически компетентных клеток. Инкубируют на льду в течение пяти минут. Инкубируйте клетки в течение 30 сек при 42 ° С.
- Место труб на льду в течение 2 мин. Добавьте 125 мкл Супер оптимального бульона с катаболитной репрессии (SOC). Взболтать пробирки при 37 ° С в течение 1 часа.
- Пластина 100 мкл трансформированных клеток на LB пластинах с спектиномицином (50 мкг / мл), X-Gal и изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). Grow O / N при 37 ° С.
- Transform 2,5 мкл каждой реакционной смеси в 25 мкл химически компетентных клеток.
- Выберите 2-3 белых колоний для каждой реакции и проверки с помощью ПЦР колоний с использованием праймеров pCR8_F1 и pCR8_R1 (таблица 2).
- Сделать мастер смеси реагентов. Например, таблица 3.
- Выберите колонию и намазать его в нижней части трубки, ПЦР, а затем положить остатки колонии в 2 мл LB с спектиномицином(50 мкг / мл). Поместите 15 мкл мастер смеси в пробирку с колонией.
- Выполните следующую программу ПЦР (таблица 4)
- Проверьте ПЦР (запустить весь объем) на 1,5% агарозном геле с помощью электрофореза. Правильные клоны будут иметь полосу при ожидаемого размера, а также мазок и лестницу полос. Для примера соответствующего мазка, см 34,33.
- Grow 2 мл культуры правильных клонов в LB СМИ O / N при 37 ° С в дрожащей инкубаторе.
- Минипрепаративную плазмид в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Последовательность, чтобы проверить последовательность Talen с pCR8_F1 и pCR8_R1. Следуйте ранее описанных способов 35.
- Использование правильных клонов подтверждали секвенированием, настроить реакцию # 2 (Talen комплект), который будет размещать RVDS из векторов А и В, и окончательный РВД в вектор назначения.
- Приготовьте смесь для реакции 2 (таблица 5).
Примечание: ХаЛ.Ф. реакции могут быть использованы. - Поместите реакции в амплификатор и запустить следующую программу: 37 ° C / 10 мин + 16 ° C / 15 мин + 37 ° C / 15 мин + 80 ° C / 5 мин.
- Приготовьте смесь для реакции 2 (таблица 5).
- Transform реакций.
- Transform 2,5 мкл каждой реакционной смеси в 25 мкл химически компетентных клеток.
- Смешайте 2,5 мкл реакционной смеси 25 мкл химически компетентных клеток. Инкубируют на льду в течение 5 мин. Теплового шока клетки в течение 30 сек при 42 ° С.
- Место труб на льду. Добавьте 125 мкл SOC. Место труб в качалке инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
- Пластина 100 мкл трансформированных клеток на LB пластинах с ампициллином (100 мкг / мл), X-Gal и IPTG. Grow O / N при 37 ° С
- Transform 2,5 мкл каждой реакционной смеси в 25 мкл химически компетентных клеток.
- Pick 1-3 белых колоний для каждой реакции и проверки с помощью ПЦР колоний с использованием праймеров TAL_F1 и TAL_R2 (таблица 2).
- Приготовьте раствор полимеразы Mastermix, воды и праймеров, какописанный в таблице 3. Выберите колонию и намазать его в нижней части трубки , ПЦР, а затем положить остатки колонии в 2 мл LB с ампициллином (100 мкг / мл). Поместите 15 мкл раствора в пробирку с колонией.
- Запустите программу PCR (таблица 6).
- Проверьте ПЦР на 1,5% -ном агарозном геле путем электрофореза. Правильные клоны будут иметь смазывание и лестницу полос. Для примера соответствующего мазка, см 34,33.
- Grow 2 мл культуры правильных клонов в LB СМИ O / N при 37 ° С в дрожащей инкубаторе.
- Минипрепаративную плазмид в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Последовательность , чтобы проверить последовательность Talen с TAL_F1 и TAL_R2 следуя ранее описанных способов 35.
3. мРНК Транскрипция Таленс
- Дайджест 4 мкг последовательности-шаблона проверена с 2 мкл Sac I в течение 2 ч при 37 ° С. Выполнить 2 мкл Sac I-расщепленную плазмиду на агарозном геле 1,5% с помощью электрофореза. Плазмиды, которые правильно перевариваются будет отображать одну полосу.
- Очищают оставшийся Sac I-расщепленную плазмиду в соответствии с протоколом набора для очистки ПЦР. Промыть дважды с промывочным раствором перед элюцией. Элюции в 30 мкл нуклеазы без воды.
- Следуйте стандартным протоколом для производства T3 мРНК.
- Установить половину реакций с использованием 0,5 мкг линеаризованной матрицы (полученного выше). Инкубируют при 37 ° С в течение 2 часов.
- Добавить 0,5 мкл ДНКазы (входит в комплект) и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
- Очищают мРНК, следуя инструкциям производителя. Элюции в 30 мкл нуклеазы без воды.
- Запуск 1,5% агарозном геле с помощью электрофореза, чтобы проверить мРНК.
- Для очистки устройства гель с продуктом для устранения загрязнения РНКазы и подготовить 1,2% геля.
- Смешайте 1 мкл мРНК + 4 &# 181; л нуклеазы без воды + 5 мкл glyoxyl загрузки красителя. Инкубируйте образцы при 50 ° С в течение 30 мин. Центрифуга трубки на короткое время и место на льду перед запуском гель.
- Проверьте концентрацию с помощью метода количественного определения концентрации нуклеиновых кислот и хранить РНК в виде аликвот при -80 & deg; С. Выберите размер аликвоты таким образом, что РНК не замерзла / размороженной более одного раза.
Примечание: Концентрации 500-1000 нг / обычно получают NL. РНК с более низкой концентрацией может быть использован до тех пор, как целостность РНК поддерживается (по оценке группы, а не мазок на гель).
4. Вводят Astyanax mexicanus Эмбрионы с мРНК Talen
- Подготовьте инструменты для инъекций.
- Налейте инъекционные пластины путем заливки 1,2% агарозы в воде рыба (вода кондиционированного с бикарбонатом натрия и морской соли до рН 7,4 и проводимости 700 мкс) в чашку Петри. Поместите форму (пластмассовую деталь с выступами, чтобы сделать лунки для рыбыяйца) внутри блюдо. Удалить плесень, когда агарозном закалены и хранят при температуре 4 ° C. Подробные сведения о пресс - форме см 36.
- Вытащите иглы для инъекций с помощью иглы съемника в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Соответствующая длина иглы имеет важное значение для инъекций. Иглы, которые слишком долго будет слишком гибким для инъекций. Протокол для протяжки игл будет меняться в зависимости от используемого оборудования тянуть иглы. Примером соответствующей иглы показан на рисунке 1. Для нашего оборудования, мы тянуть иглы, 5-6 см в длину, и имеют внешний диаметр на конце приблизительно 0,011 мм при разбивании. Тем не менее, иглы должны быть откалиброваны (этап 4.3.4), чтобы определить ширину проема. Пример программы для вытягивания иглы можно найти в таблице 7. - Подготовьте стеклянные пипетки для переноса эмбриона, разбив пипетку так, чтобы отверстие достаточно велико для яйца, чтобы пройти. Пламя сломанный конец доэто уже не резким.
Примечание: Важно использовать стеклянные пипетки и стеклянные шары при работе с А. mexicanus яйца и эмбрионы , поскольку они являются липкие и будет придерживаться пластика.
- Сбор 1-клеток Стадии яйца.
- Порода A. mexicanus в соответствии со стандартными протоколами 37.
Примечание: Например, если рыба поддерживается на 14 свет: 10 темного цикла и использования Zeitgerber времени (ZT) с ZT0, как свет и ZT14, как свет выключали, наша поверхность рыбы икру между ZT15 и ZT19. Точное время нереста должны быть определены для каждой отдельной лаборатории. - Побудить нерест по перекормить рыбу в течение 3-4 дней до спаривания и размещения рыбы в пресной воде. Поднимите ° F Температура 2. Примечание: Наша начальная температура воды составляет около 74 ° F.
- Собирают поверхности яйца рыбы в темноте, проверяя каждые 15 минут, чтобы получить яйца на стадии 1 клеток. Сотни яиц могут быть получены из одной пары поверхности рыбы.
- собиратьяйца в стеклянной чаши для предотвращения прилипания к пластиковой поверхности и сортировки для выделения эмбрионов на стадии 1 клеток перед инъекцией путем наблюдения яйца под микроскопом и сбор яиц, которые одна клетка. Храните яйца в свежей воде системы (резервуар для воды, в которых размещался взрослые рыбы, который был обработан для рН и проводимости).
- Порода A. mexicanus в соответствии со стандартными протоколами 37.
- Вводят мРНК Talen.
- Вводят различные количества общей мРНК (равные количества каждого Talen в паре), чтобы определить оптимальную концентрацию для инъекций, как токсичность и эффективность зависят от Talen пары. Начните путем введения концентрации общей мРНК, которые являются 400-800 пг. Развести и объединить мРНК до желаемых концентраций для инъекций 1,5 нл.
- Нагрузка разбавленный мРНК в задней части иглы, и прикрепить иглу к микро-форсункой.
- Перерыв иглу с помощью пинцета.
- Калибровка иглы. Например, извлечь 10 раз и собрать полученную каплю в микро-капилляра. Для 10 х 100 одноразовые 1,081; л, 32 мм микро капилляр, падение должно заполнить микро капилляр до 0,5 мм для 1,5 л / 1 инъекции. Отрегулировать время впрыска и давление по мере необходимости.
- Вставьте иглу в одну ячейку и ввести мРНК. Вводят мРНК непосредственно в клетку, не в желток.
- Сбор инъекционные эмбрионов в стеклянных шарах. Держите эмбрионов при 23-25 ° С. Удалить мертвых эмбрионов (эмбрионов, которые становятся мутными и неправильной формы) регулярно в течение первых нескольких дней после инъекции. Рекордное число погибших и деформированных эмбрионов от контроля (неинъецированных) и инжектированных пластин.
Примечание: Увеличение концентрации мРНК может привести к увеличению токсичности и деформации / гибели эмбрионов. Таким образом, токсичность в сравнении эффективности должны быть сбалансированы, чтобы определить наилучший концентрацию мРНК для введения.
5. Фенотип Основатель Рыба и оценка эффективности Talen
- Жертвоприношение эмбрионов в соответствии с местным протоколом животных.
Примечание: Мы эвтаназииэмбрионов путем быстрого охлаждения на льду. - Сбор эмбрионов в 0,8 мкл ПЦР с использованием стрип трубок передачи пипетки.
Примечание: Определение генотипа может быть выполнено на отдельных эмбрионов или пулы эмбрионов. - Извлечение ДНК.
- Место эмбрионов в 100 мкл 50 мМ гидроксида натрия (NaOH) и инкубируют при 95 ° С в течение 30 мин, затем охлаждают до 4 & deg; С.
- Добавить 1/10 объем (10 мкл) в 1 М Трис-HCl , рН 8.
- Выполните ПЦР на области с использованием праймеров , сконструированных на шаге 1.3 (таблицы 8 и 9 для протоколов выборки). Для получения индивидуальных эмбрионов 1 мкл ДНК достаточна для ПЦР-реакции.
- Дайджест полученного продукта ПЦР с использованием соответствующего фермента рестрикции, и запустить 1,5% агарозном геле с помощью электрофореза.
- Например, для генотипирования Глазокожный альбинизм 2 (oca2) локус в инъецированных эмбрионах переваривать ПЦР - продукта с использованием фермента рестрикции BSR I путем добавления 0.5 Мкл BSR I непосредственно до 12,5 мкл завершения реакции ПЦР, инкубирование при 65 ° С в течение 2 часов. Запуск непереваренной и расщеплении на геле. Полосы устойчивые к рестрикционным ферментным (то есть группы , которые не переваривают) , показывают , что Таленом-индуцированные мутации присутствуют (рисунок 2).
- (Необязательно) Вычислить частоту мутаций в процентах путем определения процентного содержания неподрезанные продукта путем анализа изображений гелей на Фиджи 38 с помощью инструмента анализа гель для вычисления значения интенсивности каждой полосы , как описано выше 29.
- Определить последовательность мутантного аллеля по ТА клонировании геле рестриктазы Устойчивые мутантные группу и секвенирование клонов.
- Гель очищают рестриктазой Устойчивые мутантные группу в соответствии с инструкциями изготовителя. TA клонировать группу в соответствии с инструкциями изготовителя. Выберите колонии и расти в 1,5 мл LB O / N при 37 ° С в встряхиваниеминкубатор.
- Минипрепаративную культуры в соответствии с инструкциями изготовителя. Отправить ДНК для секвенирования.
- С помощью программы, такие как APE, совместите мутантные последовательности с последовательностью дикого типа.
- Скопируйте и вставьте обе последовательности в APE файлы. Выберите "Выровнять две последовательности" инструмент из меню "Сервис".
- Укажите две последовательности ДНК, используя раскрывающиеся меню.
Примечание: обратной комплементарной клонированной последовательности, возможно, должны быть использованы в зависимости от направления ПЦР вошел в клонирующий вектор. Если последовательности не совпадают, повторите шаги проверяя "Rev-Com" флажок в поле "Выровнять ДНК".
- Оценка основателя рыбы для фенотипов на соответствующей стадии и с использованием соответствующих методов для ожидаемого фенотипа 29 (Например, на рисунке 3). Методы фенотипирования будут основаны на ожидаемом фенотипе для гена целевого исследователем с использованием protocол.
6. Экран для зародышевой линии передачи
Примечание: A. mexicanus достигают половой зрелости в возрасте 4-8 месяцев.
- Крест половозрелых рыб основателя дикого типа рыбы.
- Эмбрионы экрана или взрослые рыбы с использованием методов на этапах 5,1-5,7 (рисунок 4). Для взрослых рыб, кусок хвоста можно закрепить следующие обезболиванием.
- Обезболить рыбу, погрузив рыбу в растворе Tricaine (этиловый эфир 3-аминобензойной кислоты), чтобы уменьшить напряжение во время плавника вырезку. После плавник вырезку, позволяют рыбе восстановиться в пресной воде. Рыба быстро восстанавливаться; наблюдать, пока они не восстановились (плавают нормально).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Инъекции пара Talen приводит к связыванию RVDS до конкретных нуклеотидов ДНК и , таким образом димеризации доменов Foki, что приводит к двухцепочечных разрывов 39 , которые могут быть устранены через негомологичной конец присоединения (NHEJ). NHEJ часто вносит ошибки, которые приводят к инсерции или делеции (вставкам). Вставкам могут быть идентифицированы путем амплификации в область вокруг целевой сайт Таленом и переваривание полученного ампликона с ферментом рестрикции, который разрезает внутри спейсерной области Таленом. Аллели без электромотора INDEL будет переваривать в то время как аллели , содержащие вставкам , которые изменяют целевую последовательность рестриктазы не переваривается, создавая стойкую группу рестриктазы (рисунок 2).
Talen инъекции может вероятно , приведет к биаллельных мутаций генов в A. mexicanus 29. Таким образом, некоторые фенотипы могут быть оценены в основателю рыбы. Для Например, мы оценивали пигментации поверхности рыбы вводили Таленс таргетирования oca2, гена гипотетического нести ответственность за альбинизм в нескольких альбиносов популяций cavefish 1,28. Мы нашли альбиносов патчи в oca2 Talen-закачиваемой рыбы нет в неинъецированных рыбы 29 (рисунок 3).
Для многих экспериментов, желательно иметь мутантные линии рыб для оценки фенотипов. Основатель рыбы с передаваемыми мутантных аллелей могут быть идентифицированы путем генотипирования потомство от скрещивания основателя рыбы дикого типа рыбы (рисунок 4).
Рисунок 1. Игла для инъекций мРНК. Фотография микропипетки до Разрываясь используется для инъекций мРНК Talen в одноклеточных эмбрионов._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Talen эффективность для oca2. 306 п.н. продуктов ПЦР из экзона 9 oca2 в Astyanax mexicanus были исследованы на потерю фермента сайта рестрикции , когда различные количества мРНК Talen вводили 29. Ампликон из контрольного эмбриона переваривают в то время как часть ампликону был устойчив к ограничению дайджеста в бассейнах 10 Таленом инъецированных эмбрионов. Ограничение фермента переварить устойчивые группы из эмбрионов , инъецированных мРНК Talen мишенью oca2 было показано , что содержат вставкам 29. Следует отметить, что увеличение концентрации мРНК впрыскивается приводит к увеличению эффективности Talen (более непереваренной ДНК). Дорожки с "-" являются непереваренной, полосы с "+" являются DigesТэд с ферментом рестрикции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Фенотипирование основатель рыбы изменений в пигментации. (A) Управление неинъецированных поверхности А. mexicanus. (B) Patch отсутствует меланофоры в качестве учредителя поверхности рыбы вводили 400 мкг Talen мРНК с таргетингом oca2 (стрелка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Передача зародышевую Talen индуцированной mutatioнс. 306 п.о. ПЦР - продукты из экзона 9 oca2 в А. mexicanus были исследованы на потерю фермента сайта рестрикции в бассейнах 10 F 1 рыбы из введенном основателя рыбы. Ампликон из контрольного эмбриона переваривают в то время как часть ампликону был устойчив к ограничению дайджеста в бассейнах 10 F 1 эмбрионов. Ограничение фермента переварить устойчивые группы из oca2 F 1 s было показано, содержат вставкам 29. Дорожки с "-" являются непереваренной, полосы с "+" переваривали ферментом рестрикции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| реакции А | Reactiна B | |||
| количество | реагент | количество | реагент | |
| 4 мкл | воды | 10 мкл | воды | |
| 1 мкл | pFUS_A | 1 мкл | pFUS_B4 | |
| 1 мкл | BsaI | 1 мкл | BsaI | |
| 1 мкл | БСА | 1 мкл | БСА | |
| 1 мкл | Лигаза | 1 мкл | Лигаза | |
| 2 мкл | 10Х Лигаза | 1 мкл | 10Х Лигаза | |
| 1 мкл | pNH1 | 1 мкл | pNG1 | |
| 1 мкл | pNH2 | 1 мкл | pHD2 | |
| 1 мкл | pNG3 | 1 мкл | pNH3 | |
| 1 мкл | pHD4 | 1 мкл | pNI4 | |
| 1 мкл | pHD5 | |||
| 1 мкл | pHD6 | |||
| 1 мкл | pNG7 | |||
| 1 мкл | pHD8 | |||
| 1 мкл | pNG9 | |||
| 1 мкл | pHD10 | |||
Таблица 1. Пример реакции сборки А и В дляTalen содержащий RVDS NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.
| грунтовка название | последовательность (5'-3 ') |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
Таблица 2. ПЦР - праймеров для ПЦР колоний, из 34.
| реагент | количество |
| Taq Mastermix, 2x | 50 мкл |
| pCR8_F1 праймер,10 мкМ | 4 мкл |
| pCR8_R1 праймера, 10 мкМ | 4 мкл |
| Нуклеазы без воды | 42 мкл |
| * Настройка основной смеси, если используется другой Taq | |
Таблица 3. Мастер смесь для 100 мкл (15 мкл / реакции) для колонии PCR 1.
| шаг | Температура (° С) | Время (сек) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 105 |
| 5 | Перейдите к шагу 2 в течение 30 циклов | |
| 6 | 72 | 300 |
Таблица 4. Программа ПЦР для ПЦР колоний 1.
| количество | реагент | концентрация |
| 12 мкл | воды | |
| 1 мкл | вектор А | 100 нг / мкл |
| 1 мкл | вектор B | 100 нг / мкл |
| 1 мкл | вектор назначения pT3Ts-дт | 50 нг / мкл |
| 1 мкл | Окончательный РВД (ГНР-РВД) | 100 нг / мкл |
| 1 мкл | Esp3I | |
| 1 мкл | лигазная | |
| 2 мкл | 10Х Лигаза | |
Таблица 5. Протокол второго сборочных реакций.
| шаг | Температура (° С) | Время (сек) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 180 |
| 5 | Перейдите к шагу 2 в течение 30 циклов | |
| 6 | 72 | 300 |
Таблица 6. Программа ПЦРдля колонии PCR 2.
| высокая температура | 290 |
| вытащить | 150 |
| скорость | 100 |
| время | 150 |
| Эти параметры для Flaming / коричневый микропипетки Puller модели Р-97 с использованием корыта нити | |
Таблица 7. Пример игла вытягивать программы.
| реагент | количество |
| Taq Mastermix, 2x | 12.5 мкл |
| ген специфический прямой праймер, 10 мкМ | 1 μL |
| ген конкретного обратного праймера, 10 мкМ | 1 мкл |
| Нуклеазы без воды | 9.5 мкл |
| ДНК | 1 мкл |
| * Настройка основной смеси, если используется другой Taq | |
Таблица 8. Протокол Образец для гена специфической ПЦР.
| шаг | Температура (° С) | Время (сек) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 56 | 30 |
| 4 | 72 | 60 |
| 5 | Перейти к SТЭП 2 в течение 35 циклов | |
| 6 | 72 | 300 |
| * Регулировки температуры отжига и время расширения для специфических праймеров и размера продукта ПЦР | ||
Таблица 9. Программа ПЦР Образец для гена специфической ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Большие успехи были достигнуты в последние годы на пути к пониманию генетической основы эволюции признаков. В то время как гены - кандидаты , лежащие в основе эволюции ряда признаков были идентифицированы, он остается сложной задачей , чтобы проверить эти гены в естественных условиях из - за отсутствия генетической сговорчивости из наиболее эволюционно интересных видов. Здесь мы сообщаем способ редактирования генома в A. mexicanus, вид используется для изучения эволюции пещерных животных. Генетическое картирование изучает 1,21,23 и ген - кандидат подходы 19,40 выявили ряд генов - кандидатов для эволюции признаков в виде пещеры А. mexicanus. Недавней публикации cavefish генома 41 обеспечивает дополнительный мощный инструмент для идентификации генов - кандидатов для эволюции пещерных черт. Тестирование функции многих из этих генов-кандидатов требует методов для снижения экспрессии гена. Единственный вариант тока для исследованияING уменьшенную экспрессию генов в A. mexicanus является использование Morpholinos. Однако ген морфолино нокдаун преходяще, ограничено несколько дней после оплодотворения, и не является полезным для изучения признаков у взрослых животных, таких , как различия в поведении между взрослой пещеры и поверхностной рыбы , как школьного обучения 17, гиперфагия 19 и привлечение вибрации поведение 42. Генерация потери функциональных аллелей генов, таких как те, которые могут быть выполнены с использованием Таленс, будет иметь решающее значение для тестирования роли генов-кандидатов для этих признаков.
Методы были разработаны для простого монтажа Talen пар 33 и подробный протокол для этого метода доступен 34. Этот протокол был оптимизирован для использования данио Беделла и др. , 7, используя другой конечный вектор назначения, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-ГТ). Этот вектор позволяет транскрипции мРНК Talen для инъекций в одноклеточных эмбрионов данио.Мы использовали этот модифицированный метод сборки, подробно описаны здесь, чтобы собрать и транскрибировать Таленс для инъекций в A. mexicanus. Мы обнаружили , что при введении в одноклеточных поверхности А. mexicanus эмбрионов, как описано в этом протоколе, мы могли мутировать А. mexicanus гены 29. Для дальнейших исследований генов - кандидатов , не описанных в данном протоколе, последовательности могут быть найдены в геноме cavefish 41 и используется для идентификации Talen целевых сайтов.
Критические для успешных инъекций является высокое качество Talen мРНК. Таким образом, проверка качества РНК, запустив небольшое количество РНК на гель перед инъекцией важно (этап 3.6). Другие меры предосторожности для поддержания целостности РНК, такие как замораживание аликвот, чтобы избежать замораживания оттепели (шаг 3.7), а также поддержание стерильных условий с помощью чистой воды и РНКазы трубки и советы во время инъекций (этап 4), должны быть приняты. Дополнительным важным шагом к повышению закачиваемой рыбывычищать мертвых эмбрионов после инъекции, так как мертвые эмбрионы могут быстро повлиять на качество воды. Таким образом, мы удалить мертвые эмбрионы на следующее утро после инъекции, и периодически в течение следующих нескольких дней после инъекции для поддержания здоровых живых эмбрионов (этап 4.3.6).
Talen мутагенеза в Astyanax mexicanus может быть весьма эффективным; Тем не менее, эффективность зависит от пары Таленом вводили 29. Увеличение концентрации мРНК может привести к увеличению токсичности и уродства и гибель инъецированных эмбрионов. Таким образом, токсичность в сравнении эффективности должны быть проверены и сбалансированы, чтобы определить оптимальную концентрацию мРНК для введения. Для получения высокоэффективных пар Talen, фенотипы могут быть оценены в закачиваемой основателя рыбы. Например, инъекция Таленс ориентации oca2 приводило к альбиносов заплатки поверхности рыбы 29 (рисунок 3). Для других признаков или генов, однако, оценка фенотипов основателя рыбы может быть сложной задачей из-затонко фенотипа или низкой эффективности пары Talen закачиваемой. Таким образом, для многих приложений будет желательно, чтобы генерировать зародышевых мутации в гене, представляющего интерес для анализа роли гена-кандидата в не мозаичной животного. Получение передачи зародышевой из Talen-индуцированных мутаций в A. mexicanus возможно 29 (фигура 4). Таким образом, этот метод может быть применен для оценки других генов-кандидатов.
Несколько ограничений на выполнение генетических манипуляций в Astyanax mexicanus существуют в настоящее время. Поверхностные и cavefish породы в темноте, поздно ночью. В лаборатории, где это не возможно, чтобы изменить светлый темный цикл, исследователи должны прийти поздно ночью, чтобы выполнить инъекции, так как она имеет решающее значение для введения сразу после нереста. Кроме того, важно, чтобы собрать поверхности эмбрионов рыб в темноте, так как свет влияет на нерест.
Другие методы, в particuлар в CRISPR систему / Cas (обзор в 43), существуют для редактирования генома и, вероятно , будет применяться к A. mexicanus. Действительно, протоколы для РНК руководство по сборке существуют , которые являются быстрым и легким 44 и сообщил здесь протокол может быть изменен для CRISPR / Cas инъекции. Кроме того, новые приложения для редактирования генома быстро развивается, и многие из них могут оказаться полезными для А. mexicanus исследователей. Например, в данио точных мутаций были сделаны в интересующего гена путем совместной инъекции Таленс с одноцепочечной олиго , содержащего мутацию 7. Этот метод может быть полезен для оценки роли пещеры аллели в формировании пещерных фенотипы, такие как роль миссенс - мутации в некоторых пещерных аллели MC4R в различиях в обмене веществ , наблюдаемых между cavefish и поверхностной рыбы 19. Таленс также были использованы для генерации аллели генов посредством гомологичной рекомбинации, которые экспрессируют маркеры флуоресцентных Iп структуры , сходные с эндогенным локусов 45. Эти методы могут быть использованы в A. mexicanus для оценки подмножеств клеток или экспрессии генов - кандидатов. Система / Cas CRISPR использовался в данио для получения тканеспецифичную нокаут гена 46. Эти методы, применяемые к А. mexicanus, может быть полезным для оценки генетической основы процессов , таких как потеря глаза в cavefish. Линзы играет решающую роль в процессе потери глаза в cavefish 47 и тканеспецифическая CRISPR система / Cas может быть использована для оценки роли генов - кандидатов для потери глаз специально в линзе по сравнению с другими тканями глаза. Эти и другие методы генома редактирования могут быть использованы в A. mexicanus в будущих исследованиях , чтобы ответить на критические вопросы эволюции пещерных черт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Департаментом генетики, развития и клеточной биологии и Университета штата Айова и грант NIH EY024941 (WJ) .DR. Джеффри Essner представили свои замечания по рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
References
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
- Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
- Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
- Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Gross, J. B.
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
- Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
- Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
- Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
- Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326 (2009).
- Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108 (2012).
- Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
- Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
- Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823 (2013).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
- Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82 (2011).
- Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
- Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
- Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
- Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647 (2014).
- McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).
