Summary
mutagénesis gen de la orientación es ahora posible en una amplia gama de organismos utilizando técnicas de edición genoma. Aquí, demostramos un protocolo para la mutagénesis dirigida de genes usando activador de la transcripción como nucleasas efectoras (Talens) en Astyanax mexicanus, una especie de peces que incluye a los peces de superficie y cavefish.
Introduction
La comprensión de la base genética de la evolución rasgo es un objetivo de investigación crítica de los biólogos evolutivos. Se ha logrado un progreso considerable en la identificación de loci que subyacen a la evolución de los rasgos y la localización de genes candidatos dentro de estos loci (por ejemplo 1-3). Sin embargo, las pruebas funcionalmente el papel de estos genes se ha mantenido desafiante como muchos organismos utilizados para el estudio de la evolución de los rasgos no son actualmente manejable de forma genética. El advenimiento de las tecnologías de edición genoma ha aumentado considerablemente manipulabilidad genética de una amplia gama de organismos. Nucleasas de transcripción activador de efectoras (Talens) y agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPRs) se han utilizado para generar mutaciones específicas en los genes en un número de organismos (por ejemplo 4-11). Estas herramientas, aplicado en un sistema evolutivamente relevante, tienen el potencial de revolucionar la forma en que los biólogos evolutivos estudiar la base genética de la evolución.
Astyanax mexicanus es una especie de pez que existe en dos formas: a. (Peces de superficie) que habitan en el río forma superficial y múltiples formas cavernícolas (cavefish) A. cavefish mexicanus evolucionó de ancestros de peces de superficie (revisado en 12). Las poblaciones de cavefish han desarrollado una serie de características, incluyendo la pérdida de los ojos, disminución o pérdida de la pigmentación, el número de papilas gustativas y neuromastos craneales, y los cambios de aumento en el comportamiento, tales como la pérdida de la conducta escolar, aumento de la agresividad, los cambios en la alimentación de la postura y la hiperfagia 13 -19. Cavefish y pescado superficie son interfértiles, y los experimentos de mapeo genético se han realizado para identificar loci y genes candidatos para los rasgos de la cueva 1,20-26. Algunos genes candidatos han sido probados para un papel funcional en la contribución a los rasgos de la cueva en el cultivo celular 1,19, en organismos modelo de otras especies de 21 o 27 por la sobreexpresión o una caída transitoria ucantar morfolinos 28 en A. mexicanus. Sin embargo, cada uno de estos métodos tiene limitaciones. La capacidad de generar alelos mutantes de estos genes en A. mexicanus es crítica para la comprensión de su función en la evolución de cavefish. Por lo tanto, A. mexicanus es un organismo candidato ideal para la aplicación de las tecnologías de edición genoma.
Aquí describimos un método para la edición del genoma de A. mexicanus usando Talens. Este método se puede utilizar para evaluar mosaico inyectado peces fundador para fenotipos y para el aislamiento de líneas de pescado con mutaciones estables en los genes de interés 29.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales estaban en conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Estatal de Iowa y la Universidad de Maryland.
1. Diseño TALEN
- De entrada deseada secuencia diana a un sitio web de diseño TALEN. (Por ejemplo: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Entrada elegido longitudes de matriz espaciador / repetición.
- Copiar la secuencia genómica en la casilla "Secuencia".
- Dentro de la pestaña "Usuario Proporciona espaciador / RVD Longitudes" seleccionar la longitud del espaciador y la longitud de la matriz.
Nota: Las longitudes del espaciador de 15 pares de bases y repetir longitudes de matriz de 15-17 trabajo bien y hacer el montaje menos complejo.
- Seleccionar un par TALEN. pares TALEN diseñado alrededor de un sitio de enzima de restricción único permiten para el genotipado por digestión de enzima de restricciónun producto de PCR.
- Cebadores Diseño para amplificar la región genómica que rodea el sitio de destino TALEN el uso de un sitio web, como Primer3 30-32. Cuando genotipo con una enzima de restricción, cebadores de diseño para amplificar una región que contiene el sitio de enzima de restricción sólo una vez. Se recomienda que esta región se amplifica y se secuenció antes de la construcción para identificar cualquier TALEN polimorfismos presentes en el A. mexicanus población laboratorio para ser utilizado para la microinyección.
2. Asamblea TALEN (Modificado de Protocolo TALEN Kit) 33,34
Para detalles adicionales y solución de problemas, consulte el protocolo 34.
- Preparar y secuenciar los plásmidos necesarios del kit TALEN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Configurar el # 1 para las reacciones reacciones A y B. Incluir repetir variable diresidues (1-10) RVDS y la pFUS_A vector de destinación en la Reacción A. Incluir RVDS 11- (N-1) y THvector e destino pFUS_B (N-1) en la Reacción B, donde N es el número total de RVDS en la TALEN.
- Añadir a cada reacción: 1 l de cada plásmido que contiene cada RVD (100 ng / l), el vector de destino (100 ng / l), 1 l Bsa I enzima de restricción, 1 l albúmina de suero bovino (BSA) (2 mg / ml ), 1 l de ligasa, 2 l de tampón de ligasa 10X y x l de agua para un volumen total de 20 l. Por ejemplo, véase la Tabla 1.
Nota: La mitad de reacciones también se pueden utilizar. - Coloque reacciones en un termociclador y ejecute el ciclo: 10 veces (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min.
- Añadir a cada reacción: 1 l de cada plásmido que contiene cada RVD (100 ng / l), el vector de destino (100 ng / l), 1 l Bsa I enzima de restricción, 1 l albúmina de suero bovino (BSA) (2 mg / ml ), 1 l de ligasa, 2 l de tampón de ligasa 10X y x l de agua para un volumen total de 20 l. Por ejemplo, véase la Tabla 1.
- Se incuban las reacciones con nucleasa. Para cada reacción de añadir 1 l de ATP 25 mM y 1 l de nucleasa. Se incuban las reacciones a 37 ° C durante 1 hora.
- Transformar reacciones.
- Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes.
Nota: Hecho en casa c competenteells se pueden utilizar. Sin embargo, las células con baja competencia puede dar lugar a la falta de colonias.- Mezclar 2,5 l de la reacción con 25 l de células químicamente competentes. Incubar en hielo durante cinco min. Se incuban las células durante 30 segundos a 42 ° C.
- Colocar los tubos en hielo durante 2 min. Añadir 125 l de caldo de Super óptima con la represión catabólica (SOC). Agitar los tubos a 37 ° C durante 1 hora.
- Plate 100 l de las células transformadas en placas LB con espectinomicina (50 g / ml), X-gal e isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Crecer O / N a 37 ° C.
- Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes.
- Escoja 2-3 colonias blancas para cada reacción y comprobar mediante PCR de colonias usando cebadores pCR8_F1 y pCR8_R1 (Tabla 2).
- Hacer una mezcla maestra de los reactivos. Por ejemplo, véase la Tabla 3.
- Escoja una colonia y untarlo en el fondo de un tubo de PCR, y luego poner los restos de la colonia en 2 ml de LB con espectinomicina(50 mg / ml). Colocar 15 l de la mezcla maestra en el tubo con la colonia.
- Ejecute el siguiente programa de PCR (Tabla 4)
- Compruebe el PCR (ejecutar todo el volumen) en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los clones correctos tendrán una banda en el tamaño esperado, así como una mancha y una escalera de bandas. Para un ejemplo de la mancha apropiada, consulte 34,33.
- Grow 2 ml de cultivos de los clones correctos en medio LB O / N a 37 ° C en una incubadora con agitación.
- Miniprep los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Secuencia de verificación de secuencia TALEN con pCR8_F1 y pCR8_R1. Siga los procedimientos descritos anteriormente 35.
- El uso de los clones correctos verificadas por secuenciación, configurar la reacción # 2 (kit TALEN), que situará a los RVDS de los vectores A y B y el final de RVD en el vector de destino.
- Preparar la mezcla de reacción 2 (Tabla 5).
Nota: Jareacciones LF pueden ser utilizados. - Colocar las reacciones en un termociclador y ejecute el siguiente programa: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min.
- Preparar la mezcla de reacción 2 (Tabla 5).
- Transformar reacciones.
- Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes.
- Mezclar 2,5 l de la reacción con 25 l de células químicamente competentes. Incubar en hielo durante 5 min. Choque térmico de las células durante 30 segundos a 42 ° C.
- Colocar los tubos en hielo. Añadir 125 l de SOC. Colocar los tubos en una incubadora de agitación a 37 ° C durante 1 hr.
- Plate 100 l de las células transformadas en placas LB con ampicilina (100 mg / ml), X-gal e IPTG. Crecer O / N a 37 ° C.
- Transformar 2,5 l de cada reacción en 25 l químicamente células competentes.
- Escoja 1-3 colonias blancas para cada reacción y comprobar mediante PCR de colonias usando cebadores TAL_F1 y TAL_R2 (Tabla 2).
- Hacer una solución de la polimerasa de Mastermix, agua y cebadores tal como sese describe en la Tabla 3. Escoja una colonia y untarlo en el fondo de un tubo de PCR, y luego poner los restos de la colonia en 2 ml de LB con ampicilina (100 mg / ml). Colocar 15 l de la solución en el tubo con la colonia.
- Ejecutar el programa de PCR (Tabla 6).
- Compruebe la PCR en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los clones correctos tendrán un emborronamiento y una escalera de bandas. Para un ejemplo de la mancha apropiada, consulte 34,33.
- Grow 2 ml de cultivos de los clones correctos en medio LB O / N a 37 ° C en una incubadora con agitación.
- Miniprep los plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Secuencia de verificación de secuencia TALEN con TAL_F1 y TAL_R2 siguiendo los métodos descritos anteriormente 35.
3. La transcripción de ARNm Talens
- Digerir 4 g de plantilla de secuencia verificada con 2 l Sac I durante 2 horas a 37 ° C. Ejecutar 2 l de plásmido digerido con Sac en un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis. Los plásmidos que se digieren correctamente se mostrará una sola banda.
- Se purifica el plásmido digerido con Sac restante siguiendo el protocolo de kit de purificación de PCR. Lavar dos veces con la solución de lavado antes de la elución. Eluir en 30 l de agua libre de nucleasa.
- Siga el protocolo estándar para la producción de T3 mRNA.
- Configurar medias reacciones utilizando 0,5 g de plantilla linealizado (preparado anteriormente). Incubar a 37 ° C durante 2 hr.
- Añadir 0,5 l de DNasa (incluido en el kit) y se incuba a 37 ° C durante 15 minutos.
- Se purifica el mRNA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluir en 30 l de agua libre de nucleasa.
- Ejecutar un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis para comprobar el mRNA.
- Limpiar el aparato de gel con un producto para eliminar la contaminación de ARNasa y preparar un gel de 1,2%.
- Mezcla 1 mRNA l + 4 y# 181; l de agua + 5 l de tinte de carga glioxilo libre de nucleasa. Incubar las muestras a 50 ° C durante 30 min. Centrifugar los tubos brevemente y colocar en hielo antes de ejecutar el gel.
- Comprobar la concentración utilizando un método de cuantificación de las concentraciones de ácidos nucleicos y almacenar el RNA en alícuotas a -80 ° C. Elija un tamaño de alícuota de tal manera que el ARN no está congelado / descongelado más de una vez.
Nota: Las concentraciones de 500-1000 ng / nl se obtienen típicamente. ARN con una concentración más baja se puede utilizar como el tiempo que se mantiene la integridad del ARN (tal como se evaluó por una banda en lugar de una mancha en el gel).
4. Inyectar Astyanax mexicanus Los embriones con TALEN ARNm
- Preparar Herramientas para inyección.
- Verter en las placas de inyección mediante el vertido de 1,2% de agarosa en agua de pescado (agua acondicionada con bicarbonato de sodio y sal de mar a pH 7,4 y la conductividad de 700 mS) en una placa de Petri. Colocar un molde (pieza de plástico con las proyecciones de hacer pozos para peceshuevos) en el interior del plato. Retire el molde cuando la agarosa se ha endurecido y se almacena a 4 ° C. Para más detalles sobre el molde ver 36.
- Tire de agujas para inyección utilizando un extractor de aguja de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Nota: longitud de la aguja apropiada es importante para inyecciones. Agujas que son demasiado largos serán demasiado flexible para inyecciones. El protocolo para agujas de tracción variará con el equipo utilizado para tirar de las agujas. Un ejemplo de una aguja apropiada se muestra en la Figura 1. Para nuestro equipo, que tire las agujas que son de 5-6 cm de longitud, y tienen un diámetro exterior en la punta de aproximadamente 0,011 mm cuando se rompen. Sin embargo, las agujas deben ser calibrados (paso 4.3.4) para determinar el ancho de la abertura. Un programa de ejemplo para tirar de las agujas se puede encontrar en la Tabla 7. - Preparar pipetas de vidrio para la transferencia de embriones rompiendo la pipeta de modo que la abertura sea suficientemente grande para un huevo pase a través. Flamear el extremo roto hastaya no es agudo.
Nota: Es importante utilizar pipetas de vidrio y recipientes de vidrio cuando se trabaja con A. huevos mexicanus y embriones, ya que son pegajosos y se adhieren al plástico.
- Recoge 1 de células Etapa huevos.
- Raza A. mexicanus siguiendo protocolos estándar 37.
Nota: Por ejemplo, si los peces se mantienen en un 14 ciclo de luz: oscuridad 10 y usando el tiempo Zeitgerber (ZT) con Zt0 como luces encendidas y ZT14 como las luces apagadas, nuestra peces desovan superficie entre ZT15 y ZT19. la época de reproducción exacta debe determinarse para cada laboratorio individual. - Inducir el desove de los peces sobrealimentación durante 3-4 días antes del apareamiento y la colocación de los peces en agua dulce. Elevar la temperatura de 2 ° C. Nota: Nuestro temperatura inicial del agua es de aproximadamente 74 ° C.
- Recoger los huevos de peces de la superficie en la oscuridad, comprobando cada 15 min para obtener huevos en la etapa de 1 célula. Cientos de huevos se pueden obtener de un único par de peces superficie.
- Recogerhuevos en recipientes de vidrio para evitar que se pegue a las superficies de plástico y de tipo para aislar embriones en la etapa de 1 célula antes de la inyección mediante la observación de los huevos bajo el microscopio y la recogida de los huevos que son una sola célula. Mantenga los huevos en agua dulce del sistema (agua del tanque en el que se alojan los peces adultos, que ha sido tratado para el pH y la conductividad).
- Raza A. mexicanus siguiendo protocolos estándar 37.
- Inyectar TALEN mRNA.
- Inyectar diferentes cantidades de mRNA total (cantidades iguales de cada TALEN en el par) para determinar la concentración óptima para la inyección como la toxicidad y la eficacia varían por TALEN par. Para empezar, la inyección de concentraciones de ARNm totales que son 400-800 pg. Diluir y combinar mRNA a concentraciones deseadas para la inyección de 1,5 nl.
- Cargar diluyó ARNm en la parte posterior de la aguja y colocar la aguja a un micro-inyector.
- Romper la aguja con unas pinzas.
- Calibrar la aguja. Por ejemplo, expulse 10 veces y recoger el consiguiente descenso de un capilar micro. Por 10 x 100 1.0 desechable81; l, 32 mm micro capilar, la caída debe llenar el micro capilar de 0,5 mm para la inyección de 1,5 nl / 1. Ajustar el tiempo de inyección y la presión según sea necesario.
- Insertar la aguja en la celda única e inyectar el ARNm. Inyectar el mRNA directamente en la célula, no en la yema.
- Recoger los embriones inyectados en recipientes de vidrio. Mantener embriones a 23-25 ° C. Retire los embriones muertos (que se convierten en embriones nublado y de forma irregular) regularmente durante los primeros días después de la inyección. Un número récord de embriones muertos y deformes de control (no inyectada) y las placas inyectadas.
Nota: El aumento de la concentración de ARNm puede conducir a un aumento de la toxicidad y la deformidad / muerte de los embriones. Por lo tanto, la toxicidad frente a la eficiencia debe ser equilibrado para determinar la mejor concentración de ARNm para inyectar.
5. El fenotipo de los pescados Fundador y evaluar la eficiencia TALEN
- Sacrificar embriones de animales según el protocolo institucional.
Nota: Se practicar la eutanasiaembriones se refrigera rápidamente en hielo. - Recoger los embriones en 0,8 l de PCR tiras de tubos utilizando una pipeta de transferencia.
Nota: El genotipado puede realizarse en embriones o piscinas de embriones individuales. - Extraer el ADN.
- Coloque los embriones en 100 l de hidróxido de sodio 50 mM (NaOH) y se incuba a 95 ° C durante 30 min, después se enfría a 4 ° C.
- Añadir 1/10 volumen (10 l) de 1 M Tris-HCl pH 8.
- Realizar una PCR en la región utilizando los cebadores diseñados en el paso 1.3 (véase las Tablas 8 y 9 para los protocolos de muestra). Para los embriones individuales 1 l de ADN es suficiente para la reacción de PCR.
- Se digiere el producto de PCR resultante con la enzima de restricción apropiada y correr un gel de agarosa al 1,5% mediante electroforesis.
- Por ejemplo, para la genotipificación del locus albinismo oculocutáneo 2 (OCA2) en embriones inyectados digerir el producto de PCR usando la enzima de restricción Bsr I mediante la adición de 0.5 L de Bsr I directamente a 12,5 l de la reacción de PCR completado, incubando a 65 ° C durante 2 horas. Ejecutar el no digerido y el producto digerido en un gel. Bandas resistentes de enzimas de restricción (es decir, bandas que no digieren) indican que las mutaciones inducidas por TALEN están presentes (Figura 2).
- (Opcional) Calcular la tasa de mutación porcentaje determinando el porcentaje de producto sin cortar mediante el análisis de imágenes de los geles en Fiji 38 utilizando la herramienta de análisis de gel para calcular el valor de intensidad de cada banda como se ha descrito previamente 29.
- Determinar la secuencia de los alelos mutantes por clonación TA la banda mutante resistente se purificó en gel de enzima de restricción y secuenciación de clones.
- Gel purificar la enzima de restricción banda mutante resistente siguiendo las instrucciones del fabricante. TA clonar la banda siguiendo las instrucciones del fabricante. Recoger colonias y crecer en 1,5 ml de LB O / N a 37 ° C en un zarandeoincubadora.
- culturas Miniprep siguientes instrucciones del fabricante. Enviar el ADN para la secuenciación.
- El uso de un programa como el mono, alinear las secuencias mutantes de la secuencia de tipo salvaje.
- Copiar y pegar las dos secuencias en archivos APE. Elija la herramienta "alinear dos secuencias" en el menú "Herramientas".
- Especificar las dos secuencias de ADN utilizando los menús desplegables.
Nota: puede ser necesario utilizar dependiendo de la dirección de la PCR entró en el vector de clonación el complemento inverso de la secuencia clonada. Si las secuencias no se alinean, repita los pasos marcando la casilla "Rev-Com" en el cuadro "ADN Align".
- Evaluar los peces fundador de fenotipos en la etapa adecuada y mediante métodos apropiados para el fenotipo esperado 29 (Por ejemplo, la Figura 3). Los métodos de fenotipificación se basarán en el fenotipo esperado para el gen diana por el investigador usando el protocol.
6. Pantalla de transmisión de la línea germinal
Nota: A. mexicanus alcanzar la madurez sexual a los 4-8 meses.
- Cruzar los peces sexualmente maduros fundador de peces de tipo salvaje.
- Embriones de pantalla o peces adultos usando métodos en los pasos 5.1-5.7 (Figura 4). Para peces adultos, un trozo de la cola se puede enganchar tras la anestesia.
- Anestesiar pescado sumergiendo pescado en una solución de tricaína (éster etílico del ácido 3-aminobenzoico) para reducir la tensión durante el recorte de la aleta. Tras corte de una aleta, permiten que los peces se recuperen en agua dulce. Los peces se recuperan con rapidez; observar hasta que se recuperen (normalmente son la natación).
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Representative Results
TALEN par inyecciones dan como resultado la unión de los RVDS a los nucleótidos de ADN específicas y por lo tanto la dimerización de los dominios de FokI, dando lugar a roturas de doble cadena 39 que pueden ser reparados a través de extremos no homólogos (NHEJ). NHEJ menudo introduce errores que resultan en inserciones o deleciones (indeles). Indeles pueden ser identificados mediante la amplificación de la región que rodea el sitio de destino TALEN y digerir el amplicón resultante con una enzima de restricción que corta dentro de la región espaciadora TALEN. Los alelos sin un indel se digerir, mientras que los alelos que contiene indeles que cambian la secuencia diana con enzimas de restricción no digerirá, produciendo una banda resistente a los enzimas de restricción (Figura 2).
Inyecciones TALEN probable pueden dar lugar a mutaciones de genes bialélicos en A. mexicanus 29. Por lo tanto, algunos fenotipos pueden ser evaluados en el pescado fundador. por ejemplo, se evaluó la pigmentación en peces tapa inyectada en Talens OCA2 la orientación, el gen de la hipótesis de ser responsable de albinismo en múltiples poblaciones albinas de cavefish 1,28. Encontramos parches albinos en los peces inyectados-TALEN OCA2 no está presente en el pescado sin inyectar 29 (Figura 3).
Para muchos experimentos, es deseable disponer de líneas mutantes de peces para evaluar fenotipos. Fundador de pescado con alelos mutantes de transmisión puede ser identificado por genotipo de la progenie de los cruces de peces fundador a los peces de tipo salvaje (Figura 4).
Figura 1. Aguja para la inyección de mRNA. Fotografía de una micropipeta antes de ser rota utiliza para inyectar TALEN ARNm en embriones unicelulares._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. eficiencia TALEN para OCA2. 306 productos pb de PCR de exón 9 de OCA2 en Astyanax mexicanus se examinaron para la pérdida del sitio de enzima de restricción cuando se inyectaron diferentes cantidades de mRNA 29 TALEN. El amplicón de un embrión de control se digirió mientras que una parte del amplicón era resistente a la digestión de restricción en las piscinas de 10 TALEN inyecta embriones. Restricción de digestión con enzimas de bandas resistentes a partir de embriones inyectados con mRNA TALEN dirigido OCA2 han demostrado que contienen indeles 29. Tenga en cuenta que el aumento de las concentraciones de ARNm inyectado se obtiene mayor eficiencia TALEN (ADN sin digerir más). Carriles con "-" son digeridas, carriles con "+" son DigesTed con enzimas de restricción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Fenotipificación peces fundador de los cambios en la pigmentación. (A) Superficie de control no inyectado A. mexicanus. (B) Parche que carecen de melanóforos en un pez superficie fundador inyectados con 400 pg TALEN ARNm de orientación OCA2 (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. transmisión de la línea germinal de mutatio TALEN inducidans. 306 bp productos PCR de exón 9 del OCA2 en A. mexicanus se examinaron para la pérdida del sitio de enzima de restricción en piscinas de 10 F 1 pescado de un pez fundador inyectado. El amplicón de un embrión de control se digirió mientras que una parte del amplicón era resistente a la digestión de restricción en las piscinas de 10 F 1 embriones. Enzima de restricción digerir bandas resistentes de F OCA2 han sido mostrados 1 s para contener indeles 29. Carriles con "-" están sin digerir, carriles con "+" son digeridos con la enzima de restricción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reacción A | Reactien B | |||
| cantidad | reactivo | cantidad | reactivo | |
| 4 l | agua | 10 l | agua | |
| 1 l | pFUS_A | 1 l | pFUS_B4 | |
| 1 l | BsaI | 1 l | BsaI | |
| 1 l | BSA | 1 l | BSA | |
| 1 l | ligasa | 1 l | ligasa | |
| 2 l | tampón de ligasa 10X | 1 l | tampón de ligasa 10X | |
| 1 l | pNH1 | 1 l | pNG1 | |
| 1 l | pNH2 | 1 l | PhD2 | |
| 1 l | pNG3 | 1 l | pNH3 | |
| 1 l | pHD4 | 1 l | pNI4 | |
| 1 l | PhD5 | |||
| 1 l | PHD6 | |||
| 1 l | pNG7 | |||
| 1 l | pHD8 | |||
| 1 l | pNG9 | |||
| 1 l | pHD10 | |||
Tabla 1. Ejemplo de montaje de reacción A y B para unaTALEN contiene RVDS NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.
| nombre de imprimación | secuencia (5'-3 ') |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
Tabla 2. Los cebadores de PCR para PCR de colonias, de 34.
| reactivo | cantidad |
| Mastermix Taq, 2x | 50 l |
| pCR8_F1 imprimación,10 uM | 4 l |
| cebador pCR8_R1, 10 uM | 4 l |
| agua libre de nucleasa | 42 l |
| * Ajuste de mezcla maestra si se utiliza un taq diferente | |
Tabla 3. Maestro mezcla de 100 l (15 l / reacción) por PCR de colonias 1.
| paso | la temperatura (° C) | tiempo (seg) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 105 |
| 5 | Vaya al paso 2 durante 30 ciclos | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabla 4. Programa de PCR para PCR de colonias 1.
| cantidad | reactivo | concentración |
| 12 l | agua | |
| 1 l | A vector | 100 ng / l |
| 1 l | vector B | 100 ng / l |
| 1 l | vector destino pT3Ts-GT | 50 ng / l |
| 1 l | RVD final (PLR-RVD) | 100 ng / l |
| 1 l | Esp3I | |
| 1 l | ligasa | |
| 2 l | tampón de ligasa 10X | |
Tabla 5. Protocolo para las reacciones de segundo montaje.
| paso | la temperatura (° C) | tiempo (seg) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 180 |
| 5 | Vaya al paso 2 durante 30 ciclos | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabla 6. Programa de PCRpara la PCR de colonias 2.
| calor | 290 |
| Halar | 150 |
| velocidad | 100 |
| hora | 150 |
| Estos parámetros son para un Flaming / Castaño Micropipeta Tirador Modelo P-97 utilizando un filamento de artesa | |
Tabla 7. Ejemplo de programa de la aguja tirando.
| reactivo | cantidad |
| Mastermix Taq, 2x | 12,5 l |
| gen cebador directo específico, 10 micras | 1 μl |
| gen cebador inverso específico, 10 micras | 1 l |
| agua libre de nucleasa | 9.5 l |
| ADN | 1 l |
| * Ajuste de mezcla maestra si se utiliza un taq diferente | |
Tabla 8. protocolo de muestra para la PCR específica de genes.
| paso | la temperatura (° C) | tiempo (seg) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 56 | 30 |
| 4 | 72 | 60 |
| 5 | Ve a SASO 2 durante 35 ciclos | |
| 6 | 72 | 300 |
| * Ajustar la temperatura de recocido y tiempo de extensión de cebadores específicos y el tamaño del producto de PCR | ||
Tabla 9. programa de PCR de la muestra para la PCR específica de genes.
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Discussion
Grandes avances se han hecho en los últimos años hacia la comprensión de la base genética de la evolución de los rasgos. Aunque se han identificado los genes candidatos que subyacen a la evolución de una serie de rasgos, se ha mantenido un reto para poner a prueba estos genes in vivo debido a la falta de maleabilidad genética de las especies evolutivamente más interesantes. Aquí mostramos un método para la edición del genoma de A. mexicanus, una especie usada para estudiar la evolución de los animales de la cueva. La cartografía genética estudia 1,21,23 y el gen candidato se aproxima a 19,40 han identificado una serie de genes candidatos para la evolución de los rasgos en forma de cueva A. mexicanus. La reciente publicación del genoma cavefish 41 proporciona una poderosa herramienta adicional para la identificación de genes candidatos para la evolución de los rasgos de la cueva. Prueba de la función de muchos de estos genes candidatos requiere de técnicas para reducir la expresión de genes. La única opción actual para el estudioing expresión génica reducida en A. mexicanus es por el uso de morfolinos. Sin embargo, gen desmontables morfolino es transitoria, limitada a unos pocos días después de la fecundación, y no es útil para el estudio de los rasgos en los animales adultos, como las diferencias de comportamiento entre la cueva de adultos y peces de superficie como la instrucción 17, 19 hiperfagia y la atracción de vibración 42 comportamiento. Generación de pérdida de alelos función de los genes, como los que se pueden hacer usando Talens, será crítico para el ensayo de la función de los genes candidatos para estos rasgos.
Se han desarrollado métodos para facilitar el montaje de pares TALEN 33 y el protocolo de detalles de este método está disponible 34. Este protocolo se ha optimizado para el uso de pez cebra por Bedell et al., 7, utilizando un vector destino final diferente, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-GT). Este vector permite la transcripción de mRNA TALEN para la inyección en embriones de pez cebra unicelulares.Hemos utilizado este método de montaje modificada, se explica en detalle aquí, para ensamblar y transcribir Talens para la inyección en A. mexicanus. Hemos encontrado que cuando se inyecta en la superficie unicelular A. embriones mexicanus, tal como se describe en este protocolo, se podrían mutar A. genes mexicanus 29. Para futuras investigaciones sobre genes candidatos que no se describen en este protocolo, las secuencias se pueden encontrar en el genoma cavefish 41 y utilizarse para identificar sitios diana TALEN.
Crítico para inyecciones exitosas es ARNm TALEN alta calidad. Por lo tanto, la comprobación de la calidad del ARN mediante la ejecución de una pequeña cantidad de ARN en un gel antes de la inyección es importante (Paso 3.6). Otras precauciones para mantener la integridad del ARN, tales como la congelación alícuotas para evitar el deshielo de congelación (paso 3.7), y el mantenimiento de condiciones estériles mediante el uso de tubos de agua limpia y libre de RNasa y consejos durante las inyecciones (paso 4), se deben tomar. Un paso crítico adicional para la cría de peces es inyectadala limpieza de embriones muertos después de la inyección, como embriones muertos pueden afectar rápidamente la calidad del agua. De este modo, se elimina embriones muertos la mañana después de las inyecciones, y periódicamente durante los próximos pocos días después de las inyecciones para mantener los embriones vivos sanos (Paso 4.3.6).
TALEN mutagénesis en Astyanax mexicanus puede ser altamente eficiente; Sin embargo, la eficiencia varía en función del par TALEN inyecta 29. El aumento de las concentraciones de ARNm puede conducir a un aumento de la toxicidad y la deformidad y la muerte de los embriones inyectados. Por lo tanto, la toxicidad frente a la eficiencia debe ser probado y equilibrado para determinar la concentración óptima de mRNA para inyectar. Para los pares de TALEN altamente eficientes, fenotipos pueden ser evaluados en el pescado fundador inyectado. Por ejemplo, la inyección de Talens OCA2 focalización resultó en parches albinos en el pescado superficie 29 (Figura 3). Para otros rasgos o genes, sin embargo, la evaluación de los fenotipos en los peces fundador puede ser un reto debidoque sutilmente del fenotipo o baja eficiencia de la pareja TALEN inyectado. Por lo tanto, para muchas aplicaciones será deseable para generar mutaciones de línea germinal en un gen de interés para el análisis de la función de un gen candidato en un animal no mosaico. La obtención de la transmisión de la línea germinal de mutaciones inducidas por TALEN en A. mexicanus es posible 29 (Figura 4). Por lo tanto, esta técnica se puede aplicar para evaluar otros genes candidatos.
Existen unas pocas limitaciones para realizar manipulaciones genéticas en Astyanax mexicanus en este momento. Superficie y raza cavefish en la oscuridad, tarde en la noche. En un laboratorio en el que no es posible revertir el ciclo de oscuridad luz, los investigadores deben llegar tarde por la noche para llevar a cabo inyecciones, ya que es fundamental para inyectar inmediatamente después del desove. Además, es importante recoger embriones de peces de superficie en la oscuridad, como la luz afecta el desove.
Otras técnicas, en particular el sistema / Cas CRISPR (revisado en 43), existiendo para la edición del genoma y que probablemente será aplicable a A. mexicanus. De hecho, existen protocolos para el conjunto de guía de ARN que son rápida y fácil 44 y el protocolo reportados aquí pueden ser modificados para inyección CRISPR / Cas. Además, se están desarrollando nuevos rápidamente aplicaciones para editar genoma, y muchas de ellas pueden resultar útiles para A. investigadores mexicanus. Por ejemplo, en las mutaciones precisas de pez cebra se han hecho en un gen de interés por coinjecting Talens con una sola oligo hebra que contiene una mutación 7. Esta técnica podría ser útil para evaluar el papel de los alelos de la cueva en la generación de fenotipos de las cavernas, tales como el papel de una mutación sin sentido en ciertos alelos cueva de MC4R en diferencias en el metabolismo observadas entre cavefish y la superficie de los peces 19. Talens también se han utilizado para generar alelos de genes a través de recombinación homóloga que expresan marcadores fluorescentes in patrones similares a los loci endógenos 45. Estos métodos se podrían utilizar en A. mexicanus para evaluar subconjuntos de células o la expresión de genes candidatos. El sistema / Cas CRISPR se ha utilizado en el pez cebra para obtener los tejidos específicos de eliminación de genes 46. Estas técnicas, aplicadas a A. mexicanus, podría ser útil para evaluar la base genética de los procesos tales como la pérdida del ojo en cavefish. La lente tiene un papel crítico en el proceso de pérdida de ojo en cavefish 47 y el sistema / Cas CRISPR específico de tejido puede ser usado para evaluar el papel de los genes candidatos para la pérdida de ojo específicamente en la lente frente a otros tejidos del ojo. Estas y otras técnicas de edición de genoma pueden ser utilizados en A. mexicanus en futuros estudios para responder a las preguntas críticas acerca de la evolución de los rasgos de la cueva.
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Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Departamento de Genética, Desarrollo y Biología Celular y la Universidad Estatal de Iowa y por el NIH subvención EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner proporcionó comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
References
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
- Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
- Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
- Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Gross, J. B.
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
- Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
- Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
- Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
- Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326 (2009).
- Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108 (2012).
- Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
- Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
- Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823 (2013).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
- Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82 (2011).
- Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
- Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
- Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
- Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647 (2014).
- McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).
