Summary
Gen hedefleme mutajenez genom düzenleme teknikleri kullanılarak organizmaların geniş bir mümkündür. Burada, Astyanax mexicanus, yüzey balık ve cavefish içeren balık türlerinin efektör nükleazlar (Talens) gibi transkripsiyon aktivatörü kullanılarak hedeflenen gen mutasyon için bir protokol göstermektedir.
Introduction
Sürekli evrim genetik temelini anlamak evrimci biyologların kritik bir araştırma hedeftir. Önemli ilerleme özelliklerin evrimini altında yatan lokusların belirlenmesi ve (örneğin 1-3) bu loci içinde aday genlerin saptayarak yapılmamıştır. Ancak, fonksiyonel bu genlerin rolü özelliklerin evrimini incelemek için kullanılan birçok organizmaları zorlu kaldı etmiştir test şu anda genetik uysal değildir. Genom düzenleme teknolojileri çıkması büyük ölçüde organizmaların geniş bir genetik uygulanabılirliği artmıştır. Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) ve kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmişlerdir kısa yineleyen tekrarlar (CRISPRs) (Örnek 4-11 için) organizmadan genler hedefli mutasyon üretmek için kullanılmıştır. Bir evrimsel ilgili sisteme uygulanan bu araçları, evrimsel biyologlar evrimin genetik temeli çalışma yol devrim potansiyeline sahip.
Astyanax mexicanustan iki şekilde bulunur balık türüdür. Bir nehir yaşayan yüzey formu (yüzey balık) ve çoklu mağaralarda yaşayan formları (cavefish) A. mexicanustan cavefish (12 gözden) yüzey balık atalarından evrimleştiği. Cavefish popülasyonu gibi okullaşma davranışının kaybı, artan saldırganlık, duruş ve hiperfajya 13 beslenme değişiklikleri gibi davranış damak tadınızı ve kafatası neuromasts ve değişikliklerin sayısında artış, azalma ya da pigmentasyon kaybı, gözlerde kaybı da dahil olmak üzere özellikleri bir dizi geliştiğini -19. Cavefish ve yüzey balıkları interfertile, ve genetik haritalama deneyleri mağara özellikleri 1,20-26 için lokus ve aday genleri tanımlamak için yapılmıştır. Bazı aday genler diğer türlerin 21 model organizmalarda veya aşırı ifadesinin 27 veya geçici demonte u tarafından, hücre kültürü 1,19 mağara özellikleri katkıda işlevsel rolü için test edilmiştirA. morpholinos 28 şarkı mexicanustan. Bununla birlikte, bu yöntemlerin her biri, bir sınırlama vardır. A. Bu genlerin mutant alelleri oluşturma yeteneği mexicanustan cavefish evriminde işlevini anlamak için kritik önem taşır. Bu nedenle, A. mexicanustan genom düzenleme teknolojileri uygulanması için ideal bir aday organizmadır.
Burada A. genom düzenleme için bir yöntem özetlemektedir mexicanustan Talens kullanılmıştır. Bu yöntem, fenotip ve ilgi 29 genlerin kararlı mutasyonları ile balık hatları izole etmek için mozaik enjekte kurucu balık değerlendirmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına uygun olarak ve Iowa Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Maryland Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. TALEN Tasarım
- Bir TALEN tasarım web sitesine giriş istenen hedef dizisi. (Örneğin https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Giriş boşluk / tekrar dizi uzunlukları seçildi.
- "Dizi" etiketli kutunun içine genomik dizisi kopyalayın.
- "Özel Spacer / RVD Uzunlukları sağlayın" sekme içinde boşluk uzunluğu ve dizi uzunluğunu seçin.
Not: 15 baz çiftlerinin Spacer uzunlukları ve iyi 15-17 iş dizi uzunlukları tekrarlamak ve montaj az karmaşık hale getirmektedir.
- Bir TALEN çiftini seçin. benzersiz sınırlama enzimi noktasının etrafında tasarlanmış TALEN çiftleri kısıtlama enzimi tarafından genotipleme sindirilmesi izinBir PCR ürünü,.
- Tasarım primerler gibi Primer3 30-32 gibi web sitesini kullanarak TALEN hedef alanını çevreleyen genomik bölgeyi yükseltmek için. bir kısıtlama enzimiyle genotipleme olduğunda, astar tasarımı bir kere kısıtlayıcı enzim merkezi ihtiva eden bir bölümünün yükseltilmesi için. Bölgenin büyütülmüş ve A içinde mevcut olan herhangi polimorfizmlerini tespit etmek TALEN yapı önce dizilenmiştir önerilir mexicanustan laboratuar popülasyon mikro enjeksiyon için kullanılmak üzere.
(TALEN Kit Protokolü Modifiye) 2. TALEN Meclisi 33,34
Ek ayrıntılar ve sorun giderme için protokol 34 bkz.
- Hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre TALEN kiti gerekli plazmidler sırası.
- reaksiyonlar A ve B için 1 reaksiyonlar tekrar değişkenli diresidues (RVDs) 1-10 ve Reaksiyon A. hedef vektör pFUS_A RVDs dahil 11- dahil # (N-1) ve th kurmakN talen bölgesindeki RVDs sayısı e hedef vektör pFUS_B Reaksiyon B (n-1).
- Her reaksiyon ekleyin: Her RVD (100 ng / | il), hedef vektör (100 ng / | il), 1 ul Bsa I kısıtlayıcı enzim, 1 ul Sığır Serum Albumin (BSA) (2 mg / ml ihtiva eden her bir plazmid, 1 ul ), 1 ul ligazı, 20 ul toplam hacim su ul 10x ligaz tamponu ve x 2 ul. Örneğin, bakınız Tablo 1.
Not: yarım reaksiyonları da kullanılabilir. - Bir PCR reaksiyonları yerleştirin ve döngüyü çalıştırın: 10x (37 ° C / 5 dk + 16 ° C / 10 dk) + 50 ° C / 5 dk + 80 ° C / 5 dk.
- Her reaksiyon ekleyin: Her RVD (100 ng / | il), hedef vektör (100 ng / | il), 1 ul Bsa I kısıtlayıcı enzim, 1 ul Sığır Serum Albumin (BSA) (2 mg / ml ihtiva eden her bir plazmid, 1 ul ), 1 ul ligazı, 20 ul toplam hacim su ul 10x ligaz tamponu ve x 2 ul. Örneğin, bakınız Tablo 1.
- nükleazı ile reaksiyonları inkübe edin. Her reaksiyon için 1 ul 25 mM ATP ve 1 ul nükleaz ekleyin. 1 saat süre ile 37 ° C 'de reaksiyonlar inkübe edin.
- Tepkiler Transform.
- Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü.
Not: Ev yapımı yetkili carşın kullanılabilir. Bununla birlikte, düşük yetkinlik hücreler koloni eksikliği ile sonuçlanabilir.- kimyasal olarak yetkin hücre 25 ul reaksiyon 2.5 ul karıştırın. Beş dakika süre ile buz üzerinde inkübe edin. 42 ° C'de 30 saniye boyunca inkübe hücreleri.
- 2 dakika boyunca buz üzerinde tüpler yerleştirin. Katabolik baskı (SOC) ile Süper Optimal suyu 125 ul ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de tüpler çalkalayın.
- Plaka spektinomisin (50 ug / ml) LB plakaları üzerine dönüştürülmüş hücreler, 100 ul, X-gal ve izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG). 37 ° C sıcaklıkta O / N büyütün.
- Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü.
- Her reaksiyon için 2-3 Beyaz koloniler ve primerlerin pCR8_F1 ve pCR8_R1 (Tablo 2) kullanılarak koloni PCR ile kontrol edin.
- reaktiflerin bir ana karışımı olun. Örneğin, bakınız Tablo 3.
- Bir koloni seçin ve bir PCR tüp dibine onu yayma ve daha sonra spektinomisin ile 2 ml LB içine koloninin kalıntılarını koymak(50 ug / ml). koloniye ile tüpe ana karışımı 15 ul yerleştirin.
- Aşağıdaki PCR programını çalıştırın (Tablo 4)
- elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde PCR (tüm birimi çalıştırın) kontrol edin. Doğru klonlar, beklenen boyutta bir bant gibi bir yayma ve bantların bir merdiven olacaktır. Uygun smear örneği için 34,33 bkz.
- bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de LB ortamı O / N doğru klon 2 mi kültür büyütün.
- üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler miniprep.
- Sıra pCR8_F1 ve pCR8_R1 ile TALEN dizisini kontrol etmek için. Daha önce tarif edilen metotlar 35 izleyin.
- dizisi ile doğrulandı doğru klonlar kullanarak, hedef vektörü içine A ve B vektörleri ve son RVD gelen RVDs yerleştirir reaksiyon 2. (TALEN kiti) kurmuştur.
- Reaksiyonun 2 (Tablo 5) karışımı hazırlayın.
Not: HaEğer reaksiyonları kullanılabilir. - Bir PCR reaksiyonları yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 37 ° C / 10 dk + 16 ° C / 15 dk + 37 ° C / 15 dk + 80 ° C / 5 dk.
- Reaksiyonun 2 (Tablo 5) karışımı hazırlayın.
- Tepkiler Transform.
- Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü.
- kimyasal olarak yetkin hücre 25 ul reaksiyon 2.5 ul karıştırın. 5 dakika buz üzerinde inkübe edin. Isıtma 42 ° C'de 30 saniye boyunca hücrelerin şok.
- buz üzerinde tüpler yerleştirin. SOC 125 ul ekleyin. 1 saat süre ile 37 ° C 'de çalkalayıcı bir inkübatör içinde tüpler yerleştirin.
- Plaka ampisilin (100 ug / ml), X-gal ve IPTG ile LB levhaları üzerine dönüştürülmüş hücreler 100 ul. 37 ° C sıcaklıkta O / N büyütün
- Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü.
- Her reaksiyon için 1-3 Beyaz koloniler ve koloni PCR ile primerler TAL_F1 kullanarak TAL_R2 (Tablo 2) ile kontrol edin.
- polimeraz master, su ve primer olarak bir çözeltisini yapmakTablo 3'te tarif edilmiştir. Bir koloni almak ve bir PCR tüpünün dibine smear ve ampisilin (100 ug / ml) ile 2 ml LB içinde koloninin kalıntılarını koydu. koloni tüpe çözeltisi 15 ul koyun.
- PCR programı (Tablo 6) çalıştırın.
- elektroforez ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde PCR edin. Doğru klonlar bulaşmasını ve bantların bir merdiven olacak. Uygun smear örneği için 34,33 bkz.
- bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de LB ortamı O / N doğru klon 2 mi kültür büyütün.
- üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler miniprep.
- Dizi TAL_F1 ve TAL_R2 daha önce tarif edilen metotlar 35 aşağıdaki TALEN sekansını kontrol etmek için.
Talens 3. mRNA transkripsiyonunu
- 37 ° C'de 2 saat boyunca 2 ul Sac I ile dizi-belirlenmiş şablon 4 ug Digest. Elektroforez ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde Sac I ile sindirilmiş plasmid 2 ul çalıştırın. Doğru sindirilir Plazmidler tek bant gösterecektir.
- PCR saflaştırma kiti protokolü sonra, kalan Sac I ile sindirilmiş plasmid saflaştırılır. Elüsyon önce yıkama çözeltisi ile iki kez yıkanır. nükleaz içermeyen su 30 ul içinde yıkayın.
- T3 mRNA üretimi için standart bir protokol izleyin.
- Lineerleştirilmiş şablonun 0.5 mikrogram ile yarım reaksiyonları kurmak (yukarıda hazırlanan). 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- DNase (kiti içinde bulunur), 0.5 ul ilave edin ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek mRNA arındırın. 30 ul nükleaz içermeyen su içine Zehir.
- mRNA kontrol etmek için elektroforez ile% 1.5 agaroz jel çalıştırın.
- RNaz kontaminasyonu ortadan kaldırmak ve% 1.2 jel hazırlamak için bir ürün ile jel aparat temizleyin.
- Karışım 1 ul mRNA + 4-# 181; l nükleaz içermeyen su + 5 ul glioksil yükleme boyası. 30 dakika boyunca 50 ° C'de inkübe edin. jel çalıştırmadan önce buz üzerinde santrifüj tüplerine kısaca ve yer.
- nükleik asit konsantrasyonlarının ölçülmesi için bir yöntem kullanarak yoğunlaştırma kontrol edin ve -80 ° C'de parçalar halinde saklayın RNA. RNA / dondurulmuş birden fazla çözülmüş değildir, öyle ki, bir kısım boyutu seçin.
Not: 500-1000 ng konsantrasyonlar / nl genellikle elde edilir. RNA bütünlüğü korunur (a bant yerine jel üzerinde yayma tarafından değerlendirilir) daha düşük bir konsantrasyonda RNA sürece kullanılabilir.
TALEN mRNA ile 4. enjekte Astyanax mexicanustan Embriyolar
- Enjeksiyon için Araçlar hazırlayın.
- bir petri içine balık su (sodyum bikarbonat ve deniz tuzu pH 7.4 ve iletkenlik 700 mS ile şartlandırılmış su)% 1.2 agaroz dökerek enjeksiyon plakaları dökün. balık kuyu olmak için çıkıntılar olan bir kalıbın (plastik parça yerleştirinçanak içinde yumurta). 4 ° C'de agaroz sertleşmiş kalıp ve mağaza çıkarın. Kalıpta ayrıntılar 36 için bkz.
- üreticinin talimatlarına göre bir iğne çektirmenin kullanarak enjeksiyon için iğne çekin.
Not: Uygun iğne uzunluğu enjeksiyonlar için önemlidir. çok uzun olan iğneler enjeksiyonlar için çok esnek olacaktır. çekerek iğne protokol iğneler çekmek için kullanılan ekipman ile değişecektir. Uygun bir iğne bir örnek bizim ekipman için, uzunluğu 5-6 cm iğne çekin. Şekil 1'de gösterildiği ve kırıldığı zaman yaklaşık 0.011 mm ucunda bir dış çapa sahip olduğu. Ancak, iğneler açılış genişliğini belirlemek için (adım 4.3.4) kalibre edilmelidir. Iğneler çekmek için bir örnek program Tablo 7'de bulunabilir. - bir yumurta geçmesine açılış yeterince büyük ve böylece pipet kırarak embriyo transferi için cam pipetler hazırlayın. kırık ucu kadar Alevartık keskindir.
Not: A. ile çalışırken cam pipetler ve cam kase kullanmak önemlidir mexicanustan yumurta ve embriyo onlar yapışkan ve plastik uyacaktır olarak.
- 1-hücreli Sahne Yumurta toplayın.
- Irk A. mexicanustan standart protokoller 37 Aşağıdaki.
Not: Örneğin, balık 14 ışık tutulur eğer: 10 karanlık döngüsü ve ışıklar kapalı olarak ve ZT14 ışıkları olarak ZT0 ile Zeitgerber zaman (ZT) kullanılarak, ZT15 ve ZT19 tarihleri arasında yüzey balık yumurtlamak. Tam yumurtlama zamanı her laboratuar için tespit edilmelidir. - çiftleşme öncesi 3-4 gün balık fazla besleme ve taze suya balık koyarak yumurtlama neden olur. Sıcaklık 2 ° F kaldırın. Not: Bizim ilk su sıcaklığı yaklaşık 74 ° F.
- 1 hücre aşamada yumurta elde etmek için her 15 dakikada kontrol karanlıkta yüzey balık yumurta toplamak. yumurta yüz yüzeyi balık tek bir çift elde edilebilir.
- Toplamakcam kase yumurta plastik yüzeylere yapışmasını önler ve sıralama mikroskop altında yumurta gözlemleyerek ve tek bir hücre olan yumurta toplama yoluyla enjeksiyondan önce 1 hücre aşamasında embriyoların izole etmek. (PH ve iletkenlik için işlem görmüş yetişkin balıklar yer aldığı bir hazne suyu,), taze sistem suda yumurta tutun.
- Irk A. mexicanustan standart protokoller 37 Aşağıdaki.
- TALEN mRNA enjekte.
- toksisite ve etkinlik TALEN çift değişir gibi enjeksiyon için uygun konsantrasyonu belirlemek için toplam mRNA (çiftteki her talen eşit miktarlarda) farklı miktarlarda enjekte edilir. 400-800 pg olan toplam mRNA konsantrasyonlarını enjekte ederek başlayın. Seyreltilir ve 1.5 NL enjekte edilmesi için istenen konsantrasyonlara mRNA birleştirir.
- Yük iğnenin arkasına mRNA seyreltilmiş ve bir mikro-enjektöre iğneyi takın.
- forseps kullanarak iğne kırın.
- iğne kalibre edin. Örneğin, 10 kez çıkarma ve bir mikro kapiller gerilemesi toplar. 10 x 100 atılabilir 1.081 l, 32 mm mikro kılcal, damla 1.5 nl / 1 enjeksiyon için 0.5 mm mikro kılcal doldurmalıdır. Gerektiğinde enjeksiyon zamanı ve basıncını ayarlayın.
- tek hücre içine iğne takın ve mRNA enjekte edin. değil sarısı içine, hücre içine doğrudan mRNA enjekte edilir.
- cam kase enjekte embriyolar toplayın. 23-25 ° C embriyolar tutun. ölü embriyolar düzenli enjeksiyonu takiben ilk birkaç gün için (bulutlu ve düzensiz şekilli hale embriyolar) çıkarın. kontrol (uninjected) ve enjekte edilen levhalardan ölü ve deforme embriyoların rekor numaraları.
Not: Artan mRNA konsantrasyonu artmış toksisite ve embriyo deformite / ölüme yol açabilir. Bu nedenle, randıman karşı toksisiteyi enjekte mRNA iyi konsantrasyonunu belirlemek için dengelenmelidir.
5. Fenotip Kurucu Balık ve TALEN Verimliliği değerlendirin
- kurumsal hayvan protokole göre embriyolar Kurban.
Not: euthanizeHızlı tarafından embriyolar buz üzerinde ürpertici. - Bir transfer pipet kullanarak 0,8 ul PCR şerit tüpler içine embriyolar toplayın.
Not: Genotiplendirme bireysel embriyolar veya embriyoların havuzları üzerinde gerçekleştirilebilir. - DNA ayıklayın.
- 100 ul 50 mM sodyum hidroksit (NaOH) içine yerleştirin embriyolar 4 ° C'ye soğutun, 30 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin.
- 1 M Tris-HCI pH 8 1/10 hacmi (10 ul) eklenir.
- Adım 1.3 tasarlanan primerler (örnek protokoller için masalar 8 ve 9 bakınız) kullanarak bölgede bir PCR gerçekleştirin. Bireysel embriyolar için DNA 1 ul PCR reaksiyonu için yeterlidir.
- uygun kısıtlama enzimi ile elde edilen PCR ürünü sindirimi ve elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde çalıştırıldı.
- Örneğin, enjekte edilen embriyolar okülokütanöz albinizm 2 (OCA2) odağı genotipleme için 0 ekleyerek kısıtlama enzimi Bsr kullanıyorum PCR ürünü sindirmek2 saat boyunca 65 ° C'de inkübe tamamlanmış PCR reaksiyonunun 12.5 ul e BSR doğrudan I .5 ul. sindirilmemiş ve bir jel üzerinde sindirilmiş ürünü çalıştırın. Kısıtlama enzimi dayanıklı grupları (yani, sindirimi olmayan bantları) TALEN kaynaklı mutasyon mevcut olan (Şekil 2) olduğunu göstermektedir.
- (İsteğe bağlı), daha önce tarif edildiği gibi 29 Her bir bandın şiddeti değerini hesaplamak için jel analizi alet Fiji 38 jel görüntüleri analiz ederek kesilmemiş ürünün yüzdesi belirlenerek yüzde mutasyon oranını hesaplar.
- Ta jel ile saflaştırılmıştır sınırlama enzimi dirençli mutant bandını klonlamak ve klonlar, dizileme ile mutant alleli dizisini belirlemek.
- Jel kısıtlama üreticinin talimatlarına aşağıdaki dirençli mutant bant enzim arındırmak. TA üreticinin talimatlarına aşağıdaki bant klonlamak. koloniler ve çalkalama 37 ° C'de 1.5 ml LB O / N büyümekinkübatör.
- Üreticinin talimatları izleyerek Miniprep kültürleri. sıralaması için DNA gönder.
- Böyle maymun gibi bir program kullanarak, vahşi tip dizisine mutant dizileri aynı hizaya getirin.
- Kopyala ve APE dosyaları içine de dizileri yapıştırın. "Araçlar" menüsünden "Align İki Diziler" aracını seçin.
- Açılır menüleri kullanarak iki DNA dizilerini belirtin.
Not: klonlanmış dizinin ters tamamlayıcı PCR klonlama vektörü içine çıktı yönüne bağlı olarak kullanılabilir gerekebilir. dizileri hizalamak yoksa, "Align DNA" kutusuna "Rev-Com" kutusunu işaretleyerek adımları tekrarlayın.
- Uygun aşamada fenotipleri ve beklenen fenotip 29 için uygun yöntemler (Örneğin, Şekil 3) kullanarak kurucu balık değerlendirin. fenotipleme yöntemleri protoc kullanılarak araştırmacı tarafından hedeflenen gen için beklenen fenotipin dayanacaktırol.
Germline İletimi için 6. Ekran
Not: A. mexicanustan 4-8 ayda cinsel olgunluğa erişirler.
- vahşi tip balık cinsel olgunluğa kurucu balık çapraz.
- Ekran embriyolar veya adımlar 5,1-5,7 yöntemleri kullanarak yetişkin balık (Şekil 4). Yetişkin balıklar için, kuyruk parçası anesthetization aşağıdaki kesilebilir.
- fin kırpma sırasında baskıyı azaltmak için tricaine (3-aminobenzoik asit etil ester) içindeki bir çözeltisi içinde balık daldırarak balık anestezisi. fin kırpma ardından, balık taze suya kurtarmak için izin verir. Balık hızla kurtarmak; onlar (normalde yüzme) iyileşene kadar gözleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TALEN çifti enjeksiyonlar (NHEJ) birleştiren homolog olmayan uç boyunca tamir edilebilir iki iplikçikli sonları 39 ile sonuçlanan, dolayısıyla Foki etki dimerizasyonunu spesifik DNA nükleotidini RVDs bağlanması ve sonuçlanır. NHEJ sık sık ekleme veya çıkarma (indeller) neden hataları tanıttı. Indeller TALEN hedef bölgesini çevreleyen bölgenin amplifiye edilmesi ve TALEN aralayıcı bölge içinde kesen bir sınırlama enzimi ile elde edilen amplikon sindirilmesi ile tespit edilebilir. Allelleri bir sınırlama enzim dayanıklı bant üreten, (Şekil 2) sindiremez olacak restriksiyon enzim hedef sırasını değiştirmek indellerin içeren sırasında bir Indel olmadan allel sindirir.
TALEN enjeksiyonları olasılıkla A. bialelik gen mutasyonları neden olabilir mexicanustan 29. Bu nedenle, bazı fenotipleri kurucu balık değerlendirilebilir. İçin örneğinde, Talens hedefleme OKA2'den, cavefish 1,28 birden albino popülasyonlarında albinism sorumlu olduğu varsayımında gen enjekte yüzey balık pigmentasyon değerlendirildi. Biz uninjected balık 29 (Şekil 3) değil mevcut OCA2 TALEN enjekte balık albino yamalar bulundu.
Birçok deney için, fenotipleri değerlendirmek için balık mutan çizgileri olması arzu edilir. Iletilen mutant allel ile Kurucu balık vahşi tip balık (Şekil 4) kurucu balık haçlar döl genotipleme tarafından tespit edilebilir.
MRNA enjekte etmek için Şekil 1. İğne. önce bir mikropipet Fotoğraf tek hücreli embriyo TALEN mRNA enjekte etmek için kullanılan kırık edilir._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
TALEN mRNA'nın farklı miktarlarda 29 enjekte edildiğinde Astyanax mexicanus içinde OKA2'den ekson 9'dan OKA2'den. 306 bp'lik PCR ürünleri için Şekil 2. TALEN verimliliği sınırlama enzimi kaybı açısından incelendi. amplikon bir kısmı TALEN embriyoların enjekte 10 havuzlarında kısıtlama sindirmek dirençli iken bir kontrol embriyo amplikon sindirildi. Enzim TALEN mRNA enjekte edilmiş embriyoların dirençli bantları restriksiyon dijest OKA2 indeller 29 ihtiva ettiği gösterilmiştir hedef almıştır. mRNA'nın artan konsantrasyonları artan TALEN verimliliği (daha fazlası sindirilmemiş DNA) sonuçları enjekte edin. "-" Ile yolları ile, şerit sindirilmemiş olan "+" Diges vardırted kısıtlama enzimi ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Pigmentasyon değişiklikleri için Şekil 3. Fenotiplendirme kurucusu balık. (A) uninjected yüzey A. Kontrol mexicanustan. (B) Yama OCA2 (ok) hedefleyen 400 pg TALEN mRNA enjekte kurucu yüzey balık melanophores eksik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
TALEN bağlı mutatio Şekil 4. tohum soyu naklindenA. OKA2'den ekson 9'dan ns. 306 bp'lik PCR ürünleri mexicanustan enjekte kurucu balık 10 F 1 balık havuzları sınırlama enzimi kaybı açısından incelendi. Amplikon bir kısmı 10 F 1 embriyo havuzlarında kısıtlama sindirmek dirençli iken bir kontrol embriyo amplikon sindirildi. Kısıtlama enzimi 1 s indellerin 29 içerdiği gösterilmiştir OCA2 F dayanıklı bantları sindiremez. Ile şerit "-" "+" sınırlama enzimi ile sindirilir ile, şerit sindirilmemiş edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Reaksiyon bir | ReactiB | |||
| miktar | reaktif | miktar | reaktif | |
| 4 ul | Su | 10 ul | Su | |
| 1 ul | pFUS_A | 1 ul | pFUS_B4 | |
| 1 ul | Bsal | 1 ul | Bsal | |
| 1 ul | BSA | 1 ul | BSA | |
| 1 ul | ligaz | 1 ul | ligaz | |
| 2 ul | 10x ligaz tamponu | 1 ul | 10x ligaz tamponu | |
| 1 ul | pNH1 | 1 ul | pNG1 | |
| 1 ul | pNH2 | 1 ul | pHD2 | |
| 1 ul | pNG3 | 1 ul | pNH3 | |
| 1 ul | pHD4 | 1 ul | pNI4 | |
| 1 ul | pHD5 | |||
| 1 ul | pHD6 | |||
| 1 ul | pNG7 | |||
| 1 ul | pHD8 | |||
| 1 ul | pNG9 | |||
| 1 ul | pHD10 | |||
Bir Tablo 1. Örnek reaksiyon montaj A ve BTALEN içeren RVDs NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.
| primer ismi | dizisi (5'-3 '), |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
34 koloni PCR Tablo 2. PCR primerleri.
| reaktif | miktar |
| Taq mastermiks, 2x | 50 ul |
| pCR8_F1 astar,10 uM | 4 ul |
| pCR8_R1 primeri, 10 uM | 4 ul |
| Nükleaz içermeyen su | 42 ul |
| Farklı bir Taq kullanılması durumunda * master karışımı ayarlama | |
Koloni için 100 ul (15 ul / reaksiyon) PCR 1 Tablo 3. Ana karışımı.
| adım | Sıcaklık (° C) | Zaman (sn) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 105 |
| 5 | 30 devir için 2. adıma gidin | |
| 6 | 72 | 300 |
Koloni PCR 1 Tablo 4. PCR programı.
| miktar | reaktif | konsantrasyon |
| 12 ul | Su | |
| 1 ul | vektör A | 100 ng / ml |
| 1 ul | B vektörü | 100 ng / ml |
| 1 ul | Hedef vektör pT3Ts-gT | 50 ng / | il |
| 1 ul | Nihai RVD (PLR-RVD) | 100 ng / ml |
| 1 ul | Esp3I | |
| 1 ul | ligaz | |
| 2 ul | 10x ligaz tamponu | |
Ikinci montaj reaksiyonları için Tablo 5. Protokolü.
| adım | Sıcaklık (° C) | Zaman (sn) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 180 |
| 5 | 30 devir için 2. adıma gidin | |
| 6 | 72 | 300 |
Tablo 6. PCR programıkoloni PCR 2.
| sıcaklık | 290 |
| Çek | 150 |
| hız | 100 |
| zaman | 150 |
| Bu parametreler, bir çukur iplik kullanarak bir Flaming / Brown Mikropipet Çektirme Model P-97 içindir | |
Program çekerek Tablo 7. Örnek iğne.
| reaktif | miktar |
| Taq mastermiks, 2x | 12.5 ul |
| gen spesifik ileri primer, 10 uM | 1. μl |
| gene spesifik ters primer, 10 uM | 1 ul |
| Nükleaz içermeyen su | 9.5 ul |
| DNA | 1 ul |
| Farklı bir Taq kullanılması durumunda * master karışımı ayarlama | |
Gen spesifik PCR için Tablo 8. Örnek protokolü.
| adım | Sıcaklık (° C) | Zaman (sn) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 56 | 30 |
| 4 | 72 | 60 |
| 5 | s git35 devir için tep 2 | |
| 6 | 72 | 300 |
| * Spesifik primerler ve PCR ürün boyutu için tavlama sıcaklığı ve uzatma süresini ayarlamak | ||
Gen spesifik PCR için Tablo 9. Örnek PCR programı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Büyük adımlar özelliklerin evrim genetik temelini anlamaya yönelik son yıllarda yapılmıştır. Özellikleri, bir dizi evrimi yatan aday gen belirlenmişse de, bunun nedeni en evrimsel ilginç türlerinin genetik tractability eksikliği, in vivo olarak, bu genlerin test etmek zor kalmıştır. Burada A. genom düzenleme için bir yöntem raporu mexicanustan, bir tür mağara hayvanların evrimi incelemek için kullandı. Genetik haritalama 1,21,23 çalışmaları ve aday gen A mağara şeklinde özelliklerin gelişimi için aday genlerin bir dizi belirledik 19,40 yaklaşımlar mexicanustan. Cavefish genomunun 41 son yayın mağara özelliklerin evrimi için aday genlerin belirlenmesi için ek güçlü bir araç sağlar. Bu aday genlerin çoğu fonksiyon testi gen ifadesini azaltmak için teknikler gerektirir. Çalışma için tek geçerli seçenekA. indirgenmiş gen ekspresyonunu ing mexicanustan morpholinos kullanımıdır. Ancak, morfolino gen demonte bir kaç gün sonra döllenme ile sınırlı, geçici ve böyle 17, hiperfaji 19 ve titreşim cazibe davranışı 42 okullaşma gibi yetişkin mağara ve yüzey balıkları arasındaki davranış farklılıkları gibi yetişkin hayvanlarda özellikleri incelemek için kullanışlı değildir. Bu Talens kullanılarak yapılabilir olduğu gibi genlerin işlevini allel kaybı üretilmesi, bu özelliklerin aday genlerin rolü test etmek için önemli olacaktır.
Yöntem TALEN çifti 33 arasında kolay montaj ve bu yöntem için ayrıntılı bir protokol geliştirilmiştir 34 mevcuttur. Bu protokol, farklı bir nihai hedef vektörü kullanılarak, bedelli ve ark. 7 tarafından Zebra balığı kullanım için optimize edilmiş, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-gT). Bu vektör, tek hücreli zebra balığı embriyolara enjeksiyonu için TALEN mRNA'nın transkripsiyonuna imkan verir.Biz montajı ve A. içine enjeksiyon için Talens uyarlamak için, burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır, bu değiştirilmiş montaj yöntemi kullandık mexicanustan. Biz bulduğu tek hücreli yüzey A. enjekte edildiğinde mexicanustan embriyolar, bu protokol kapsamında açıklandığı gibi, biz A. mutasyona olabilir mexicanustan genler 29. Bu protokol açıklanmayan aday genler üzerinde gelecekteki araştırmalar için, diziler cavefish genom 41 bulunan ve TALEN hedef siteleri belirlemek için kullanılabilir.
Başarılı enjeksiyonlar için kritik kaliteli TALEN mRNA olduğunu. Bu nedenle, enjeksiyondan önce bir jel üzerinde RNA az miktarda çalıştırarak RNA kalitesinin kontrol önemlidir (adım 3.6) 'dir. Böyle donma thaws (3.7 Adım) önlemek için alikotları dondurma ve enjeksiyonlar (Adım 4) sırasında temiz su ve RNAse ücretsiz tüpler ve ipuçlarını kullanarak steril koşulları sürdürmek olarak muhafaza RNA bütünlüğü için diğer önlemler, önlemler alınmalıdır. yükselterek enjekte balık için ek bir kritik adımÖlü embriyolar hızla su kalitesini etkileyebilir olarak, enjeksiyonu takiben ölü embriyolar dışarı temizlik. Böylece, enjeksiyonları ertesi sabah ölü embriyolar kaldırmak ve periyodik önümüzdeki birkaç gün için sağlıklı canlı embriyolar (Adım 4.3.6) korumak için enjeksiyonları takiben.
Astyanax mexicanus içinde TALEN mutagenez yüksek verimli olabilir; Ancak, verimlilik TALEN çifti bağlı olarak 29 enjekte değişir. Artan mRNA konsantrasyonları artmış toksisite ve deformite ve enjekte edilen embriyoların ölümüne yol açabilir. Bu nedenle, randıman karşı toksisiteyi test edilmiş ve enjekte mRNA optimal konsantrasyonunu belirlemek için dengelenmelidir. yüksek verimli TALEN çiftleri için, fenotipleri enjekte kurucu balık değerlendirilebilir. Örneğin, TALENS hedefleme OKA2'den enjeksiyon yüzeyi balık 29 albino yamalar (Şekil 3) ile sonuçlandı. diğer özellikler ya da genler için, ancak, kurucu balık fenotip değerlendirilmesi nedeniyle zor olabilirkurnazca fenotip veya enjekte TALEN çiftinin düşük verimlilik için. Bu nedenle, bir çok uygulama için bir non-mozaik hayvanda bir aday genin rolünün analiz için ilgi konusu bir gen tohum çizgisi mutasyon üretmek için arzu edilir. A. TALEN kaynaklı mutasyon elde tohum çizgisi iletim mexicanustan 29 (Şekil 4) mümkündür. Bu nedenle, bu teknik, diğer aday genleri değerlendirmek için uygulanabilir.
Astyanax mexicanus genetik manipülasyonlar gerçekleştirmeden birkaç sınırlamalar şu anda mevcuttur. Yüzey ve gece geç karanlıkta cavefish cins. o yumurtlama hemen sonra enjekte kritik olduğu gibi hafif koyu döngüsü tersine çevirmek mümkün değildir laboratuvarda araştırmacılar, enjeksiyon gerçekleştirmek için gece geç saatlerde gelmelidir. Işık yumurtlama etkileyecek Buna ek olarak, karanlıkta yüzey balığı embriyolar toplamak için önemlidir.
özelde diğer teknikler,(43 gözden) CRISPR / Cas sistemini lar, genom düzenleme için mevcut ve muhtemel A'ya geçerli olacak mexicanustan. Gerçekten de, kılavuz RNA montaj için protokoller ve hızlı 44 kolay olduğu ana kadar ve protokol CRISPR / Cas enjeksiyon için değiştirilebilir Burada bildirilen. Ayrıca, genom düzenleme için yeni uygulamalar hızla geliştirilmektedir ve bunların birçoğu A için yararlı olabilir mexicanustan araştırmacılar. Örneğin, zebra balığı hassas mutasyon mutasyona 7 ihtiva eden bir tek şeritli oligo TALENS coinjecting ilgilenilen bir gen ile yapılmıştır. Bu teknik cavefish ve yüzey balıkları 19 arasında gözlenen metabolizma farklılıklar MC4R belli mağara allel bir missense mutasyon rolü mağara fenotipleri, üreten mağara alel rolünü değerlendirmek için yararlı olabilir. Talens, flüoresan işaretçileri, tarif homolog rekombinasyon yoluyla genlerin alelleri oluşturmak için kullanılmıştırendojen loci 45 benzer n desenleri. Bu yöntemler, A. kullanılabilecek mexicanustan hücreler ya da aday genlerin sentezlenmesi alt kümelerini değerlendirmek. CRISPR / Cas sistem doku spesifik gen nakavt 46 elde etmek için Zebra balığı kullanılmıştır. A. uygulanan Bu teknikler, mexicanustan gibi cavefish göz kaybı gibi işlemler genetik temeli değerlendirmek için yararlı olabilir. Lens cavefish 47 göz kaybı sürecinde kritik bir rol oynamaktadır ve dokuya özgü CRISPR / Cas sistemi özellikle gözün diğer dokularda karşı lens göz kaybı için aday genlerin rolü değerlendirmek için kullanılabilir. Bu ve diğer genom düzenleme teknikleri A'da kullanılabilir Gelecekteki çalışmalarda mexicanustan mağara özelliklerin evrim hakkında kritik sorulara cevap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Genetik, Kalkınma ve Hücre Biyolojisi ve Iowa State Üniversitesi Bölümü tarafından ve NIH hibe EY024941 (WJ) .Dr tarafından finanse edildi. Jeffrey Essner el yazması üzerine yorum sağladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
References
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
- Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
- Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
- Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Gross, J. B.
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
- Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
- Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
- Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
- Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326 (2009).
- Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108 (2012).
- Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
- Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
- Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823 (2013).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
- Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82 (2011).
- Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
- Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
- Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
- Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647 (2014).
- McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).
