Summary
-Gen-targeting mutagenese is nu mogelijk in een breed scala van organismen, waarbij genoom montagetechnieken. Hier tonen we een protocol voor gerichte gen mutagenese met behulp van transcriptie-activator, zoals effector nucleasen (Talens) in Astyanax mexicanus, een soort vis dat oppervlak vis en cavefish omvat.
Introduction
Inzicht in de genetische basis van trait evolutie een kritisch onderzoek doel van evolutionair biologen. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het identificeren loci grondslag liggen aan de evolutie van de eigenschappen en het opsporen van kandidaat-genen binnen deze loci (bijvoorbeeld 1-3). Echter functioneel testen van de rol van deze genen is gebleven uitdagend veel organismen gebruikt voor het bestuderen van de ontwikkeling van eigenschappen momenteel niet genetisch handelbaar. De komst van het genoom editing technologieën is sterk toegenomen genetische maakbaarheid van een breed scala van organismen. Transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) en geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom repeats (CRISPRs) gebruikt om gerichte mutaties in genen genereren verschillende organismen (bijvoorbeeld 4-11). Deze tools, toegepast op een evolutionair relevante systeem, hebben het potentieel om een revolutie in de manier waarop evolutionair biologen onderzoek naar de genetische basis van de evolutie.
Astyanax mexicanus is een vissoort die in twee vormen bestaat:. A-river woning oppervlak vorm (oppervlak vis) en multiple-grotwoning formulieren (cavefish) A. mexicanus cavefish ontstaan uit het oppervlak vis voorouders (besproken in 12). Populaties van cavefish hebben een aantal eigenschappen, waaronder het verlies van de ogen, te verminderen of verlies van pigmentatie geëvolueerd, verhoogde aantallen smaakpapillen en craniale neuromasts, en veranderingen in het gedrag, zoals het verlies van het onderwijs gedrag, toegenomen agressie, veranderingen in het voeden van houding en hyperfagie 13 -19. Cavefish en oppervlakte vissen zijn interfertile, en genetische mapping experimenten zijn uitgevoerd om loci en kandidaat-genen te identificeren voor grot trekken 1,20-26. Kandidaatgenen zijn getest voor een functionele rol bij hol eigenschappen in celkweek 1,19, in modelorganismen andere soorten 21 of 27 overexpressie of transiënte knockdown uzingen morpholinos 28 in A. mexicanus. Echter, elk van deze methoden heeft beperkingen. Het vermogen om gemuteerde allelen van deze genen in A. genereren mexicanus is essentieel voor het begrijpen van de functie in de evolutie van cavefish. Aldus A. mexicanus is een ideale kandidaat organisme voor de toepassing van genoom editing technologieën.
Hier schetsen we een methode voor het genoom bewerking in A. mexicanus gebruik TALENS. Deze methode kan worden gebruikt om mozaïek geïnjecteerde grondlegger vis evalueren fenotypes en voor het isoleren van leidingen vis met stabiele mutaties in genen van belang 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures waren in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Iowa State University en de Universiteit van Maryland.
1. TALEN Ontwerp
- Input gewenste doelsequentie naar een TALEN ontwerp website. (Bijvoorbeeld: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Input gekozen spacer / herhalen reeks lengtes.
- Kopieer de genoomsequentie in het vak "Sequence".
- Binnen het tabblad 'Zorg voor Custom Spacer / RVD Lengths "selecteert u de lengte van de tussengroep en de vele lengte.
Opmerking: Spacer lengte van 15 basenparen en herhaal scala lengtes van 15-17 werk goed en maakt de montage minder complex.
- Selecteer een TALEN paar. TALEN paren rond een unieke restrictie-enzym plaats zorgen voor genotypering door restrictie-enzym digestieeen PCR product.
- Ontwerp primers aan de genomische regio rond de TALEN beoogde plaats met behulp van een website, zoals Primer3 30-32 versterken. Wanneer genotyperen met een restrictie-enzym, ontwerp primers voor een gebied dat de restrictie enzymplaats eenmalig bevat amplificeren. Aanbevolen wordt deze regio geamplificeerd en gesequenced voorafgaand aan TALEN constructie één polymorfismen in de A. identificeren mexicanus lab bevolking worden gebruikt voor micro-injectie.
2. TALEN Assembly (Gewijzigd van de TALEN Kit Protocol) 33,34
Voor meer informatie en het oplossen van problemen, zie het protocol 34.
- Bereiden en sequentie noodzakelijke plasmiden uit de TALEN kit volgens instructies van de fabrikant.
- Stel de # 1 reacties voor reacties A en B. opnemen herhaalde variabele diresidues (RVDS) 1-10 en de bestemming vector pFUS_A in reactieschema A. opnemen RVDS 11- (N-1) en ee bestemmingsvector pFUS_B (N-1) in reactieschema B waarbij N het totale aantal RVDS in TALEN.
- Naar elke reactie: 1 pi van elk plasmide dat elke RVD (100 ng / gl), de bestemming vector (100 ng / ul), 1 ui Bsa I restrictie-enzym, 1 ul runderserumalbumine (BSA) (2 mg / ml ), 1 ui ligase, 2 ui 10X ligasebuffer en x gl water voor een totaal volume van 20 pl. Bijvoorbeeld, zie tabel 1.
Opmerking: Half reacties kunnen ook worden gebruikt. - Plaats reacties in een thermocycler en start de cyclus: 10 keer (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min.
- Naar elke reactie: 1 pi van elk plasmide dat elke RVD (100 ng / gl), de bestemming vector (100 ng / ul), 1 ui Bsa I restrictie-enzym, 1 ul runderserumalbumine (BSA) (2 mg / ml ), 1 ui ligase, 2 ui 10X ligasebuffer en x gl water voor een totaal volume van 20 pl. Bijvoorbeeld, zie tabel 1.
- Incubeer de reacties met nuclease. Om elke reactie voeg 1 pl 25 mM ATP en 1 pi nuclease. Incubeer reacties bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Transform reacties.
- Transformatie 2,5 pi van elke reactie in 25 gl chemisch competente cellen.
Opmerking: Homemade bevoegde cells kan worden gebruikt. Echter kunnen cellen met lage competentie resulteren in een gebrek aan kolonies.- Meng 2,5 ul van de reactie met 25 ul van chemisch competente cellen. Incubeer op ijs gedurende vijf minuten. Incubeer de cellen gedurende 30 seconden bij 42 ° C.
- Plaats de buizen op ijs gedurende 2 minuten. Voeg 125 ul van Super Optimal bouillon met katabolische repressie (SOC). Schud de buizen bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Plaat 100 ul van de getransformeerde cellen op LB-platen met spectinomycine (50 ug / ml), X-gal en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Grow O / N bij 37 ° C.
- Transformatie 2,5 pi van elke reactie in 25 gl chemisch competente cellen.
- Pick 2-3 witte kolonies voor elke reactie en controleren door kolonie PCR met behulp van primers pCR8_F1 en pCR8_R1 (tabel 2).
- Maak een master mix van de reagentia. Bijvoorbeeld, zie tabel 3.
- Kies een kolonie en smeer het in de bodem van een PCR-buis, en zet dan de overblijfselen van de kolonie in 2 ml LB met spectinomycine(50 ug / ml). Plaats 15 ul van de master mix in de buis met de kolonie.
- Voer het volgende PCR-programma (Tabel 4)
- Controleer de PCR (run het hele volume) op een 1,5% agarosegel door elektroforese. De juiste klonen zal een band bij de verwachtte grootte en een uitstrijkje en een ladder van bands. Voor een voorbeeld van de juiste uitstrijkje, zie 34,33.
- Kweek 2 ml kweken van de juiste klonen in LB media O / N bij 37 ° C in een schudincubator.
- Miniprep de plasmiden volgens de instructies van de fabrikant.
- Sequentie TALEN sequentie te controleren met pCR8_F1 en pCR8_R1. Volg de eerder beschreven methoden 35.
- Met de juiste klonen geverifieerd door sequentiebepaling, het opzetten van de reactie # 2 (TALEN kit), die de RVDS van de A- en B-vectoren en de uiteindelijke RVD plaatst in de bestemming vector.
- Bereiden mix voor reactie 2 (Tabel 5).
Opmerking: HaAls reacties kunnen worden gebruikt. - Leg de reacties in een thermocycler en voer het volgende programma: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min.
- Bereiden mix voor reactie 2 (Tabel 5).
- Transform reacties.
- Transformatie 2,5 pi van elke reactie in 25 gl chemisch competente cellen.
- Meng 2,5 ul van de reactie met 25 ul van chemisch competente cellen. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Heat shock de cellen gedurende 30 seconden bij 42 ° C.
- Plaats de buizen op ijs. Voeg 125 gl SOC. Plaats de buizen in een schudincubator bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Plaat 100 ul van de getransformeerde cellen op LB-platen met ampicilline (100 ug / ml), X-gal en IPTG. Grow O / N bij 37 ° C
- Transformatie 2,5 pi van elke reactie in 25 gl chemisch competente cellen.
- Pick 1-3 witte kolonies voor elke reactie en controleren door kolonie PCR met behulp van primers TAL_F1 en TAL_R2 (tabel 2).
- Voeg een oplossing van de polymerase mastermix, water en primers zoalsin tabel 3 beschreven. Kies een kolonie en smeer deze in de bodem van een PCR-buis, en vervolgens de restanten van de kolonie in 2 ml LB met ampicilline (100 ug / ml). Plaats 15 gl van de oplossing in de buis met de kolonie.
- Voer het PCR-programma (Tabel 6).
- Controleer de PCR op een 1,5% agarosegel door elektroforese. De juiste klonen een versmeringsfilter en een ladder van bands. Voor een voorbeeld van de juiste uitstrijkje, zie 34,33.
- Kweek 2 ml kweken van de juiste klonen in LB media O / N bij 37 ° C in een schudincubator.
- Miniprep de plasmiden volgens de instructies van de fabrikant.
- Sequentie TALEN sequentie te controleren met TAL_F1 en TAL_R2 volgende eerder beschreven werkwijzen 35.
3. mRNA transcriptie van Talens
- Digest 4 ug-sequentie geverifieerd sjabloon met 2 pi SacI gedurende 2 uur bij 37 ° C. Run 2 ui van het SacI gedigereerde plasmide op een 1,5% agarosegel door elektroforese. Plasmiden die correct worden verteerd zal een enkele band weer te geven.
- Zuiver het resterende SacI gedigereerde plasmide na het PCR zuivering kit protocol. Was tweemaal met de wasoplossing vóór elutie. Elueren in 30 ul nuclease-vrij water.
- Volg het standaardprotocol voor T3 mRNA-productie.
- Opzetten half reacties onder gebruikmaking van 0,5 ug gelineariseerd template (hierboven bereide). Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Voeg 0,5 gl DNase (inbegrepen in kit) en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Zuiver het mRNA, volgens de instructies van de fabrikant. Elueren in 30 ul nuclease-vrij water.
- Voer een 1,5% agarosegel door elektroforese aan het mRNA controleren.
- Maak de gel apparaat met een product om RNase verontreiniging weg te werken en voor te bereiden een 1,2% gel.
- Meng 1 pl mRNA + 4 &# 181; l nuclease-vrij water + 5 ui glyoxyl laden kleurstof. Incubeer monsters bij 50 ° C gedurende 30 minuten. Centrifuge de buizen kort en leg ze op het ijs voordat u de gel.
- Controleer de concentratie onder toepassing van een werkwijze voor het kwantificeren van nucleïnezuur concentraties en bewaar het RNA in monsters bij -80 ° C. Kies een portie grootte zodanig dat RNA niet is bevroren / meer dan een keer ontdooid.
Let op: Concentraties van 500-1.000 ng / nl zijn meestal verkregen. RNA met een lagere concentratie kan worden gebruikt zolang RNA behouden blijft (zoals beoordeeld door een band in plaats van een vlek op de gel).
4. Injecteer Astyanax mexicanus Embryo's met TALEN mRNA
- Bereid Tools for Injection.
- Pour injectie platen door uitgieten 1,2% agarose in viswater (water geconditioneerd met natriumbicarbonaat en zeezout op pH 7,4 en geleidbaarheid 700 uS) in een petrischaal. Plaats een mal (plastic stuk met projecties putten voor vissen makeneieren) in de schotel. Verwijder de mal als de agarose uitharden en bewaar bij 4 ° C. Voor meer informatie over de mal te zien 36.
- Pull naalden voor injectie met een naald trekker volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: Geschikte naaldlengte belangrijk voor injecties. Naalden die te lang zijn zullen ook flexibel voor injecties. Het protocol voor het trekken naalden zal variëren met de gebruikte naalden trekken materiaal. Een voorbeeld van een geschikte naald wordt getoond in figuur 1. Voor onze apparatuur, we trekken naalden die 5-6 cm lang en hebben een buitendiameter aan het uiteinde van ongeveer 0,011 mm of gebroken. Er moet echter worden gekalibreerd naalden (stap 4.3.4) om openingsbreedte bepalen. Voorbeeld programma voor het trekken naalden zijn te vinden in tabel 7. - Bereid glazen pipetten voor embryotransplantatie door het breken van de pipet zodat de opening is groot genoeg om een ei te passeren. Vlam het gebroken einde totdatHet is niet meer scherp.
Opmerking: Het is belangrijk glas pipetten en glaskommen wanneer gewerkt met A. mexicanus eieren en embryo's als ze zijn plakkerig en zal zich houden aan plastic.
- Verzamel 1-cel Stage Eieren.
- Breed A. mexicanus volgende standaard protocollen 37.
Let op: Als er bijvoorbeeld vissen op een 14 licht worden gehouden: 10 donker-cyclus en het gebruik van Zeitgerber tijd (ZT) met Zt0 als lichten aan en ZT14 als lichten uit, onze oppervlakte vissen paaien tussen ZT15 en ZT19. Exact paaitijd moet worden bepaald voor elke individuele lab. - Induceren paaien door overvoeding vis voor 3-4 dagen voorafgaand aan de paring en het vissen in zoet water. Verhoog de temperatuur 2 ° C. Let op: Onze eerste temperatuur van het water is ongeveer 74 ° C.
- Verzamel oppervlak vis eieren in het donker, het controleren van elke 15 minuten naar eieren op de 1-cel stadium te verkrijgen. Honderden eieren kunnen worden verkregen uit een enkel paar oppervlak vis.
- Verzameleneieren in glazen schalen te voorkomen vasthouden aan kunststof oppervlakken en sorteren om embryo's in het 1 cellig stadium isoleren vóór injectie door het observeren eieren onder de microscoop en het verzamelen van eieren die een enkele cel. Bewaar eieren in zoet water systeem (tank water waarin volwassen vissen worden gehuisvest, dat is behandeld voor pH en geleidbaarheid).
- Breed A. mexicanus volgende standaard protocollen 37.
- Injecteren TALEN mRNA.
- Injecteer verschillende hoeveelheden totaal mRNA (gelijke hoeveelheden van elke TALEN in het paar) om de optimale concentratie te bepalen voor injectie als toxiciteit en doeltreffendheid verschillen per TALEN paar. Start door het injecteren concentraties van totaal mRNA die 400-800 pg. Verdunnen en combineren mRNA tot gewenste concentraties voor het injecteren van 1,5 nl.
- Load verdund mRNA in de achterkant van de naald en bevestig de naald op een micro-injector.
- Breek de naald met behulp van een tang.
- Kalibreren van de naald. Bijvoorbeeld, uit te werpen 10 keer en het verzamelen van de daaruit voortvloeiende daling van een micro capillair. Voor 10 x 100 wegwerp 1.081, l, 32 mm micro capillair, moet de daling van de micro capillair te vullen tot 0,5 mm 1,5 nl / 1 injectie. Stel de injectietijd en druk nodig.
- Steek de naald in de cel en injecteer het mRNA. Injecteer het mRNA direct in de cel, niet in de dooier.
- Verzamel geïnjecteerde embryo's in glazen kommen. Houd embryo bij 23-25 ° C. Het verwijderen van dode embryo's (embryo's die bewolkt en onregelmatig gevormde worden) regelmatig voor de eerste paar dagen na de injectie. Record aantal doden en misvormde embryo's uit controle (uninjected) en geïnjecteerd platen.
Let op: verhoogde mRNA concentratie kan leiden tot verhoogde toxiciteit en misvorming / overlijden van embryo's. Zo mag toxiciteit versus efficiëntie worden gebalanceerd om de beste concentratie van mRNA vast te injecteren.
5. Fenotype Oprichter Fish and Evalueer TALEN Efficiency
- Offer embryo's volgens de institutionele dier protocol.
Let op: We euthanaserenembryo's snel afgekoeld op ijs. - Verzamel embryo's in 0,8 pi PCR-strip buizen met behulp van een overdracht pipet.
Opmerking: Genotypering kan worden uitgevoerd op individuele embryo's of pools van embryo. - Extract DNA.
- Plaats embryo's in 100 ui 50 mM natriumhydroxide (NaOH) en incubeer bij 95 ° C gedurende 30 min, daarna afkoelen tot 4 ° C.
- Voeg 1/10 volume (10 pl) van 1 M Tris-HCl pH 8.
- Voer een PCR op het gebied met de primers van stap 1,3 (zie de tabellen 8 en 9 voor voorbeeldprotocollen). Voor individuele embryo 1 pl DNA is voldoende voor de PCR-reactie.
- Digest het verkregen PCR-product met het geschikte restrictie-enzym en uitvoeren van een 1,5% agarosegel door elektroforese.
- Bijvoorbeeld, voor de genotypering oculocutaan albinisme 2 (OCA2) locus geïnjecteerde embryo verteren het PCR product met de restrictie-enzym Bsr I door toevoeging 00,5 ui Bsr I direct naar 12,5 ui van de PCR-reactie voltooide, incuberen bij 65 ° C gedurende 2 uur. Voer de onverteerde en verteerde product op een gel. Restrictie-enzym resistent banden (dwz groepen die niet verteren) geven aan dat TALEN geïnduceerde mutaties aanwezig (figuur 2).
- (Optioneel) Bereken percentage mutatie snelheid door het bepalen van het percentage van de ongesneden product door het analyseren van beelden van de gels in Fiji 38 gebruik van de gel analyse-instrument om de intensiteit waarde van elke band te berekenen, zoals eerder 29 beschreven.
- Bepaal de volgorde van mutante allelen door TA klonering de gel gezuiverd restrictie-enzym resistent mutant band en sequencing klonen.
- Gel zuiveren het restrictie-enzym resistent mutant band volgens de instructies van de fabrikant. TA kloon de band volgens de instructies van de fabrikant. Pick kolonies en groeien in 1,5 ml LB O / N bij 37 ° C in een schuddendincubator.
- Miniprep culturen de instructies van de fabrikant. Stuur het DNA voor sequentiebepaling.
- Een programma zoals aap, lijn de mutante sequenties van de wildtype sequentie.
- Kopieer en plak beide sequenties in APE. Kies de "Align twee sequenties" tool uit het menu "Extra".
- Geef de twee DNA-sequenties met behulp van de dropdown menu's.
Opmerking: De omgekeerde complement van de gekloneerde sequentie moet worden gebruikt afhankelijk van de richting waarin de PCR ging in de kloneringsvector. Als de sequenties niet af te stemmen, herhaalt u stap het vakje "Rev-Com" in het vak "Align DNA".
- Evalueer oprichter vis voor fenotypes op de juiste fase en het gebruik van passende methoden voor het verwachte fenotype 29 (bijvoorbeeld figuur 3). Werkwijzen voor fenotypering wordt gebaseerd op het verwachte fenotype voor het gen doelwit van de onderzoeker die het protocol.
6. scherm voor kiembaantransmissie
Opmerking: A. mexicanus geslachtsrijp bij 4-8 maanden.
- Steek seksueel volwassen oprichter vis tot wild type vis.
- Scherm embryo's en volwassen vis met werkwijzen stappen 5,1-5,7 (figuur 4). Voor volwassen vissen, kan een stukje van de staart worden geknipt na verdoving.
- Verdoven vis vissen door onderdompeling in een oplossing van tricaïne (3-aminobenzoëzuur ethylester) om stress te verminderen tijdens fin knippen. Na fin knippen, laat vis te herstellen in zoet water. Vis terug te snel; observeren totdat ze hersteld zijn (worden normaal zwemmen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TALEN paar injecties leiden tot binding van de RVDS specifieke DNA nucleotiden en daardoor dimerisatie van FokI domeinen, waardoor dubbelstrengs breuken 39 die kan worden gerepareerd door niet-homologe end-joining (NHEJ). NHEJ introduceert vaak fouten die leiden tot toevoegingen of weglatingen (indels). INDELs kunnen worden geïdentificeerd door het amplificeren van het gebied rondom de TALEN doelplaats en het digereren van het verkregen amplicon met een restrictie enzym dat knipt bij de TALEN spacergebied. Allelen zonder indel zal verteren terwijl allelen bevatten indels dat het restrictie-enzym doelsequentie veranderen zal verteren, produceren van een restrictie-enzym bestendige band (figuur 2).
TALEN injecties kan waarschijnlijk resulteren in biallele genmutaties in A. mexicanus 29. Zo kunnen sommige fenotypes in stichter vis worden beoordeeld. Voor Zo evalueerden we pigmentatie in het oppervlaktewater vissen geïnjecteerd met Talens targeting OCA2, het gen dat verantwoordelijk is voor de hypothese albinisme in meerdere albino populaties van cavefish 1,28 te zijn. We vonden albino vlekken in OCA2 TALEN-geïnjecteerde vis niet in niet-geïnjecteerde vis 29 (figuur 3).
Voor veel experimenten, is het wenselijk om mutante lijnen van vis gaan fenotypen. Oprichter vis met overdraagbare mutante allelen kunnen worden geïdentificeerd door genotypering van de nakomelingen van kruisingen van de stichter van vis tot wild type vis (figuur 4).
Figuur 1. Naald voor het injecteren mRNA. Foto van een micropipet alvorens te worden gebroken voor het injecteren TALEN mRNA in eencellige embryo._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. TALEN efficiency voor OCA2. 306 bp PCR-producten van exon 9 van OCA2 in Astyanax mexicanus werden onderzocht voor het verlies van het restrictie-enzym site wanneer verschillende hoeveelheden TALEN mRNA werden geïnjecteerd 29. Het amplicon van controle embryo werd gedigereerd terwijl een gedeelte van het amplicon was resistent tegen restrictiedigestie in de pools van 10 TALEN geïnjecteerde embryo. Restrictie-enzym digest resistente bands embryo geïnjecteerd met mRNA TALEN gerichte OCA2 Aangetoond is indels 29 bevatten. Merk op dat toenemende concentraties van mRNA geïnjecteerd resulteert in verhoogde TALEN rendement (meer onverteerd DNA). Lanes met "-" worden onverteerd, stegen met "+" zijn Digested met restrictie-enzym. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Fenotypering oprichter vis voor veranderingen in de pigmentatie. (A) De controle-geïnjecteerde oppervlak A. mexicanus. (B) Patch ontbreekt melanoforen in een van de oprichters oppervlak vis geïnjecteerd met 400 pg TALEN mRNA targeting OCA2 (pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. kiembaantransmissie van TALEN geïnduceerde mutations. 306 bp PCR-producten van exon 9 van OCA2 in A. mexicanus werden onderzocht voor het verlies van het restrictie-enzym site in pools van 10 F 1 vis uit een geïnjecteerde oprichter vis. Het amplicon van controle embryo werd gedigereerd terwijl een gedeelte van het amplicon was resistent tegen restrictiedigestie in de pools van 10 F 1 embryo. Restrictie-enzym digest resistente bands OCA2 F 1 dit is aangetoond indels 29 bevatten. Lanes met "-" worden onverteerd, stegen met "+" worden verteerd met restrictie-enzym. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| reactie A | Reactiover B | |||
| bedrag | reagens | bedrag | reagens | |
| 4 gl | water | 10 gl | water | |
| 1 pi | pFUS_A | 1 pi | pFUS_B4 | |
| 1 pi | BsaI | 1 pi | BsaI | |
| 1 pi | BSA | 1 pi | BSA | |
| 1 pi | ligase | 1 pi | ligase | |
| 2 gl | 10x ligasebuffer | 1 pi | 10x ligasebuffer | |
| 1 pi | pNH1 | 1 pi | pNG1 | |
| 1 pi | pNH2 | 1 pi | PHD2 | |
| 1 pi | pNG3 | 1 pi | pNH3 | |
| 1 pi | pHD4 | 1 pi | pNI4 | |
| 1 pi | pHD5 | |||
| 1 pi | PHD6 | |||
| 1 pi | pNG7 | |||
| 1 pi | pHD8 | |||
| 1 pi | pNG9 | |||
| 1 pi | pHD10 | |||
Tabel 1. Voorbeeld reactiemengsel samenstel A en B voor eenTALEN met RVDS NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.
| primer naam | sequentie (5'-3 ') |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
Tabel 2. PCR primers voor PCR kolonie uit 34.
| reagens | bedrag |
| Taq mastermix, 2x | 50 gl |
| pCR8_F1 primer,10 uM | 4 gl |
| pCR8_R1 primer, 10 uM | 4 gl |
| Nuclease-vrij water | 42 ul |
| * Stel meester mix als een andere Taq wordt gebruikt | |
Tabel 3. master mix voor 100 pl (15 ul / reactie) gedurende 1 kolonie PCR.
| stap | temperatuur (° C) | (sec) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 105 |
| 5 | Ga naar stap 2 voor 30 cycli | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabel 4. PCR programma kolonie PCR 1.
| bedrag | reagens | concentratie |
| 12 ul | water | |
| 1 pi | vector A | 100 ng / gl |
| 1 pi | vector B | 100 ng / gl |
| 1 pi | bestemming vector pT3Ts GT | 50 ng / gl |
| 1 pi | final RVD (PLR-RVD) | 100 ng / gl |
| 1 pi | Esp3I | |
| 1 pi | ligase | |
| 2 gl | 10x ligasebuffer | |
Tabel 5. Protocol voor de tweede assemblage reacties.
| stap | temperatuur (° C) | (sec) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 180 |
| 5 | Ga naar stap 2 voor 30 cycli | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabel 6. PCR-programmavan kolonie PCR 2.
| warmte | 290 |
| Trekken | 150 |
| snelheid | 100 |
| tijd | 150 |
| Deze parameters zijn voor een Flaming / Brown Micropipet Puller Model P-97 met behulp van een trog filament | |
Tabel 7. Voorbeeld naald trekken programma.
| reagens | bedrag |
| Taq mastermix, 2x | 12,5 pl |
| genspecifieke forward primer, 10 uM | 1 μl |
| genspecifieke reverse primer, 10 uM | 1 pi |
| Nuclease-vrij water | 9,5 pl |
| DNA | 1 pi |
| * Stel meester mix als een andere Taq wordt gebruikt | |
Tabel 8. Voorbeeld protocol voor gen-specifieke PCR.
| stap | temperatuur (° C) | (sec) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 56 | 30 |
| 4 | 72 | 60 |
| 5 | Ga naar Stap 2 voor 35 cycli | |
| 6 | 72 | 300 |
| * Aanpassen annealing temperatuur en verlenging tijd voor specifieke primers en PCR-product grootte | ||
Tabel 9. Voorbeeld PCR programma genspecifieke PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grote vooruitgang is geboekt in de afgelopen jaren naar het begrijpen van de genetische basis van de evolutie van eigenschappen. Terwijl kandidaat genen voor de ontwikkeling van een aantal eigenschappen is geïdentificeerd, is het een uitdaging om deze genen in vivo testen gebleven door het gebrek aan volgzaamheid van genetische evolutionair meest interessante soorten. Hier melden wij een methode voor het genoom bewerking in A. mexicanus, een soort die wordt gebruikt om de evolutie van de grot dieren te bestuderen. Genetische mapping bestudeert 1,21,23 en kandidaat-gen benadert 19,40 een aantal kandidaat-genen geïdentificeerd voor de evolutie van kenmerken in de grot vorm van A. mexicanus. De recente publicatie van de cavefish genoom 41 geeft een extra krachtig hulpmiddel voor de identificatie van kandidaatgenen voor de evolutie van de grot trekken. de functie van veel van deze kandidaatgenen testen vereist technieken om genexpressie te verminderen. De enige huidige optie voor studieing verlaagde genexpressie in A. mexicanus is door het gebruik van morpholinos. Echter, morfolino-gen knock-down is van voorbijgaande aard, beperkt tot een paar dagen na de bevruchting, en is niet nuttig voor het bestuderen van eigenschappen bij volwassen dieren, zoals gedragsverschillen tussen volwassen grot en oppervlakte vissen zoals scholing 17, hyperfagie 19 en trillingen aantrekkingskracht gedrag 42. Genereren van functieverlies allelen van genen, zoals die kunnen worden gemaakt met Talens, zal cruciaal voor het testen van de rol van kandidaatgenen voor deze eigenschappen zijn.
Methoden ontwikkeld voor eenvoudige montage van TALEN paren 33 en gedetailleerd protocol voor deze methode 34 beschikbaar. Dit protocol werd geoptimaliseerd voor zebravis gebruik door Bedell et al. 7, met behulp van een andere eindbestemming vector, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-BT). Deze vector maakt transcriptie van mRNA TALEN voor injectie in eencellige zebravisembryo's.We hebben deze gewijzigde assemblage gebruikte methode, hier gedetailleerd uitgelegd, te monteren en te transcriberen Talens voor injectie in A. mexicanus. We vonden dat wanneer geïnjecteerd in eencellige oppervlak A. mexicanus embryo's, zoals beschreven in dit protocol, we konden A. muteren mexicanus genen 29. Voor toekomstig onderzoek naar kandidaatgenen niet beschreven in dit protocol kunnen sequenties worden gevonden in het genoom cavefish 41 en gebruikt TALEN doelplaatsen identificeren.
Van cruciaal belang voor een succesvolle injecties is van hoge kwaliteit TALEN mRNA. Aldus controle voor RNA-kwaliteit door het uitvoeren van een kleine hoeveelheid RNA op een gel voor de injectie van belang (stap 3,6). Andere voorzorgsmaatregelen voor het behoud van RNA integriteit, zoals het bevriezen van monsters te bevriezen ontdooien (stap 3.7) te vermijden, en handhaven van steriele omstandigheden met behulp van schoon water en RNAse-vrij buizen en tips tijdens injecties (stap 4), moeten worden genomen. Een extra cruciale stap naar het verhogen van geïnjecteerde vis ishet opruimen van dode embryo's na de injectie, zoals dode embryo's snel kan invloed hebben op de waterkwaliteit. Zo hebben we het verwijderen van dode embryo's de ochtend na de injecties, en periodiek voor de komende paar dagen na de injecties om gezonde live-embryo's (stap 4.3.6) te handhaven.
TALEN mutagenese in Astyanax mexicanus kan zeer efficiënt zijn; echter efficiency afhankelijk van de geïnjecteerde 29 TALEN paar. Verhoogde mRNA-concentraties leiden tot verhoogde toxiciteit en misvorming en dood van geïnjecteerde embryo. Zo mag toxiciteit versus efficiëntie worden getest en evenwicht de optimale concentratie van mRNA vast te injecteren. Voor zeer efficiënte TALEN paren, kunnen fenotypes bij geïnjecteerd oprichter vis worden beoordeeld. Bijvoorbeeld, injectie van Talens gericht OCA2 geleid albino vlekken in vis oppervlak 29 (figuur 3). Voor andere eigenschappen of genen, maar de beoordeling van fenotypes in stichter vis kan een uitdaging te wijten zijnop subtiele wijze van het fenotype of lage efficiëntie van de TALEN paar geïnjecteerd. Zo veel toepassingen wenselijk zal zijn om kiemlijn mutaties genereren een gen van belang voor de analyse van de rol van een kandidaatgen in een niet-mozaïek dieren. Het verkrijgen van kiembaantransmissie TALEN geïnduceerde mutaties in A. mexicanus mogelijk 29 (figuur 4). Aldus kan deze techniek worden toegepast op andere kandidaatgenen.
Enkele beperkingen aan het uitvoeren van genetische manipulaties in Astyanax mexicanus bestaan op dit moment. Oppervlak en cavefish ras in het donker, laat in de nacht. In een laboratorium waar het niet mogelijk is om het licht donker cyclus keren moeten onderzoekers laat 's nachts komt injecties voeren, aangezien het essentieel is voor direct injecteren na het afzetten. Bovendien is het belangrijk om het oppervlak vis embryo's te verzamelen in het donker, zo licht paai beïnvloeden.
Andere technieken, in bijzonlar de CRISPR / Cas systeem (besproken in 43), aanwezig voor het bewerken genoom en ook bruikbaar zijn A. mexicanus. Inderdaad, protocollen voor gids RNA assemblage bestaan die een snelle en gemakkelijke 44 zijn en het protocol gerapporteerd hier kan worden aangepast voor CRISPR / Cas injectie. Bovendien worden nieuwe toepassingen genoom bewerking snel ontwikkeld en veel van deze kan nuttig blijken voor A. mexicanus onderzoekers. Bijvoorbeeld, in zebravis precieze mutaties in een gen van interesse door coinjecting Talens met een enkelstrengige oligo die een mutatie 7. Deze techniek kan bruikbaar zijn voor het evalueren van de rol van de grot allelen genereren hol fenotypes, zoals de rol van een missense mutatie in bepaalde hol allelen van MC4R verschillen in metabolisme gevonden tussen cavefish en vis oppervlak 19 zijn. TALENS zijn ook gebruikt om allelen van genen via homologe recombinatie dat ik fluorescente markers tot expressie genererenn patronen vergelijkbaar met het endogene loci 45. Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt in A. mexicanus subsets van cellen of expressie van kandidaatgenen. De CRISPR / Cas systeem is gebruikt in zebravis weefselspecifieke gen knockout 46 verkrijgen. Deze technieken toegepast A. mexicanus, kan nuttig zijn om de genetische basis van processen zoals oog- verlies cavefish evalueren. De lens speelt een cruciale rol in het proces van het oog verlies cavefish 47 en de weefselspecifieke CRISPR / Cas systeem kan worden gebruikt om de rol van kandidaatgenen voor ogen verlies evalueren specifiek in de lens versus andere weefsels van het oog. Deze en andere genoom-bewerkingstechnieken kunnen worden gebruikt in A. mexicanus in toekomstige studies om kritische vragen over de evolutie van de grot kenmerken beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de afdeling Genetica, Ontwikkeling en Celbiologie en Iowa State University en door NIH-subsidie EY024941 (WJ) .Dr. Jeffrey Essner verstrekt commentaar op het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
References
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
- Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
- Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
- Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Gross, J. B.
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
- Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
- Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
- Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
- Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326 (2009).
- Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108 (2012).
- Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
- Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
- Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823 (2013).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
- Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82 (2011).
- Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
- Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
- Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
- Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647 (2014).
- McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).
