Summary
Gene-målretting mutagenese er nå mulig i et bredt spekter av organismer ved bruk av genomet redigering teknikker. Her viser vi en protokoll for målrettet genet mutagenese ved hjelp av transkripsjon aktivator som effektor nukleaser (Talens) i Astyanax mexicanus, en fiskeart som inkluderer overflaten fisk og cavefish.
Introduction
Forstå genetiske grunnlaget for trekk evolusjon er en kritisk forskning mål av evolusjonære biologer. Betydelig fremgang har blitt gjort for å identifisere loci ligger til grunn for utviklingen av egenskaper og pinpointing kandidat gener innenfor disse loci (for eksempel 1-3). Imidlertid funksjonelt testing av rollen til disse genene har forble utfordrende så mange organismer som brukes for å studere utviklingen av egenskaper er for tiden ikke genetisk medgjørlig. Ankomsten av genomet redigering teknologi har økt genetisk manipulability av et bredt spekter av organismer. Transkripsjons aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens) og gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPRs) har blitt brukt til å generere målrettede mutasjoner i genene i en rekke organismer (for eksempel 4-11). Disse verktøyene, anvendt på en evolusjonært relevant system, har potensial til å revolusjonere måten evolusjonsbiologer studere genetiske grunnlaget for evolusjon.
Astyanax mexicanus er en fiskeart som finnes i to former: a. Elv-bolig flate form (flate fisk) og flere hulelevende former (cavefish) A. mexicanus cavefish utviklet seg fra overflaten fiske forfedre (anmeldt i 12). Bestander av cavefish har utviklet en rekke trekk, inkludert tap av øynene, redusere eller tap av pigmentering, økt antall smaksløker og kranie neuromasts, og endringer i atferd som tap av skolegang atferd, økt aggresjon, endringer i fôring holdning og hyperphagia 13 -19. Cavefish og overflaten fisk er interfertile, og genetisk kartlegging forsøk har blitt utført for å identifisere loci og kandidatgener for hule egenskaper 1,20-26. Noen kandidat gener har blitt testet for en funksjonell rolle i å bidra til hule egenskaper i cellekultur 1,19, i modellorganismer av andre arter 21 eller ved overekspresjon 27 eller forbigående knockdown usynge morpholinos 28 i A. mexicanus. Imidlertid har hver av disse fremgangsmåter begrensninger. Evnen til å generere mutante alleler av disse genene i A. mexicanus er avgjørende for å forstå deres funksjon i utviklingen av cavefish. Således, A. mexicanus er en ideell kandidat organisme for anvendelse av genom redigering teknologier.
Her vil vi skissere en metode for genom redigering i A. mexicanus hjelp Talens. Denne fremgangsmåten kan brukes til å evaluere mosaikk injisert legger fisk for fenotyper og for isolering av linjer av fisk med stabile mutasjoner i gener av interesse 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer var i tråd med retningslinjene fra National Institutes of Health og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Iowa State University og University of Maryland.
1. TALEN Design
- Input ønskede mål sekvens til en TALEN utforming nettside. (For eksempel: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Input valgt spacer / gjenta rekkevidder.
- Kopier genomisk sekvens i boksen merket "Sequence".
- Innenfor "Gi Custom Spacer / RVD Lengder" -kategorien velger spacer lengde og rekke lengde.
Merk: Distanse lengder på 15 basepar og gjenta array-lengder på 15-17 fungerer bra og gjør monteringen mindre kompleks.
- Velg en TALEN par. Talen parene konstruert rundt et unikt restriksjonsenzymsete tillate for genotyping av restriksjonsenzym bearbeideret PCR-produkt.
- Design primere til å forsterke den genomiske regionen rundt TALEN målområdet ved hjelp av en nettside som Primer3 30-32. Når genotyping med et restriksjonsenzym, for å utforme primere forsterke en region som inneholder restriksjonsenzymsete bare én gang. Det anbefales at denne regionen er amplifisert og sekvensert før TALEN konstruksjon for å identifisere eventuelle polymorfismer som er tilstede i A. mexicanus lab befolkningen som skal brukes til mikroinjeksjon.
2. TALEN Assembly (Modifisert fra TALEN Kit Protocol) 33,34
For flere detaljer og feilsøking, se protokoll 34.
- Utarbeide og sekvensere nødvendige plasmider fra TALEN kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sett opp # 1 reaksjoner for reaksjonene A og B. Inkluder gjenta-variable diresidues (RVDs) 1-10 og destinasjonen vektor pFUS_A i reaksjon A. Inkluder RVDs 11- (N-1) og the destinasjonsvektor pFUS_B (N-1) i reaksjon B, hvor N er det totale antall RVDs i TALEN.
- Legg til hver reaksjon: 1 ul av hvert plasmid inneholdende hver RVD (100 ng / ul), bestemmelses vektor (100 ng / pl), 1 pl Bsa I restriksjonsenzym, 1 pl bovint serumalbumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 pl ligase, 2 ul av 10 x ligasebuffer og x ul av vann til et totalvolum på 20 ul. For eksempel, se tabell 1.
Merk: Halvparten reaksjoner kan også brukes. - Plasser reaksjoner i en termosykler og kjør syklus: 10 x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min.
- Legg til hver reaksjon: 1 ul av hvert plasmid inneholdende hver RVD (100 ng / ul), bestemmelses vektor (100 ng / pl), 1 pl Bsa I restriksjonsenzym, 1 pl bovint serumalbumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 pl ligase, 2 ul av 10 x ligasebuffer og x ul av vann til et totalvolum på 20 ul. For eksempel, se tabell 1.
- Inkuber reaksjoner med nuklease. Til hver reaksjon legge en mL 25 mM ATP og 1 ul nuklease. Inkuber reaksjoner ved 37 ° C i 1 time.
- Transform reaksjoner.
- Transform 2,5 mL av hver reaksjon i 25 ul kjemisk kompetente celler.
Merk: Hjemmelaget kompetent calen kan anvendes. Imidlertid kan celler med lav kompetanse resultere i manglende kolonier.- Bland 2,5 ul av reaksjonsblandingen med 25 ul av kjemisk kompetente celler. Inkuber på is i fem minutter. Cellene inkuberes i 30 sekunder ved 42 ° C.
- Plasser rørene på is i 2 min. Legg 125 mL av Super Optimal buljong med catabolitt undertrykkelse (SOC). Rist rørene ved 37 ° C i 1 time.
- Plate 100 ul av de transformerte celler på LB-plater med spectinomycin (50 ug / ml), X-gal og isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG). Grow O / N ved 37 ° C.
- Transform 2,5 mL av hver reaksjon i 25 ul kjemisk kompetente celler.
- Pick 2-3 hvite kolonier på hver reaksjon vist ved koloni-PCR ved bruk av primere pCR8_F1 og pCR8_R1 (tabell 2).
- Foreta en konsentrat-blanding av reagensene. For eksempel, se tabell 3.
- Plukk en koloni og smøre det inn i bunnen av en PCR rør, og deretter sette restene av kolonien i 2 ml LB med spectinomycin(50 ug / ml). Plassere 15 ul masterblanding inn i røret med kolonien.
- Kjør følgende PCR-programmet (tabell 4)
- Kontroller PCR (kjøre hele volumet) på en 1,5% agarosegel ved elektroforese. De riktige kloner vil ha et band på forventet størrelse samt en sverte og en stige av band. For et eksempel på den aktuelle smøre, se 34,33.
- Vokse 2 ml kulturer av de korrekte klonene i LB-medium O / N ved 37 ° C i en risteinkubator.
- Miniprepp plasmidene i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sekvens for å sjekke TALEN sekvens med pCR8_F1 og pCR8_R1. Følg tidligere beskrevne metoder 35.
- Bruke riktige kloner verifisert ved sekvensering, sette opp reaksjonen # 2 (TALEN kit), som vil plassere RVDs fra A- og B-vektorer og den endelige RVD inn destinasjonen vektor.
- Forbered blanding for reaksjon 2 (tabell 5).
Merk: Half reaksjoner kan anvendes. - Plasser reaksjoner i en termo og kjøre følgende program: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min.
- Forbered blanding for reaksjon 2 (tabell 5).
- Transform reaksjoner.
- Transform 2,5 mL av hver reaksjon i 25 ul kjemisk kompetente celler.
- Bland 2,5 ul av reaksjonsblandingen med 25 ul av kjemisk kompetente celler. Inkuber på is i 5 min. Varmesjokk cellene i 30 sekunder ved 42 ° C.
- Plasser rørene på is. Legg 125 mL av SOC. Plasser rørene i en risteinkubator ved 37 ° C i 1 time.
- Plate 100 ul av de transformerte celler på LB-plater med ampicillin (100 ug / ml), X-gal og IPTG. Grow O / N ved 37 ° C.
- Transform 2,5 mL av hver reaksjon i 25 ul kjemisk kompetente celler.
- Pick 1-3 hvite kolonier på hver reaksjon vist ved koloni-PCR ved bruk av primere TAL_F1 og TAL_R2 (tabell 2).
- Lage en løsning av polymerase Mastermix, vann og primere sombeskrevet i Tabell 3. Plukk en koloni og smøre det inn i bunnen av en PCR rør, og deretter sette restene av kolonien i 2 ml LB med ampicillin (100 pg / ml). Plasser 15 mL av løsningen inn i røret med kolonien.
- Kjør PCR-programmet (tabell 6).
- Kontroller PCR på en 1,5% agarosegel ved elektroforese. De riktige kloner vil ha en flekker og en stige av band. For et eksempel på den aktuelle smøre, se 34,33.
- Vokse 2 ml kulturer av de korrekte klonene i LB-medium O / N ved 37 ° C i en risteinkubator.
- Miniprepp plasmidene i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sekvens for å sjekke TALEN sekvens med TAL_F1 og TAL_R2 følgende tidligere beskrevne metoder 35.
3. mRNA transkripsjon av Talens
- Digest 4 mikrogram av sekvens-verifisert mal med 2 ul Sac jeg for to timer ved 37 ° C. Kjør 2 ul av det Sac I-spaltet plasmid på en 1,5% agarosegel ved elektroforese. Plasmider som er riktig fordøyd vil vise et enkelt band.
- Rens det gjenværende Sac I-spaltet plasmid følgende PCR-rensesettprotokollen. Vask to ganger med vaskeløsningen før eluering. Elueres i 30 mL av nukleasefritt vann.
- Følg standard protokoll for T3 mRNA produksjon.
- Sett opp halvreaksjoner ved bruk av 0,5 mikrogram av lineært mal (fremstilt ovenfor). Inkuber ved 37 ° C i 2 timer.
- Tilsett 0,5 mL av DNase (inkludert i settet) og inkuberes ved 37 ° C i 15 min.
- Rense mRNA, etter produsentens anvisninger. Elueres i 30 mL nukleasefritt vann.
- Kjør en 1,5% agarosegel ved elektroforese for å kontrollere mRNA.
- Rengjør gelapparatur med et produkt for å eliminere RNase forurensning og forberede en 1,2% gel.
- Mix 1 mL mRNA + 4 &# 181; l nukleasefritt vann + 5 ul glyoksyl lasting fargestoff. Inkuber prøvene ved 50 ° C i 30 minutter. Sentrifuger rørene kort og legg på is før du kjører gel.
- Sjekk konsentrasjonen ved hjelp av en metode for å kvantifisere nukleinsyre-konsentrasjoner og lagre RNA i alikvoter ved -80 ° C. Velge en delmengde størrelse slik at RNA ikke er frosset / tint mer enn én gang.
Merk: Konsentrasjoner av 500-1000 ng / nl er vanligvis oppnådd. RNA med en lavere konsentrasjon kan anvendes, så lenge RNA integritet opprettholdes (som vurdert av et bånd i stedet for et smøre på gelen).
4. Injiser Astyanax mexicanus embryoer med TALEN mRNA
- Forbered Verktøy for injeksjon.
- Hell injeksjonsplater ved å helle 1,2% agarose i fisk vann (vannavkjølte med natriumbikarbonat og havsalt til pH 7,4 og ledningsevnen 700 uS) inn i en petriskål. Plasser en mold (plastbiten med anslag for å gjøre brønner for fiskegg) inne i fatet. Fjern formen når agarose har herdet og oppbevares ved 4 ° C. For detaljer om mold se 36.
- Trekk nåler for injeksjon ved hjelp av en nål avtrekker i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Riktig nål lengde er viktig for injeksjoner. Nåler som er for lang tid vil være for fleksibel for injeksjoner. Protokollen for å trekke nålene vil variere med det utstyr som brukes til å trekke nåler. Et eksempel på en egnet nål er vist i figur 1. For vårt utstyr, trekker vi kanyler som er 5-6 cm i lengde, og har en ytre diameter på spissen på omtrent 0,011 mm når de blir brutt. Imidlertid bør nåler kalibreres (trinn 4.3.4) for å bestemme åpningsbredde. Et eksempel på program for å trekke nålene kan finnes i tabell 7. - Forbered glass pipetter for embryo ved å bryte pipette slik at åpningen er stor nok for et egg til å passere gjennom. Flamme brutt enden tildet ikke lenger er skarp.
Merk: Det er viktig å bruke glass pipetter og glass boller når du arbeider med A. mexicanus egg og embryoer som de er klissete og vil følge plast.
- Samle en celle Stage egg.
- Rase A. mexicanus følgende standard protokoller 37.
Merk: For eksempel, hvis fisken blir vedlikeholdt på en 14 lys: 10 mørke syklus og bruk Zeitgerber tid (ZT) med ZT0 som lysene på og ZT14 som lysene av, vår overflatefisk gyter mellom ZT15 og ZT19. Nøyaktig gytetidspunkt må bestemmes for hver enkelt lab. - Fremkall gyting av overfôring fisken i 3-4 dager før parring og plassere fisken i ferskvann. Heve temperaturen 2 ° C. Merk: Vår første vanntemperaturen er ca 74 ° C.
- Samle overflate fiskeegg i mørket, sjekker hver 15 min for å oppnå egg på en cellestadiet. Hundrevis av egg kan fås fra et enkelt par av flate fisk.
- Samleegg i glass boller for å hindre stikker til plastoverflater og slag for å isolere embryoer på en celle stadiet før injeksjon ved å observere egg under mikroskopet og samle egg som er en enkelt celle. Hold egg i friskt system vann (tank vann hvori voksen fisk befinner seg, som er blitt behandlet for pH og konduktivitet).
- Rase A. mexicanus følgende standard protokoller 37.
- Injisere TALEN mRNA.
- Injisere ulike mengder av total mRNA (like mengder hver TALEN i paret) for å finne den optimale konsentrasjonen for injeksjon som giftighet og effektivitet varierer etter TALEN par. Start ved å injisere konsentrasjoner av total mRNA som er 400-800 pg. Fortynn og kombinere mRNA til ønskede konsentrasjoner for å injisere 1,5 nl.
- Load utvannet mRNA inn på baksiden av nålen og fest nålen til en mikro-injektor.
- Brekke nålen ved hjelp av pinsett.
- Kalibrer nålen. For eksempel, ta ut 10 ganger og samle den resulterende fall i en mikro kapillær. For 10 x 100 disponibel 1,081; l, 32 mm mikro kapillært, bør rulle fylle mikrokapillært til 0,5 mm for 1,5 nl / en injeksjon. Juster sprøyte tid og trykk etter behov.
- Stikk nålen inn én celle og injisere mRNA. Injisere mRNA direkte inn i cellen, ikke inn i eggeplomme.
- Samle injiserte embryoer i glassboller. Hold embryoer ved 23-25 ° C. Fjern døde embryoer (befruktede egg som blir overskyet og uregelmessig form) regelmessig for de første dagene etter injeksjon. Posten antall døde og deformerte embryoer fra kontroll (injiserte) og injisert plater.
Merk: Økt mRNA konsentrasjoner kan medføre økt toksisitet og misdannelse / død av embryoer. Således, giftighet i forhold til effektivitet må balanseres for å bestemme den beste konsentrasjonen av mRNA som skal injiseres.
5. Phenotype Grunnlegger Fisk og evaluere TALEN Efficiency
- Offer embryoer i henhold til institusjonelle dyr protokollen.
Merk: Vi avliveembryoer ved hurtig kjøling på is. - Samle embryoer til 0,8 mL PCR strips hjelp av en overførings pipette.
Merk: Genotyping kan utføres på individuelle embryo eller bassenger av embryoer. - Pakk DNA.
- Plasser embryoer i 100 ul 50 mM natriumhydroksid (NaOH) og inkuber ved 95 ° C i 30 minutter, avkjøl deretter til 4 ° C.
- Legg 1/10 volum (10 ul) av 1 M Tris-HCl pH 8.
- Utfør en PCR på regionen ved hjelp av primere utformet i trinn 1.3 (se tabell 8 og 9 for eksempel protokoller). For enkelte embryoer 1 ul DNA er tilstrekkelig for PCR-reaksjonen.
- Fordøye resulterende PCR-produkt med den passende restriksjonsenzym og kjøre en 1,5% agarosegel ved elektroforese.
- For eksempel, for genotyping den oculocutaneous albinisme 2 (oca2) locus i injiserte embryoer fordøye PCR produktet ved hjelp av restriksjonsenzymet Bsr jeg ved å legge til 0.5 Ul Bsr I direkte til 12,5 ul av PCR-reaksjonen fullført, inkubering ved 65 ° C i 2 timer. Kjør ufordøyd og det spaltede produkt på en gel. Restriksjonsenzym resistente bånd (dvs. bånd som ikke fordøyes) indikerer at TALEN-induserte mutasjoner er til stede (figur 2).
- (Valgfritt) Beregn prosentmutasjonsraten ved å bestemme hvor stor prosentandel av uncut produkt ved å analysere bilder av gels i Fiji 38 bruke gel analyse verktøy for å beregne intensiteten verdien av hvert band som beskrevet tidligere 29.
- Bestemme sekvensen av mutante alleler av TA kloning av gelrenset restriksjonsenzym resistente mutant bånd og sekvensering av kloner.
- Gel rense restriksjonsenzymet resistent mutant bandet å følge produsentens instruksjoner. TA klone bandet å følge produsentens instruksjoner. Plukke kolonier og vokser i 1,5 ml LB O / N ved 37 ° C i en ristekuvøse.
- Miniprepp kulturer etter produsentens anvisninger. Send DNA for sekvensering.
- Ved hjelp av et program som ape, justere mutante sekvensene til villtype sekvens.
- Kopier og lim begge sekvenser i APE-filer. Velg "Juster to sekvenser" verktøy fra "Verktøy" -menyen.
- Angi de to DNA-sekvenser ved hjelp av rullegardinmenyer.
Merk: Den omvendte komplement av den klonede sekvensen kan ha behov for å bli brukt, avhengig av hvilken retning den PCR gikk inn i kloningsvektoren. Hvis sekvensene ikke justere, gjenta trinn sjekker den "Rev-Com" boksen i "Align DNA" boksen.
- Vurdere grunnleggeren fisk for fenotyper på passende trinn og ved hjelp av egnede metoder for den forventede fenotype 29 (for eksempel figur 3). Metoder for fenotyping vil være basert på forventet fenotype for genet målrettet av forskeren bruker protocol.
6. Screen for kimcellelinje Transmission
Merk: A. mexicanus kjønnsmoden ved 4-8 måneder.
- Krysse kjønnsmoden grunnleggeren fisk til villtype fisk.
- Skjerm embryo eller voksen fisk ved hjelp av metoder i trinn 5.1-5.7 (figur 4). For voksen fisk, kan en del av halen klippes etter bedøvelsen.
- Bedøve fisk ved å senke fisk i en løsning av Tricaine (3-aminobenzosyre-etylester) for å redusere spenning i løpet av finneklipping. Etter fin klipping, la fisken å komme seg i ferskvann. Fisk komme seg raskt; observere før de har gjenvunnet (svømmer normalt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Talen par injeksjoner føre til binding av RVDs til spesifikke DNA-nukleotider og dermed dimerization av Foki domener, noe som resulterer i doble strandede pauser 39 som kan repareres gjennom ikke-homolog ende bli (NHEJ). NHEJ introduserer ofte feil som resulterer i innskudd eller slettinger (indels). Indels kan identifiseres ved å forsterke området rundt TALEN målstedet og bearbeider det resulterende fragment med et restriksjonsenzym som kutter innenfor det TALEN spacer regionen. Lene uten en Indel vil fordøye mens alleler som inneholder indels som endrer restriksjonsenzymet målsekvensen ikke vil fordøye, produsere et restriksjonsenzym motstandsdyktig bånd (figur 2).
Talen injeksjoner kan trolig føre til biallelic genmutasjoner i A. mexicanus 29. Således kan noen fenotyper vurderes i grunnlegger fisk. Til eksempel evaluert vi pigmentering i overflaten fisk injisert med Talens målretting oca2, genet antatt å være ansvarlig for albinisme i flere albino bestander av cavefish 1,28. Vi fant albino flekker i oca2 TALEN-injisert fisk ikke er til stede i injiserte fisk 29 (figur 3).
For mange eksperimenter, er det ønskelig å ha mutante linjer av fisk for å evaluere fenotyper. Grunnlegger fisk med overfør mutante alleler kan identifiseres ved genotyping avkom fra krysninger av grunnleggeren fisk til villtype fisk (figur 4).
Figur 1. Needle for å injisere mRNA. Fotografi av en mikropipette før de blir brutt brukes til å injisere TALEN mRNA inn encellede embryoer._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. TALEN effektivitet for Oca2. 306 bp PCR-produkter fra ekson 9 av oca2 i Astyanax mexicanus ble undersøkt for tap av restriksjonsenzymsete når ulike mengder av TALEN mRNA ble injisert 29. Amplikonet fra en kontroll embryo ble spaltet mens en del av amplikonet var resistent mot restriksjonskutting i bassenger av 10 TALEN injiserte embryoer. Restriksjonsenzym fordøye resistente band fra embryoer injisert med TALEN mRNA målrettet oca2 har vist seg å inneholde indels 29. Legg merke til at økende konsentrasjoner av mRNA injisert i øket TALEN effektivitet (mer ufordøyd DNA). Baner med "-" er ufordøyd, baner med "+" er Digested med restriksjonsenzym. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. fenotyping grunnleggeren fisk for endringer i pigmentering. (A) Kontroll-injiserte overflate A. mexicanus. (B) Patch mangler Melanophores i en grunnlegger overflaten fisk injisert med 400 pg TALEN mRNA målretting oca2 (pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. germline overføring av TALEN indusert mutations. 306 bp PCR-produkter fra ekson 9 av oca2 i A. mexicanus ble undersøkt for tap av restriksjonsenzymsete i dammer av 10 F 1 fisk fra en injisert grunnleggeren fisk. Amplikonet fra en kontroll embryo ble spaltet mens en del av amplikonet var resistent mot restriksjonskutting i bassenger av 10 F-1 embryoer. Restriksjonsenzym fordøye resistente band fra oca2 F 1 s har vist seg å inneholde indels 29. Baner med "-" er ufordøyd, baner med "+" er fordøyd med restriksjonsenzymet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| reaksjon A | Reactipå B | |||
| beløp | reagens | beløp | reagens | |
| 4 pl | vann | 10 ul | vann | |
| 1 mL | pFUS_A | 1 mL | pFUS_B4 | |
| 1 mL | BsaI | 1 mL | BsaI | |
| 1 mL | BSA | 1 mL | BSA | |
| 1 mL | ligase | 1 mL | ligase | |
| 2 pl | 10x ligasebufferoppløsning | 1 mL | 10x ligasebufferoppløsning | |
| 1 mL | pNH1 | 1 mL | pNG1 | |
| 1 mL | pNH2 | 1 mL | pHD2 | |
| 1 mL | pNG3 | 1 mL | pNH3 | |
| 1 mL | pHD4 | 1 mL | pNI4 | |
| 1 mL | pHD5 | |||
| 1 mL | pHD6 | |||
| 1 mL | pNG7 | |||
| 1 mL | pHD8 | |||
| 1 mL | pNG9 | |||
| 1 mL | pHD10 | |||
Tabell 1. Eksempel reaksjon enhet A og B for enTALEN inneholder RVDs NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.
| primer navn | -sekvens (5'-3 ') |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
Tabell 2. PCR primere for koloni PCR, fra 34.
| reagens | beløp |
| Taq Mastermix, 2x | 50 pl |
| pCR8_F1 primer,10 uM | 4 pl |
| pCR8_R1 primer, 10 uM | 4 pl |
| Nukleasefritt vann | 42 mL |
| * Juster mester blanding hvis en annen Taq brukes | |
Tabell 3. Master miks for 100 mL (15 pl / reaksjon) for koloni PCR 1.
| skritt | temperatur (° C) | tid (sek) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 105 |
| 5 | Gå til trinn 2 for 30 sykluser | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabell 4. PCR program for koloni PCR 1.
| beløp | reagens | konsentrasjon |
| 12 pl | vann | |
| 1 mL | En vektor | 100 ng / mL |
| 1 mL | vektor B | 100 ng / mL |
| 1 mL | reisemål vektor pT3Ts-gt | 50 ng / mL |
| 1 mL | endelig RVD (PLR-RVD) | 100 ng / mL |
| 1 mL | Esp3I | |
| 1 mL | ligase | |
| 2 pl | 10x ligasebufferoppløsning | |
Tabell 5. Protokoll for andre monterings reaksjoner.
| skritt | temperatur (° C) | tid (sek) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 180 |
| 5 | Gå til trinn 2 for 30 sykluser | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabell 6. PCR programfor koloni PCR to.
| varme | 290 |
| dra | 150 |
| hastighet | 100 |
| tid | 150 |
| Disse parametrene er for en Flaming / Brown Mikropipette Puller Model P-97 ved hjelp av et trau filament | |
Tabell 7. Eksempel nål trekke program.
| reagens | beløp |
| Taq Mastermix, 2x | 12,5 mL |
| gen bestemt fremover primer, 10 mikrometer | 1 μl |
| gen bestemt reverse primer, 10 mikrometer | 1 mL |
| Nukleasefritt vann | 9,5 mL |
| DNA | 1 mL |
| * Juster mester blanding hvis en annen Taq brukes | |
Tabell 8. Eksempel på protokollen for gen spesifikk PCR.
| skritt | temperatur (° C) | tid (sek) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 56 | 30 |
| 4 | 72 | 60 |
| 5 | Gå til step 2 for 35 sykluser | |
| 6 | 72 | 300 |
| * Justere glødetemperatur og forlengelse tid for spesifikke primere og PCR produktstørrelse | ||
Tabell 9. Eksempel PCR program for genet spesifikk PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Store fremskritt er gjort i de senere år mot å forstå den genetiske grunnlaget for utviklingen av egenskaper. Selv om kandidatgener ligger til grunn for utviklingen av et antall av egenskaper er blitt identifisert, har det vært vanskelig å teste disse gener in vivo på grunn av mangel av genetisk tractability av de evolusjonært interessante arter. Her rapporterer vi en metode for genom redigering i A. mexicanus, en art som brukes til å studere utviklingen av hule dyr. Genetisk kartlegging studerer 1,21,23 og kandidat genet nærmer 19,40 har identifisert en rekke kandidatgener for utviklingen av egenskaper i hulen form av A. mexicanus. Den nylige utgivelsen av cavefish genomet 41 gir en ekstra kraftig verktøy for å identifisere kandidatgener for utviklingen av hule egenskaper. Å teste funksjonen av mange av disse kandidat gener krever teknikker for å redusere genekspresjon. Den eneste aktuelle alternativet for studiering redusert genekspresjon i A. mexicanus er ved bruk av morpholinos. Imidlertid er morfolino genet knockdown forbigående, begrenset til noen få dager etter befruktning, og er ikke nyttig for å studere egenskaper hos voksne dyr, for eksempel atferdsforskjeller mellom voksen hule og flate fisk som skolegang 17, hyperphagia 19 og vibrasjon tiltrekning atferd 42. Generering av tap av funksjons alleler av gener, slik som de som kan lages ved hjelp av Talens, vil være avgjørende for testing rollen som kandidat gener for disse trekkene.
Det er utviklet metoder for enkel montering av talen parene 33 og detaljert protokoll for denne fremgangsmåte er tilgjengelig 34. Denne protokollen ble optimalisert for sebrafisk bruk av Bedell et al. 7, med en annen endelig destinasjon vektor, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS GT). Denne vektoren åpner for transkripsjon av TALEN mRNA for injeksjon i encellede sebrafisk embryoer.Vi har brukt denne modifiserte montering metoden forklart i detalj her, å montere og transkribere Talens for injeksjon i A. mexicanus. Vi har funnet at når det injiseres i encellet overflate A. mexicanus embryo, som beskrevet i denne protokollen, kan vi mutere A. mexicanus gener 29. For fremtidig forskning på kandidatgener som ikke er beskrevet i denne protokollen, kan sekvenser bli funnet i cavefish genomet 41 og brukes til å identifisere Talen målområder.
Kritisk for vellykkede injeksjoner er høy kvalitet TALEN mRNA. Således kontroll for RNA kvalitet ved å kjøre en liten mengde av RNA på en gel før injeksjon er viktig (trinn 3.6). Andre forholdsregler for å opprettholde RNA integritet, som for eksempel å fryse porsjoner for å unngå frost tiner (trinn 3.7), og opprettholde sterile forhold ved bruk av rent vann og RNase-fritt rør og tips under injeksjoner (trinn 4), skal tas. En ekstra viktig skritt for å heve injisert fisk errense ut døde embryoer etter injeksjon, som døde embryoer kan raskt påvirke vannkvaliteten. Dermed fjerner vi døde fostre morgenen etter injeksjoner, og med jevne mellomrom for de neste dagene etter injeksjoner for å opprettholde en sunn levende embryoer (trinn 4.3.6).
TALEN mutagenese i Astyanax mexicanus kan være svært effektiv; Men effektiviteten varierer avhengig av TALEN par injisert 29. Økte mRNA konsentrasjoner kan gi økt toksisitet og misdannelse og død av injisert embryo. Således, giftighet i forhold til effektivitet skal testes og balansert for å bestemme den optimale konsentrasjonen av mRNA som skal injiseres. For svært effektive Talen parene, kan fenotyper bli vurdert i injiseres grunnleggeren fisk. For eksempel injeksjon av Talens målretting oca2 resulterte i albino flekker i overflaten fisk 29 (figur 3). For andre egenskaper eller gener, men vurderingen av fenotyper i grunnleggeren fisk kan være utfordrende på grunntil diskret av fenotypen eller lav effektivitet av det TALEN paret injisert. Således kan for mange anvendelser vil det være ønskelig å generere kimlinje-mutasjoner i et gen av interesse for analyse av rollen til en kandidat-gen i en ikke-mosaikk dyr. Innhenting germline overføring av TALEN-induserte mutasjoner i A. mexicanus er mulig 29 (figur 4). Således kan denne teknikken bli anvendt for å evaluere andre kandidat gener.
Noen begrensninger til å utføre genetiske manipulasjoner i Astyanax mexicanus eksisterer på dette tidspunktet. Surface og cavefish rasen i mørket, sent på kvelden. I et laboratorium hvor det ikke er mulig å reversere lys mørke-syklusen, må forskere kommer sent på natten for å utføre injeksjoner, som det er viktig å injisere umiddelbart etter gyting. I tillegg er det viktig å samle overflatefiske embryoer i mørket, som lett vil påvirke gyting.
Andre teknikker, i spesilar den CRISPR / Cas system (anmeldt i 43), eksisterer for genom redigering og vil trolig gjelde for A. mexicanus. Faktisk protokoller for guide RNA montering finnes som er rask og enkel 44 og protokollen angitt her kan bli endret for CRISPR / Cas injeksjon. I tillegg er nye søknader om genom redigering raskt under utvikling, og mange av disse kan være nyttig for A. mexicanus forskere. For eksempel, i sebrafisk presise mutasjoner er blitt gjort i et gen av interesse ved coinjecting Talens med et enkeltkjedet oligonukleotid som inneholdt en mutasjon 7. Denne teknikken kan være nyttig for å vurdere rollen som hule alleler generere hule fenotyper, som for eksempel rollen som en missense mutasjon i visse hule alleler av mc4r i forskjeller i stoffskiftet observert mellom cavefish og overflatefisk 19. Talens har også blitt brukt til å generere alleler av genene via homolog rekombinasjon som uttrykker fluorescerende markører in mønstre som ligner på den endogene loci 45. Disse metodene kan brukes i A. mexicanus å evaluere undergrupper av celler eller ekspresjon av kandidatgener. Den CRISPR / Cas system er blitt brukt i sebrafisk for å oppnå vev-spesifikke genet knockout 46. Disse teknikker, anvendt til A. mexicanus, kan være nyttig for å evaluere den genetiske basis av prosesser så som øye tap i cavefish. Linsen spiller en kritisk rolle i prosessen med øyet tap i cavefish 47 og den vevsspesifikt CRISPR / Cas system kan brukes til å vurdere rollen til kandidatgener for øye tap spesifikt i linsen i forhold til andre vev i øyet. Disse og andre genom-redigering teknikker kan benyttes i A. mexicanus i fremtidige studier for å svare på kritiske spørsmål om utviklingen av hule egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Institutt for genetikk, Utvikling og cellebiologi og Iowa State University og ved NIH stipend EY024941 (WJ) .Dr. Jeffrey Essner gitt kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
References
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
- Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
- Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
- Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Gross, J. B.
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
- Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
- Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
- Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
- Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326 (2009).
- Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108 (2012).
- Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
- Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
- Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823 (2013).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
- Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82 (2011).
- Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
- Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
- Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
- Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647 (2014).
- McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).
