Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

השרשה ורישום האלחוטי electroretinogram ופוטנציאל חזותי מעורר אצל חולדות Conscious

Published: June 29, 2016 doi: 10.3791/54160
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Optometry and Vision Sciences, University of Melbourne, 2Pfizer Neusentis

Summary

אנחנו מראים נהלי השתלת הקלטה כירורגית למדוד אותות חזותיים אלקטרו מן העין (electroretinogram) והמוח (ויזואלי עורר פוטנציאל) בחולדות מודעות, וזה יותר מקביל למצב האנושי שבו הקלטות מתנהלות ללא מקעקעת הרדמה.

Abstract

Electroretinogram שדה מלא (ERG) ופוטנציאל חזותי עורר (VEP) הם כלי שימושי כדי להעריך רשתית ויושרה מסלול ויזואלי הן במעבדה והן במסגרות קליניות. נכון לעכשיו, מדידות ERG ו VEP פרה-קליניות מבוצעות בהרדמה כדי להבטיח מיקומים אלקטרודה יציבים. עם זאת, עצם הנוכחות של הרדמה הוכחה לזהם תגובות פיסיולוגיות נורמליות. כדי להתגבר מקעקעת הרדמה אלו, אנו מפתחים פלטפורמה חדשנית assay ERG ו VEP בחולדות מודעות. אלקטרודות הושתלו תת-conjunctivally על העין כדי assay את ERG ו epidurally על קליפת הראייה למדוד את VEP. מגוון של משרעת ורגישות / פרמטרי תזמון assayed הוא ERG ו VEP להגדיל אנרגיות זוהרות. אותות ERG ו VEP מוצגים להיות יציב דיר לפחות השתלת 4 שבועות לאחר ניתוח. יכולת זו כדי להקליט אותות ERG ו VEP ללא הרדמה מקעקעת בשנות ה פרה-קלינייםetting אמור לספק תרגום מעולה נתונים קליניים.

Introduction

ERG ו VEP הם פולשנית בכלי vivo להעריך את תקינות מסלולים רשתית וחזותיים בהתאמה בשנייה במעבדת המרפאה. התנאים המלאים שדה ERG מניב צורת גל מאפיין אשר יכול להיות שבור למטה לתוך רכיבים שונים, כאשר כל יסוד המייצג כיתות תאים שונים של 1,2 מסלול הרשתית. צורת גל ERG השדה מלא הקלאסיקה מורכבת של שיפוע שלילי ראשוני (א-גל), אשר הוכח לייצג חשיפה לאור קולטי אור פעילות פוסט 2-4. א-גל ואחריו גל חיובי משמעותי (ב-גל) המשקף פעילות חשמלית של הרשתית במרכז, בעיקר תאי ON-דו קוטבית 5-7. יתר על כן, אפשר לשנות אנרגיה זוהרת היתר עם ​​עוררות יתר מרווח לבודד חרוט מתגובות מוט 8.

המבזק VEP מייצג פוטנציאל חשמלי של גזע קליפת המוח החזותית בתגובה לגירוי אור ברשתית9,10. צורת גל זה יכול להיות שבור למטה לתוך רכיבים מוקדמים ומאוחרים, עם רכיב מוקדם המשקף את פעילות של נוירונים של מסלול retino-geniculo-striate 11-13 ומרכיב מאוחר המייצג עיבוד קליפת המוח מתבצע רבדים V1 שונים בחולדות 11,13. לכן מדידה בו זמנית של ERG ו VEP חוזרת הערכה מקיפה של המבנים המעורבים המסלול ויזואלי.

נכון לעכשיו, על מנת לרשום אלקטרופיזיולוגיה בחיות, הרדמה הוא מועסק כדי לאפשר מיקום יציב של אלקטרודות. נעשו ניסיונות למדוד ERG ו VEP בחולדות מודע 14-16 אך מחקרים אלה המועסקים התקנה קווית, אשר יכול להיות מסורבל שעלול להביא ללחץ חיה בהגבלת חופש התנועה של בעלי חיים התנהגות טבעית 17. עם התקדמות בטכנולוגיה אלחוטית כולל מזעור משופר וחיי סוללה, ניתן כיום ליישם גישה טלמטריה עבור ERGהקלטת ד VEP, ומקטינה את הלחץ הקשור קלטות קווים ושיפור כדאיים לטווח ארוך. לגמרי הפנימו השתלות יציבות של בדיקות טלמטריה הוכיחו להיות מוצלח לניטור כרוני של טמפרטורה, לחץ דם 18, פעילות 19 וכן electroencephalography 20. התפתחויות אלו בטכנולוגיה תסייענה גם עם דירות ויציבות של הקלטות מודעות, הגדלת השירות של הפלטפורמה ללימודים כרוניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: ניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לקוד האוסטרלי עבור הטיפול ושימוש בחיות למטרות מדעיות (2013). אתיקה אישור בעלי חיים הושג מוועדת האתיקה בעלי חיים, אוניברסיטת מלבורן. החומרים במסמך זה הנם עבור ניסויי מעבדה בלבד, ולא מיועדים לשימוש רפואי או וטרינרים.

1. אלקטרודות הכנה

הערה: משדר שלושה ערוץ משמש להשתלה כירורגית המאפשרת 2 ERG ו -1 הקלטת VEP להתנהל בו זמנית. השלוש אלקטרודות הפעילות פעילים ושלוש צריכות להיות מראש מעוצבות לתוך צורת טבעת לפני ההשתלה כדי לצרף את העין. למטרות זיהוי, היצרנית סגורה אלקטרודות פעיל לבן חצי, חצי נדני פלסטיק צבעוניים בעוד אלקטרודות פעיל מכוסים נדנים בצבע מלאים. האלקטרודה הקרקע (נדן פלסטיק שקוף) נותרת ללא שינוי. לכל אלקטרונ הפעיל ולא פעילהתנהגות האודות צעדים 1.1, 1.2, 1.3 ו -1.7.

  1. להתיר את האלקטרודה נירוסטת גדילים הכפולה עם שתי צבת הקנס הטתה.
  2. Trim אחד גדילי נירוסטה (כ 1 ס"מ מהקצה), השארת גדיל בודד כבר ישר הנותרים לעצב את האלקטרודה טבעת.
  3. מקפלים את גדיל נירוסטה יחיד בחזרה אל עצמו ולסובב, ויצרו טבעת חלקה על קצה האלקטרודה.
  4. עבור האופנתיים אלקטרודות פעיל ERG לולאה זה ~ 0.2 - 0.5 מ"מ קוטר על ידי סיבוב בסיס של הלולאה (לצורך המתואר כאן, לעצב שתי אלקטרודות לפעול בדרך זו כדי להקליט ERG משתי העיניים), ועבור ERG פעיל אלקטרודות VEP להפוך את בקוטר לולאה ~ 0.8 מ"מ קוטר (בדוגמה זו, לעשות את זה עבור אלקטרודה VEP פעיל אחד וכל שלוש אלקטרודות פעילה).
  5. הוק האלקטרודה VEP הפעילה המעגלית סביב בורג נירוסטה (בקוטר 0.7 מ"מ, אורך 3 מ"מ) כך האלקטרודה מונח כנגד ראש הבורג.
  6. hook 3 אלקטרודות הפעילים (2 ERG, 1 VEP) סביב בורג נירוסטה שני (בקוטר 0.7 מ"מ, אורך 3 מ"מ).
  7. משוך את שרוול הפלסטיק קדימה על הקצוות החדים של שני גדיל הנירוסטה להפחית גירוי.
  8. לעקר את משדרי טלמטריה על ידי השריית glutaraldehyde 2% במשך יותר מ -10 שעות ב כ 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף את המשדר עם פעמים מלוחות 3 סטרילי.

2. משדר השרשה

  1. הכנת בעלי חיים
    1. לחטא את אזור הניתוח לפני ניסויים על ידי ניקוי עם אתנול 70%. החיטוי כל ציוד כירורגי לפני השימוש ולשמור ציוד כלורהקסידין כשאינו בשימוש במהלך הניתוח. כסה את בעל החיים עם וילון כירורגי במהלך הניתוח כדי לשמור על סביבה סטרילית. ודא כי כל הנסיינים לובשים מסכות כירורגיות, כפפות וחלוקים סטרילי.
    2. להשרות הרדמה עם 1.5 - 2% isoflurane, בקצב זרימה של 3 ליטר / דקה ו maintaiנד ב 1.5 - 2% ב -2 ליטר / דקה במהלך הניתוח. אשר עומק מספיק של הרדמה על ידי היעדר רפלקס דוושה על צובט את השריר בין האצבעות.
    3. לגלח אזור 40 מ"מ x 30 מ"מ מעל הבטן מלמעלה במפשעה אל עצם החזה.
    4. לגלח אזור 30 מ"מ x 20 מ"מ מעל המצח, האחוריים לעיניים קדמית האוזניים.
    5. לחטא את שני האזורים המגולחים. לקבלה באזור המצח לחטא עם 10% יוד povidone שלוש פעמים (להימנע משימוש חיטוי על בסיס אלכוהול לאזור ליד העין, להיות עקבי עם התקן העיסוק שנקבע על ידי האיגוד וטכנולוגים כירורגי). במהלך הבטן לחטא עם יוד povidone 10% ו 70% אתנול.
    6. החל 1 טיפה של proxymetacaine לקרנית עבור הרדמה מקומית נוספת.
    7. החל 1 טיפה של נתרן חומצה גליקולית תאית בקרנית כדי למנוע התייבשות של העיניים.
  2. השתלה ניתוחית
    1. ביצוע חתך 10 מ"מעל הראש לאורך קו האמצע האנכי בין האוזניים באיזמל מנתחים.
    2. ביצוע חתך 5 מ"מ על הבטן דרך שכבת העור לאורך קו האמצע מתחת עצם החזה.
    3. מנהרה באורך מתחת לעור צינורית בקוטר 5 מ"מ מן החתך בבטן אל החתך בראשו.
    4. להאכיל את חוטי אלקטרודות (3 פעילים ו -3 פעילה) של המשדר דרך הצינורית מבטן הראש.
    5. השאירו את האלקטרודה התייחסות עם בסיס משדר ולכסות את קצה האלקטרודה עם גזה ספטית.
    6. מכסים את טיפים אלקטרודה (3 פעילים ו -3 פעילה) עם גזה ספטית.
    7. אבטח את ראשו של החולדה פלטפורמה stereotaxic.
    8. הרחב את חתך מצח 30mm באורך עם מספרי כירורגיות.
    9. לחשוף אזור הניתוח על ידי חוזרת בה עור רפוי עם 2 תפרים (0 - 3) ב ~ 3 ו -9 בערב.
    10. לגרד את periosteum המכסה את הגולגולת באמצעות גזה מעוקרת לחשוף גבחת, תפרים למבדה ו קו אמצע. מקדחה שני חורים דרך הגולגולת על פעיל VEP (7 מ"מ הגחון גבחת 3 מ"מ לרוחב קו האמצע) ו פעיל (5 מקורי מ"מ עד גבחת על קו האמצע) הקואורדינטות stereotaxic.
    11. צרף VEP אלקטרודות פעיל פעיל עם ברגים נירוסטה מראש המצורפת (בקוטר 0.7 מ"מ, אורך 3 מ"מ) לגולגולת עם מברג קטן ~ 1 מ"מ עומק לתוך החורים התערובת של העוגיות. זה מעגן את הבורג עד העצם מבלי לפגוע ברקמת קליפת המוח הבסיסית.
    12. להשתיל אלקטרודות הפעילה ERG להשתמש 8 - תפר 0 לחזור בו העפעף העליון באופן זמני.
    13. כנס מתחת לעור צינורית 16 עד 21 G מאחורי העין דרך אל fornix הלחמית המעולה.
    14. הסר את המחט המנחה.
    15. להאכיל את האלקטרודה הפעיל באמצעות קטטר הפלסטיק המקוצר מן המצח כלפי העין. ואז להסיר את הקטטר פלסטיק.
    16. השתמש תפר זמני (0 - 8), אשר הוא מושחל דרך הלולאה אלקטרודה, כדי למנוע את ELECTrode מן חוזרת בה בחזרה אל המנהרה.
    17. ביצוע חתך 0.5 מ"מ על הלחמית מעולה בשעה 12, 1 מ"מ מאחורי לימבוס. השתמש דיסקציה קהה לחשוף את בלובן העין הבסיסית.
    18. השתל 8 - תפר 0 מיד מאחורי לימבוס על עובי חצי scleral - 0 או 9.
    19. הסר תפר זמני מן האלקטרודה פעיל ERG.
    20. לעגן את האלקטרודה ERG פעיל תפר עובי חצי scleral ידי קשירת 3 קשרים רצופים הבטחת קצה האלקטרודה ממוקם קרוב לימבוס.
    21. סגור את דש הלחמית באמצעות 1 עד 2 תפרים קטע (0 - 8 0 - 9). ודא הלחמית מכסה לחלוטין את האלקטרודה ERG כדי לשפר את נוחות.
    22. הסר תפר חוזרת בה העפעף.
    23. חזור על התהליך עבור העין הנגדית.
    24. החל ג'ל cyanoacrylate על הגולגולת כדי לאבטח את כל הברגים חלד וחוטי האלקטרודה. ודא אלקטרודות הפעילים ERG לא יימשכו חזקים מדי לפני ההבטחה כדי enתנועות עיניים מסוגלות.
    25. סגור את הפצע בראשו באמצעות שאינו נספג 3 - תפר 0.
    26. סובב מכרסם לחשוף באזור הבטן. להאריך את חתך עורי בבטן עד 40 מ"מ לאורך alba Linea עם מספרי כירורגיות.
    27. ביצוע חתך 35 מ"מ דרך קיר השריר הפנימי לחשוף את חלל הבטן הפנימי.
    28. שימוש בשני תפרים (0 - 3) לצרף את הגוף המשדר אל דופן הבטן הפנימית בצד ימין של בעל החיים. הימנע פנייה הכבדה.
    29. Loop אלקטרודה הקרקע ומאובטח הצורה הזו עם תפר (0 - 3). מניחים אותו חופשי צף בתוך חלל הבטן.
    30. סגור את הצפק באמצעות תפר מתמשך (0 - 3).
    31. סגירת החתך בעור באמצעות תפרים קטע (0 - 3).
  3. טיפול לאחר הניתוח
    1. צג את החיה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. בית החיה לאחר הניתוח ביחידים.
    2. נהל carprאופן תת עורי על שיכוך כאבים (5 מ"ג / ק"ג) פעם ביום למשך 4 ימים.
    3. להוסיף אנטיביוטיקה דרך הפה מניעתי (Enrofloxin, 5 מ"ג / ק"ג) למי השתייה למשך 7 ימים שלאחר הניתוח.
    4. החל משחה אנטי דלקתית לאתרים חתך בעור כדי להפחית גירוי במשך 7 ימים לאחר הניתוח הראשון.

3. ניהול ERG ו VEP הקלטות בחולדות Conscious

  1. Dark להסתגל חיה במשך 12 שעות לפני הקלטות ERG ו VEP
  2. לנהל את כל המניפולציות ניסיון תחת תאורה אדומה עמומה (17.4 cd.m -2, λ מקסימום = 600 ננומטר)
  3. החל הרדמה מקומית (0.5% proxymetacaine) ו מתרחבים (0.5% tropicamide) טיפות לקרנית.
  4. מדריך המכרסם המודע לתוך עוצר בהתאמה אישית, ברור.
    הערה: אורכו של צינור פלסטיק זה יכול להיות מותאם כדי להתאים חולדות בגדלים שונים עם קוטר הכוללת קבוע ב -60 מ"מ. החלק הקדמי של המכשיר מחודד כדי למזער ראש מוvement ומכיל נקבים לאפשר נשימה רגילה. מול מחודד זה מאפשר יישור וייצוב של הראש והעיניים של חולדת הפתיחה בתחום Ganzfeld. ראוי לציין, כי המכרסם כבר התאקלם העוצר (3 עד 5 פעמים) לפני הניתוח.
  5. מניח את המכרסם מול קערת Ganzfeld בעיניים המיושרות עם פתיחת הקערה.
  6. הפעל משדר שכינה ידי העברת מגנט בתוך ~ 5 סנטימטר של המשדר. ודא כי המשדר הוא על ידי בדיקת נורית LED מעמד על בסיס המקלט.
  7. אסוף אותות על פני טווח של אנרגיות זוהרות (כלומר, -5.6 ל 1.52 יומן cd.sm -2) כפי שתואר לעיל 21. בקצרה, אותות ממוצעים יותר ברמות אור דימר (~ 80 חזרות) ופחות על האנרגיות זורחות הבהיר (~ 1 חוזר). בהדרגה להאריך את מרווח interstimulus מ 1 עד 180 שניות מ dimmest לרמת האור החזק.
  8. כדי לבודד את מוט ERGותגובות חרוטות לנצל פרדיגמה התאום פלאש 8. לדוגמה, ליזום שני הבהובים ב 1.52 יומן cd.sm -2 עם 500 מרווח בין גירוי msec שביניהם.
  9. כדי להקליט אותות VEP, 20 חזרות ממוצעות על האנרגיות זורחות הבהיר (כלומר, 1.52 יומן cd.sm -2, 5 שניות מרווח בין גירוי).
  10. כדי להעריך את יציבות השתל, אשר נבחנת על ידי השתנות האות לאורך זמן, לנהל הקלטות ERG ו VEP 7, 10, 14, 21 ו -28 ימים לאחר הניתוח.
  11. בעקבות תקופת הניסוי, להרדים חולדות באמצעות זריקה intracardial של pentobarbiturate (1.5 מ"ל / ק"ג) לאחר קטמין: הרדמה xylazine (12: 1 מ"ג / ק"ג).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תגובת קולטי האור מנותחת על ידי התאמת גאוס בפיגור על הקצה המוביל של איבר היורד הראשוני של תגובת ERG ב -2 האנרגיות המאירות העליונות (1.20, 1.52 יומן CSM -2) עבור כל חיה, על פי המודל של כבש Pugh 22, שגובשה על ידי הוד ליבנה 23. נוסחא זו המחזירה משרעת פרמטר רגיש, (איור 1 ג ו 1D, בהתאמה). פונקציה היפרבולית הייתה מצוידת לתגובת האנרגיה המאירה של תאים דו קוטביים מוט עבור כל חיה, אשר גם חזיר משרעת פרמטר רגיש, (איור 1E ו 1F בהתאמה). משרעת תא דו קוטבי Cone נותחה כתגובת שיא של הגל (גל דף של איור 1A ו -1 B), עם זמן מרומז נלקח כמו הזמן שלקח להגיע בתגובת שיא. לפרטים נוספים ראה ואח Charng 24.

איור 1 א 'וב' מציג צורת גל ERG ± ומשווקי מנועי חיפוש (n = 8) בחולדות מודעות לכל יום 7 ו -28 לאחר ניתוח. צורות הגל להיראות מעט גדול ביום 28 לעומת יום 7, אבל ניתוח מודל מעורב ליניארי עולה כי אין השפעה זמן משמעותי (p = 0.14 ל 0.67) עבור קולטי האור (כהה מותאם PIII) משרעת (תרשים 1C) ורגישות (1D איור ); מוט תא דו קוטבית (כהה מותאם PII) משרעת (איור 1E) ורגישות (איור 1F); חרוט דו קוטבי תא (מותאמות אור PII) משרעת (איור 1G) וזמן מרומז (איור 1H). באופן דומה, SEMs waveform VEP (n = 8, איור 2 א) מופיע דומה ב -7 ו -28 ימים לאחר ניתוח, עם משרעת (איור 2B ו 2C) ועיתוי (2D איור - 2F) פרמטריםמראה שום אפקט זמן משמעותי (p = 0.20 כדי 0.93). תוצאות אלו מצביעות על יציבות אות ERG ו VEP חזקה.

אות לרעש הממוצע (SNR, n = 8) יחס של שניהם (איור 3 א) ERG ו VEP (איור 3 ב) חזרו יציבות טובה יותר מחמשת הקלטה המודעים. בתרחיש זה, אות ERG מוגדרת כמו משרעת תגובת P2 ERG בעוד רעש היא הפסגה המקסימלי לשוקת משרעת מחושב מ -10 מרווח מראש גירוי msec. ב VEP, משרעת P2-N1 הוא ייחשב כאיתות בעוד רעש מוחזר גם על ידי השיא לשוקת 10 מראש המרווח גירוי msec. לא היתה השפעה משמעותית על פני זמן SNR של שני ERG ו VEP (p = 0.49 ו- 0.62 בהתאמה).

איור 1
איור 1: תצוגת Electroretinograms המודעת Characteris Waveforms טיק ומדידות הדירות (A - B). גל ERG ± ומשווקי מנועי חיפוש (n = 8) על פני מגוון רחב של אנרגיות המאירה ביום 7 (א) ו -28 (ב) שלאחר הניתוח. (CF) רוד ופרמטרים חרוט ERG הם זממו נגד הזמן לאחר ההשתלה. רוד (כהה מותאם PIII) משרעת photoreceptoral (C) ורגישות (D), תא דו קוטבית מוט (המותאמות כהה PII) משרעת (E) ורגישות (F), ו מדוך דו קוטבית (המותאמות אור PII) משרעת (G ) וזמן מרומז (H) כל הראה הקלטות יציבות ב -5 מפגשים. כל הסמלים מציינים את הערך הממוצע (± SEM). נתון זה יש הבדל בין ואח Charng. 24 איור 4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 2
איור 2: Conscious חזותית פוטנציאלים מעוררים תערוכת Waveforms מאפיין ומדידות הדירות (א) גל VEP ± ומשווקי מנועי חיפוש (n = 8) הם זממו ביום 7 ו -28 שלאחר הניתוח.. (B - F) פרמטרים משרעת והעיתוי VEP מוערכים מעל 1 חודש לאחר ההשתלה. P1-N1 (B) ו- P2-N1 (C) משרעת וכן P1 (D), N1 (E) ו P2 (F) פרמטרים זמן מרומז כולם היו יציבים לאורך 5 ההקלטות. כל הסמלים מציינים את הערך הממוצע (± SEM). נתון זה יש הבדל בין ואח Charng. 24 איור 6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ontent "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 3
איור 3:. מערכת טלמטריה מדגים יחס אות לרעש יציב לאורך זמן יחס אות לרעש של (א) ERG ו- (ב) VEP לא שונו באופן משמעותי לאורך זמן (n = 8). כל הסמלים מציינים את הערך הממוצע (± SEM). נתון זה יש הבדל בין Charng et al. 24 איור S1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשל אופיו פולשנית של אלקטרופיזיולוגיה חזותית, קלטות ERG ו VEP בחולים אנושיים מתנהלות בתנאים מודעים רק דורשות שימוש בהרדמה מקומית עבור מיקום האלקטרודה. לעומת זאת, אלקטרופיזיולוגיה חזותי במודלים של בעלי חיים מתנהל כמקובל בהרדמה כללית כדי לאפשר מיקום האלקטרודה יציב על ידי ביטול תנועות עיניים וגוף מרצון. עם זאת, הרדמה כללית הנפוץ לשנות את תגובות ERG ו VEP כפי שמוצגת על ידי בפרסום הקודם שלנו 24 ואחרים 25-27. כמו פיתוח כזה של פלטפורמת ERG ו VEP מודעת במודל מכרסם מספק ייצוג מעולה של תגובות פיסיולוגיות במודלים של בעלי חיים, שעשוי בתורו להרשות translatability טוב יותר מן הפרה-קליני כדי ממצאים קליניים. חסרון נוסף של בהרדמה הוא שזה מגביל את משך ניסוי. באופן ספציפי יותר, שימוש בחומרי הרדמה ממושכת וכן administ חזרמנה של הרדמה יכול להגדיל את הסיכוי של תופעות לוואי כגון סמים לבנות ובעיות נשימה הקשורות 28.

מחקר זה הראה כי מערכת טלמטריה בחולדות מודעות חזרה יציבות אות ERG ו VEP חזקות לפחות לאחר ניתוח 28 ימים. הקבוצה שלנו היא הראשונה שערכו תגובות ERG ו VEP אלחוטיות מודעות בו זמנית 24 ו כתב היד הזה מפרט את פעולות כירורגיות והקלטה מעורבות. השוואת הליכי כירורגיים אחרים שנערכו עם קלטות ERG ו VEP קווית מודעות להמחיש יציבות מעולה של ERG ואת דירות שווות בהקלטות VEP פני תקופת 1 חודש 15.

ההליכים הכירורגיים וההקלטות מודעות עוקבות יש הפוטנציאל להיות מיושם על מודלים של בעלי חיים שונים. הפלטפורמה כוללת תועלת פוטנציאלית ביישומים רבים שבם זה מועיל כדי למנוע בלבול הקשורים הרדמה 29. כולל אלהגילוי תרופות אודה, תרגום משופרת מחקרים בבני אדם, וניסויים כרוניים או אורך.

שינויים אפשריים לטכניקה לכלול שינוי מספר ערוצי biopotential מושתלים והקליטו בו זמנית. זה יכול להשתנות מ 1 עד 4 מוביל biopotential ובכך יכול למדוד אלקטרופיזיולוגיה חזותי עורר מבין 1 עין 2 עיניים ו -2 הקורטקס הראייתי. ראוי לציין, כי השינוי במספר ערוצי biopotentials מוביל גם השינוי של רוחב הלהקה הקליט אשר תהיינה השלכות על אותות אלקטרו בתדירות גבוהה. לדוגמא משדר 3 ערוץ biopotential ששמש במחקר זה (F50-EEE) נבחר להראות שזה אפשרי להקליט בו זמנית עורר חזותי תגובות מהרשתית ואת קליפת ראייה של עכברוש מודע. עם זאת, משדרי ערוץ 3 אלה יש רוחב פס של 1 - 100 הרץ, אשר יכול בנאמנות להקליט ERG a- ו ב-גלי אבל תשנה הפוטנציאלים תנודתית בגלל their גבוה בתדר 24. לעומת זאת, אם זה היה עניין במחקר להקליט פוטנציאלים תנודתית ואז משדר עם ערוצי הקלטה פחות (כלומר, רוחב פס רחב יותר) יכול להיות מועסק. אפשר גם עבור גירוי האור להיות שינה, למשל במקום לנהל שדה מלא ERG ו VEP, פיזיולוגיה חזותית בתגובה להבהב גירויים יכול גם להיות מנוצל.

מגבלה עיקרית אחת בתרגום בטכניקה זו כדי במודלים של בעלי חיים אחרים היא בגודל של העין של החיה. לא צריך אחת בעיות השתלת האלקטרודות העינית לבעלי חיים הגדולה יותר מאשר חולדות. עם זאת, זה יהיה מאתגר להשתיל את האלקטרודה ERG על גבי עין עכבר בשל שטח העבודה הקטן יותר. השתלת קליפת המוח, מצד השני, צריכה להיות פשוטה יחסית לביצוע ברוב בחיות מעבדה.

ישנם כמה היבטים של הניתוח שצריכה נצפה מקרוב כדי להבטיח implantatio המוצלחn. זה הכרחי כי טבעת אלקטרודה ERG נוצרה לתוך טבעת חלקה עקב גירוי שעלול להיגרם על ידי כל קצוות גסים על הלולאה. השתלת אלקטרודות פעילה ERG היא הקלה על ידי שני הנסיינים במקביל, אחד לייצב את העין ואילו השני מצרף את האלקטרודה בלובן העין. יש לשים לב במיוחד כדי לנקוט כדי להבטיח תפר scleral (2.2.19) הוא רק חצי עובי, כמו תפר scleral בעובי מלא ימוטט את גלגל העין ולגרום דליפה הזגוגית. השתלת אלקטרודות על הגולגולת (VEP פעיל ERG / VEP אלקטרודות פעילה) היא פחות טכנית תובעני מזה של אלקטרודות ERG. אף על פי כן, קיים הכרח כי פעם האלקטרודות מעוגנים לגולגולת, החוטים מותרים כדי ליישר טבעי להפחית כל מתח מיותר. התאקלמות כדי עוצר ההקלטה לפני ההשתלה כירורגית יתרון להפחית תנועות מוגזמות במהלך הקלטות ERG ו VEP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioamplifier ADInstruments ML 135 Amplifies ERG and VEP signals
Carboxymethylcellulose sodium 1.0% Allergan CAS 0009000-11-7 Maintain corneal hydration during surgery
Carprofen 0.5% Pfizer Animal Health Group CAS 53716-49-7 Post-surgery analgesia, given with injectable saline for fluid replenishment
Chlorhexadine 0.5% Orion Laboratories 27411, 80085 Disinfection of surgical instrument
Cyanoacrylate gel activator RS components 473-439 Quickly dries cyanoacrylate gel
Cyanocrylate gel  RS components 473-423 Fix stainless screws to skull
Dental burr Storz Instruments, Bausch and Lomb E0824A Miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws
Drill Bosch Dremel 300 series Automatic drill for trepanning
Enrofloxin Troy Laboratories Prophylactic antibiotic post surgey
Ganzfeld integrating sphere Photometric Solutions International Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size
Gauze swabs Multigate Medical Products Pty Ltd 57-100B Dries surgical incision and exposed skull surface during surgery
Isoflurane 99.9% Abbott Australasia Pty Ltd CAS 26675-46-7 Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery
Kenacomb ointment Aspen Pharma Pty Ltd To reduce skin irritation and itching after surgery
Luxeon LEDs Phillips Lighting Co. For light stimulation, twenty 5 W and one 1 W LEDs, controlled by Scope software
Needle (macrosurgery) World Precision Instruments 501959 for suturing abdominal and head surgery, used with 3 - 0 suture, eye needle, cutting edge 5/16 circle Size 1, 15 mm
Needle holder (macrosurgery) World Precision Instruments 500224 To hold needle during abdominal and head surgery
Needle holder (microsurgery) World Precision Instruments 555419NT To hold needle during ocular surgery
Optiva catheter Smiths Medical International LTD 16 or 21 G Guide corneal active electrodes from skull to conjunctiva
Povidone iodine 10% Sanofi-Aventis CAS 25655-41-8 Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML 785 Acquire signal from telemetry transmitter, paired to telemetry data converter
Proxymetacaine 0.5% Alcon Laboratories  CAS 5875-06-9 Topical ocular analgesia
Restrainer cutom made Front of the restrainer is tapered to minimize head movement, length can be adjusted to accommodate different rat length, overall diameter is 60 mm. 
Scapel blade R.G. Medical Supplies SNSM0206 For surgical incision
Scissors (macrosurgery) World Precision Instruments 501225 for cutting tissue on the abodmen and forhead
Scissors (microsurgery) World Precision Instruments 501232 To dissect the conjunctiva for electrode attachment
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus via the ADI Powerlab system and collects data
Shaver Oster Golden A5 Shave fur from surgical areas
Stainless streel screws  MicroFasteners L001.003CS304 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length 
Stereotaxic frame David Kopf Model 900 A small animal stereotaxic instrument for locating the implantation landmarks on the skull
Surgical drape Vital Medical Supplies GM29-612EE Ensure sterile enviornment during surgery
Suture (macrosurgery) Ninbo medical needles 3-0 for suturing abdominal and head surgery, sterile silk braided, 60 cm
Suture needle (microsurgery) Ninbo medical needles 8-0 or 9-0 for ocular surgery including, suturing electrode to sclera and closing conjunctival wound, nylon suture, 3/8 circle 1 × 5, 30 cm
Telemetry data converter  DataSciences International R08 allows telemetry signal to interface with data collection software
Telemetry Data Exchange Matrix DataSciences International Gathers data from transmitters, pair with receiver
Telemetry data receiver DataSciences International RPC-1 Receives telemetry data from transmitter
Telemetry transmitter DataSciences International F50-EEE 3 channel telemetry transmitter
Tropicamide 0.5% Alcon Laboratories  Iris dilation
Tweezers (macrosurgery) World Precision Instruments 500092 Manipulate tissues during abdominal and head surgery
Tweezers (microsurgery) World Precision Instruments 500342 Manipulate tissues during ocular surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frishman, L. J. Origins of the Electroretinogram. , The MIT Press. (2006).
  2. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J Physiol. 77, 207-239 (1933).
  3. Brown, K. T. The eclectroretinogram: its components and their origins. Vision Res. 8, 633-677 (1968).
  4. Brown, K. T., Murakami, M. Biphasic Form of the Early Receptor Potential of the Monkey Retina. Nature. 204, 739-740 (1964).
  5. Kline, R. P., Ripps, H., Dowling, J. E. Generation of b-wave currents in the skate retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 75, 5727-5731 (1978).
  6. Krasowski, M. D., et al. Propofol and other intravenous anesthetics have sites of action on the gamma-aminobutyric acid type A receptor distinct from that for isoflurane. Mol Pharmacol. 53, 530-538 (1998).
  7. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J Gen Physiol. 93, 101-122 (1989).
  8. Nixon, P. J., Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. The contribution of cone responses to rat electroretinograms. Clin Experiment Ophthalmol. 29, 193-196 (2001).
  9. Weinstein, G. W., Odom, J. V., Cavender, S. Visually evoked potentials and electroretinography in neurologic evaluation. Neurol Clin. 9, 225-242 (1991).
  10. Sand, T., Kvaloy, M. B., Wader, T., Hovdal, H. Evoked potential tests in clinical diagnosis. Tidsskr Nor Laegeforen. 133, 960-965 (2013).
  11. Brankack, J., Schober, W., Klingberg, F. Different laminar distribution of flash evoked potentials in cortical areas 17 and 18 b of freely moving rats. J Hirnforsch. 31, 525-533 (1990).
  12. Creel, D., Dustman, R. E., Beck, E. C. Intensity of flash illumination and the visually evoked potential of rats, guinea pigs and cats. Vision Res. 14, 725-729 (1974).
  13. Herr, D. W., Boyes, W. K., Dyer, R. S. Rat flash-evoked potential peak N160 amplitude: modulation by relative flash intensity. Physiol Behav. 49, 355-365 (1991).
  14. Guarino, I., Loizzo, S., Lopez, L., Fadda, A., Loizzo, A. A chronic implant to record electroretinogram, visual evoked potentials and oscillatory potentials in awake, freely moving rats for pharmacological studies. Neural Plast. 11, 241-250 (2004).
  15. Szabo-Salfay, O., et al. The electroretinogram and visual evoked potential of freely moving rats. Brain Res Bull. 56, 7-14 (2001).
  16. Valjakka, A. The reflection of retinal light response information onto the superior colliculus in the rat. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245, 1199-1210 (2007).
  17. Lapray, D., Bergeler, J., Dupont, E., Thews, O., Luhmann, H. J. A novel miniature telemetric system for recording EEG activity in freely moving rats. J Neurosci Methods. 168, 119-126 (2008).
  18. Lim, K., Burke, S. L., Armitage, J. A., Head, G. A. Comparison of blood pressure and sympathetic activity of rabbits in their home cage and the laboratory environment. Exp Physiol. 97, 1263-1271 (2012).
  19. Nguyen, C. T., Brain, P., Ivarsson, M. Comparing activity analyses for improved accuracy and sensitivity of drug detection. J Neurosci Methods. 204, 374-378 (2012).
  20. Ivarsson, M., Paterson, L. M., Hutson, P. H. Antidepressants and REM sleep in Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley rats. Eur J Pharmacol. 522, 63-71 (2005).
  21. He, Z., Bui, B. V., Vingrys, A. J. The rate of functional recovery from acute IOP elevation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 4872-4880 (2006).
  22. Lamb, T. D., Pugh, E. N. A quantitative account of the activation steps involved in phototransduction in amphibian photoreceptors. J Physiol. 449, 719-758 (1992).
  23. Hood, D. C., Birch, D. G. Rod phototransduction in retinitis pigmentosa: estimation and interpretation of parameters derived from the rod a-wave. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 2948-2961 (1994).
  24. Charng, J., et al. Conscious wireless electroretinogram and visual evoked potentials in rats. PLoS Onez. 8, e74172 (2013).
  25. Galambos, R., Szabo-Salfay, O., Szatmari, E., Szilagyi, N., Juhasz, G. Sleep modifies retinal ganglion cell responses in the normal rat. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 2083-2088 (2001).
  26. Meeren, H. K., Van Luijtelaar, E. L., Coenen, A. M. Cortical and thalamic visual evoked potentials during sleep-wake states and spike-wave discharges in the rat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 108, 306-319 (1998).
  27. Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122, 163-176 (2011).
  28. Amouzadeh, H. R., Sangiah, S., Qualls, C. W. Jr, Cowell, R. L., Mauromoustakos, A. Xylazine-induced pulmonary edema in rats. Toxicol Appl Pharmacol. 108, 417-427 (1991).
  29. Charng, J., et al. Retinal electrophysiology is a viable preclinical biomarker for drug penetrance into the central nervous system. J Ophthalmol. , (2016).

Tags

התנהגות גיליון 112 אלקטרופיזיולוגיה טלמטריה electroretinogram פוטנציאל עורר חזותי בהכרה הרדמה
השרשה ורישום האלחוטי electroretinogram ופוטנציאל חזותי מעורר אצל חולדות Conscious
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Charng, J., He, Z., Bui, B.,… More

Charng, J., He, Z., Bui, B., Vingrys, A., Ivarsson, M., Fish, R., Gurrell, R., Nguyen, C. Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats. J. Vis. Exp. (112), e54160, doi:10.3791/54160 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter