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Behavior

आरोपण और वायरलेस electroretinogram की रिकॉर्डिंग और यह जानते हुए चूहे में दृश्य पैदा संभावित

Published: June 29, 2016 doi: 10.3791/54160
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Department of Optometry and Vision Sciences, University of Melbourne, 2Pfizer Neusentis

Summary

हम शल्य आरोपण और रिकॉर्डिंग प्रक्रियाओं आंख (electroretinogram) और होश में चूहों में मस्तिष्क (दृश्य पैदा की क्षमता) है, जो मानव हालत जहां रिकॉर्डिंग संज्ञाहरण घालमेल के बिना आयोजित कर रहे हैं के लिए और अधिक अनुरूप है से दृश्य electrophysiological संकेतों को मापने के लिए दिखा।

Abstract

पूरे क्षेत्र electroretinogram (एर्ग) और दृश्य पैदा की क्षमता (VEP) दोनों प्रयोगशाला और नैदानिक ​​सेटिंग में रेटिना और दृश्य मार्ग अखंडता का आकलन करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं। वर्तमान में, preclinical एर्ग और VEP माप संज्ञाहरण के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं स्थिर इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट सुनिश्चित करने के लिए। हालांकि, संज्ञाहरण की उपस्थिति बहुत सामान्य शारीरिक प्रतिक्रियाओं को दूषित करने के लिए दिखाया गया है। इन संज्ञाहरण घालमेल कर दिया है पर काबू पाने के लिए, हम होश में चूहों में एर्ग और VEP की परख के लिए एक उपन्यास मंच का विकास। इलेक्ट्रोड शल्य चिकित्सा द्वारा आंख एर्ग परख और epidurally दृश्य कोर्टेक्स VEP को मापने के लिए खत्म करने के लिए पर प्रत्यारोपित कर रहे उप conjunctivally। आयाम और संवेदनशीलता का एक रेंज / समय पैरामीटर चमकदार ऊर्जा बढ़ाने के लिए दोनों एर्ग और VEP के लिए यत्न कर रहे हैं। एर्ग और VEP संकेतों कम से कम 4 सप्ताह के बाद शल्य आरोपण के लिए स्थिर और repeatable होना दिखाया गया है। संज्ञाहरण के बिना एर्ग और VEP संकेतों रिकॉर्ड करने के लिए इस क्षमता preclinical एस में घालमेलEtting नैदानिक ​​डेटा के लिए बेहतर अनुवाद प्रदान करना चाहिए।

Introduction

एर्ग और VEP विवो उपकरण में न्यूनतम इनवेसिव क्रमशः दोनों प्रयोगशाला और क्लिनिक में रेटिना और दृश्य रास्ते की अखंडता का आकलन करने के लिए कर रहे हैं। पूरे क्षेत्र एर्ग एक विशेषता तरंग जो विभिन्न घटकों में विभाजित किया जा सकता है प्रत्येक तत्व रेटिना मार्ग 1,2 के अलग सेल वर्गों का प्रतिनिधित्व करने के साथ, अर्जित करता है। क्लासिक पूरे क्षेत्र एर्ग तरंग एक प्रारंभिक नकारात्मक ढलान (एक-लहर), जो फोटोरिसेप्टर गतिविधि पोस्ट प्रकाश जोखिम 2-4 का प्रतिनिधित्व करने के लिए दिखाया गया है के होते हैं। एक-एक लहर काफी सकारात्मक तरंग (ख-तरंग) जो मध्यम रेटिना, मुख्य रूप से पर द्विध्रुवी कोशिकाओं 5-7 की विद्युतीय गतिविधि को दर्शाता द्वारा पीछा किया जाता है। इसके अलावा, एक लोहे की छड़ की प्रतिक्रियाएं 8 से कोन को अलग-थलग करने के लिए चमकदार ऊर्जा और अंतर प्रोत्साहन अंतराल भिन्न हो सकते हैं।

फ्लैश VEP रेटिना प्रकाश उत्तेजना के जवाब में दृश्य कोर्टेक्स और मस्तिष्क स्टेम की बिजली क्षमता का प्रतिनिधित्व करता है9,10। इस तरंग जल्दी और देर घटकों में विभाजित किया जा सकता है, जल्दी घटक retino-geniculo-रेखायुक्त मार्ग 11-13 और देर घटक चूहों 11,13 में विभिन्न V1 laminae में प्रदर्शन cortical प्रसंस्करण का प्रतिनिधित्व करने के न्यूरॉन्स की गतिविधियों को दर्शाती है। इसलिए एर्ग और VEP के एक साथ माप दृश्य मार्ग में शामिल संरचनाओं की व्यापक मूल्यांकन रिटर्न।

वर्तमान में, क्रम में पशुओं में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्ड करने के लिए, संज्ञाहरण इलेक्ट्रोड के स्थिर प्लेसमेंट सक्षम करने के लिए कार्यरत है। वहाँ होश में चूहों 14-16 में एर्ग और VEP को मापने के लिए प्रयास किया गया है लेकिन इन अध्ययनों से एक दूसरे से जुड़े सेटअप, जो बोझिल हो सकता है और पशुओं के आंदोलन और प्राकृतिक व्यवहार 17 सीमित द्वारा पशु तनाव को जन्म दे सकती कार्यरत हैं। सुधार miniaturization और बैटरी जीवन सहित वायरलेस प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों के साथ, यह अब एर्ग एक के लिए एक टेलीमेटरी दृष्टिकोण को लागू करने के लिए संभव हैडी VEP रिकॉर्डिंग, वायर्ड रिकॉर्डिंग और दीर्घकालिक व्यवहार्यता में सुधार के साथ जुड़े तनाव कम करें। टेलीमेटरी जांच के पूरी तरह से भली भाँति स्थिर implantations तापमान, रक्तचाप 18, गतिविधि 19 की पुरानी निगरानी के साथ ही electroencephalography 20 के लिए सफल साबित किया है। प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में इस तरह के अग्रिम भी repeatability और सचेत रिकॉर्डिंग की स्थिरता के साथ सहायता, पुरानी अध्ययन के लिए मंच की उपयोगिता बढ़ जाएगी।

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Protocol

आचार बयान: पशु प्रयोगों वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए देखभाल और उपयोग पशु की (2013) के लिए ऑस्ट्रेलियाई संहिता के अनुसार आयोजित की गई। पशु आचार अनुमोदन पशु आचार समिति, मेलबोर्न विश्वविद्यालय से प्राप्त हुई थी। माल के साथ साथ प्रयोगशाला प्रयोगों ही है, और न चिकित्सा या पशु चिकित्सा उपयोग के लिए इरादा कर रहे हैं।

1. तैयारी इलेक्ट्रोड्स

नोट: एक तीन चैनल ट्रांसमीटर शल्य आरोपण जो 2 एर्ग और 1 VEP रिकॉर्डिंग में सक्षम बनाता है एक साथ आयोजित किया जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। तीन सक्रिय और निष्क्रिय तीन इलेक्ट्रोड आदेश आंख को संलग्न करने में आरोपण से पहले एक अंगूठी के आकार में पूर्व जमाने की जानी चाहिए। पहचान के प्रयोजनों के लिए, निर्माता, आधा सफेद में सक्रिय इलेक्ट्रोड संलग्न किया गया है आधे रंग की प्लास्टिक शीथ, जबकि निष्क्रिय इलेक्ट्रोड पूर्ण रंग शीथ में कवर कर रहे हैं। जमीन इलेक्ट्रोड (स्पष्ट प्लास्टिक म्यान) अनछुए रह गया है। सभी सक्रिय और निष्क्रिय electr के लिएOdes आचरण 1.1, 1.2, 1.3 और 1.7 कदम।

  1. दो ठीक इत्तला दे दी सरौता के साथ डबल असहाय स्टेनलेस स्टील इलेक्ट्रोड सुलझाना।
  2. स्टेनलेस स्टील किस्में (टिप से लगभग 1 सेमी) के एक ट्रिम, एक भी लंबे समय तक सीधे अंगूठी इलेक्ट्रोड आकार देने के लिए शेष किनारा छोड़ने।
  3. एकल स्टेनलेस स्टील किनारा वापस ही है और मोड़ पर मोड़ो, इलेक्ट्रोड की नोक पर एक चिकनी अंगूठी बनाने।
  4. एर्ग सक्रिय इलेक्ट्रोड फैशन के लिए इस लूप ~ 0.2 - 0.5 पाश के आधार घुमा द्वारा व्यास में मिमी (प्रयोजन यहाँ वर्णित के लिए, इस तरह से दोनों आंखों से एर्ग रिकॉर्ड करने के लिए में दो सक्रिय इलेक्ट्रोड आकार), और के लिए एर्ग निष्क्रिय और VEP इलेक्ट्रोड पाश व्यास ~ 0.8 मिमी व्यास (इस उदाहरण में, यह एक सक्रिय VEP इलेक्ट्रोड और सभी तीन निष्क्रिय इलेक्ट्रोड के लिए करते हैं) बनाते हैं।
  5. एक स्टेनलेस स्टील के पेंच (व्यास 0.7 मिमी, लंबाई 3 मिमी) तो इलेक्ट्रोड पेंच सिर के खिलाफ टिकी हुई है चारों ओर परिपत्र VEP सक्रिय इलेक्ट्रोड हुक।
  6. हू3 निष्क्रिय इलेक्ट्रोड (2 एर्ग, 1 VEP) एक दूसरे स्टेनलेस स्टील स्क्रू (व्यास 0.7 मिमी, लंबाई 3 मिमी) के चारों ओर।
  7. दो स्टेनलेस स्टील किनारा के तेज सिरों पर आगे प्लास्टिक आस्तीन खींचो जलन को कम करने के लिए।
  8. लगभग 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 से अधिक घंटे के लिए 2% glutaraldehyde में भिगोने से टेलीमेटरी ट्रांसमीटरों जीवाणुरहित। तो बाँझ खारा 3 बार के साथ ट्रांसमीटर कुल्ला।

2. ट्रांसमीटर आरोपण

  1. पशु तैयारी
    1. 70% इथेनॉल के साथ सफाई से प्रयोग करने से पहले शल्य चिकित्सा क्षेत्र कीटाणुरहित। उपयोग करने से पहले सभी सर्जिकल उपकरण आटोक्लेव और chlorhexidine में उपकरणों को बनाए रखने के लिए जब सर्जरी के दौरान उपयोग में नहीं है। सर्जरी के दौरान एक शल्य कपड़ा के साथ पशु कवर एक बाँझ वातावरण बनाए रखने के लिए। सुनिश्चित करें कि सभी प्रयोगकर्ताओं सर्जिकल मास्क, दस्ताने बाँझ और गाउन पहनते हैं।
    2. 1.5 के साथ संज्ञाहरण प्रेरित - 2% isoflurane, 3 एल / मिनट और maintai के प्रवाह की दर पर2 एल / मिनट सर्जरी भर में 2% - 1.5 पर नेड। पैर की उंगलियों के बीच पेशी बन्द रखो पर एक पेडल पलटा के अभाव से संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई की पुष्टि करें।
    3. उरोस्थि को कमर के ऊपर से पेट के ऊपर एक 40 मिमी x 30 मिमी क्षेत्र दाढ़ी।
    4. आंखों के पीछे माथे पर एक 30 मिमी x 20 मिमी क्षेत्र दाढ़ी, और कान के लिए पूर्वकाल।
    5. दो मुंडा क्षेत्रों कीटाणुरहित। माथे क्षेत्र के लिए 10% povidone आयोडीन तीन बार (सर्जिकल प्रौद्योगिकीविदों की एसोसिएशन द्वारा बाहर सेट, आंख के पास क्षेत्र के लिए शराब के आधार पर दवाइयों के उपयोग से बचने के अभ्यास के मानक के अनुरूप किया जा रहा है) के साथ कीटाणुरहित। पेट पर 10% povidone आयोडीन और 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित।
    6. अतिरिक्त सामयिक संज्ञाहरण के लिए कॉर्निया के लिए proxymetacaine की 1 बूंद लागू करें।
    7. कॉर्निया के लिए carboxymethylcellulose सोडियम की 1 बूंद लागू आंखों के सूखने को रोकने के लिए।
  2. शल्य आरोपण
    1. एक 10 मिमी चीराएक शल्य छुरी के साथ कान के बीच खड़ी midline के साथ सिर पर।
    2. उरोस्थि नीचे midline के साथ त्वचा की परत के माध्यम से पेट पर एक 5 मिमी चीरा।
    3. सुरंग सिर चीरा पेट चीरा से एक 5 मिमी व्यास प्रवेशनी subcutaneously।
    4. सिर के पेट से प्रवेशनी के माध्यम से ट्रांसमीटर के इलेक्ट्रोड तारों (3 सक्रिय और निष्क्रिय 3) फ़ीड।
    5. ट्रांसमीटर आधार के साथ संदर्भ इलेक्ट्रोड छोड़ दो और सड़न रोकनेवाला धुंध के साथ इलेक्ट्रोड टिप को कवर किया।
    6. मम्मियाँ धुंध के साथ इलेक्ट्रोड सुझावों (3 सक्रिय और निष्क्रिय 3) को कवर किया।
    7. एक stereotaxic मंच करने के लिए चूहे के सिर सुरक्षित।
    8. शल्य कैंची के साथ लंबाई में 30mm करने के माथे चीरा बढ़ाएँ।
    9. पर ~ 3 और 9 बजे - 2 टांके (0 3) के साथ ढीली त्वचा retracting द्वारा शल्य चिकित्सा क्षेत्र को बेनकाब।
    10. periosteum खोपड़ी निष्फल धुंध का उपयोग कर शीर्षस्थान, लैम्ब्डा और midline टांके बेनकाब करने के लिए overlying परिमार्जन। और निष्क्रिय (5 मिमी व्याख्यान चबूतरे midline पर शीर्षस्थान के लिए) (7 मिमी उदर 3 मिमी midline के लिए पार्श्व शीर्षस्थान के लिए) VEP सक्रिय पर खोपड़ी के माध्यम से दो छेद ड्रिल stereotaxic सह तालमेल।
    11. पूर्व संलग्न स्टेनलेस स्टील शिकंजा (व्यास 0.7 मिमी, लंबाई 3 मिमी) खोपड़ी के लिए एक छोटा सा स्क्रू ड्राइवर ~ 1 premade छेद में गहराई में मिमी के साथ साथ VEP सक्रिय और निष्क्रिय इलेक्ट्रोड संलग्न। यह अंतर्निहित cortical ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना हड्डी के लिए पेंच एंकर।
    12. प्रत्यारोपण एर्ग सक्रिय इलेक्ट्रोड एक 8 का उपयोग करें - 0 सिवनी अस्थायी रूप से ऊपरी पलक वापस लेना।
    13. बेहतर conjunctival तोरणिका के माध्यम से आँख के पीछे से एक 16 21 जी प्रवेशनी subcutaneously डालें।
    14. मार्गदर्शक सुई निकालें।
    15. आंख की ओर माथे से छोटा प्लास्टिक कैथेटर के माध्यम से सक्रिय इलेक्ट्रोड फ़ीड। फिर प्लास्टिक कैथेटर को हटा दें।
    16. एक अस्थायी सिवनी (8 - 0) का प्रयोग करें, जो इलेक्ट्रोड पाश के माध्यम से पिरोया है, चुनाव रोकने के लिएसुरंग में वापस retracting से लताड़ दिया।
    17. 12 बजे, किनारी पीछे 1 मिमी पर बेहतर कंजाक्तिवा पर एक 0.5 मिमी चीरा। अंतर्निहित श्वेतपटल बेनकाब करने के लिए कुंद विच्छेदन का प्रयोग करें।
    18. आधे scleral मोटाई में किनारी के पीछे तुरंत 0 सिवनी - प्रत्यारोपण एक 8 - 0 या 9।
    19. एर्ग सक्रिय इलेक्ट्रोड से अस्थायी सिवनी निकालें।
    20. लगातार 3 इलेक्ट्रोड की नोक सुनिश्चित गांठ बांधने से आधे scleral मोटाई सिवनी को एर्ग सक्रिय इलेक्ट्रोड एंकर किनारी के पास स्थित है।
    21. (0 - - 0 9 को 8) conjunctival फ्लैप 1 से 2 बाधित टांके का उपयोग कर बंद कर दें। सुनिश्चित करें कि कंजाक्तिवा पूरी तरह से आराम में सुधार करने एर्ग इलेक्ट्रोड शामिल किया गया है।
    22. पलक retracting सिवनी निकालें।
    23. contralateral आंख के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ।
    24. खोपड़ी के ऊपर cyanoacrylate जेल लागू सभी स्टेनलेस शिकंजा और इलेक्ट्रोड तारों को सुरक्षित करने के लिए। सुनिश्चित करें एर्ग सक्रिय इलेक्ट्रोड en को हासिल करने से पहले भी तंग नहीं निकाला जाता हैसक्षम आँख आंदोलनों।
    25. 0 सिवनी - एक गैर absorbable 3 का उपयोग कर सिर घाव को बंद करें।
    26. कृंतक घुमाएँ पेट क्षेत्र बेनकाब करने के लिए। शल्य कैंची के साथ LINEA अल्बा के साथ 40 मिमी के लिए पेट चीरा त्वचीय लंबा।
    27. भीतरी उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए आंतरिक मांसपेशियों दीवार के माध्यम से एक 35 मिमी चीरा।
    28. दो टांके (3 - 0) का प्रयोग जानवर के दाहिने हाथ की ओर भीतरी पेट की दीवार के लिए ट्रांसमीटर शरीर देते हैं। जिगर से संपर्क करने से बचें।
    29. लूप जमीन इलेक्ट्रोड और एक सिवनी (3 - 0) के साथ इस हालत में सुरक्षित। यह उदर गुहा में मुक्त अस्थायी रखें।
    30. एक सतत सिवनी (- 0 3) का उपयोग पेरिटोनियम बंद करें।
    31. बाधित टांके (- 0 3) का उपयोग त्वचा चीरा बंद करें।
  3. पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल
    1. पशु मॉनिटर जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए। हाउस पशु अकेले सर्जरी के बाद।
    2. carpr प्रशासनOFEN subcutaneously पीड़ानाश (5 मिलीग्राम / किग्रा) 4 दिनों के लिए एक दिन में एक बार के लिए।
    3. 7 दिन के बाद सर्जरी के लिए पीने के पानी के लिए रोगनिरोधी मौखिक एंटीबायोटिक दवाओं (Enrofloxin, 5 मिलीग्राम / किग्रा) जोड़ें।
    4. त्वचा चीरा साइटों के लिए एक विरोधी भड़काऊ मरहम लागू पहले 7 दिनों के बाद सर्जरी के लिए जलन को कम करने के लिए।

3. आचार एर्ग और यह जानते हुए चूहे में VEP रिकॉर्डिंग

  1. डार्क एर्ग और VEP रिकॉर्डिंग करने से पहले 12 घंटे के लिए पशुओं के लिए अनुकूलित
  2. मंद लाल रोशनी (17.4 cd.m -2, λ अधिकतम = 600 एनएम) के तहत सभी प्रयोगात्मक जोड़तोड़ का संचालन
  3. सामयिक संज्ञाहरण (0.5% proxymetacaine) और विस्फारित (0.5% tropicamide) कॉर्निया के लिए चला जाता लागू करें।
  4. एक कस्टम बनाया, स्पष्ट restrainer में सचेत कृंतक गाइड।
    नोट: इस प्लास्टिक ट्यूब की लंबाई कुल व्यास 60 मिमी पर तय साथ अलग अलग आकार में चूहों को समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। डिवाइस के सामने के छोर सिर मो कम करने के लिए पतला हैvement और सामान्य श्वास सक्षम करने के लिए छेद होता है। यह पतला सामने Ganzfeld क्षेत्र के उद्घाटन के लिए संरेखण और चूहे के सिर और आंखों के स्थिरीकरण की अनुमति देता है। ध्यान दें कि कृंतक restrainer (3 से 5 मौकों) सर्जरी से पहले करने के लिए acclimatized कर दिया गया है।
  5. आंखों के कटोरा के उद्घाटन के साथ गठबंधन के साथ Ganzfeld कटोरा के सामने कृंतक रखें।
  6. ट्रांसमीटर की ~ 5 सेमी के भीतर एक चुंबक से गुजर रहा निबाह ट्रांसमीटर चालू करें। सत्यापित करें कि ट्रांसमीटर रिसीवर आधार पर एलईडी स्थिति प्रकाश की जाँच करके पर है।
  7. के रूप में पहले 21 में वर्णित चमकदार ऊर्जा (यानी, -5.6 1.52 लॉग करने के लिए cd.sm -2) की एक सीमा से अधिक संकेतों लीजिए। संक्षेप में, उज्जवल चमकदार ऊर्जा पर मद्धम प्रकाश के स्तर (~ 80 दोहराता) और कम से कम औसत अधिक संकेतों (~ 1 दोहराने)। धीरे-धीरे dimmest से प्रतिभाशाली प्रकाश के स्तर के लिए 1 से 180 सेकंड से interstimulus अंतराल लंबा।
  8. एर्ग रॉड को अलग करने के लिएऔर शंकु प्रतिक्रियाएं एक जुड़वां फ्लैश प्रतिमान 8 का उपयोग। उदाहरण के लिए, -2 1.52 लॉग cd.sm में दो चमक एक 500 मिसे अंतर प्रोत्साहन अंतराल के बीच के साथ आरंभ करें।
  9. उज्जवल चमकदार ऊर्जा पर VEP का संकेत है, औसत 20 दोहराता रिकॉर्ड करने के लिए (यानी, 1.52 लॉग cd.sm -2, 5 सेकंड के अंतर प्रोत्साहन अंतराल)।
  10. प्रत्यारोपण स्थिरता, जो समय के साथ संकेत परिवर्तनशीलता द्वारा मूल्यांकन किया है का मूल्यांकन करने के लिए, आचरण एर्ग और VEP रिकॉर्डिंग 7, 10, 14, 21 और 28 दिनों के बाद सर्जरी।
  11. xylazine संज्ञाहरण (12: 1 मिलीग्राम / किग्रा) प्रयोगात्मक अवधि के बाद, pentobarbiturate की intracardial इंजेक्शन (1.5 मिलीग्राम / किग्रा) ketamine के बाद के माध्यम से चूहों euthanize।

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Representative Results

फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रिया, प्रत्येक जानवर के लिए शीर्ष 2 चमकदार ऊर्जा (1.20, 1.52 लॉग सीएसएम -2) पर एर्ग प्रतिक्रिया की प्रारंभिक उतरते अंग के अग्रणी किनारे करने के लिए एक देरी गाऊसी फिटिंग द्वारा विश्लेषण किया है और मेमने प्यूघ के मॉडल पर आधारित 22, डाकू और बिर्च 23 से तैयार की है। इस फार्मूले को एक आयाम और एक संवेदनशीलता पैरामीटर, (चित्रा 1 सी और 1 डी, क्रमशः) देता है। एक अतिशयोक्तिपूर्ण समारोह प्रत्येक जानवर के लिए छड़ी द्विध्रुवी कोशिकाओं के चमकीले ऊर्जा प्रतिक्रिया है, जो भी एक आयाम और एक संवेदनशीलता पैरामीटर, (चित्रा 1E और 1F क्रमशः) लौटे करने के लिए लगाया गया था। कोन द्विध्रुवी सेल आयाम तरंग के शिखर प्रतिक्रिया (चित्रा 1 ए और 1 बी के शीर्ष तरंग), समय यह चोटी प्रतिक्रिया तक पहुँचने के लिए ले ली के रूप में लिया अंतर्निहित समय के साथ के रूप में विश्लेषण किया गया था। अधिक जानकारी के लिए कृपया Charng एट अल देखना 24।

चित्रा 1 ए और बी 7 दिन में होश में चूहों में एसईएम (एन = 8) और 28 के बाद सर्जरी ± एर्ग तरंग से पता चलता है। Waveforms दिन 28 7 दिन की तुलना में थोड़ा बड़ा होना दिखाई देते हैं, लेकिन रैखिक मिश्रित मॉडल विश्लेषण (काले अनुकूलित PIII) आयाम (चित्रा 1 सी) फोटोरिसेप्टर के लिए (पी = 0.14 0.67 करने के लिए) कोई महत्वपूर्ण समय प्रभाव का पता चला और संवेदनशीलता (चित्रा -1 ); रॉड द्विध्रुवी सेल (काले अनुकूलित PII) आयाम (चित्रा 1E) और संवेदनशीलता (चित्रा 1F); कोन द्विध्रुवी सेल (प्रकाश अनुकूलित PII) आयाम (चित्रा 1G) और निहित समय (चित्रा 1H)। (- 2 एफ चित्रा 2 डी) पैरामीटर इसी तरह, VEP तरंग एसईएम (एन = 8, चित्रा 2A) आयाम (चित्रा 2 बी और 2 सी) और समय के साथ के बाद सर्जरी, 7 और 28 दिनों में तुलनीय दिखाईकोई महत्वपूर्ण समय प्रभाव दिखा (पी = 0.20 0.93 करने के लिए)। इन परिणामों के मजबूत एर्ग और VEP संकेत स्थिरता का संकेत मिलता है।

औसत संकेत करने वाली शोर (SNR, एन = 8) दोनों एर्ग (चित्रा 3 ए) के अनुपात और VEP (चित्रा 3 बी) पांच सचेत रिकॉर्डिंग सत्रों में अच्छा स्थिरता लौट आए। इस परिदृश्य में, एर्ग संकेत करते हुए शोर इसकी गणना 10 मिसे पूर्व उत्तेजना अंतराल से आयाम गर्त लिए अधिक से अधिक चोटी है एर्ग p2 की प्रतिक्रिया के आयाम के रूप में के रूप में परिभाषित किया गया है। VEP में, P2-एन 1 आयाम जबकि शोर भी चोटी से वापस आ रहा है 10 मिसे पूर्व उत्तेजना अंतराल के गर्त करने के लिए संकेत के रूप में माना जाता है। दोनों एर्ग और VEP के SNR (पी = 0.49 और 0.62 क्रमशः) भर में कोई महत्वपूर्ण समय प्रभाव था।

आकृति 1
चित्रा 1: होश में Electroretinograms प्रदर्शनी characterisटिक waveforms और repeatable माप (ए - बी)। एसईएम (एन = 8) दिन 7 (ए) और 28 (बी) में चमकदार ऊर्जा की एक विस्तृत श्रृंखला में ± एर्ग waveforms के बाद सर्जरी। (सीएफ) रॉड और कोन एर्ग मापदंडों के आरोपण के बाद समय के खिलाफ साजिश रची है। छड़ (काले अनुकूलित PIII) photoreceptoral आयाम (सी) और संवेदनशीलता (डी), रॉड द्विध्रुवी सेल (काले अनुकूलित PII) आयाम (ई) और संवेदनशीलता (एफ), और शंकु द्विध्रुवी सेल (प्रकाश अनुकूलित PII) आयाम (जी ) और निहित समय (एच) सभी 5 सत्रों में स्थिर रिकॉर्डिंग से पता चला है। सभी प्रतीकों औसत मूल्य (± SEM) से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा Charng एट अल से संशोधित किया गया है। 24 चित्रा 4. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वर्ग = "jove_content" fo: रख-together.within-पेज = "1"> चित्र 2
चित्रा 2: होश दृश्य पैदा की क्षमता एसईएम ± विशेषता waveforms और repeatable माप (ए) VEP waveforms प्रदर्शनी (एन = 8) दिन 7 और 28 के बाद सर्जरी पर प्लॉट किए जाते हैं।। (बी - एफ) VEP आयाम और समय पैरामीटर आरोपण के बाद 1 महीने से अधिक मूल्यांकन कर रहे हैं। P1-एन 1 (बी) और P2-एन 1 (सी) आयाम के रूप में अच्छी तरह के रूप में पी 1 (डी), एन 1 (ई) और p2 (एफ) निहित समय मापदंडों सभी 5 रिकॉर्डिंग सत्रों में स्थिर थे। सभी प्रतीकों औसत मूल्य (± SEM) से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा Charng एट अल से संशोधित किया गया है। 24 चित्रा 6 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ontent "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्र तीन
चित्रा 3:। टेलीमेटरी प्रणाली समय पर स्थिर सिग्नल के लिए शोर अनुपात को दर्शाता है (ए) का संकेत करने वाली शोर अनुपात एर्ग और (बी) VEP काफी बदल नहीं किया गया है समय के साथ (एन = 8)। सभी प्रतीकों औसत मूल्य (± SEM) से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा Charng एट अल। 24 चित्रा एस 1 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

दृश्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की न्यूनतम आक्रामक प्रकृति के कारण, मानव रोगियों में एर्ग और VEP रिकॉर्डिंग के प्रति जागरूक शर्तों के तहत आयोजित कर रहे हैं और केवल इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट के लिए सामयिक anesthetics के उपयोग की आवश्यकता है। इसके विपरीत, पशु मॉडल में दृश्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पारंपरिक सामान्य संज्ञाहरण के तहत आयोजित किया जाता है स्वैच्छिक आंख और शरीर की गतिविधियों को नष्ट करने से स्थिर इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट सक्षम करने के लिए। हालांकि, आमतौर पर इस्तेमाल सामान्य anesthetics एर्ग और VEP प्रतिक्रियाओं के रूप में हमारे पिछले प्रकाशन 24 और दूसरों को 25-27 के द्वारा दिखाया बदल। एक कृंतक मॉडल में एक सचेत एर्ग और VEP मंच के इस तरह के विकास के रूप में पशु मॉडल में शारीरिक प्रतिक्रियाओं, जो मई बदले में नैदानिक ​​निष्कर्षों के preclinical से बेहतर translatability बर्दाश्त के बेहतर प्रतिनिधित्व प्रदान करता है। संज्ञाहरण का उपयोग करने का एक और नुकसान है कि यह एक प्रयोग की अवधि को सीमित करता है। अधिक विशेष रूप से, लंबे समय तक संज्ञाहरण के उपयोग दोहराया administ के रूप में भीanesthetics के राशन ऐसी दवा का निर्माण और जुड़े सांस की समस्या 28 के रूप में प्रतिकूल प्रभाव की संभावना को बढ़ा सकते हैं।

इस अध्ययन से पता चला है कि होश में चूहों में टेलीमेटरी प्रणाली में कम से कम 28 दिनों के बाद सर्जरी के लिए मजबूत एर्ग और VEP संकेत स्थिरता लौट आए। हमारे समूह पहले एक साथ 24 सचेत वायरलेस एर्ग और VEP प्रतिक्रियाओं का संचालन करने के लिए है और इस पांडुलिपि शामिल शल्य चिकित्सा और रिकॉर्डिंग प्रक्रियाओं का विवरण। वायर्ड सचेत एर्ग और VEP रिकॉर्डिंग के साथ आयोजित अन्य शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की तुलना में एक 1 महीने की अवधि 15 से अधिक एर्ग में बेहतर स्थिरता और VEP रिकॉर्डिंग में बराबर repeatability वर्णन।

शल्य चिकित्सा तकनीक और बाद में होश में रिकॉर्डिंग क्षमता के विभिन्न पशु मॉडलों के लिए लागू किया जाना है। मंच के कई अनुप्रयोगों में संभावित उपयोगिता जहां यह संज्ञाहरण 29 के साथ जुड़े घालमेल से बचने के लिए भी फायदेमंद है। ये सहितUde दवाओं की खोज, मानव अध्ययन, और क्रोनिक या अनुदैर्ध्य प्रयोगों के लिए सुधार अनुवाद।

तकनीक के लिए संभावित संशोधनों प्रत्यारोपित और एक साथ दर्ज biopotential चैनलों की संख्या में फेरबदल शामिल हैं। यह 1 से 4 biopotential सुराग से भिन्न है और इस प्रकार 1 आंखों के लिए 2 के बीच आंखों और 2 दृश्य cortices से दृश्य पैदा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपाय कर सकता है कर सकते हैं। ध्यान दें कि biopotentials चैनलों की संख्या में परिवर्तन भी बैंड-चौड़ाई दर्ज की गई है जो उच्च आवृत्ति electrophysiological संकेतों के लिए प्रभाव पड़ेगा के संशोधन के लिए होता है। उदाहरण के लिए 3 चैनल biopotential इस अध्ययन (F50-ईईई) में इस्तेमाल किया ट्रांसमीटर को दिखाने के लिए कि यह एक साथ रेटिना और एक सचेत चूहे के दृश्य कोर्टेक्स से नेत्रहीन पैदा की प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए संभव है चुना गया था। 100 हर्ट्ज, जो ईमानदारी से एर्ग एक- और बी लहरों रिकॉर्ड कर सकते हैं, लेकिन उनके व्यापार के कारण oscillatory क्षमता बदल जाएगा - हालांकि, इन 3 चैनल ट्रांसमीटरों 1 के एक बैंड-चौड़ाई हैउच्च आवृत्ति 24 R। इसके विपरीत, यदि यह अध्ययन oscillatory क्षमता तो कम रिकॉर्डिंग चैनलों (यानी, व्यापक बैंड-चौड़ाई) नियोजित किया जा सकता है के साथ एक ट्रांसमीटर को रिकॉर्ड करने के लिए ब्याज की थी। यह भी संभव है के लिए प्रकाश प्रोत्साहन बजाय उत्तेजनाओं भी उपयोग किया जा सकता झिलमिलाहट के जवाब में पूरे क्षेत्र एर्ग और VEP, दृश्य शरीर क्रिया विज्ञान के संचालन के लिए उदाहरण के लिए, बदल सकता है।

अन्य पशु मॉडल के लिए इस तकनीक का अनुवाद करने में एक प्रमुख सीमा जानवर की आंख के आकार है। एक जानवरों के लिए नेत्र इलेक्ट्रोड चूहों से भी बड़ा दाखिल कोई समस्या नहीं होनी चाहिए। हालांकि, यह छोटे क्षेत्र में काम करने के कारण एक माउस आंख पर एर्ग इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण करने के लिए चुनौतीपूर्ण होगा। cortical आरोपण, दूसरे हाथ पर, अपेक्षाकृत सबसे प्रयोगशाला पशुओं में प्रदर्शन करने के लिए स्पष्ट किया जाना चाहिए।

वहाँ बारीकी से सफल implantatio सुनिश्चित करने के लिए मनाया जा करने की जरूरत है कि सर्जरी के कई पहलू हैंएन। यह आवश्यक है कि एर्ग इलेक्ट्रोड की अंगूठी है कि लूप पर कोई किसी न किसी किनारों द्वारा प्रेरित किया जा सकता है जलन के कारण एक चिकनी रिंग में बनाई है। एर्ग सक्रिय इलेक्ट्रोड का आरोपण दो समवर्ती प्रयोगकर्ताओं द्वारा सुविधा है, एक आंख को स्थिर करने के लिए, जबकि अन्य श्वेतपटल करने के लिए इलेक्ट्रोड देता है। विशेष देखभाल scleral सिवनी (2.2.19) सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना है केवल आधा मोटाई, के रूप में एक पूर्ण मोटाई scleral सिवनी नेत्रगोलक पंचर और कांच का रिसाव का कारण होगा। खोपड़ी पर इलेक्ट्रोड का आरोपण (VEP सक्रिय और एर्ग / VEP निष्क्रिय इलेक्ट्रोड) कम तकनीकी एर्ग इलेक्ट्रोड की है कि अधिक से अधिक मांग है। फिर भी, यह जरूरी है कि एक बार इलेक्ट्रोड खोपड़ी के लिए लंगर डाले हैं, तारों स्वाभाविक रूप से फहरना के लिए किसी भी अनावश्यक तनाव कम करने के लिए अनुमति दी जाती है। शल्य दाखिल करने से पहले रिकॉर्डिंग restrainer को Acclimatization एर्ग और VEP रिकॉर्डिंग के दौरान अत्यधिक आंदोलनों को कम करने के लिए फायदेमंद है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioamplifier ADInstruments ML 135 Amplifies ERG and VEP signals
Carboxymethylcellulose sodium 1.0% Allergan CAS 0009000-11-7 Maintain corneal hydration during surgery
Carprofen 0.5% Pfizer Animal Health Group CAS 53716-49-7 Post-surgery analgesia, given with injectable saline for fluid replenishment
Chlorhexadine 0.5% Orion Laboratories 27411, 80085 Disinfection of surgical instrument
Cyanoacrylate gel activator RS components 473-439 Quickly dries cyanoacrylate gel
Cyanocrylate gel  RS components 473-423 Fix stainless screws to skull
Dental burr Storz Instruments, Bausch and Lomb E0824A Miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws
Drill Bosch Dremel 300 series Automatic drill for trepanning
Enrofloxin Troy Laboratories Prophylactic antibiotic post surgey
Ganzfeld integrating sphere Photometric Solutions International Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size
Gauze swabs Multigate Medical Products Pty Ltd 57-100B Dries surgical incision and exposed skull surface during surgery
Isoflurane 99.9% Abbott Australasia Pty Ltd CAS 26675-46-7 Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery
Kenacomb ointment Aspen Pharma Pty Ltd To reduce skin irritation and itching after surgery
Luxeon LEDs Phillips Lighting Co. For light stimulation, twenty 5 W and one 1 W LEDs, controlled by Scope software
Needle (macrosurgery) World Precision Instruments 501959 for suturing abdominal and head surgery, used with 3 - 0 suture, eye needle, cutting edge 5/16 circle Size 1, 15 mm
Needle holder (macrosurgery) World Precision Instruments 500224 To hold needle during abdominal and head surgery
Needle holder (microsurgery) World Precision Instruments 555419NT To hold needle during ocular surgery
Optiva catheter Smiths Medical International LTD 16 or 21 G Guide corneal active electrodes from skull to conjunctiva
Povidone iodine 10% Sanofi-Aventis CAS 25655-41-8 Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML 785 Acquire signal from telemetry transmitter, paired to telemetry data converter
Proxymetacaine 0.5% Alcon Laboratories  CAS 5875-06-9 Topical ocular analgesia
Restrainer cutom made Front of the restrainer is tapered to minimize head movement, length can be adjusted to accommodate different rat length, overall diameter is 60 mm. 
Scapel blade R.G. Medical Supplies SNSM0206 For surgical incision
Scissors (macrosurgery) World Precision Instruments 501225 for cutting tissue on the abodmen and forhead
Scissors (microsurgery) World Precision Instruments 501232 To dissect the conjunctiva for electrode attachment
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus via the ADI Powerlab system and collects data
Shaver Oster Golden A5 Shave fur from surgical areas
Stainless streel screws  MicroFasteners L001.003CS304 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length 
Stereotaxic frame David Kopf Model 900 A small animal stereotaxic instrument for locating the implantation landmarks on the skull
Surgical drape Vital Medical Supplies GM29-612EE Ensure sterile enviornment during surgery
Suture (macrosurgery) Ninbo medical needles 3-0 for suturing abdominal and head surgery, sterile silk braided, 60 cm
Suture needle (microsurgery) Ninbo medical needles 8-0 or 9-0 for ocular surgery including, suturing electrode to sclera and closing conjunctival wound, nylon suture, 3/8 circle 1 × 5, 30 cm
Telemetry data converter  DataSciences International R08 allows telemetry signal to interface with data collection software
Telemetry Data Exchange Matrix DataSciences International Gathers data from transmitters, pair with receiver
Telemetry data receiver DataSciences International RPC-1 Receives telemetry data from transmitter
Telemetry transmitter DataSciences International F50-EEE 3 channel telemetry transmitter
Tropicamide 0.5% Alcon Laboratories  Iris dilation
Tweezers (macrosurgery) World Precision Instruments 500092 Manipulate tissues during abdominal and head surgery
Tweezers (microsurgery) World Precision Instruments 500342 Manipulate tissues during ocular surgery

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References

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व्यवहार अंक 112 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी टेलीमेटरी electroretinogram दृश्य पैदा की क्षमता है जागरूक संज्ञाहरण
आरोपण और वायरलेस electroretinogram की रिकॉर्डिंग और यह जानते हुए चूहे में दृश्य पैदा संभावित
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Charng, J., He, Z., Bui, B.,… More

Charng, J., He, Z., Bui, B., Vingrys, A., Ivarsson, M., Fish, R., Gurrell, R., Nguyen, C. Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats. J. Vis. Exp. (112), e54160, doi:10.3791/54160 (2016).

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