Introduction
Estimulación Magnética Transcraneal Repetitiva (rTMS), una herramienta para la estimulación cerebral no invasiva y neuromodulación, se ha aplicado en el tratamiento de diversas condiciones tales como dolor central 1,2, depresión 3, migraña 4, e incluso ictus 5-7. La rápida evolución de la corriente eléctrica a través de bobinas en la cabeza induce un campo eléctrico en la corteza cerebral y una activación neuronal resultante. La excitabilidad de la corteza cerebral puede ser modulada por rTMS, que pueden durar durante más de 30 min después de la estimulación se termina.
Los mecanismos sugeridos de los rTMS efecto posterior incluyen la potenciación a largo plazo / efecto-depresión, tales como 8, cambio transitorio en equilibrio iónico 9 y 10 cambios metabólicos. Además, Di Lazzaro et al. sugieren que la estimulación theta-burst intermitente afecta a las entradas sinápticas excitadoras de neuronas piramidales de las vías, tanto en el estimuladoy el hemisferio contralateral 11.
limitaciones significativas, sin embargo, han obstaculizado los investigadores de la conversión de pruebas en laboratorio a situaciones clínicas. En primer lugar, en estudios previos en animales, estimulación magnética transcraneal repetitiva se utiliza para la estimulación de todo el cerebro 12. Estimulación de todo el cerebro es muy diferente de los protocolos utilizados en los estudios en humanos 9. El otro problema está relacionado con la duración de la estimulación. Esto es al menos en parte atribuible al hecho de que un sistema de enfriamiento eficaz no estaba disponible para las pequeñas bobinas en el pasado.
En los últimos años, los artículos seminales se han publicado sugiriendo formas para superar estas dificultades en el experimento rTMS en el cerebro pequeño animal. Por estos modelos animales, se reveló que el cerebro de rata también muestra cambios excitabilidad cortical similares a los humanos en respuesta a la rTMS de baja frecuencia 13. Más importante aún, los mecanismos celulares y moleculares de la rTMS son cada vez más being investigó utilizando modelos animales de rTMS. Un ejemplo de ello es que un tipo distinto de interneuronas inhibitoria es conocido por ser más sensibles a la estimulación theta ráfaga intermitente 14. modelos de roedores de rTMS, por lo tanto, ofrecen nuevas oportunidades para explorar cuestiones muy solicitado en las bases moleculares de los cambios inducidos por la estimulación magnética transcraneal repetitiva. Si los pequeños modelos animales de rTMS se pueden utilizar en varios laboratorios, se puede acelerar en gran medida y fortalecer la investigación en esta área.
A continuación se describe cómo aplicar estimulación magnética transcraneal repetitiva en el hemisferio unilateral de cerebro de rata, una extensión del trabajo previo 15. cambios estimulación inducida se evaluaron mediante el uso de tomografía micro-tomografía de emisión de (PET) y microarrays de ARNm para estudiar los cambios rTMS inducida en la corteza cerebral estimulado.
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Protocol
Todos los procedimientos que utilizan animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Hospital Universitario Nacional de Seúl.
1. Configuración Experimental
- preparación de animales
- Permitir ratas macho Sprague-Dawley de 1 semana a adaptarse a su nuevo entorno antes de iniciar el experimento.
NOTA: Aunque las ratas de 8 semanas de edad fueron utilizados en el presente estudio, desarrollo o cerebro adulto puede ser elegido de acuerdo con las hipótesis de investigación.
- Permitir ratas macho Sprague-Dawley de 1 semana a adaptarse a su nuevo entorno antes de iniciar el experimento.
- La anestesia de inhalación para la inducción
- Inducir y mantener la anestesia con 5% y el 2% de isoflurano disuelto en 40% / 60% y 25% / 75% de oxígeno / nitrógeno a través de un cono de cámara y la nariz, respectivamente. Ajustar la profundidad de la anestesia hasta el nivel de la abolición de la retirada reflejo pedal para pizca dedo del pie para confirmar la anestesia adecuada.
NOTA: El uso de animales despertado puede ser una mejor opción en términos de traslación, pero hay dificultades para frenar durante rTMS y tey son propensos al estrés excesivo. - Monitorear la temperatura corporal con una sonda rectal y mantenerla a 37 ° C mediante el uso de una manta homeotérmica. Monitorear la profundidad anestésica mediante pedal del reflejo de retirada, la temperatura, la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca.
- Inducir y mantener la anestesia con 5% y el 2% de isoflurano disuelto en 40% / 60% y 25% / 75% de oxígeno / nitrógeno a través de un cono de cámara y la nariz, respectivamente. Ajustar la profundidad de la anestesia hasta el nivel de la abolición de la retirada reflejo pedal para pizca dedo del pie para confirmar la anestesia adecuada.
- Conmutación a la anestesia intravenosa para el mantenimiento
- Preparar la cola con un algodón con alcohol. Cateterizar la vena lateral de la cola con un catéter venoso de calibre 24 para la transición a la anestesia IV (Figura 1A). Carga de propofol por vía intravenosa (1 mg / kg [· min] durante 10 min, utilizando 10 mg / ml de emulsión) a los animales. Suspender el isoflurano 5 minutos después de comenzar la carga de propofol.
- Mantener la sedación con propofol a una velocidad de infusión de 500 - 700 g / (kg · min) durante todo el experimento, como en un estudio previo 16. Suplemento de oxígeno a 0,8 l / min a través de un cono de la nariz.
NOTA: La anestesia con propofol es reducir la supresión potencial de la excitabilidad cortical por el inhalagente ación 17-19. Sin embargo, la anestesia no es obligatoria en los experimentos de rTMS, y los animales despertado también se puede utilizar. métodos de anestesia deben decidirse teniendo en cuenta las hipótesis de investigación. - Utilice la pomada veterinaria en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
- Aplicar la estimulación magnética (véase la Sección 2) 10 minutos después de la transición completa a la anestesia iv.
- condiciones de recuperación
- Monitorear los signos vitales durante la fase de recuperación. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Si un animal ha sido sometido a cirugía, no lo devuelva a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
NOTA: Si se realiza una cirugía para un modelo de la enfermedad, el tratamiento del dolor post-quirúrgico es necesario. Sin embargo, no es necesario el manejo del dolor para este experimento rTMS.
- Monitorear los signos vitales durante la fase de recuperación. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Si un animal ha sido sometido a cirugía, no lo devuelva a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
2. Estimulación Magnética Transcraneal Repetitiva
- Estimulador y la bobina
- Aplicar la estimulación mediante el uso de un estimulador repetitivo que ofrece estímulos bifásicos a través de una figura-8 bobina 25 mm. Localizar el centro de la bobina de 0,5 cm lateral al vértice en la línea biauricular, y en ángulo de la bobina de 45 ° con el suelo.
NOTA: La intensidad de campo magnético máxima de la bobina es 4,0 T. La bobina magnética está montado firmemente en un soporte incorporado.
- Aplicar la estimulación mediante el uso de un estimulador repetitivo que ofrece estímulos bifásicos a través de una figura-8 bobina 25 mm. Localizar el centro de la bobina de 0,5 cm lateral al vértice en la línea biauricular, y en ángulo de la bobina de 45 ° con el suelo.
- Motor umbral
- Determinar el umbral motor (MT) en el punto caliente, con el centro de la bobina posicionada 0,5 cm lateral al vértice en la línea biauricular y con la superficie plana sobre la bóveda craneal. Esta es la misma metodología utilizada en un estudio previo 20.
NOTA: Definir MT como la intensidad mínima de estímulo que evoca 5 o más palpables las contracciones en la pata contralateral en 10 estímulos consecutivos. Compruebe si la estimulación está causando principalmente la contracción del músculo contralateral para garantizar la estimulación unilateral. - Aplicación de rTMS
- Aplicar rTMS 10 min después de la estabilización de la anestesia profunda. Colocar el centro de la bobina en el sitio de rTMS diana, seleccionado de las cortezas cerebrales en función de las preguntas de investigación. Entonces, la inclinación de la bobina para asegurar un contacto directo entre el centro de la bobina y la superficie del cráneo en el punto de estimulación.
NOTA: Por ejemplo, dispuesto en ángulo de la bobina 45 ° con respecto al suelo para minimizar un posible efecto directo de la estimulación magnética transcraneal repetitiva en la corteza contralateral (Figura 1B y 1C). - Someter a los animales a una sesión de 20 minutos rTMS del hemisferio unilateral. Uso de la consola de software, entregar rTMS con una baja frecuencia (1 Hz), alta frecuencia (20 Hz), o protocolo de estimulación simulada, y ajustar la intensidad de la estimulación a 100 - 110% de la MT.
- Realizar 1 Hz de estimulación sin descanso. Uso de la entrada de la consola de software "1200" inyecciones para "20" min). Para la estimulación 20 Hz, realizar 2 segundos de estimulación seguido por 28seg de descanso. Uso de la entrada de la consola de software "1600" inyecciones para "20" min.
- Para la estimulación simulada, incline la bobina perpendicular (90 ° de rotación) a la bóveda craneal y coloque el borde de la bobina 2 cm de distancia de la superficie de la cabeza (Figura 1D). Fije el soporte de la bobina firmemente al aparato principal; no hay necesidad de mantener la bobina con la mano durante el experimento.
NOTA: Para compensar los efectos no específicos acústicos y otros, protocolos simulados diferentes deben ser utilizados para protocolos de estimulación distintos. Por ejemplo, la estimulación simulada 1-Hz se puede utilizar para 1 Hz rTMS experimentos.
- Aplicar rTMS 10 min después de la estabilización de la anestesia profunda. Colocar el centro de la bobina en el sitio de rTMS diana, seleccionado de las cortezas cerebrales en función de las preguntas de investigación. Entonces, la inclinación de la bobina para asegurar un contacto directo entre el centro de la bobina y la superficie del cráneo en el punto de estimulación.
- El enfriamiento de la bobina
- Utilice un sistema de refrigeración por agua para permitir la estimulación magnética repetitiva durante más de 20 min a 1 y 20 Hz frecuencias de estimulación (Figura 2). Hacer circular agua helada que rodea toda la longitud de la bobina durante el experimento para evitar el sobrecalentamiento, aunque la temperatura de la bobina o estimulador no se supervisa.
NOTA: bobinas de rata enfriadas disponibles comercialmente también se pueden utilizar. - Si es posible, controlar la temperatura de la batería mediante la visualización del indicador de calentamiento de la máquina rTMS. NOTA: No hubo consecuencias adversas relacionadas con la estimulación rTMS. Hay, sin embargo, un riesgo de quemaduras potencial si las etiquetas de identificación del oído de metal se utilizan cerca de la bobina estimulante.
- Utilice un sistema de refrigeración por agua para permitir la estimulación magnética repetitiva durante más de 20 min a 1 y 20 Hz frecuencias de estimulación (Figura 2). Hacer circular agua helada que rodea toda la longitud de la bobina durante el experimento para evitar el sobrecalentamiento, aunque la temperatura de la bobina o estimulador no se supervisa.
3. Micro por emisión de positrones
- preparación de animales
- Llevar a cabo la anestesia de inhalación para la inducción de la anestesia y iv para el mantenimiento (véase el paso 1.2.1 y 1.3.1). Aplicar de 1 Hz rTMS a un animal durante 10 minutos a una intensidad de estimulación de 100 a 110% de la MT.
- Cinco minutos después de terminar la estimulación rTMS, inyectar 1 mCi de 2- [F-18] fluoro-desoxiglucosa (FDG 18) disuelto en 0,5 ml de solución salina normal por vía intravenosa mediante el uso de un catéter de vena de la cola. Permita 30 minutos para el 18 de captación de FDG. NOTA: Coloque la rata bajo anestesia durante la totalidad de micro-PET experimento.
- Análisis de imagen
- Utilizar un escáner PET de imágenes del cerebro para reafirmar la unilateralidad de la estimulación. Reconstruir imágenes con un algoritmo iterativo 3-D. Para evaluar los cambios en el metabolismo inducidos por la estimulación magnética transcraneal repetitiva, identificar regiones de interés (ROI) en las imágenes de las secciones transversales del cerebro 21.
- Eutanasia
- Después de realizar la imagen micro-PET, la eutanasia a las ratas en una cámara previamente llenado con dióxido de carbono, mientras que las ratas están en anestesia profunda.
4. mRNA de microarrays
- Eutanasia
- Inducir y mantener la anestesia con 5% y el 2% de isoflurano disuelto en 40% / 60% y 25% / 75% de oxígeno / nitrógeno a través de un cono de cámara y la nariz, respectivamente. Anestesiar profundamente al nivel de abolir el reflejo de retirada pedal para pellizco del dedo del pie antes de ser decapitado.
- Decapitar a las ratas para la eutanasia 5 minutos después de 1 sesión de 1 Hz rTMS.
- la cosecha de tejidos
- Coloque los materiales e instrumentos quirúrgicos en el orden de uso, incluyendo toallas plegadas de papel, un rongeur hueso, micro tijeras, tijeras quirúrgicas más grandes, una microforcep, una hoja de bisturí No. 10 o 11, una tapa 10-cm placa de Petri de vidrio lleno de hielo y tubos de 1,5 ml. Prepare una bolsa de plástico para la eliminación de la canal.
- Hacer una incisión en la piel en la línea media en el anterioposteriorly cráneo. Sin rodeos diseccionar los tejidos blandos y los músculos circundantes con unas tijeras quirúrgicas, y retire el trozo de hueso del cráneo utilizando una gubia ósea. diseccionar rápidamente el cerebro fresco y cuidadosamente el cráneo. A continuación, ponerlo en hielo utilizando los microforceps y micro tijeras. Enjuague el tejido cerebral en solución salina normal enfriada con hielo.
- Transferir el cerebro para hielo seco inmediatamente, y posteriormente almacenarlo a -80 ° C en un tubo hasta su posterior procesamiento.
- Descongelar el tejido cerebral antes de la cosecha.
- Coloque el lado dorsal del cerebro, y cosechar el tejido cerebral del stimulated corteza cerebral (alrededor del punto caliente en la corteza motora primaria) en el hielo utilizando los microforceps y micro tijeras. Poner el tejido recogido en el tubo de 1,5 ml.
- preparación de ARN
- Extraer el ARN total a partir de homogeneizados de tejidos utilizando el reactivo de lisis 22. Proceso de la digestión con DNasa y procedimientos de limpieza. Cuantificar el RNA de muestras y alícuotas y almacenar a -80 ° C hasta su uso.
- Para el control de calidad, evaluar la pureza y la integridad del ARN por electroforesis en gel desnaturalizante, a una relación de OD de 260: 280, y analizarlos en un analizador disponible comercialmente.
- Etiquetado y purificación
- Amplificar y purificar el ARN total mediante el uso de un kit de amplificación de ARN disponible comercialmente para producir cRNA biotinilado. Brevemente, inversa transcribir 550 ng de ARN total en ADNc usando un cebador de T7 oligo (dT). Sintetizar e in vitro transcribir la segunda cadena de cDNA y luego etiquetarla con biotina-NTP.
- después purficación, cuantificar ADNc mediante el uso de un espectrofotómetro.
- La hibridación y los datos de exportación 23
- Utilice la BeadChip expresión para el análisis de la expresión del ARNm. Hibridar los 750 ng muestras de ADNc marcadas a cada rata-12 expresión de bolas de serie de 16 - 18 horas a 58 ° C. Llevar a cabo la detección de la señal múltiple mediante el uso de estreptavidina-Cy3.
- matrices de escaneo con un escáner confocal. Realizar el procesamiento de exportación de datos de matriz y el análisis mediante el uso de un software disponible en el mercado.
- Determinar el umbral motor (MT) en el punto caliente, con el centro de la bobina posicionada 0,5 cm lateral al vértice en la línea biauricular y con la superficie plana sobre la bóveda craneal. Esta es la misma metodología utilizada en un estudio previo 20.
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Representative Results
Quince de 8 semanas de edad ratas Sprague-Dawley fueron utilizados para un análisis entre los calificadores fiabilidad de la determinación separada MT. El uso de la palpación de contracciones musculares, los MTs se podían obtener en todas las ratas y se mide como 33.00 ± 4.21% de salida máxima estimulador (MSO%) y 33,93 ± 0,88% MSO, respectivamente, por dos investigadores independientes. sesgo de Bland y Altman fue -0.93, y los límites de 95% de acuerdo a la -9.13 eran 7,26%.
En el experimento de micro-PET en seis ratas de 8 semanas de edad (n = 4 en los rTMS 1 Hz, y n = 2 en el grupo rTMS falsa), la captación de 18 F-FDG en el rendimiento de la inversión se calcula como el promedio nCI / cc después de la calibración de ambas cortezas cerebrales ipsilateral y contralateral en las mismas imágenes. La radiactividad en la zona contralateral se usó como una referencia para normalizar los datos obtenidos en el área ipsilateral, y se calculó la relación de adsorción de diferencial (DUR).Los Durs medios obtenidos a partir de tres imágenes transversales consecutivos se promediaron para obtener el Durs para las ratas. Esta es la misma metodología utilizada en un estudio previo 21. 18 imágenes PET-FDG mostraron un aumento focal en el metabolismo de la glucosa en el área cortical izquierda estimulado en el grupo de 1 Hz, el apoyo a la unilateralidad de los rTMS (Figura 3).
En el estudio de microarrays de ARNm, la calidad del desempeño de hibridación y el chip en general fueron controlados por inspección visual, tanto de los controles de calidad internos y los datos escaneados primas. datos de la matriz se filtraron de acuerdo con un valor de detección de p <0,05 (similar a la relación de señal a ruido) en al menos 50% de las muestras (se requiere un valor de señal más alta para obtener un valor de detección de p <0,05). El valor de la señal gen seleccionado fue transformada por logaritmo y normalizó mediante el uso de un método de cuantiles. La significación estadística de la expresión data se determinó usando la prueba de Mann-Whitney U y doble cambio, en el que la hipótesis nula de que no existe diferencia entre la 1-Hz rTMS (n = 4) y los grupos sham (n = 4). La tasa de falso descubrimiento se controla ajustando el valor de p utilizando el algoritmo de Benjamini-Hochberg. Después de la normalización y filtrado, los ARNm que muestra expresiones diferenciales significativos (| cambio veces | 1,2, p <0,05) fueron seleccionados. Como resultado, los niveles de expresión de los genes tempranos inmediatos fueron significativamente mayores en el grupo de rTMS que en el grupo de tratamiento simulado, con las expresiones del arco, JunB, y los genes Egr2 upregulated (Figura 4A).
Además, se midió expresiones de ARNm de BDNF en la corteza contralateral estimulado y después de 5 días consecutivos de 20 min-estimulación magnética transcraneal repetitiva (n = 5 cada uno en la de 1 Hz y 20 Hz-grupos). Después de la estimulación de 1 Hz, la expresión de ARNm de BDNF fue significativamente higher en la corteza estimulado que en el contralateral (Figura 4B). Esto reveló rTMS inducida por los cambios en los diferenciales cortezas cerebrales estimuladas y contralateral.
Figura 1. Ajustes experimentales. (A) Un catéter intravenoso se inserta en una vena lateral de la cola (flecha), y un cono de nariz se utiliza para la anestesia con isoflurano, así como para suplemento de oxígeno después de una transición a propofol intravenoso. (B ) vista anterolateral dorsal durante la estimulación magnética transcraneal repetitiva. (vista posterior C) dorsal. La superficie de una bobina de figura de 8 forma un ángulo de 45 ° con el suelo para reducir al mínimo el potencial de la estimulación directa de la corteza contralateral. (D) una ilustración esquemática de rTMS falsa. La bobina se coloca 2 cm de distancia de e inclinado perpendicular (90 ° de rotación)a la bóveda craneal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. El sistema de refrigeración utiliza una bomba de agua de circulación con Motor. Embalaje de hielo en los cables de cobre de la bobina no es necesaria, ya que el sistema de refrigeración que envuelve el cable de la bobina es suficiente para enfriar el calor producido en los cables de cobre. La superficie de la bobina no está en contacto directo con el agua helada. El sistema de refrigeración está activo durante las sesiones de estimulación.
Figura 3. Tomografía por Emisión de Positrones (PET) de imágenes. (A) Las secciones coronales de imágenes de micro-PET deuna rata obtenido utilizando 2- [F-18] fluoro-desoxiglucosa, que muestra el aumento del metabolismo de la glucosa local en la corteza estimulada después de rTMS 1 Hz durante 10 minutos a 100% de los MT (flechas). (b) la relación de captación de FDG en la corteza estimulada / contralateral en el 1-Hz (n = 4) y la falsa rTMS grupo (n = 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. El mRNA de microarrays de los genes tempranos inmediatos y BDNF. (A) Arco, JunB, y Egr2 fueron expresados diferencialmente, que fueron identificados en el microarray obtuvieron 5 minutos después de 1 sesión de 1 Hz rTMS, ordenada por el cambio veces. Los niveles de expresión de los genes fueron significativamente mayores en el grupo de rTMS (n = 4) than en el grupo de tratamiento simulado (n = 4) (p <0,05 con Mann-Whitney U test), con la expresión de los genes de Arco, JunB, y Egr2 upregulated. (B) Después de 5 días consecutivos de 20 minutos a 1 Hz rTMS, la expresión del ARNm de BDNF fue significativamente mayor en la corteza estimulada que en el lado contralateral (* p <0,05, prueba de Wilcoxon signed-rank). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El propósito principal de este estudio fue la introducción de un modelo animal de rTMS unilaterales. Aunque la estimulación unilateral es una de las características más fundamentales de la investigación rTMS humanos, muchos estudios no lo han adoptado en pequeños animales. Sin embargo, Rotenberg et al. 15 registraron eurodiputados contralateral con estimulación del MT 100% usando una bobina en forma de 8 con un diámetro exterior de lóbulo 20 mm, mientras que la estimulación con 112,5% y 133,3% MT produce ipsilateral, así como eurodiputados contralateral. Esto podría ser debido a que el campo eléctrico inducido grande puede afectar el hemisferio contralateral. Por lo tanto, nuestro estudio es una extensión de este trabajo previo 15,24, moviendo la bobina más lateral y la inclinación a acentuar la estimulación unilateral. El objetivo principal de este estudio se logró debido a que confirmó que las micro-PET reveló un aumento local en el metabolismo de la glucosa en la corteza cerebral estimulada después de estimulación magnética transcraneal repetitiva (Figura 3).
jove_content "> Ubicación y la angulación de la bobina son pasos críticos en este experimento. estimulación unilateral es posible colocando el centro de la EMTr bobina 1 cm lateral al vértice en la línea biauricular y angulación a las bobinas 45 ° con el suelo. La estimulación el sitio puede ser diferente de la corteza motora primaria (M1), dependiendo de la condición que los investigadores desea orientar rTMS. Por ejemplo, destinado a mejorar la depresión, la corteza prefrontal dorsolateral (CPFDL) se estimula con rTMS, pero el umbral motor, que también se mide en M1, determina la intensidad de la estimulación incluso para CPFDL rTMS del mismo modo, el punto de acceso -. 0,5 cm lateral al vértice en la línea biauricular - se utilizó para determinar el umbral motor en el presente estudio la corteza más lateral -. 1 cm lateral al vértice - fue seleccionado intencionalmente para asegurar la unilateralidad de la estimulación e investigar los cambios moleculares rTMS inducida. ve_content "> En cuanto a la intensidad del campo magnético dentro del tejido, en un estudio previo elemento modelado finito en el campo eléctrico inducido en el cerebro de ratón, el campo eléctrico inducido por el 70 mm figura-8 bobina a 75% MSO alcanzó aproximadamente 150 V / m en la superficie del cerebro y en la corteza. la intensidad de campo eléctrico se redujo drásticamente como la distancia aumenta, mostrando la profundidad máxima con mayor que 100 V / m fuerza era sólo 1,9 mm para la figura-8 bobina 70 mm 25. en otra rata estudio, a 10 mm de profundidad de la intensidad de campo eléctrico inducido se redujo hasta el 25% de los que en la superficie del cerebro 26. Curiosamente, la región media de potencia (HPR) era tan amplio como ~ 7 x 7 mm (0,51 cm 2) incluso cuando un 25 mm figura-8 bobina se utilizó 25. Aunque los números de hormigón no se proporcionaron para el 70 mm en forma de 8 de la bobina, Salvador y Miranda comentaron que la HPR para la bobina 70 mm era más grande que el de la bobina de 25 mm. Ya que queríamos evitar que el HPR de cubrir lahemisferio contralateral, se seleccionó un punto 1 cm lateral a la línea media. La inclinación era inevitable para asegurar el contacto directo entre el centro de la bobina y la superficie del cráneo en el punto de estimulación.La anestesia puede potencialmente deprimir la excitabilidad neuronal, metabolismo de la glucosa, y la expresión génica. Haghighi et al. puesto de manifiesto que el isoflurano a una concentración de 0,5% significativamente deprimidos eurodiputados transcraneal eléctricas registradas de ratas 17. Por otra parte, los eurodiputados se conservaron durante la infusión de propofol de hasta 40 mg / [kg · h], con amplitudes grandes restante en ratas 18. En un estudio en seres humanos, no se detectaron los potenciales de acción muscular compuesto (CMAP) durante la anestesia con isoflurano. Sin embargo, 333 Hz, la estimulación magnética de cuatro impulsos evocados CMAP en el músculo hipotenar en 75% de los pacientes, y en el músculo tibial anterior en 65% de los pacientes, durante la anestesia propofol 19. El uso de animales despertado puede ser una mejor opción en los Physaspectos IOLÓGICA, pero no son fáciles de sujetar durante rTMS y son propensos a condiciones de estrés.
Como solución de problemas, un refrigerador simple que utiliza una bomba de circulación de agua nos ha permitido extender la duración de la estimulación durante más de 20 minutos, incluso a una frecuencia de estimulación de 20 Hz. Esto es importante ya que permite a la mayor cantidad de estímulos como en los protocolos de rTMS para sujetos humanos. El enfriamiento de la bobina en forma de 8 con sólo una bolsa de agua enfriada con hielo de mano no era suficiente para garantizar la estimulación de más de 20 min. rTMS duración larga en pequeños animales proporcionará la oportunidad para una investigación a fondo de los mecanismos moleculares de la estimulación magnética transcraneal repetitiva. bobinas de rata enfriados comercialmente disponibles serán las alternativas razonables.
Hay varias limitaciones en este experimento. En primer lugar, solamente un impulso bifásico estaba disponible, que era una limitación de la máquina rTMS se utilizó. serán necesarios futuros estudios que investigan el efecto de varios pulsos y formas de onda.En segundo lugar, hemos adoptado un enfoque pragmático para determinar el umbral motor por palpación. Aunque este método puede ser inferior a las técnicas de EMG en términos de precisión, es fácilmente reproducible y aplicable a muchas hipótesis de investigación. Por ejemplo, si el propósito primario de un investigador fueron para investigar las diferencias entre la corteza motora primaria y subcortices adyacentes en el gen inducida por rTMS o expresión de la proteína, la determinación más precisa de umbral motor sería necesario. Si un investigador, sin embargo, querido analizar, pueden ser suficientes rTMS inducida por perfiles de expresión génica en el tejido cortical prefrontal dorsolateral el enfoque pragmático presente, ya que la distancia y el ángulo entre el tejido diana y la bobina pueden variar ligeramente durante el movimiento de la bobina de la M1 a la zona de córtex prefrontal dorsolateral. En tercer lugar, a pesar de que la rTMS aplicado con éxito en el hemisferio unilateral del cerebro de la rata, siendo la estimulación no es tan central como rTMS en la investigación humana. La fuerte eléctrico inducidocampo de ~ 0,5 cm 2 con menos de 10 cm 2 de la superficie de cerebro de rata parece relativamente más difusa que la de la superficie hemisférica humana de ~ 2.500 cm 2 27. Creemos, sin embargo, que el modelo presentado en este documento puede ser utilizado para elucidar los mecanismos moleculares de la estimulación magnética transcraneal repetitiva al permitir el análisis de la diferencia entre hemisférica en su efecto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Homeothermic blanket with a rectal probe | Harvard apparatus | 507222F | |
| Isoflurane (Forane sol.) | Choongwae | ||
| Propofol (Provive Inj. 1% 20 ml) | Claris Lifesciences | ||
| Repetitive magnetic stimulator (Magstim Rapid2) | Magstim Company Ltd | ||
| 25 mm figure-of-8 coil | Magstim Company Ltd | 1165-00 | |
| PET-CT | GE Healthcare | ||
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | (US Patent No. 5,346,994) | |
| RNeasy Lipid Tissue Mini Kit | Qiagen | 74804 | |
| RNeasy Mini Spin Columns | Qiagen | (Mat No. 1011708) | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Ambion Illumina RNA amplification kit | Ambion | ||
| Nanodrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| Illumina RatRef-12 Expression BeadChip | Illumina, Inc. | ||
| Amersham fluorolink streptavidin-Cy3 | GE Healthcare Bio-Sciences |
References
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