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Behavior

चूहा मस्तिष्क के एकतरफा गोलार्ध के लिए दोहराव transcranial चुंबकीय उत्तेजना

Published: October 22, 2016 doi: 10.3791/54217
Automatic Translation
1,2, 2,3,4, 5, 6, 7, 7
1Department of Rehabilitation Medicine, Chungnam National University Hospital, Daejeon, 2Department of Biomedical Engineering, Seoul National University College of Medicine, 3Institute of Medical and Biological Engineering, Medical Research Center, Seoul National University, 4Department of Biomedical Engineering, Seoul National University Hospital, 5Department of Nuclear Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul National University College of Medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Gangwon Do Rehabilitation Hospital, 7Department of Rehabilitation Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul National University College of Medicine

Introduction

दोहराव transcranial चुंबकीय उत्तेजना (rTMS), गैर इनवेसिव मस्तिष्क उत्तेजना और neuromodulation के लिए एक उपकरण है, इस तरह के केंद्रीय दर्द 1,2, अवसाद 3, माइग्रेन 4, और यहां तक कि स्ट्रोक 5-7 के रूप में विभिन्न शर्तों के उपचार में लागू किया गया है। तेजी से कॉयल के माध्यम से विद्युत धारा को बदलने के सिर सेरेब्रल कॉर्टेक्स और एक परिणामी न्यूरोनल सक्रियण पर एक बिजली के क्षेत्र लाती है। सेरेब्रल कॉर्टेक्स के excitability rTMS, जो अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए पिछले के बाद उत्तेजना समाप्त होता है सकते द्वारा संग्राहक जा सकता है।

बाद प्रभाव rTMS का सुझाव दिया तंत्र दीर्घकालिक potentiation / अवसाद की तरह प्रभाव 8, आयनिक संतुलन 9 में क्षणिक पारी शामिल है, और चयापचय परिवर्तनों 10। इसके अलावा, Di Lazzaro एट अल। सुझाव है कि रुक-रुक कर थीटा-फट उत्तेजना दोनों प्रेरित में, पथ न्यूरॉन्स पिरामिड को उत्तेजक synaptic आदानों को प्रभावित करता हैऔर contralateral गोलार्द्ध 11।

महत्वपूर्ण सीमाओं, हालांकि, नैदानिक ​​स्थितियों पर बेंच सबूत अनुवाद से शोधकर्ताओं रुकावट है। सबसे पहले, पिछले जानवरों के अध्ययन में, rTMS पूरे मस्तिष्क की उत्तेजना 12 के लिए इस्तेमाल किया गया था। पूरे मस्तिष्क उत्तेजना मानव अध्ययन 9 में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल से काफी अलग है। अन्य समस्या उत्तेजना की अवधि के साथ संबंधित है। यह कम से कम आंशिक रूप से तथ्य यह है कि एक प्रभावी शीतलन प्रणाली अतीत में छोटे कॉयल के लिए उपलब्ध नहीं था के कारण है।

हाल के वर्षों में, मौलिक लेख छोटे जानवर मस्तिष्क पर rTMS प्रयोग में इन कठिनाइयों पर काबू पाने के लिए तरीके का सुझाव प्रकाशित किया गया है। इन पशु मॉडल के द्वारा, यह पता चला था कि चूहे के मस्तिष्क भी कम आवृत्ति rTMS 13 के जवाब में मानव के रूप में समान cortical excitability परिवर्तन दिखाता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, rTMS के सेलुलर और आणविक तंत्र तेजी से bei हैंएनजी rTMS के पशु मॉडल का उपयोग कर जांच की। बिंदु में एक मामला है कि निरोधात्मक interneuron की एक अलग प्रकार रुक-रुक कर थीटा फट उत्तेजना से 14 सबसे संवेदनशील हो जाना जाता है। rTMS के कृंतक मॉडल, इस प्रकार, rTMS प्रेरित परिवर्तन के आणविक आधार पर बहुत समय से मांग सवालों की खोज के लिए नए अवसर प्रदान करते हैं। rTMS के छोटे पशु मॉडल और अधिक प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है, यह बहुत तेजी लाने और इस क्षेत्र में अनुसंधान को मजबूत कर सकता है।

अब हम वर्णन कैसे चूहे के मस्तिष्क, पिछले काम 15 का एक विस्तार के एकतरफा गोलार्द्ध के लिए rTMS लागू करने के लिए। उत्तेजना प्रेरित परिवर्तन प्रेरित सेरेब्रल कॉर्टेक्स में rTMS प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए माइक्रो-पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) और mRNA प्रोटीन का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया।

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Protocol

जानवरों का उपयोग प्रक्रियाओं की समीक्षा और सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी अस्पताल के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. प्रायोगिक सेटअप

  1. पशु तैयारी
    1. प्रयोग शुरू करने से पहले अपने नए वातावरण के लिए अनुकूल करने के लिए पुरुष Sprague-Dawley चूहों की अनुमति दें 1 सप्ताह।
      नोट: हालांकि 8 सप्ताह पुराने चूहों वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, एक विकासशील या वयस्क मस्तिष्क अनुसंधान परिकल्पना के हिसाब से चुना जा सकता है।
  2. प्रेरण के लिए साँस लेना संज्ञाहरण
    1. प्रेरित और 5% और क्रमश: एक कक्ष और नाक शंकु के माध्यम से 40% / 60% और 25% / 75% ऑक्सीजन / नाइट्रोजन में भंग isoflurane के 2% के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें। पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए पेडल वापसी पलटा खत्म उचित anesthetization पुष्टि करने के लिए के स्तर पर संज्ञाहरण गहराई को समायोजित करें।
      नोट: awoken जानवरों का प्रयोग translational मामले में एक बेहतर विकल्प हो सकता है, लेकिन वहाँ rTMS और टी के दौरान नियंत्रित करने के लिए कठिनाई हैंअरे अत्यधिक तनाव से ग्रस्त हैं।
    2. एक गुदा जांच के साथ शरीर के तापमान पर नजर रखने और एक homeothermic कंबल का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर इसे बनाए रखने के। संवेदनाहारी गहराई पेडल वापसी पलटा, तापमान, सांस की दर और दिल की दर का उपयोग कर मॉनिटर।
  3. स्विच ओवर रखरखाव के लिए नसों में संज्ञाहरण के लिए
    1. एक शराब झाड़ू के साथ पूंछ तैयार करें। चतुर्थ संज्ञाहरण (चित्रा 1 ए) के लिए संक्रमण के लिए एक 24 गेज शिरापरक कैथेटर के साथ एक पार्श्व पूंछ नस कैथीटेराइज़। लोड Propofol नसों (1 मिलीग्राम / [किलो · मिनट] 10 से अधिक मिनट, 10 मिलीग्राम / एमएल पायस का उपयोग) पशुओं के लिए। Propofol लोडिंग शुरू करने के बाद isoflurane 5 मिनट के बंद।
    2. 500 की एक प्रेरणा दर पर Propofol बेहोश करने की क्रिया को बनाए रखें - 700 माइक्रोग्राम / (किलो · मिनट) प्रयोग के दौरान, पिछले एक अध्ययन में 16 के रूप में। 0.8 एल / मिनट में ऑक्सीजन पूरक एक नाक शंकु के माध्यम से।
      नोट: Propofol के साथ संज्ञाहरण inhal द्वारा cortical excitability के संभावित दमन को कम करने के लिए हैव्यावहारिक एजेंट 17-19। हालांकि, संज्ञाहरण rTMS प्रयोगों में अनिवार्य नहीं है, और awoken जानवरों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। संज्ञाहरण तरीकों अनुसंधान परिकल्पना के विचार में निर्णय लिया जाना चाहिए।
    3. जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सा मरहम का प्रयोग करें।
    4. चुंबकीय उत्तेजना (section2 देखें) चतुर्थ संज्ञाहरण के लिए पूरा संक्रमण के बाद 10 मिनट के लिए लागू करें।
  4. वसूली की स्थिति
    1. वसूली चरण के दौरान महत्वपूर्ण संकेत मॉनिटर। पशु छोड़ पहुंच से बाहर है जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए नहीं है। एक पशु शल्य चिकित्सा आया है, तो जब तक पूरी तरह से बरामद अन्य जानवरों की कंपनी के लिए इसे वापस नहीं है।
      नोट: यदि एक रोग मॉडल के लिए शल्य चिकित्सा की है, शल्य चिकित्सा के बाद दर्द प्रबंधन के लिए आवश्यक है। हालांकि, दर्द प्रबंधन इस rTMS प्रयोग के लिए आवश्यक नहीं है।

2. दोहराव transcranial चुंबकीय उत्तेजना

  1. उत्तेजक और कुंडल
    1. एक दोहराव उत्तेजक है कि एक 25 मिमी आंकड़ा -8 तार के माध्यम से biphasic उत्तेजनाओं उद्धार का उपयोग करके उत्तेजना को लागू करें। कुंडल 0.5 सेमी biauricular लाइन पर शिखर के लिए पार्श्व के केंद्र का पता लगाने, और भूमि पर कुंडली 45 ° कोनेदार।
      नोट: कुंडली के अधिक से अधिक चुंबकीय क्षेत्र ताकत 4.0 टी चुंबकीय तार में निर्मित एक धारक पर मजबूती से मुहिम शुरू की है।
  2. मोटर दहलीज
    1. गर्म स्थान पर मोटर दहलीज (एमटी) निर्धारित करते हैं, कुंडली के केंद्र के साथ तैनात 0.5 सेमी biauricular लाइन पर और calvaria पर सतह फ्लैट के साथ शीर्ष करने के लिए पार्श्व। यह वही पिछले एक अध्ययन 20 में इस्तेमाल किया पद्धति है।
      नोट: न्यूनतम उत्तेजना तीव्रता लगातार 10 उत्तेजनाओं से contralateral forepaw पर 5 या अधिक स्पष्ट संकुचन evoking रूप मीट्रिक टन परिभाषित करें। चाहे वह उत्तेजना मुख्य रूप से एकतरफा उत्तेजना सुनिश्चित करने के लिए contralateral मांसपेशियों में संकुचन पैदा कर रहा है सत्यापित करें।
    2. rTMS के आवेदन
      1. गहरी संज्ञाहरण के स्थिरीकरण के बाद rTMS 10 मिनट लागू करें। अनुसंधान के सवालों के आधार पर मस्तिष्क cortices से चयनित लक्ष्य rTMS स्थल पर कुंडली के केन्द्र रखें। फिर, कुंडल झुकाव कुंडल केंद्र और उत्तेजना बिंदु पर खोपड़ी की सतह के बीच सीधे संपर्क सुनिश्चित करने के लिए।
        नोट: उदाहरण के लिए, जमीन के लिए कोनेदार कुंडल 45 ° contralateral कोर्टेक्स (चित्रा 1 बी और 1 सी) पर rTMS के एक संभावित प्रत्यक्ष प्रभाव को कम करने के लिए।
      2. एकतरफा गोलार्द्ध के 20 मिनट rTMS के एक सत्र के लिए जानवरों के अधीन। सॉफ्टवेयर सांत्वना का उपयोग करना, एक कम आवृत्ति (1 हर्ट्ज), उच्च आवृत्ति (20 हर्ट्ज), या नकली उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ rTMS देने, और 100 में उत्तेजना तीव्रता सेट - मीट्रिक टन की 110%।
      3. बाकी के बिना 1 हर्ट्ज उत्तेजना प्रदर्शन करना। सॉफ्टवेयर सांत्वना इनपुट "1,200" के लिए "20" मिनट) शॉट्स का उपयोग करना। 20 हर्ट्ज उत्तेजना के लिए, उत्तेजना के 2 सेकंड 28 के द्वारा पीछा आचरणबाकी के सेकंड। सॉफ्टवेयर सांत्वना इनपुट "1600" "20" मिनट के लिए शॉट्स का उपयोग करना।
      4. दिखावा उत्तेजना के लिए, calvaria को सीधा तार (90 ° रोटेशन) झुकाव और सिर की सतह (चित्रा -1) से 2 सेमी के अलावा कुंडल किनारे जगह है। मुख्य तंत्र को मजबूती से तार धारक तय; प्रयोग के दौरान हाथ से कुंडल धारण करने के लिए कोई जरूरत नहीं है।
        ध्यान दें: ध्वनिक और अन्य गैर विशिष्ट प्रभाव के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, अलग अलग दिखावा प्रोटोकॉल उत्तेजना प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, 1-हर्ट्ज दिखावा उत्तेजना 1-हर्ट्ज rTMS प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. कुंडल शीतलक
      1. 1- और 20 हर्ट्ज उत्तेजना आवृत्तियों (चित्रा 2) में 20 से अधिक मिनट के लिए दोहराव चुंबकीय उत्तेजना सक्षम करने के लिए एक पानी शीतलन प्रणाली का प्रयोग करें। , प्रयोग के दौरान तार की पूरी लंबाई के आसपास के overheating रोकने के लिए बर्फीले पानी प्रसारित हालांकि कुंडल या उत्तेजक का तापमान निगरानी नहीं है।
        नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ठंडा चूहे कॉयल का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
      2. यदि संभव हो तो, rTMS मशीन के ताप गेज को देखने के द्वारा कुंडल तापमान की निगरानी। नोट: कोई प्रतिकूल rTMS उत्तेजना से संबंधित परिणामों थे। हालांकि वहाँ एक संभावित खतरे को जला धातु कान पहचान टैग उत्तेजक कुंडल के पास का उपयोग किया जाता है,।

    3. माइक्रो पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी

    1. पशु तैयारी
      1. रखरखाव (देखें कदम 1.2.1 और 1.3.1) के लिए प्रेरण और चतुर्थ संज्ञाहरण के लिए साँस लेना संज्ञाहरण का संचालन। मीट्रिक टन की 100-110% की उत्तेजना तीव्रता पर 10 मिनट के लिए एक जानवर को 1-हर्ट्ज rTMS लागू करें।
      2. पांच मिनट rTMS उत्तेजना खत्म करने के बाद, नसों के एक पूंछ नस कैथेटर का उपयोग करके 2- [एफ 18] फ्लोरो deoxyglucose (18 FDG) सामान्य नमक के 0.5 मिलीलीटर में भंग की 1 mCi इंजेक्षन। 18 FDG तेज के लिए 30 मिनट की अनुमति दें। नोट: पूरे सूक्ष्म पीई के दौरान संज्ञाहरण के तहत चूहे की जगहटी प्रयोग।
    2. छवि विश्लेषण
      1. उत्तेजना के unilaterality की पुष्टि करने के ब्रेन इमेजिंग के लिए एक पालतू स्कैनर का प्रयोग करें। एक 3 डी चलने का एल्गोरिथ्म के साथ छवियों पुनर्निर्माण किया। RTMS से प्रेरित चयापचय में परिवर्तन का आकलन करने के लिए, अनुप्रस्थ मस्तिष्क धारा 21 की छवियों में ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों की पहचान।
    3. इच्छामृत्यु
      1. माइक्रो-पीईटी इमेजिंग प्रदर्शन करने के बाद, एक कक्ष कार्बन डाइऑक्साइड के साथ प्रीफिल्ड जबकि चूहों गहरी संज्ञाहरण में हैं में चूहों euthanize।

    4. mRNA माइक्रोएरे

    1. इच्छामृत्यु
      1. प्रेरित और 5% और क्रमश: एक कक्ष और नाक शंकु के माध्यम से 40% / 60% और 25% / 75% ऑक्सीजन / नाइट्रोजन में भंग isoflurane के 2% के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें। decapitated जा रहा से पहले पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए पेडल वापसी पलटा खत्म करने के स्तर पर गहरा anesthetize।
      2. 1-हर्ट्ज rTMS के 1 सत्र के बाद इच्छामृत्यु 5 मिनट के लिए चूहों सिर काटना।
    2. ऊतक फसल
      1. उपयोग के क्रम में सामग्री और सर्जिकल उपकरणों बाहर करना, मुड़ा हुआ कागज तौलिये, एक हड्डी rongeur, microscissors, बड़ा शल्य कैंची, एक microforcep, एक नहीं, 10 या 11 स्केलपेल ब्लेड, एक lidded 10 सेमी गिलास पेट्री बर्फ से भरा पकवान सहित और 1.5 मिलीलीटर ट्यूब। शव के निपटान के लिए एक प्लास्टिक की थैली तैयार करें।
      2. खोपड़ी anterioposteriorly में एक midline त्वचा चीरा। दो टूक नरम ऊतक और शल्य कैंची के साथ आसपास की मांसपेशियों को काटना, और खोपड़ी की हड्डी एक हड्डी rongeur का उपयोग कर टुकड़ा निकाल दें। जल्दी खोपड़ी से ध्यान ताजा मस्तिष्क काटना। फिर, microforceps और microscissors का उपयोग करके यह बर्फ पर लेट गई। ठंडा सामान्य नमक में मस्तिष्क के ऊतकों कुल्ला।
      3. तुरंत सूखी बर्फ के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण, और बाद में आगे की प्रक्रिया जब तक एक ट्यूब में -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
      4. फसल से पहले मस्तिष्क के ऊतकों गला लें।
      5. मस्तिष्क पृष्ठीय पक्ष की जगह, और फसल अनुसूचित जनजाति से मस्तिष्क के ऊतकोंmicroforceps और microscissors का उपयोग करके बर्फ पर सेरेब्रल कॉर्टेक्स (प्राथमिक मोटर प्रांतस्था में गर्म स्थान के आसपास) imulated। 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में काटा ऊतक रखो।
    3. आरएनए तैयारी
      1. सेल अभिकर्मक 22 का उपयोग ऊतक homogenates से कुल शाही सेना निकालें। DNase पाचन और साफ-अप प्रक्रियाओं के साथ प्रक्रिया। शाही सेना के नमूने और aliquots यों और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक दुकान।
      2. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing, 260 के एक आयुध डिपो के अनुपात में शाही सेना पवित्रता और अखंडता का मूल्यांकन: 280, और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विश्लेषक पर उन्हें विश्लेषण।
    4. लेबल और शुद्धि
      1. बढ़ाना और biotinylated क्रेना उपज के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए प्रवर्धन किट का उपयोग करके कुल शाही सेना शुद्ध। संक्षेप में, रिवर्स टाइप करना एक T7 oligo (डीटी) प्राइमर का उपयोग करके सीडीएनए के लिए कुल शाही सेना के 550 एनजी। Synthesize और इन विट्रो में दूसरी कतरा सीडीएनए टाइप करें और उसके बाद बायोटिन राष्ट्रीय क्षयरोग नियंत्रण कार्यक्रम के साथ लेबल।
      2. पुर के बादवर्गीकरण, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके सीडीएनए यों।
    5. संकरण और डेटा निर्यात 23
      1. mRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए अभिव्यक्ति beadchip का प्रयोग करें। 58 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटा - 16 के लिए प्रत्येक चूहे-12 अभिव्यक्ति मनका सरणी के लिए लेबल 750 एनजी सीडीएनए नमूने संकरण। streptavidin-Cy3 का उपयोग करके सरणी संकेत का पता लगाने के लिए बाहर ले।
      2. एक confocal स्कैनर के साथ स्कैन सरणियों। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सरणी डेटा निर्यात प्रसंस्करण और विश्लेषण करते हैं।

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Representative Results

पंद्रह 8 सप्ताह पुराने पुरुष Sprague-Dawley चूहों मीट्रिक टन दृढ़ संकल्प का एक अलग अंतर करदाता विश्वसनीयता विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया। मांसपेशियों में ऐंठन की टटोलने का कार्य का उपयोग करना, एमटीएस, सभी चूहों में प्राप्य और 33.00 ± 4.21% अधिक से अधिक उत्तेजक निर्गम (% एमएसओ) और 33.93 ± 0.88% एमएसओ, क्रमशः के रूप में मापा गया दो स्वतंत्र शोधकर्ताओं द्वारा। नरम-Altman पूर्वाग्रह -0.93 था, और समझौते के 95% सीमा 7.26% करने के लिए -9.13 थे।

छह 8 सप्ताह पुरानी चूहों (एन = 1 हर्ट्ज rTMS में 4, और एन = 2 दिखावा rTMS समूह में) पर सूक्ष्म पीईटी प्रयोग में, ROIs में 18 एफ FDG के तेज औसतन रूप में गणना की गई एक ही छवियों में दोनों ipsilateral और contralateral मस्तिष्क cortices की जांच के बाद NCI / सीसी। contralateral क्षेत्र में रेडियोधर्मिता एक संदर्भ ipsilateral क्षेत्र में प्राप्त डेटा को सामान्य करने के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और अंतर तेज अनुपात (अवधि) की गणना की गई।मतलब लगातार तीन अनुप्रस्थ छवियों से प्राप्त durs चूहों के लिए durs प्राप्त करने के लिए औसतन थे। यह वही पिछले एक अध्ययन में इस्तेमाल किया पद्धति है 21। 18 FDG-पीईटी छवियों 1-हर्ट्ज समूह में उत्तेजित बाईं cortical क्षेत्र में ग्लूकोज चयापचय में एक केन्द्र वृद्धि (चित्रा 3) से पता चला है, rTMS के unilaterality का समर्थन।

mRNA माइक्रोएरे अध्ययन में, संकरण और समग्र चिप प्रदर्शन की गुणवत्ता दोनों आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण की जाँच और कच्चे स्कैन डेटा के दृश्य निरीक्षण द्वारा निगरानी की गई। सरणी डेटा कम से कम 50% के नमूनों में 0.05 <(संकेत करने वाली शोर अनुपात के समान) का पता लगाने पी मूल्य के हिसाब से छान रहे थे (एक उच्च संकेत मूल्य 0.05 की <एक का पता लगाने पी मूल्य प्राप्त करने के लिए आवश्यक था)। चुने गए जीन संकेत मान लघुगणक द्वारा बदल दिया है और एक quantile विधि का उपयोग कर सामान्यीकृत था। अभिव्यक्ति दा के सांख्यिकीय महत्वटा मान व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग करके निर्धारित और परिवर्तन, जिसमें शून्य परिकल्पना यह थी कि कोई फर्क नहीं 1-हर्ट्ज rTMS के बीच मौजूद गुना था (एन = 4) और दिखावा समूह (एन = 4)। झूठे खोज दर Benjamini-होचबर्ग कलन विधि का उपयोग करके पी मूल्य समायोजन करके नियंत्रित किया गया था। सामान्य बनाने और छानने के बाद, mRNAs महत्वपूर्ण अंतर भाव दिखा (| गुना परिवर्तन | 1.2, पी <0.05) चुना गया। नतीजतन, तत्काल जल्दी जीन की अभिव्यक्ति के स्तर दिखावा समूह की तुलना में rTMS समूह में काफी अधिक थे, upregulated आर्क, Junb के भाव और Egr2 जीन (चित्रा -4 ए) के साथ।

इसके अलावा, हम (1-हर्ट्ज में एन = 5 प्रत्येक और 20 हर्ट्ज समूहों) 20 मिनट rTMS के 5 दिनों के बाद लगातार प्रेरित और contralateral कोर्टेक्स में BDNF mRNA भाव मापा। 1-हर्ट्ज उत्तेजना के बाद, BDNF mRNA अभिव्यक्ति काफी highe थाcontralateral एक (चित्रा 4 बी) में से प्रेरित कोर्टेक्स में आर। यह अंतर rTMS प्रेरित प्रेरित और contralateral मस्तिष्क cortices में परिवर्तन का पता चला।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रयोगात्मक सेटिंग। (ए) एक अंतःशिरा कैथेटर एक पार्श्व पूंछ नस (तीर) पर डाला जाता है, और एक नाक शंकु के एक स्विच ओवर नसों में Propofol करने के बाद ऑक्सीजन के पूरक के रूप में अच्छी तरह से isoflurane के साथ संज्ञाहरण के लिए प्रयोग किया जाता है। (बी ) पृष्ठीय rTMS। (सी) पृष्ठीय पीछे दृश्य के दौरान अग्रपाश्विक देखें। एक आंकड़ा के-8 तार की सतह जमीन contralateral कोर्टेक्स की क्षमता का प्रत्यक्ष उत्तेजना को कम करने के लिए 45 डिग्री angulated है। (डी) दिखावा rTMS का एक योजनाबद्ध चित्रण। तार से 2 सेमी की दूरी पर रखा गया है और सीधा झुका हुआ है (90 ° रोटेशन)calvaria करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. शीतलन प्रणाली के साथ मोटर। कुंडली के तांबे के तारों पर बर्फ पैकिंग की जरूरत नहीं है, के रूप में शीतलन प्रणाली कुंडली के केबल enwrapping गर्मी तांबे के तारों में उत्पादित शांत करने के लिए पर्याप्त है एक पानी परिसंचारी पंप का उपयोग करता है। तार की सतह ठंडी पानी के साथ सीधे संपर्क में नहीं है। शीतलन प्रणाली उत्तेजना सत्र के दौरान सक्रिय है।

चित्र तीन
चित्रा 3. पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) छवि। (ए) की सूक्ष्म पीईटी छवियों का राज्याभिषेक वर्गोंएक चूहे का उपयोग कर प्राप्त 2- [एफ 18] फ्लोरो deoxyglucose, उत्तेजित कोर्टेक्स में वृद्धि हुई स्थानीय ग्लूकोज चयापचय दिखाने के बाद 1 हर्ट्ज rTMS मीट्रिक टन (तीर) की 100% से कम 10 मिनट के लिए। (बी) FDG तेज के अनुपात 1-हर्ट्ज में प्रेरित / contralateral कोर्टेक्स में (एन = 4) और दिखावा rTMS समूह (एन = 2)। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. तत्काल जल्दी जीन की mRNA माइक्रोएरे और BDNF। (ए) आर्क, Junb, और Egr2 विभिन्न व्यक्त कर रहे थे जो माइक्रोएरे पर पहचान की गई है 1-हर्ट्ज rTMS के 1 सत्र के बाद 5 मिनट प्राप्त की, गुना परिवर्तन द्वारा आदेश दिया। जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर rTMS समूह में काफी अधिक थे (एन = 4) Than दिखावा समूह में (एन = 4) (पी <मान व्हिटनी यू परीक्षण के साथ 0.05), upregulated आर्क, Junb, और Egr2 जीनों की अभिव्यक्ति के साथ। (बी), 20 मिनट 1-हर्ट्ज के 5 दिनों के बाद लगातार rTMS, BDNF mRNA अभिव्यक्ति contralateral पक्ष में अधिक से प्रेरित कोर्टेक्स में काफी अधिक था (* पी <0.05, Wilcoxon हस्ताक्षर किए रैंक परीक्षण)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन के प्राथमिक उद्देश्य एकतरफा rTMS के एक पशु मॉडल पेश करने के लिए किया गया था। हालांकि एकतरफा उत्तेजना मानव rTMS अनुसंधान के सबसे मौलिक विशेषताओं में से एक है, कई अध्ययनों छोटे जानवरों में इसे नहीं अपनाया है। हालांकि, Rotenberg एट अल। 15 100% मीट्रिक टन 20 मिमी के बाहर पालि व्यास के साथ एक आंकड़ा -8 का तार का उपयोग करने की उत्तेजना के साथ contralateral MEPs दर्ज की गई, जबकि 112.5% और 133.3% मीट्रिक टन के साथ उत्तेजना ipsilateral के साथ ही contralateral MEPs का उत्पादन किया। इस वजह से बड़े प्रेरित बिजली के क्षेत्र contralateral गोलार्द्ध को प्रभावित कर सकते हो सकता है। इस प्रकार, हमारे अध्ययन में इस पिछले काम 15,24 का एक विस्तार, कुंडल अधिक पार्श्व चलती है और यह एकतरफा उत्तेजना दबाव का झुकने से है। क्योंकि हम पुष्टि की है कि सूक्ष्म पीईटी (चित्रा 3) rTMS के बाद उत्तेजित सेरेब्रल कॉर्टेक्स में ग्लूकोज चयापचय में एक स्थानीय वृद्धि से पता चला इस अध्ययन के प्राथमिक उद्देश्य हासिल की थी।

jove_content "> स्थान और कुंडली के कोणीयकरण इस प्रयोग में महत्वपूर्ण कदम biauricular लाइन पर शीर्ष करने के लिए पार्श्व और भूमि पर कुंडली 45 ° angulating तार कर रहे हैं। एकतरफा उत्तेजना rTMS के केंद्र रखकर संभव है 1 सेमी। उत्तेजना साइट शर्त यह है कि जांचकर्ताओं rTMS के साथ लक्षित करना चाहते हैं पर निर्भर करता है, प्राथमिक मोटर प्रांतस्था (एम 1) से अलग हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, अवसाद को सुधारने के लिए, dorsolateral प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (DLPFC) rTMS के साथ प्रेरित है, लेकिन मोटर सीमा है, जो यह भी एम 1 में मापा जाता है, DLPFC rTMS के लिए भी उत्तेजना तीव्रता का निर्धारण करता है इसी तरह, हॉटस्पॉट -। 0.5 सेमी biauricular लाइन पर शिखर के लिए पार्श्व - वर्तमान अध्ययन में मोटर सीमा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और पार्श्व कोर्टेक्स -। 1 सेमी शिखर के लिए पार्श्व - जानबूझकर उत्तेजना के unilaterality सुनिश्चित करने और rTMS प्रेरित आणविक परिवर्तन जांच करने के लिए चुना गया था।

ve_content "> ऊतक के भीतर चुंबकीय क्षेत्र ताकत, माउस मस्तिष्क में प्रेरित बिजली के मैदान पर पिछले एक परिमित तत्व मॉडलिंग अध्ययन में के रूप में, से प्रेरित बिजली के क्षेत्र में 70 मिमी आंकड़ा -8 75% पर कुंडली एमएसओ लगभग पहुँच 150 वी मस्तिष्क की सतह पर और कोर्टेक्स में / मी। बिजली क्षेत्र की ताकत के रूप में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई दूरी गिरा, 100 से अधिक वी / मी ताकत के साथ अधिकतम गहराई दिखा 70 मिमी आंकड़ा -8 कुंडल 25 के लिए सिर्फ 1.9 मिमी था। एक और चूहे में अध्ययन, 10 मिमी गहराई पर प्रेरित बिजली क्षेत्र की ताकत है कि मस्तिष्क की सतह पर 26 से 25% की कमी हुई। दिलचस्प है, आधा बिजली क्षेत्र (HPR) था के रूप में व्यापक ~ 7 x 7 मिमी (0.51 सेमी 2) यहाँ तक कि जब एक 25 के रूप में मिमी आंकड़ा -8 कुंडल 25 इस्तेमाल किया गया था। हालांकि ठोस संख्या 70 मिमी आंकड़ा -8 तार के लिए नहीं प्रदान किया गया, साल्वाडोर और मिरांडा टिप्पणी की 70 मिमी तार के लिए HPR 25 मिमी तार की तुलना में बड़ा था। चूंकि हम चाहते थे कवर से HPR को रोकने केcontralateral गोलार्द्ध, हम एक जगह 1 सेमी midline के लिए पार्श्व का चयन किया। झुकाना कुंडल केंद्र और उत्तेजना बिंदु पर खोपड़ी की सतह के बीच सीधे संपर्क सुनिश्चित करने के लिए अपरिहार्य था।

संज्ञाहरण संभावित neuronal excitability, ग्लूकोज चयापचय, और जीन अभिव्यक्ति दबाना कर सकते हैं। Haghighi एट अल। 0.5% काफी उदास बिजली Transcranial चूहों 17 से दर्ज MEPs की एकाग्रता में है कि isoflurane का पता चला। दूसरी ओर, MEPs, 40 मिलीग्राम / [किलो · मानव संसाधन] के रूप में उच्च Propofol निषेचन के दौरान संरक्षित किया गया आयाम चूहों 18 में बड़े शेष के साथ। एक मानव अध्ययन में, कोई यौगिक पेशी कार्रवाई की क्षमता (CMAP) isoflurane संज्ञाहरण के दौरान पाया गया। हालांकि, 333 हर्ट्ज, चार पल्स चुंबकीय उत्तेजना CMAP hypothenar मांसपेशियों में रोगियों के 75% में पैदा की, और रोगियों के 65% में पूर्वकाल tibial मांसपेशी, Propofol संज्ञाहरण 19 के दौरान में। awoken जानवरों का उपयोग मानसिक में एक बेहतर विकल्प हो सकता हैiological पहलुओं, लेकिन वे rTMS के दौरान नियंत्रित करने के लिए आसान नहीं हैं और तनावपूर्ण स्थितियों से ग्रस्त हैं।

समस्या निवारण के रूप में, एक सरल कूलर है कि एक पानी-घूम पंप का इस्तेमाल भी एक 20 हर्ट्ज उत्तेजना आवृत्ति पर अधिक से अधिक 20 मिनट के लिए उत्तेजना अवधि का विस्तार करने के लिए हमें सक्षम होना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि यह मानव विषयों के लिए rTMS प्रोटोकॉल में के रूप में कई stimulations सक्षम बनाता है। ठंडा ही एक हाथ में बर्फ के ठंडे पानी बैग के साथ आंकड़ा -8 कुंडल अधिक से अधिक 20 मिनट की उत्तेजना सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त नहीं था। छोटे जानवरों में लांग rTMS अवधि rTMS के आणविक तंत्र में गहराई से जांच के लिए अवसर प्रदान करेगा। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ठंडा चूहे कॉयल उचित विकल्प होगा।

इस प्रयोग में कई सीमाओं थे। सबसे पहले, केवल एक biphasic नाड़ी उपलब्ध था, जो rTMS मशीन हम इस्तेमाल की एक सीमा थी। विभिन्न दालों और waveforms के प्रभाव की जांच के भविष्य के अध्ययन की जरूरत होगी।दूसरा, हम एक व्यावहारिक दृष्टिकोण टटोलने का कार्य द्वारा मोटर सीमा निर्धारित करने के लिए अपनाया। हालांकि इस पद्धति शुद्धता के मामले में ईएमजी तकनीकों को नीचा हो सकता है, यह आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और कई अनुसंधान परिकल्पना के लिए लागू है। उदाहरण के लिए, यदि एक शोधकर्ता के प्राथमिक उद्देश्य प्राथमिक मोटर प्रांतस्था और rTMS प्रेरित जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति में आसन्न subcortices के बीच मतभेद की जांच करने के लिए थे, मोटर दहलीज के और अधिक सटीक दृढ़ संकल्प आवश्यक होगा। एक शोधकर्ता हैं, हालांकि, विश्लेषण करने के लिए rTMS प्रेरित dorsolateral प्रीफ्रंटल cortical ऊतक में जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल, वर्तमान व्यावहारिक दृष्टिकोण पर्याप्त हो सकता है, क्योंकि दूरी और लक्ष्य ऊतक और कुंडल के बीच कोण कुंडली के आंदोलन के दौरान थोड़ा भिन्न हो सकते हैं चाहता था एम 1 से DLPFC क्षेत्र के लिए। तीसरा, हालांकि हम सफलतापूर्वक चूहे के मस्तिष्क के एकतरफा गोलार्द्ध पर rTMS आवेदन किया है, अभी भी उत्तेजना नहीं मानव अनुसंधान में rTMS के रूप में के रूप में फोकल है। प्रेरित मजबूत बिजली फाई~ के चूहे के मस्तिष्क की सतह के कम से कम 10 सेमी 2 पर 0.5 सेमी 2 वृद्धावस्था के मानव hemispheric सतह ~ 2500 सेमी में है कि 2 27। हम मानते हैं, हालांकि, उस मॉडल के साथ साथ प्रस्तुत elucidating के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक फैलाना लगती है उसके प्रभाव में अंतर-hemispheric अंतर का विश्लेषण की अनुमति देकर rTMS के आणविक तंत्र।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Homeothermic blanket with a rectal probe Harvard apparatus 507222F
Isoflurane (Forane sol.) Choongwae
Propofol (Provive Inj. 1% 20 ml) Claris Lifesciences
Repetitive magnetic stimulator (Magstim Rapid2) Magstim Company Ltd
25 mm figure-of-8 coil Magstim Company Ltd 1165-00
PET-CT GE Healthcare
QIAzol Lysis Reagent Qiagen (US Patent No. 5,346,994)
RNeasy Lipid Tissue Mini Kit Qiagen 74804
RNeasy Mini Spin Columns Qiagen (Mat No. 1011708)
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
Ambion Illumina RNA amplification kit Ambion
Nanodrop Spectrophotometer NanoDrop ND-1000
Illumina RatRef-12 Expression BeadChip Illumina, Inc.
Amersham fluorolink streptavidin-Cy3 GE Healthcare Bio-Sciences

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References

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व्यवहार अंक 116 Transcranial चुंबकीय उत्तेजना न्यूरोनल प्लास्टिसिटी पशु मॉडल सेरेब्रल कॉर्टेक्स पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी तत्काल जल्दी जीन बायोमेडिकल इंजीनियरिंग
चूहा मस्तिष्क के एकतरफा गोलार्ध के लिए दोहराव transcranial चुंबकीय उत्तेजना
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Beom, J., Lee, J. C., Paeng, J. C., Han, T. R., Bang, M. S., Oh, B. M. Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to the Unilateral Hemisphere of Rat Brain. J. Vis. Exp. (116), e54217, doi:10.3791/54217 (2016).

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