Introduction
Repetitieve transcraniële magnetische stimulatie (rTMS), een middel voor invasieve hersenstimulatie en neuromodulatie, is toegepast in de behandeling van diverse aandoeningen, zoals centrale pijn 1,2, 3 depressie, migraine 4 en vlakke slag 5-7. Snel veranderende elektrische stroom door rollen op de kop een elektrisch veld op de cerebrale cortex en de resulterende neuronale activatie induceert. Exciteerbaarheid in de cerebrale cortex kan worden gemoduleerd door rTMS, die langer dan 30 minuten na de stimulering beëindigd.
Suggereerde mechanismen van de rTMS na-effect omvatten langetermijnpotentiëring / depressie-achtig effect 8, voorbijgaande verschuiving in ionische balans 9 en metabole veranderingen 10. Bovendien Di Lazzaro et al. suggereren dat intermitterende-theta burst stimulatie beïnvloedt de prikkelende synaptische ingangen darmkanaal piramidale neuronen, zowel in de gestimuleerdeen de contralaterale hemisfeer 11.
Significante beperkingen, echter, hebben de onderzoekers verhinderd vertalen on-bench bewijs om klinische situaties. Ten eerste, in eerdere dierstudies, werd rTMS gebruikt voor whole-brain stimulation 12. Whole-hersenstimulatie is heel anders dan de protocollen die worden gebruikt in humane studies 9. Het andere probleem is gerelateerd aan de duur van de stimulatie. Dit is althans ten dele worden toegeschreven aan het feit dat een efficiënt koelsysteem was beschikbaar voor kleine spoelen in het verleden.
De laatste jaren zijn artikelen verschenen rudimentaire voorstellen te doen voor het overwinnen van deze problemen in de rTMS experiment op kleine dierlijke hersenen. Door deze diermodellen werd aangetoond dat de rattenhersenen toont ook gelijkwaardig corticale exciteerbaarheid veranderingen in de menselijke reactie op laagfrequente rTMS 13. Belangrijker cellulaire en moleculaire mechanismen van rTMS steeds being onderzocht met behulp van dierlijke modellen van rTMS. Een voorbeeld is dat een afzonderlijke soort groeiremmende interneuron bekend is het meest gevoelig voor intermitterende theta burst stimulatie 14 zijn. Knaagdier modellen van rTMS, dus bieden nieuwe mogelijkheden voor het verkennen van veelgevraagde vragen over de moleculaire onderbouwing van rTMS-geïnduceerde veranderingen. Als kleine diermodellen van rTMS kan worden gebruikt in meer laboratoria, kan het sterk versnellen en onderzoek op dit gebied versterken.
We beschrijven nu hoe rTMS toepassing op de eenzijdige hemisfeer van rattenhersenen, een uitbreiding van het eerdere werk 15. Stimulatie geïnduceerde veranderingen werden onderzocht met behulp van micro-positron emissie tomografie (PET) en mRNA microarrays rTMS-geïnduceerde veranderingen in de gestimuleerde cerebrale cortex bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Seoul National University Hospital goedgekeurd.
1. Experimentele Setup
- Toebereiding van dieren
- Door mannelijke Sprague-Dawley ratten 1 week aan te passen aan hun nieuwe omgeving voordat het experiment.
Opmerking Hoewel 8 weken oude ratten werden in deze studie kan een ontwikkelende of volwassen hersenen worden gekozen overeenkomstig de onderzoekshypothesen.
- Door mannelijke Sprague-Dawley ratten 1 week aan te passen aan hun nieuwe omgeving voordat het experiment.
- Inhalatie-anesthesie voor inductie
- Anesthesie induceren en handhaven met 5% en 2% isofluraan opgelost in 40% / 60% en 25% / 75% zuurstof / stikstof via een kamer en neuskegel, respectievelijk. Pas verdoving diepte aan het niveau van de afschaffing van het pedaal terugtrekking reflex tot teen knijpen om de juiste verdoving te bevestigen.
LET OP: Het gebruik gewekt dieren kunnen een betere keuze in translationeel termen zijn, maar er zijn problemen te beteugelen tijdens rTMS en they zijn gevoelig voor overmatige stress. - Monitor lichaamstemperatuur met een rectale sonde en handhaven bij 37 ° C met behulp van een homeothermische deken. Monitor verdoving diepte met behulp van pedaal terugtrekking reflex, temperatuur, ademhaling en hartslag.
- Anesthesie induceren en handhaven met 5% en 2% isofluraan opgelost in 40% / 60% en 25% / 75% zuurstof / stikstof via een kamer en neuskegel, respectievelijk. Pas verdoving diepte aan het niveau van de afschaffing van het pedaal terugtrekking reflex tot teen knijpen om de juiste verdoving te bevestigen.
- Omschakeling naar intraveneuze anesthesie voor het onderhoud
- Bereid de staart met een alcoholdoekje. Katheteriseren een laterale staartader met een 24-gauge veneuze katheter voor de overgang naar IV anesthesie (Figuur 1A). Load intraveneus propofol (1 mg / [kg · min] gedurende 10 min, onder toepassing van 10 mg / ml emulsie) aan de dieren. Stop met isofluraan 5 min na het starten van propofol laden.
- Handhaaf propofol sedatie met een infusiesnelheid van 500-700 ug / (kg · min) gedurende het experiment, zoals in een eerdere studie 16. Supplement zuurstof bij 0,8 l / min via een neuskegel.
LET OP: anesthesie met propofol is om mogelijke onderdrukking van corticale prikkelbaarheid te verminderen door de inhalatie middel 17-19. Echter, anaesthesie is niet verplicht rTMS experimenten en gewekt dieren kunnen ook worden gebruikt. Anesthesie methoden moeten met inachtneming van de onderzoekshypothesen worden beslist. - Gebruik veterinaire zalf op de ogen tot droog te voorkomen dat tijdens het onder narcose.
- Solliciteer magnetische stimulatie (zie Afdeling 2) 10 min na een volledige overgang naar iv anesthesie.
- Recovery voorwaarden
- Monitor de vitale functies tijdens de herstelfase. Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Als een dier een operatie heeft ondergaan, het niet terug te keren naar het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld.
OPMERKING: Indien chirurgie voor een ziektemodel is uitgevoerd, postoperatieve pijn nodig. Echter pijnmanagement niet noodzakelijk voor deze rTMS experiment.
- Monitor de vitale functies tijdens de herstelfase. Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Als een dier een operatie heeft ondergaan, het niet terug te keren naar het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld.
2. Repetitieve transcraniële magnetische stimulatie
- Stimulator en spoel
- Solliciteer stimulatie met behulp van een zich herhalend stimulator die tweefasige stimuli levert via een 25 mm figure-8 coil. Zoek het midden van de spoel 0,5 cm lateraal van de vertex op biauricular lijn en angulate de spoel 45 ° op de grond.
OPMERKING: De maximale magnetische veldsterkte van de spoel 4,0 T. De magneetspoel wordt stevig op een ingebouwde houder gemonteerd.
- Solliciteer stimulatie met behulp van een zich herhalend stimulator die tweefasige stimuli levert via een 25 mm figure-8 coil. Zoek het midden van de spoel 0,5 cm lateraal van de vertex op biauricular lijn en angulate de spoel 45 ° op de grond.
- motor drempel
- Bepaal de motor drempel (MT) en hot spot, met het midden van de spoel gepositioneerd 0,5 cm lateraal van de vertex op biauricular lijn met het oppervlak plat op het schedeldak. Dit is dezelfde methode gebruikt in een eerdere studie 20.
OPMERKING: Definieer MT als minimale stimulus intensiteit oproepen 5 of meer voelbaar contracties op de contralaterale voorpoot door 10 opeenvolgende stimuli. Controleer of de stimulatie voornamelijk veroorzaakt contralateraal spiersamentrekking eenzijdige stimulatie te waarborgen. - Toepassing van rTMS
- Solliciteer rTMS 10 min na stabilisatie van diepe narcose. Plaats het midden van de spoel op de beoogde plaats rTMS, gekozen uit de cerebrale cortices afhankelijk onderzoeksvragen. Vervolgens zet men de spoel direct contact tussen de spoel centrum en het oppervlak van de schedel op het stimuleren punt waarborgen.
Opmerking: Zo angulate de spoel 45 ° naar grond om een mogelijke rechtstreekse effect van rTMS op de contralaterale cortex (Figuur 1B en 1C) te verminderen. - De dieren gedurende een sessie van 20 min rTMS van de eenzijdige halfrond. Met behulp van de software-console, leveren rTMS met een lage frequentie (1 Hz), hoge-frequentie (20 Hz), of sham stimulatie protocol, en zet de stimulatie-intensiteit op 100-110% van het MT.
- Voer 1 Hz stimulatie zonder rust. Met behulp van de software console ingang "1200" shots voor "20" min). Voor 20 Hz stimulatie, voeren 2 sec van de stimulatie, gevolgd door 28sec van rust. Met behulp van de software console ingang "1600" shots voor "20" min.
- Voor sham stimulatie, tilt de spoel loodrecht (90 ° rotatie) om het schedeldak en plaats de spoel rand 2 cm uit elkaar van kop oppervlak (figuur 1D). Bevestig de spoel houder stevig aan de belangrijkste apparaten; behoeft aan de spoel te houden met de hand tijdens het experiment.
OPMERKING: Om te compenseren voor de akoestische en andere niet-specifieke effecten, moet onderscheiden sham-protocollen worden gebruikt voor verschillende stimulatie protocollen. Bijvoorbeeld kan 1-Hz sham stimulatie worden gebruikt voor 1-Hz rTMS experimenten.
- Solliciteer rTMS 10 min na stabilisatie van diepe narcose. Plaats het midden van de spoel op de beoogde plaats rTMS, gekozen uit de cerebrale cortices afhankelijk onderzoeksvragen. Vervolgens zet men de spoel direct contact tussen de spoel centrum en het oppervlak van de schedel op het stimuleren punt waarborgen.
- Koeling van de spoel
- Gebruik waterkoeling om herhaalde magnetische stimulatie langer dan 20 min bij inschakelen 1- en 20-Hz stimulatiefrequenties (figuur 2). Circuleren ijswater rond de gehele lengte van de spoel gedurende het experiment om oververhitting te voorkomen, hoewel de temperatuur van de spoel of stimulator niet wordt bewaakt.
Opmerking: In de handel verkrijgbare gekoeld rat spoelen kunnen ook worden gebruikt. - Als het mogelijk is, toezicht op de spoel temperatuur door het bekijken van de verwarming graadmeter van de rTMS machine. NB: Er waren geen nadelige gevolgen met betrekking tot de rTMS stimulatie. Er is echter een potentieel brandwondrisico als metaal oor identificatielabels worden gebruikt bij de stimulerende spoel.
- Gebruik waterkoeling om herhaalde magnetische stimulatie langer dan 20 min bij inschakelen 1- en 20-Hz stimulatiefrequenties (figuur 2). Circuleren ijswater rond de gehele lengte van de spoel gedurende het experiment om oververhitting te voorkomen, hoewel de temperatuur van de spoel of stimulator niet wordt bewaakt.
3. Micro Positron Emissie Tomografie
- Toebereiding van dieren
- Voeren inhalatie-anesthesie voor inductie en iv anesthesie voor onderhoud (zie stap 1.2.1 en 1.3.1). Toepassen 1 Hz rTMS aan een dier gedurende 10 minuten bij een stimulatie-intensiteit van 100-110% van de MT.
- Vijf minuten na afloop van de rTMS stimulatie Injecteer 1 mCi 2- [F-18] fluor-deoxyglucose (18 FDG) opgelost in 0,5 ml normale zoutoplossing intraveneus toegediend via een staartader katheter. Laat 30 min voor 18 FDG opname. LET OP: Plaats de rat onder verdoving tijdens de hele micro-PET experiment.
- beeldanalyse
- Gebruik een PET-scanner voor beeldvorming van de hersenen aan de eenzijdigheid van de stimulatie opnieuw te bevestigen. Reconstrueren beelden met een 3-D iteratief algoritme. Om de veranderingen in metabolisme geïnduceerd door rTMS evalueren, gebieden van belang (ROI) in de beelden van de transversale hersencoupes 21.
- euthanasia
- Na het uitvoeren van micro-PET imaging, euthanize de ratten in een kamer voorgevuld met koolstofdioxide terwijl de ratten in diepe narcose.
4. mRNA Microarray
- euthanasia
- Anesthesie induceren en handhaven met 5% en 2% isofluraan opgelost in 40% / 60% en 25% / 75% zuurstof / stikstof via een kamer en neuskegel, respectievelijk. Verdoven diep om het niveau van de afschaffing van het pedaal terugtrekking reflex tot teen knijpen voordat ze onthoofd.
- Onthoofden de ratten euthanasie 5 min na 1 sessie 1-Hz rTMS.
- tissue oogst
- Lay-out materialen en chirurgische instrumenten in de volgorde van het gebruik, met inbegrip van gevouwen papieren handdoeken, een bot rongeur, microscissors, grotere chirurgische schaar, een microforcep, een No. 10 of 11 scalpel, een deksel van 10 cm glazen petrischaal gevuld met ijs en 1,5 ml buizen. Bereid een plastic zak voor de verwijdering van het karkas.
- Maak een middellijn incisie in de schedel anterioposteriorly. Botweg ontleden het zachte weefsel en de omliggende spieren met chirurgische schaar en verwijder de schedel bot stuk met behulp van een bot rongeur. Snel ontleden de verse hersenen voorzichtig uit de schedel. Dan leg het op het ijs met behulp van de microforceps en microscissors. Spoel het hersenweefsel in ijskoud fysiologisch zout.
- Breng de hersenen onmiddellijk droogijs en vervolgens te slaan bij -80 ° C in een buis tot verdere verwerking.
- Ontdooi het hersenweefsel voor de oogst.
- Plaats de hersenen dorsale kant naar boven, en de oogst van het hersenweefsel van de stimulated cerebrale cortex (rond de hot spot in de primaire motorische cortex) op het ijs met behulp van de microforceps en microscissors. Zet het geoogste weefsel in 1,5 ml buis.
- RNA voorbereiding
- Extract totaal RNA uit weefsel homogenaten middels lysis reagens 22. Proces met DNase spijsvertering en clean-up procedures. Kwantificeren RNA monsters en aliquots en bewaar ze bij -80 ° C tot gebruik.
- Voor kwaliteitscontrole evalueren RNA zuiverheid en integriteit van denaturerende gelelektroforese in een OD-verhouding van 260: 280, en analyseren op een commercieel verkrijgbare analysator.
- Labeling en zuivering
- Vergroten en zuiveren totale RNA met behulp van een commercieel verkrijgbare RNA-amplificatie kit gebiotinyleerd cRNA verkregen. Kort samengevat, reverse transcriberen 550 ng totaal RNA in cDNA met behulp van een T7-oligo (dT) primer. Synthetiseren en in vitro transcriberen de tweede streng cDNA en vervolgens labelen met biotine-NTP.
- na purcatie, kwantificeren cDNA met behulp van een spectrofotometer.
- Hybridisatie en data export 23
- Gebruik de uitdrukking BeadChip voor mRNA expressie analyse. Hybridiseer de gelabelde 750 ng cDNA-monsters elke rat-12 expressie bead array voor 16-18 uur bij 58 ° C. Verricht detectie van de array-signaal met behulp van streptavidine-Cy3.
- Scan arrays met een confocale scanner. Voer reeks data export verwerking en analyse met behulp van een in de handel verkrijgbare software.
- Bepaal de motor drempel (MT) en hot spot, met het midden van de spoel gepositioneerd 0,5 cm lateraal van de vertex op biauricular lijn met het oppervlak plat op het schedeldak. Dit is dezelfde methode gebruikt in een eerdere studie 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vijftien 8-weken oude mannelijke Sprague-Dawley ratten werden gebruikt voor een aparte interbeoordelaarsbetrouwbaarheid analyse van MT vastberadenheid. Met behulp van palpatie van spiertrekkingen, de MT's waren verkrijgbaar in alle ratten en gemeten 33,00 ± 4,21% maximale stimulator uitgang (% MSO) en 33,93 ± 0,88% MSO, respectievelijk door twee onafhankelijke onderzoekers. Bland-Altman vooroordeel was -0,93, en de grenzen van de overeenkomst 95% waren -9,13 tot 7,26%.
In de micro-PET experiment zes 8-weken oude ratten (n = 4 in 1-Hz rTMS en n = 2 in de groep sham rTMS), werd de opname van 18F-FDG in de ROI berekend als de gemiddelde nCi / cc na kalibratie van zowel de ipsilaterale en contralaterale cerebrale cortex in dezelfde beelden. De radioactiviteit in het contralaterale gebied werd gebruikt als een verwijzing naar gegevens uit de ipsilaterale gebied normaliseren en het differentieel opnameverhouding (DUR) berekend.De gemiddelde Durs verkregen bij drie opeenvolgende dwarse beelden werden gemiddeld om de Durs verkrijgen voor de ratten. Dit is van dezelfde methode als in een eerdere studie 21. 18 FDG-PET beelden toonde een focale toename van glucosemetabolisme in de gestimuleerde linker corticale gebied in de 1-Hz groep ondersteunen de eenzijdigheid van de rTMS (figuur 3).
In het mRNA microarray studie, de kwaliteit van hybridisatie en de algehele prestaties chip werden gecontroleerd door visuele inspectie van zowel de interne kwaliteitscontroles en ruwe scangegevens. Array gegevens werden gefilterd op een detectie p waarde <0,05 (vergelijkbaar met de signaal-ruisverhouding) in ten minste 50% samples (hogere signaalwaarde diende een detectie p waarde van <0,05) te verkrijgen. De geselecteerde gen signaalwaarde werd getransformeerd door logaritme en genormaliseerd door het gebruik van een kwantiel methode. De statistische significantie van de uitdrukking data werd bepaald met behulp van de Mann-Whitney U test en voudige verandering, waarbij de nulhypothese is dat er geen verschil bestaat tussen de 1 Hz rTMS (n = 4) en sham groepen (n = 4). De valse ontdekking tarief werd geregeld door de p-waarde met behulp van de Benjamini-Hochberg algoritme. Na normalisatie en filtreren mRNAs geeft significante differentiële expressies (| veelvoudverandering | 1,2, p <0,05) werden geselecteerd. Dientengevolge, de expressieniveaus van de onmiddellijke vroege genen waren in de groep rTMS significant hoger dan in de placebo groep met de uitdrukkingen van de boog, JUNB en Egr2 genen opgereguleerd (figuur 4A).
Verder maten we BDNF mRNA expressies in de gestimuleerde en contralaterale cortex na 5 opeenvolgende dagen van 20-min rTMS (n = 5 elk in de 1-Hz en 20 Hz-groepen). Na 1 Hz stimulatie, BDNF mRNA expressie was significant higher de gestimuleerde cortex dan in de contralaterale één (figuur 4B). Hieruit bleek differentiële rTMS-geïnduceerde veranderingen in de gestimuleerde en contralaterale cerebrale cortex.
Figuur 1. Experimentele instellingen. (A) Een intraveneuze katheter wordt ingebracht in een laterale staartader (pijl), en een neuskegel wordt gebruikt voor anesthesie met isofluraan en zuurstof supplement na een omschakeling naar intraveneus propofol. (B ) Dorsale anterolaterale uitzicht tijdens rTMS. (C) Dorsale posterior view. Het oppervlak van een figure-of-8 spoel gehoekt 45 ° naar de grond om de mogelijke directe stimulatie van de contralaterale cortex minimaliseren. (D) een schematische illustratie van sham rTMS. De spoel wordt geplaatst 2 cm afstand van en gekanteld loodrecht (90 ° rotatie)naar het schedeldak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Het koelsysteem maakt gebruik van een circulatiepomp met motor. Ijs verpakking op de koperdraden van de spoel is niet noodzakelijk, aangezien het koelsysteem enwrapping de kabel van de spoel voldoende is om de warmte aan de koperdraden koelen. Het oppervlak van de spoel niet in direct contact met ijswater. Het koelsysteem is actief tijdens stimulatiesessies.
Figuur 3. Positron Emissie Tomografie (PET) Image. (A) De coronale secties van micro-PET afbeeldingeneen rat verkregen onder toepassing van 2- [F-18] fluor-deoxyglucose, met verhoogde lokale glucosemetabolisme in de gestimuleerde cortex na 1 Hz rTMS gedurende 10 min bij 100% van de MT (pijlen). (B) De verhouding van FDG opname in gestimuleerde / contralaterale cortex in de 1-Hz (n = 4) en sham rTMS-groep (n = 2). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. De mRNA Microarray van de onmiddellijke vroege genen en BDNF. (A) Arc, JUNB en Egr2 werden differentieel tot expressie, die werden geïdentificeerd aan de microarray verkregen 5 min na 1 sessie 1-Hz rTMS, besteld door voudige verandering. De expressieniveaus van de genen waren significant hoger in de groep rTMS (n = 4) than in de sham groep (n = 4) (p <0,05 met de Mann-Whitney U test), de uitdrukkingen van de boog, JUNB en Egr2 genen opgereguleerd. (B) Na 5 opeenvolgende dagen van 20-min 1-Hz rTMS, was in de gestimuleerde cortex significant hoger dan in de contralaterale zijde BDNF mRNA expressie (* p <0,05, rangtekentoets). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het primaire doel van deze studie was om een diermodel eenzijdige rTMS voeren. Ofschoon unilateraal stimulering is één van de fundamentele kenmerken van de menselijke rTMS onderzoek veel studies hebben niet in kleine dieren goedgekeurd. Echter Rotenberg et al. 15 EP opgenomen contralaterale met stimulatie van 100% MT met een 8-vormige spoel met een uitwendige diameter van nok 20 mm, terwijl stimulatie met 112,5% en 133,3% MT geproduceerd ipsilaterale en contralaterale leden. Dit kan zijn omdat de grote geïnduceerde elektrische veld de contralaterale hemisfeer beïnvloeden. Zo, onze studie is een uitbreiding van deze eerdere werk 15,24, door het bewegen van de spoel meer laterale en kantelen om eenzijdige stimulatie accentueren. Het primaire doel van deze studie was bereikt doordat we bevestigd dat micro-PET onthulde een lokale verhoging van het glucosemetabolisme in de gestimuleerde cerebrale cortex na rTMS (figuur 3).
jove_content "> Plaats en angulatie van de spoel zijn kritische stappen in dit experiment. Eenzijdige stimulatie kan door het plaatsen van het midden van de rTMS coil 1 cm lateraal van de vertex op biauricular lijn en angulaire beweging van de spoel 45 ° op de grond. Stimulatie plaats kan verschillen van de primaire motorische cortex (M1), afhankelijk van de voorwaarde dat de onderzoekers willen richten met rTMS. om bijvoorbeeld te verbeteren depressie, is de dorsolaterale prefrontale cortex (DLPFC) gestimuleerd met rTMS, maar de motor drempel, die wordt ook gemeten in M1 bepaalt de stimulatie-intensiteit zelfs DLPFC rTMS ook de hotspot -. 0,5 cm lateraal van de vertex op de biauricular regel - werd gebruikt om de motor drempelwaarde in deze studie bepalen Hoe meer laterale cortex -. 1 cm lateraal van de vertex - werd bewust gekozen om de eenzijdigheid van de stimulatie te waarborgen en te onderzoeken-rTMS geïnduceerde moleculaire veranderingen. ve_content "> Wat betreft de magnetische veldsterkte in het weefsel, in een eerdere eindige elementen modellering studie naar het geïnduceerde elektrische veld in muizenhersenen, de geïnduceerde elektrische veld door de 70 mm cijfer-8 spoel bij 75% MSO binnen ongeveer 150 V / m op de hersenen oppervlak en de cortex. de elektrische veldsterkte daalde dramatisch afstand toe, die de maximale diepte van meer dan 100 V / m sterkte was 1,9 mm voor 70 mm cijfer-8 spoel 25. in een andere rat studie bij 10 mm diep de geïnduceerde elektrische veldsterkte verlaagd tot 25% van die op de hersenen oppervlak 26. Interessant is dat de half vermogen regio (HPR) was zo ruim ~ 7 x 7 mm (0,51 cm2), zelfs wanneer een 25 mm 8-vormige spoel werd gebruikt 25. Hoewel concrete cijfers werden niet verstrekt voor de 70 mm figure-8 coil, Salvador en Miranda merkte op dat de HPR voor de 70 mm spoel was groter dan die van de 25 mm spoel. Omdat we wilden voorkomen dat de HPR uit met betrekking tot decontralaterale hemisfeer, hebben we gekozen voor een plek 1 cm lateraal van de middellijn. Tilting onvermijdelijk om direct contact tussen de spoel centrum en het oppervlak van de schedel op de stimulering punt waarborgen.Anesthesie kan mogelijk onderdrukken van neuronale prikkelbaarheid, glucose metabolisme en genexpressie. Haghighi et al. bleek dat isofluraan in een concentratie van 0,5% aanzienlijk depressief elektrische transcraniële Europarlementariërs opgenomen van ratten 17. Aan de andere kant werden EP behouden tijdens propofol infusie oplopen tot 40 mg / [kg · h], met resterende grote amplitudes bij ratten 18. In een humane studie, werden er geen verbinding spier actiepotentialen (CMAP) ontdekt tijdens isofluraananesthesie. Echter, 333 Hz, vier-puls magnetische stimulatie opgewekt CMAP in hypothenar spier in 75% van de patiënten, en in de voorste tibialis spier in 65% van de patiënten gedurende 19 propofol narcose. Met behulp gewekt dieren kunnen een betere keuze in de Phys zijniological aspecten, maar ze zijn niet gemakkelijk te beperken tijdens rTMS en zijn gevoelig voor stressvolle omstandigheden.
Als probleemoplossing, een eenvoudige koeler dat een circulatiepomp gebruikt konden wij de duur stimulatie verlengen langer dan 20 minuten, zelfs bij een 20-Hz stimulatiefrequentie. Dit is belangrijk omdat het in staat stelt zoveel als stimulaties in rTMS protocollen voor gebruik bij mensen. Afkoelen van de 8-vormige spoel met slechts handheld ijskoud water zak was niet voldoende om stimulatie van meer dan 20 min waarborgen. Lange rTMS duur in kleine dieren zal de gelegenheid bieden voor een diepgaande onderzoek naar de moleculaire mechanismen van rTMS. In de handel verkrijgbare gekoelde rat coils zal redelijke alternatieven zijn.
Er waren verschillende beperkingen in dit experiment. Eerst slechts een bifasische puls werd aangeboden, waarin een beperking van de machine rTMS we gebruikten was. Toekomstige studies naar het effect van verschillende peulvruchten en golfvormen nodig.Ten tweede hebben we goedkeuring gehecht aan een pragmatische aanpak van de motor drempel te bepalen door middel van palpatie. Hoewel deze methode lager mag zijn dan EMG technieken wat betreft nauwkeurigheid, het gemakkelijk reproduceerbaar en toepassing op vele onderzoekshypotheses. Als bijvoorbeeld het primaire doel van een onderzoeker waren de verschillen tussen de primaire motorische cortex en aangrenzende subcortices in rTMS geïnduceerde gen of eiwitexpressie te onderzoeken, nauwkeuriger bepaling van motor drempel zou moeten worden. Als onderzoeker echter wilden analyseren rTMS geïnduceerde genexpressieprofielen in de dorsolaterale prefrontale cortex weefsel, kan de onderhavige pragmatische volstaan, omdat de afstand en de hoek tussen het doelweefsel en de spoel enigszins kan variëren tijdens de verplaatsing van de spoel van de M1 naar de DLPFC omgeving. Ten derde, hoewel we met succes toegepast rTMS op de eenzijdige halfrond van de hersenen van de rat, nog steeds de stimulatie is niet zo centraal als rTMS in de menselijke onderzoek. De geïnduceerde sterke elektrische figebied van ~ 0,5 cm 2 minder dan 10 cm 2 van de rattenhersenen oppervlak lijkt relatief diffuser dan in de menselijke hemisferische oppervlak van ~ 2500 cm 2 27. Wij vinden echter, dat het model document kan worden gebruikt voor het ophelderen de moleculaire mechanismen van rTMS doordat analyse van de inter-hemisferische verschil in het effect ervan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Homeothermic blanket with a rectal probe | Harvard apparatus | 507222F | |
| Isoflurane (Forane sol.) | Choongwae | ||
| Propofol (Provive Inj. 1% 20 ml) | Claris Lifesciences | ||
| Repetitive magnetic stimulator (Magstim Rapid2) | Magstim Company Ltd | ||
| 25 mm figure-of-8 coil | Magstim Company Ltd | 1165-00 | |
| PET-CT | GE Healthcare | ||
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | (US Patent No. 5,346,994) | |
| RNeasy Lipid Tissue Mini Kit | Qiagen | 74804 | |
| RNeasy Mini Spin Columns | Qiagen | (Mat No. 1011708) | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Ambion Illumina RNA amplification kit | Ambion | ||
| Nanodrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| Illumina RatRef-12 Expression BeadChip | Illumina, Inc. | ||
| Amersham fluorolink streptavidin-Cy3 | GE Healthcare Bio-Sciences |
References
- Lefaucheur, J. P., et al. Neurogenic pain relief by repetitive transcranial magnetic cortical stimulation depends on the origin and the site of pain. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 75 (4), 612-616 (2004).
- Hirayama, A., et al. Reduction of intractable deafferentation pain by navigation-guided repetitive transcranial magnetic stimulation of the primary motor cortex. Pain. 122 (1-2), 22-27 (2006).
- O'Reardon, J. P., et al. Efficacy and safety of transcranial magnetic stimulation in the acute treatment of major depression: a multisite randomized controlled trial. Biol Psychiatry. 62 (11), 1208-1216 (2007).
- Brighina, F., et al. Facilitatory effects of 1 Hz rTMS in motor cortex of patients affected by migraine with aura. Exp Brain Res. 161 (1), 34-38 (2005).
- Lefaucheur, J. P. Stroke recovery can be enhanced by using repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS). Neurophysiol Clin. 36 (3), 105-115 (2006).
- Khedr, E. M., Ahmed, M. A., Fathy, N., Rothwell, J. C. Therapeutic trial of repetitive transcranial magnetic stimulation after acute ischemic stroke. Neurology. 65 (3), 466-468 (2005).
- Fregni, F., et al. A sham-controlled trial of a 5-day course of repetitive transcranial magnetic stimulation of the unaffected hemisphere in stroke patients. Stroke. 37 (8), 2115-2122 (2006).
- Pascual-Leone, A., Valls-Sole, J., Wassermann, E. M., Hallett, M. Responses to rapid-rate transcranial magnetic stimulation of the human motor cortex. Brain. 117 (4), 847-858 (1994).
- Ridding, M. C., Rothwell, J. C. Is there a future for therapeutic use of transcranial magnetic stimulation). Nat Rev Neurosci. 8 (7), 559-567 (2007).
- Valero-Cabre, A., Payne, B. R., Pascual-Leone, A. Opposite impact on 14C-2-deoxyglucose brain metabolism following patterns of high and low frequency repetitive transcranial magnetic stimulation in the posterior parietal cortex. Exp Brain Res. 176 (4), 603-615 (2007).
- Di Lazzaro, V., et al. The physiological basis of the effects of intermittent theta burst stimulation of the human motor cortex. J Physiol. 586 (16), 3871-3879 (2008).
- Post, A., Keck, M. E. Transcranial magnetic stimulation as a therapeutic tool in psychiatry: what do we know about the neurobiological mechanisms. J Psychiatr Res. 35 (4), 193-215 (2001).
- Muller, P. A., Dhamne, S. C., Vahabzadeh-Hagh, A. M., Pascual-Leone, A., Jensen, F. E., Rotenberg, A. Suppression of motor cortical excitability in anesthetized rats by low frequency repetitive transcranial magnetic stimulation. PLoS One. 9 (3), 91065 (2014).
- Funke, K., Benali, A. Modulation of cortical inhibition by rTMS - findings obtained from animal models. J Physiol. 589 (18), 4423-4435 (2011).
- Rotenberg, A., et al. Lateralization of forelimb motor evoked potentials by transcranial magnetic stimulation in rats. Clin Neurophysiol. 121 (1), 104-108 (2010).
- Beom, J., Kim, W., Han, T. R., Seo, K. S., Oh, B. M. Concurrent use of granulocyte-colony stimulating factor with repetitive transcranial magnetic stimulation did not enhance recovery of function in the early subacute stroke in rats. Neurol Sci. 36 (5), 771-777 (2015).
- Haghighi, S. S., Green, K. D., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials. Neurosurgery. 26, 993-997 (1990).
- Fishback, A. S., Shields, C. B., Linden, R. D., Zhang, Y. P., Burke, D. The effects of propofol on rat transcranial magnetic motor evoked potentials. Neurosurgery. 37 (5), 969-974 (1995).
- Rohde, V., Krombach, G. A., Baumert, J. H., Kreitschmann-Andermahr, I., Weinzierl, M., Gilsbach, J. M. Measurement of motor evoked potentials following repetitive magnetic motor cortex stimulation during isoflurane or propofol anaesthesia. Br J Anaesth. 91 (4), 487-492 (2003).
- Lee, S. A., Oh, B. M., Kim, S. J., Paik, N. J. The molecular evidence of neural plasticity induced by cerebellar repetitive transcranial magnetic stimulation in the rat brain: a preliminary report. Neurosci Lett. 575, 47-52 (2014).
- Fu, Y. K., et al. Imaging of regional metabolic activity by (18)F-FDG/PET in rats with transient cerebral ischemia. Appl Radiat Isot. 67 (18), 1743-1747 (2009).
- Silveyra, P., Catalano, P. N., Lux-Lantos, V., Libertun, C. Impact of proestrous milieu on expression of orexin receptors and prepro-orexin in rat hypothalamus and hypophysis: actions of Cetrorelix and Nembutal. Am J Physiol Endocrinol Metab. 292 (3), 820-828 (2007).
- Zidek, N., Hellmann, J., Kramer, P. J., Hewitt, P. G. Acute hepatotoxicity: a predictive model based on focused illumina microarrays. Toxicol Sci. 99 (1), 289-302 (2007).
- Hsieh, T. H., Dhamne, S. C., Chen, J. J., Pascual-Leone, A., Jensen, F. E., Rotenberg, A. A new measure of cortical inhibition by mechanomyography and paired-pulse transcranial magnetic stimulation in unanesthetized rats. J Neurophysiol. 107 (3), 966-972 (2012).
- Salvador, R., Miranda, P. C. Transcranial magnetic stimulation of small animals: a modeling study of the influence of coil geometry, size and orientation. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 674-677 (2009).
- Parthoens, J., Verhaeghe, J., Servaes, S., Miranda, A., Stroobants, S., Staelens, S. Performance Characterization of an Actively Cooled Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation Coil for the Rat. Neuromodulation. , (2016).
- Toro, R., et al. Brain size and folding of the human cerebral cortex. Cereb Cortex. 18 (10), 2352-2357 (2008).
