Introduction
重复经颅磁刺激（rTMS治疗），用于非侵入性脑刺激和神经调节的工具，已经在各种病症的治疗被应用于如中枢性疼痛1,2，抑郁心情 ，偏头痛4，甚至中风5-7。通过线圈快速变化的电流在磁头诱导对大脑皮层和所得神经元激活电场。大脑皮层的兴奋性可以通过磁刺激，从而可以持续超过30分钟的刺激终止后进行调制。
后效应的磁刺激的建议的机制包括长时程增强/抑郁症样作用8，在离子平衡9短暂移位，和代谢改变10。此外，迪拉扎罗等 。表明，间歇THETA突发刺激影响兴奋性突触输入到锥体束神经元，无论是在刺激与对侧大脑半球11。
显著的限制，但是，已经从台上证据转化为临床情况阻碍了研究人员。首先，在以前的动物研究中，磁刺激用于全脑刺激12。全脑刺激是从人类研究9所使用的协议完全不同。另一个问题是与刺激的持续时间有关。这至少部分归因于一个事实，即一个有效的冷却系统是在过去的小线圈不可用。
近年来，精液文章已经发表建议用于克服对小动物大脑中的磁刺激实验这些困难的方式。由这些动物模型中，据透露，在大鼠脑还示出了响应于低频磁刺激13相似皮质兴奋的变化作为人类。更重要的是，经颅磁刺激的细胞和分子机制越来越蓓NG使用经颅磁刺激的动物模型研究。一个典型的例子是，一个独特的类型抑制中间神经元的被称为是间歇THETA爆发刺激14最为敏感。经颅磁刺激的啮齿类动物模型，因此，探索对颅磁刺激引起的变化的分子基础备受追捧的问题提供了新的机遇。如果经颅磁刺激的小动物模型可以更加实验室使用，它可能会大大加快，并在这方面加强研究。
我们现在描述如何将磁刺激应用于大鼠脑，将先前的工作15的延伸的单方面半球。刺激诱导的变化通过使用微正电子发射断层扫描（PET）和mRNA微阵列来研究在受刺激大脑皮质的rTMS引起的变化进行评价。
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Protocol
所有的动物使用的程序进行审查，并由首尔大学医院的机构动物护理和使用委员会批准。
1.实验装置
- 动物准备
- 允许雄性Sprague-Dawley大鼠1周开始实验前，以适应新的环境。
注意：虽然8周龄大鼠在本研究中所使用的，显影或成人大脑可以根据研究假设来选择。
- 允许雄性Sprague-Dawley大鼠1周开始实验前，以适应新的环境。
- 吸入麻醉诱导
- 诱导并用5％异氟醚分别经由室与鼻锥体溶解在40％/ 60％和25％/ 75％氧/氮，2％维持麻醉。调整麻醉深度废除踏板撤回反射到脚趾捏，确认正确的麻醉水平。
注：使用苏醒动物可以在翻译方面更好的选择，但也有困难，经颅磁刺激和t内抑制哎很容易出现过度紧张。 - 监测体温用直肠探头，并通过使用一个恒温毯保持它在37℃。进行监控踏板撤回反射，温度，呼吸频率和心脏率麻醉深度。
- 诱导并用5％异氟醚分别经由室与鼻锥体溶解在40％/ 60％和25％/ 75％氧/氮，2％维持麻醉。调整麻醉深度废除踏板撤回反射到脚趾捏，确认正确的麻醉水平。
- 切换到第静脉麻醉进行维修
- 准备用酒精棉签尾巴。导尿与过渡到静脉麻醉（ 图1A）一个24号静脉导管的侧尾静脉中。负载异丙酚静脉内（1毫克/ [千克·分钟]在10分钟内，用10毫克/毫升乳剂）给动物。丙泊酚开始加载后停止异氟醚5分钟。
- 保持异丙酚镇静在500的输注速率- 700微克/整个实验（千克·分钟），如在先前的研究中16。 通过鼻锥在0.8升/分钟的补充氧气。
注：麻醉丙泊酚是由inhal降低大脑皮层兴奋的潜在抑制通货膨胀剂17-19。然而，麻醉是不是在磁刺激实验强制性的，并且也可以使用惊醒梦中人动物。麻醉方法应考虑研究假设的决定。 - 使用于眼部兽医药膏，以防止干燥时的麻醉下。
- 应用磁刺激（见第2节），以静脉麻醉完成后转型10分钟。
- 恢复条件
- 在监视过程中恢复阶段生命体征。不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。如果动物已经接受了手术，不要将其返回到公司的其他动物，直到完全康复。
注：如果在执行手术的疾病模型中，手术后疼痛的管理是必要的。然而，不需要用于此磁刺激实验疼痛管理。
- 在监视过程中恢复阶段生命体征。不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。如果动物已经接受了手术，不要将其返回到公司的其他动物，直到完全康复。
2.重复经颅磁刺激
- 刺激和线圈
- 通过使用重复的刺激经由 25毫米8字形线圈提供双相施加剌激的刺激。定位线圈0.5厘米外侧上biauricular线的顶点的中心，并具棱的线圈45°到地面。
注意：线圈的最大磁场强度为4.0 T的磁性线圈被牢固地安装在内置的支架。
- 通过使用重复的刺激经由 25毫米8字形线圈提供双相施加剌激的刺激。定位线圈0.5厘米外侧上biauricular线的顶点的中心，并具棱的线圈45°到地面。
- 运动阈值
- 确定在热点的运动阈值（MT），与线圈的中心位置0.5厘米外侧到顶点上biauricular线和与该表面平面上的颅盖。这是在先前的研究中20所使用的相同的方法。
注：MT定义为最小刺激强度由10个连续的刺激唤起对侧前爪5个或更多可扪及收缩。验证是否刺激主要引起对侧肌肉收缩，以保证单边刺激。 - 经颅磁刺激中的应用
- 深麻醉稳定后应用rTMS治疗10分钟。将线圈在目标rTMS治疗部位的中心，距离取决于研究问题大脑皮层选择。然后，倾斜线圈，确保线圈中心，并在刺激点颅骨的表面之间的直接接触。
注意：例如，棱线圈45°到地面，以减少磁刺激的对侧皮层（ 图1B和1C）的电位直接影响。 - 若使动物单边半球20分钟的rTMS的会话。使用软件控制台，提供磁刺激用低频率（1赫兹），高频率（20赫兹），或假刺激方案，并在100设置刺激强度 - 对MT的110％。
- 没有休息执行1 Hz的刺激。使用软件控制台输入“1200”射击为“20”分钟）。为20赫兹的刺激，进行2秒的刺激，接着28休息秒。使用软件控制台输入“1600”射击为“20”分钟。
- 对于假刺激，倾斜垂直线圈（旋转90°）到颅骨和从头部表面（ 图1D）放置线圈边缘相距2厘米。牢固地固定在线圈架的主装置;没有必要通过手工在实验过程中保持线圈。
注意：为了补偿声和其他非特异性的效果，不同的假协议应当用于不同刺激方案。例如，1赫兹假刺激可用于1Hz的磁刺激实验。
- 深麻醉稳定后应用rTMS治疗10分钟。将线圈在目标rTMS治疗部位的中心，距离取决于研究问题大脑皮层选择。然后，倾斜线圈，确保线圈中心，并在刺激点颅骨的表面之间的直接接触。
- 冷却线圈
- 使用一个水冷却系统在1-和20赫兹刺激频率（ 图2），以使超过20分钟重复磁刺激。流通周围在实验过程中线圈的整个长度，以防止过热冰水，虽然线圈或刺激器的温度不被监控。
注：市售冷却鼠线圈也可以使用。 - 如果可能的话，监控通过查看经颅磁刺激机的加热表上的线圈温度。注：有相关的rTMS刺激没有不良后果。然而，有，如果是金属耳识别标签的刺激线圈附近使用的潜在风险烧伤。
- 使用一个水冷却系统在1-和20赫兹刺激频率（ 图2），以使超过20分钟重复磁刺激。流通周围在实验过程中线圈的整个长度，以防止过热冰水，虽然线圈或刺激器的温度不被监控。
3.微正电子发射断层扫描
- 动物准备
- 进行吸入麻醉诱导和静脉麻醉进行维修（见步骤1.2.1和1.3.1）。在的MT的100-110％刺激强度施加1Hz的磁刺激的动物10分钟。
- 在完成磁刺激刺激五分钟后，注入2- [F-18]溶于0.5ml生理盐水的氟脱氧葡萄糖（FDG 18）的1毫居里静脉内通过使用尾静脉导管。允许18 FDG摄取30分钟。注意：将麻醉下大鼠整个微PE时Ť实验。
- 图像分析
- 使用PET扫描仪脑成像重申刺激unilaterality。重建一个3-D迭代算法图像。为了评估通过磁刺激诱导的代谢的变化，在横向脑切片21的图像识别感兴趣的（投资回报）的区域。
- 安乐死
- 进行微PET成像后，安乐死的大鼠与二氧化碳预填充，而老鼠是在深麻醉室。
4.基因芯片
- 安乐死
- 诱导并用5％异氟醚分别经由室与鼻锥体溶解在40％/ 60％和25％/ 75％氧/氮，2％维持麻醉。深麻醉在被斩首前废除踏板撤回反射到脚趾捏的水平。
- 斩首大鼠安乐死5分钟后，1赫兹的rTMS第1届。
- 组织收获
- 铺陈材料和外科器械中使用的顺序，包括折叠的纸巾，骨骨钳，microscissors，更大的外科剪刀，microforcep，10号或11手术刀刀片，一个带盖10厘米玻璃培养皿装满冰和1.5毫升管中。准备一个塑料袋处置尸体的。
- 使颅骨anterioposteriorly中线皮肤切口。说白了解剖软组织及周围肌肉手术剪，然后取出用咬骨钳的颅骨片。迅速从头骨解剖仔细新鲜的大脑。然后，通过使用microforceps和microscissors其放在冰上。冲洗在冰冷的生理盐水的脑组织。
- 脑立即传送到干冰，并随后将其在-80℃下保存在一个管，直到进一步处理。
- 解冻收获前脑组织。
- 将大脑背侧，并收获从ST脑组织通过使用microforceps和microscissors imulated冰大脑皮层（围绕在初级运动皮层的热点）。把收获的组织中的1.5毫升管中。
- RNA制备
- 提取用裂解试剂22组织匀浆的总RNA。过程与DNA酶消化和清理程序。定量RNA样品与等份，并将它们存储在-80℃直至使用。
- 在质量控制方面，通过变性凝胶电泳，在260 OD比评估RNA的纯度和完整性：280，并分析它们对市售的分析仪。
- 标签和净化
- 放大并通过使用市售的RNA扩增试剂盒，以产生生物素化的cRNA纯化总RNA。简言之，反向转录通过用T7寡（dT）引物550纳克总RNA到cDNA的。合成和体外转录第二链cDNA，然后与生物素的NTP标记它。
- 经过PURification，通过使用分光光度计量化的cDNA。
- 杂交和数据导出23
- 用于表达分析表达BeadChip芯片。杂交标记750纳克cDNA样品到各大鼠-12表达珠阵列16 - 18小时在58℃。通过使用链霉亲和的Cy3进行阵列信号的检测。
- 扫描阵列，共焦扫描仪。通过使用市售的软件进行阵列数据输出处理和分析。
- 确定在热点的运动阈值（MT），与线圈的中心位置0.5厘米外侧到顶点上biauricular线和与该表面平面上的颅盖。这是在先前的研究中20所使用的相同的方法。
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Representative Results
十五8周龄雄性SD大鼠被用于MT确定一个独立的评判间可靠性分析。使用肌肉抽搐的触诊的MT在所有可获得的大鼠和33.00±4.21％最大输出刺激（％MSO）和33.93±0.88％MSO，测量分别由两个独立的研究人员。奥特曼偏倚-0.93，以及协议的95％限为-9.13至7.26％。
在6个8周龄鼠（n =在1赫兹的rTMS 4，和n = 2的假rTMS组中）微PET试验，18 F-FDG在ROI的摄取计算为平均在相同的图像同侧和对侧大脑皮质的校准后NCI /毫升。在对侧区域的放射活性作为参考正常化在同侧区域获得数据，并计算差的吸收比（DUR）。从三个连续横向图像获得的平均DURs进行平均以获得DURs的影响。这是在先前的研究中所使用的相同的方法21。18 FDG-PET图像显示在1赫兹组中的刺激左侧皮质区中葡萄糖代谢的焦点增加，支撑所述磁刺激的unilaterality（ 图3）。
的mRNA的微阵列研究中，杂交和整体芯片性能的质量是由内部质量控制检查和原始扫描数据两者的视觉检查监测。阵列数据是根据至少50％的样品中的<0.05（类似于信噪比）的检测的p值过滤（被要求更高的信号值，以获得<0.05的检测p值）。所选基因的信号值通过对数转换，并通过使用一个位数方法标准化。表达大的统计显着TA通过使用曼 - 惠特尼U检验确定和褶皱的变化，其中零假设是，1赫兹的rTMS之间不存在差异（N = 4）和假组（n = 4）。的假发现率是由使用的Benjamini-Hochberg指出算法调整的p值来控制。标准化和过滤后的mRNA展示显著差异表达（|倍数变化| 1.2，P <0.05）被选定。其结果，立即早期基因的表达水平的rTMS组中较假手术组中显著更高， 弧 ，JUNB的上调表达，并的Egr2基因（ 图4A）。
此外，我们后（在1赫兹每组5和20赫兹基）20分钟磁刺激的连续5天测得的刺激和对侧皮层BDNF mRNA表达。经过1 Hz的刺激，BDNF mRNA表达显著解释第1条R IN比在对侧酮（ 图4B）的刺激皮质。这揭示了微分磁刺激诱发的刺激和对侧大脑皮质的变化。
图1. 实验设置（A）的静脉导管插入在侧尾静脉（箭头），和一鼻锥体一个切换到静脉异丙酚后用于用异氟烷麻醉以及用于氧气补充。（B经颅磁刺激（C）背背视图中）背外侧视图。图-的-8的线圈的表面成角度45°到地面，以尽量减少对侧皮层的潜在的直接刺激。（D）的假磁刺激的示意图。线圈被放置2cm处从与倾斜垂直（90°旋转）到颅骨。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 冷却系统使用具有无需电机。在线圈的铜线冰包装，因为冷却系统enwrapping线圈的电缆是足以冷却在铜线所产生的热量的水的循环泵 。线圈的表面是不与冰水直接接触。冷却系统是在刺激会话活跃。
图3. 正电子发射断层扫描（PET）图像。（A）的微PET图像的冠状切片使用获得的大鼠2- [F-18]氟脱氧葡萄糖，示出了在刺激的皮质增加本地葡萄糖代谢后1赫兹的rTMS在MT的（箭头）的100％的10分钟（B）的 FDG摄取的比例在1赫兹刺激/对侧皮质（N = 4）和假rTMS治疗组（n = 2）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4. 即早基因的mRNA芯片和BDNF。（A） 电弧 ，JUNB和的Egr2差异表达，经鉴定的芯片后，1赫兹的rTMS 1届获得5分钟，通过改变倍数订购。该基因的表达水平的rTMS组在显著升高（N = 4）塔n个假手术组（N = 4）（P <0.05与曼-惠特尼U检验），与上调弧 ，JUNB和的Egr2基因的表达。（B）后的20分钟1赫兹连续5天经颅磁刺激，BDNF mRNA的表达在刺激皮质较对侧显著较高（* p <0.05，Wilcoxon符号秩检验）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这项研究的主要目的是介绍单边rTMS治疗的动物模型。虽然单边刺激是人类颅磁刺激研究的最根本的特征之一，许多研究都没有小动物采用。然而，罗滕贝格等人 15记录，使用具有20毫米的外瓣直径的8字形线圈100％MT的刺激对侧的MEP，而刺激112.5％和133.3％的MT产生同侧以及对侧的MEP。这可能是因为大感应电场可影响对侧半球。因此，我们的研究是此以前的工作15,24的延伸，通过移动线圈多个横向和倾斜它加重单方面刺激。达到本研究的主要目的，因为我们证实，微PET揭示磁刺激后葡萄糖代谢的刺激大脑皮质的局部增加（ 图3）。
jove_content“>位置和线圈的角度是在这个实验中的关键步骤。单侧刺激可以通过将磁刺激的中心线圈1厘米外侧上biauricular线的顶点和调角的线圈45°到地面。刺激站点可以是从主运动皮层（M1）的不同，这取决于研究者希望与磁刺激定位的条件，例如，以改善抑郁症，背外侧前额叶皮层（DLPFC）受到刺激与磁刺激，但电机的阈值，其中在M1也测量，确定即使DLPFC磁刺激的刺激强度同样，热点 - 0.5厘米外侧上biauricular线的顶点 - 用于确定在本研究中的运动阈值的多个横向皮质 - 1厘米横向到顶点 - 是故意选择，以确保刺激unilaterality，探讨经颅磁刺激诱导的分子变化。 ve_content“>至于在组织内的磁场强度，在鼠脑的感应电场的先前有限元建模研究中，由感应电场70 mm图-8-线圈在75％的MSO达到约150V的在脑表面和在皮层/米2。该电场强度显着下降的距离的增加，示出具有大于100伏/米强度的最大深度是70 mm图-8-线圈25仅为1.9毫米。在另一鼠研究中，以10mm深度的感应电场强度降低到大脑表面26上的25％。有趣的是，半功率区域（HPR）是一样宽〜7×7毫米（0.51厘米2）即使当25 mm图8线圈采用25。虽然具体的数字不是为70毫米的8字形线圈提供，萨尔瓦多和米兰达评论说，HPR为70毫米的线圈比25毫米线圈的大。因为我们想防止从HPR覆盖对侧大脑半球，我们选择了一个点1厘米外侧中线。倾斜是不可避免确保线圈中心，并在刺激点颅骨的表面之间的直接接触。麻醉可以潜在抑制神经元兴奋性，糖代谢，和基因表达。 Haghighi 等 。透露，异氟醚在大鼠17录0.5％显著郁闷经颅电欧洲议会议员的浓度。另一方面，维护端点异丙酚高达40毫克/ [千克·小时]期间保存，与振幅其余大鼠18大。在人类的研究中，异氟醚麻醉过程中没有检测到复合肌肉动作电位（CMAP）。然而，333赫兹，四脉冲磁刺激诱发的CMAP在小鱼际肌在75％的患者，以及在65％的患者胫前肌，异丙酚麻醉19中。使用苏醒动物可以在物理更好的选择iological方面，但它们是不容易的磁刺激期间抑制和易于压力条件。
作为解决问题，即使用的循环水泵简单冷却器使我们能够甚至在20赫兹的刺激频率超过20分钟延长的刺激持续时间。这一点很重要，因为它使尽可能多的刺激在rTMS治疗方案为人类受试者。冷却只用手持冰冷水袋图8线圈不足以确保超过20分钟的刺激。龙颅磁刺激持续时间小动物将提供机会深入rTMS治疗的分子机制的研究。市售冷却线圈鼠将是合理的选择。
有在该实验一些局限性。首先，只有一个双相脉冲是可利用的，这是我们所使用的磁刺激机的限制。研究各种脉冲和波形的影响将来的研究将是必要的。第二，我们采取了务实的态度通过触诊来确定电机的门槛。尽管这种方法可能不如肌电技术在精度方面，它是很容易可再现的，适用于许多研究假设。例如，如果一个研究者的主要目的是研究的主要运动皮层和相邻subcortices在磁刺激诱导的基因或蛋白质表达之间的差异，运动阈值的更精确的测定是必要的。如果研究人员，但是，要分析的rTMS诱导的基因表达图谱中的背外侧前额叶皮层组织，本务实的方法就足够了，因为目标组织与线圈之间的距离和角度可以在线圈的运动期间略有不同从M1到DLPFC区。第三，虽然我们成功地应用在大鼠脑的单方面半球颅磁刺激，仍然刺激并不如在人类研究的rTMS作为焦点。诱导强电网络的〜对大鼠脑表面的小于10厘米2 0.5 cm 2的视场似乎相对比的人类半球表面〜2500厘米27，我们相信，然而，这里所提出的模型可用于阐明2更加分散通过允许在其作用的半球间差异的分析颅磁刺激的分子机制。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Homeothermic blanket with a rectal probe | Harvard apparatus | 507222F | |
| Isoflurane (Forane sol.) | Choongwae | ||
| Propofol (Provive Inj. 1% 20 ml) | Claris Lifesciences | ||
| Repetitive magnetic stimulator (Magstim Rapid2) | Magstim Company Ltd | ||
| 25 mm figure-of-8 coil | Magstim Company Ltd | 1165-00 | |
| PET-CT | GE Healthcare | ||
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | (US Patent No. 5,346,994) | |
| RNeasy Lipid Tissue Mini Kit | Qiagen | 74804 | |
| RNeasy Mini Spin Columns | Qiagen | (Mat No. 1011708) | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Ambion Illumina RNA amplification kit | Ambion | ||
| Nanodrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| Illumina RatRef-12 Expression BeadChip | Illumina, Inc. | ||
| Amersham fluorolink streptavidin-Cy3 | GE Healthcare Bio-Sciences |
References
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