Introduction
La stimulation magnétique transcrânienne répétitive (SMTr), un outil pour la stimulation cérébrale non invasive et neuromodulation, a été appliqué dans le traitement de diverses conditions telles que la douleur centrale 1,2, la dépression 3, la migraine 4, et même temps 5-7. l'évolution rapide du courant électrique à travers des bobines sur la tête induit un champ électrique sur le cortex cérébral et une activation neuronale résultant. L'excitabilité du cortex cérébral peut être modulée par SMTr, qui peut durer plus de 30 minutes après la stimulation est terminée.
Mécanismes suggérés des rTMS après-effet à long terme comprennent potentialisation / dépression comme l' effet 8, changement transitoire dans l' équilibre ionique 9 et métabolique change 10. En outre, Di Lazzaro et al. suggèrent que la stimulation de salve thêta intermittente affecte les entrées synaptiques excitateurs aux pyramidal neurones des voies, à la fois dans la stimulationet l'hémisphère controlatéral 11.
Des limites importantes, cependant, ont empêché les chercheurs de la conversion des preuves sur banc à des situations cliniques. Tout d' abord, dans des études animales précédentes, rTMS a été utilisée pour la stimulation du cerveau entier 12. La stimulation du cerveau entier est tout à fait différent des protocoles utilisés dans les études humaines 9. L'autre problème est lié à la durée de stimulation. Ceci est au moins en partie attribuable au fait qu'un système de refroidissement efficace est indisponible pour les petites bobines dans le passé.
Au cours des dernières années, des articles séminales ont été publiés en proposant des moyens permettant de surmonter ces difficultés dans l'expérience rTMS sur le petit cerveau de l'animal. Par ces modèles animaux, il a été révélé que le cerveau du rat montre également des modifications de l' excitabilité du cortex semblables chez l'être humain en réponse à la rTMS à basse fréquence 13. Plus important encore, les mécanismes cellulaires et moléculaires de la rTMS sont de plus en plus being étudiée en utilisant des modèles animaux de rTMS. Un exemple en est que un type distinct de interneuron inhibitrice est connu pour être le plus sensible à la stimulation thêta intermittente rafale 14. modèles murins de rTMS, par conséquent, offrent de nouvelles opportunités pour explorer des questions très recherchés sur les bases moléculaires des changements rTMS-induits. Si des petits modèles animaux de rTMS peuvent être utilisés dans plusieurs laboratoires, il peut grandement accélérer et renforcer la recherche dans ce domaine.
Nous décrivons maintenant comment appliquer rTMS à l'hémisphère unilatéral de cerveau de rat, une extension des travaux antérieurs 15. les changements induits par stimulation ont été évalués à l'aide de micro-tomographie par émission de positons (TEP) et les microréseaux d'ARNm pour étudier SMTr induite par des changements dans le cortex cérébral stimulé.
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Protocol
Toutes les procédures utilisant des animaux ont été examinés et approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'hôpital universitaire national de Séoul.
1. Configuration expérimentale
- préparation des animaux
- Permettre des rats mâles Sprague-Dawley de 1 semaine à adapter à leur nouvel environnement avant de commencer l'expérience.
NOTE: Bien que 8 semaines chez des rats âgés ont été utilisés dans la présente étude, un développement ou cerveau adulte peut être choisi en fonction des hypothèses de recherche.
- Permettre des rats mâles Sprague-Dawley de 1 semaine à adapter à leur nouvel environnement avant de commencer l'expérience.
- anesthésie par inhalation pour l'induction
- Et maintenir une anesthésie induire à 5% et 2% d'isoflurane dissous dans 40% / 60% et 25% / 75% d' oxygène / azote par l' intermédiaire d' une chambre et le nez conique, respectivement. Régler la profondeur de l'anesthésie au niveau de l'abolition du réflexe de retrait de la pédale de pincement de l'orteil pour confirmer anesthetization bon.
REMARQUE: L'utilisation d'animaux réveillées peut être un meilleur choix en termes de traduction, mais il y a des difficultés à retenir lors de la SMTr et they sont sujettes à un stress excessif. - Surveiller la température du corps avec une sonde rectale et le maintenir à 37 ° C à l'aide d'une couverture homéothermique. Surveiller profondeur de l'anesthésie en utilisant la pédale réflexe de retrait, la température, la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque.
- Et maintenir une anesthésie induire à 5% et 2% d'isoflurane dissous dans 40% / 60% et 25% / 75% d' oxygène / azote par l' intermédiaire d' une chambre et le nez conique, respectivement. Régler la profondeur de l'anesthésie au niveau de l'abolition du réflexe de retrait de la pédale de pincement de l'orteil pour confirmer anesthetization bon.
- Mettez-over à l'anesthésie par voie intraveineuse pour l'entretien
- Préparer la queue avec un tampon imbibé d'alcool. Cathétériser une veine de la queue latérale avec un cathéter veineux calibre 24 pour le passage à l' anesthésie intraveineuse (figure 1A). Charge propofol par voie intraveineuse (1 mg / kg · [min] pendant 10 min, en utilisant 10 mg / ml d'émulsion) aux animaux. Cesser isoflurane 5 min après le début de propofol chargement.
- Maintenir sédation au propofol à un taux de 500 pour perfusion - 700 ug / (kg · min) tout au long de l'expérience, comme dans une étude précédente 16. Supplément d' oxygène à 0,8 L / min par l' intermédiaire d' un cône de nez.
NOTE: L'anesthésie avec du propofol est de réduire la suppression potentielle de l'excitabilité corticale par le inhalAgent ation 17-19. Cependant, l'anesthésie ne soit pas obligatoire dans les expériences SMTr, et les animaux Réveillé peut également être utilisé. méthodes d'anesthésie devraient être décidées en tenant compte des hypothèses de recherche. - Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Appliquer la stimulation magnétique (voir Section2) 10 min après la transition complète de l' anesthésie iv.
- conditions de récupération
- Surveiller les signes vitaux pendant la phase de récupération. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Si un animal a subi une intervention chirurgicale, ne reviennent pas à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
REMARQUE: si une intervention chirurgicale pour un modèle de maladie est effectuée, la gestion de la douleur post-chirurgicale est nécessaire. Cependant, la gestion de la douleur est pas nécessaire pour cette expérience rTMS.
- Surveiller les signes vitaux pendant la phase de récupération. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Si un animal a subi une intervention chirurgicale, ne reviennent pas à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
2. Répétitive stimulation magnétique transcrânienne
- Stimulateur et la bobine
- Appliquer la stimulation à l'aide d' un stimulateur répétitif qui fournit des stimuli biphasique via un 25 mm en 8 bobine. Localisez le centre de la bobine de 0,5 cm latéralement au sommet sur la ligne biauricular et angulate la bobine 45 ° par rapport au sol.
NOTE: La force maximale magnétique de la bobine de champ est de 4,0 T. La bobine magnétique est monté fermement sur un support intégré.
- Appliquer la stimulation à l'aide d' un stimulateur répétitif qui fournit des stimuli biphasique via un 25 mm en 8 bobine. Localisez le centre de la bobine de 0,5 cm latéralement au sommet sur la ligne biauricular et angulate la bobine 45 ° par rapport au sol.
- seuil de moteur
- Déterminer le seuil moteur (MT) au point chaud, avec le centre de la bobine positionnée 0,5 cm latéralement au sommet sur la ligne biauricular et avec le plat de la surface sur la calvaria. Ceci est la même méthodologie utilisée dans une étude précédente 20.
NOTE: Définir MT que l'intensité minimale de stimulation évoquant 5 ou plus palpables contractions sur la patte controlatérale de 10 stimuli consécutifs. Vérifier si la stimulation est principalement la cause de la contraction du muscle controlatéral pour assurer une stimulation unilatérale. - Application de rTMS
- Appliquer rTMS 10 min après la stabilisation de l'anesthésie profonde. Placez le centre de la bobine sur le site SMTr cible, choisi parmi les cortex cérébraux en fonction des questions de recherche. Ensuite, incliner la bobine pour assurer un contact direct entre le centre de la bobine et la surface du crâne au point de stimulation.
NOTE: Par exemple, angulate la bobine de 45 ° par rapport au sol afin de minimiser un effet direct potentiel de SMTr sur le cortex controlatéral (Figure 1B et 1C). - Soumettre les animaux à une session de 20 min-rTMS de l'hémisphère unilatérale. Utilisation de la console du logiciel, de livrer rTMS avec une basse fréquence (1 Hz), à haute fréquence (20 Hz), ou d'un protocole de stimulation factice, et régler l'intensité de la stimulation à 100-110% de la MT.
- Effectuer 1 stimulation Hz sans repos. Utilisation de la console d'entrée du logiciel "1200" plans pour "20" min). Pour 20 stimulation Hz, effectuer 2 sec de la stimulation suivie par 28sec de repos. Utilisation de la console d'entrée du logiciel "1.600" plans pour min "20".
- Pour une stimulation factice, inclinez la bobine perpendiculaire (rotation de 90 °) à la calvaria et placer le bord de la bobine 2 cm en dehors de la surface de la tête (figure 1D). Fixer le support de bobine fermement à l'appareil principal; il n'y a pas besoin de tenir la bobine à la main lors de l'expérience.
REMARQUE: Pour compenser les effets non spécifiques acoustiques et d'autres, les protocoles de faux distincts doivent être utilisés pour des protocoles de stimulation distincts. Par exemple, une stimulation factice 1-Hz peut être utilisé pour 1 Hz SMTr expériences.
- Appliquer rTMS 10 min après la stabilisation de l'anesthésie profonde. Placez le centre de la bobine sur le site SMTr cible, choisi parmi les cortex cérébraux en fonction des questions de recherche. Ensuite, incliner la bobine pour assurer un contact direct entre le centre de la bobine et la surface du crâne au point de stimulation.
- Le refroidissement de la bobine
- Utilisez un système de refroidissement de l' eau pour permettre la stimulation magnétique répétitive pendant plus de 20 min à 1- et 20 Hz fréquences de stimulation (figure 2). Faire circuler l'eau glacée entourant toute la longueur de la bobine pendant l'expérience pour éviter la surchauffe, bien que la température de la bobine ou stimulateur est pas surveillée.
REMARQUE: disponibles dans le commerce des bobines refroidies de rat peuvent également être utilisés. - Si possible, surveiller la température de la batterie en observant la jauge de chauffage de la machine rTMS. NOTE: Il n'y avait pas de conséquences fâcheuses liées à la stimulation rTMS. Il y a, cependant, un risque de brûlure potentiel si les étiquettes d'identification de l'oreille de métal sont utilisés à proximité de la bobine stimulant.
- Utilisez un système de refroidissement de l' eau pour permettre la stimulation magnétique répétitive pendant plus de 20 min à 1- et 20 Hz fréquences de stimulation (figure 2). Faire circuler l'eau glacée entourant toute la longueur de la bobine pendant l'expérience pour éviter la surchauffe, bien que la température de la bobine ou stimulateur est pas surveillée.
3. tomographie par émission de positons Micro
- préparation des animaux
- Procéder à l'anesthésie par inhalation pour l'induction et l'anesthésie iv pour l'entretien (voir étape 1.2.1 et 1.3.1). Appliquer 1 Hz rTMS à un animal pendant 10 minutes à une intensité de stimulation de 100 à 110% du MT.
- Cinq minutes après la fin de la stimulation rTMS, injecter 1 mCi de 2- [F-18] fluoro-désoxyglucose (FDG 18) dissous dans 0,5 ml de sérum physiologique par voie intraveineuse à l'aide d' un cathéter dans la veine caudale. Autoriser 30 min pour 18 FDG. REMARQUE: Placez le rat sous anesthésie pendant toute la micro-PEexpérience T.
- L'analyse d'image
- Utilisez un scanner TEP pour l'imagerie cérébrale pour réaffirmer l'unilatéralité de la stimulation. Reconstruire images avec un 3-D algorithme itératif. Pour évaluer les changements dans le métabolisme induites par SMTr, identifier les régions d'intérêt (ROI) dans les images des coupes de cerveau transversales 21.
- Euthanasie
- Après avoir effectué l'imagerie micro-PET, l'euthanasie, les rats dans une chambre remplie au préalable avec du dioxyde de carbone, tandis que les rats sont en anesthésie profonde.
4. ARNm Microarray
- Euthanasie
- Et maintenir une anesthésie induire à 5% et 2% d'isoflurane dissous dans 40% / 60% et 25% / 75% d' oxygène / azote par l' intermédiaire d' une chambre et le nez conique, respectivement. Anesthetize profondément au niveau de l'abolition du retrait de la pédale réflexe de pincement de l'orteil avant d'être décapité.
- Décapitez les rats pour l'euthanasie 5 min après 1 session de 1 Hz SMTr.
- récolte de tissus
- Disposez les matériaux et les instruments chirurgicaux dans l'ordre d'utilisation, y compris les serviettes pliées en papier, une gouge osseuse, microciseaux, ciseaux chirurgicaux plus grands, un microforcep, une lame de scalpel n ° 10 ou 11, 10 cm plat lidded de Pétri en verre rempli de glace et 1,5 ml tubes. Préparer un sac en plastique pour l'élimination de la carcasse.
- Faire une incision cutanée médiane dans le anterioposteriorly du crâne. Carrément disséquer les tissus mous et les muscles environnants avec des ciseaux chirurgicaux, et enlever le morceau de crâne d'os en utilisant une gouge osseuse. disséquer rapidement le cerveau frais soigneusement du crâne. Ensuite, posez-le sur la glace en utilisant les microforceps et microciseaux. Rincer le tissu cérébral dans la glace froide solution saline normale.
- Transférer le cerveau à la glace sèche immédiatement, puis le stocker à -80 ° C dans un tube jusqu'à ce que le traitement ultérieur.
- Décongeler le tissu cérébral avant la récolte.
- Placez le cerveau dorsale vers le haut, et récolter le tissu cérébral de la stimulated cortex cérébral (autour du point chaud dans le cortex moteur primaire) sur la glace en utilisant les microforceps et microciseaux. Placez le tissu prélevé dans le tube de 1,5 ml.
- préparation d'ARN
- Extraire l' ARN total à partir des homogénats de tissus en utilisant le réactif de lyse 22. Processus avec la digestion de DNase et les procédures de nettoyage. Quantifier les échantillons d'ARN et aliquotes et stocker à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Pour le contrôle de qualité, d'évaluer la pureté et l'intégrité de l'ARN par électrophorèse sur gel dénaturant, à un rapport de DO 260: 280, et de les analyser sur un analyseur disponible dans le commerce.
- Marquage et purification
- Amplifier et purifier l'ARN total en utilisant un kit d'amplification d'ARN disponible dans le commerce pour donner ARNc biotinylé. En bref, reverse-transcription 550 ng d'ARN total en ADNc en utilisant une T7 oligo (dT). Synthétiser et in vitro transcrire le deuxième brin d' ADNc, puis l' étiqueter avec de la biotine-NTP.
- Après purification, quantifier l'ADNc en utilisant un spectrophotomètre.
- Hybridation et exporter des données 23
- Utiliser le BeadChip d'expression pour l'analyse de l'expression de l'ARNm. Hybrider les 750-ng échantillons d'ADNc marqués à chaque rat-12 expression perles tableau pour 16 - 18 h à 58 ° C. Effectuer la détection du signal de réseau en utilisant la streptavidine-Cy3.
- tableaux de numérisation avec un scanner confocal. Effectuer des données de réseau de traitement et d'analyse d'exportation en utilisant un logiciel disponible dans le commerce.
- Déterminer le seuil moteur (MT) au point chaud, avec le centre de la bobine positionnée 0,5 cm latéralement au sommet sur la ligne biauricular et avec le plat de la surface sur la calvaria. Ceci est la même méthodologie utilisée dans une étude précédente 20.
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Representative Results
Quinze 8 semaines vieux rats Sprague-Dawley ont été utilisés pour une interévaluateurs analyse de fiabilité distincte de la détermination MT. Utilisation de la palpation des contractions musculaires, les MTs ont été obtenus dans tous les rats et mesurées à 33,00 ± 4,21% de sortie maximale du stimulateur (% MSO) et 33,93 ± 0,88% MSO, respectivement, par deux chercheurs indépendants. biais Bland-Altman était -0.93, et les limites de l'accord de 95% étaient à 7,26% -9,13.
Dans l'expérience de micro-FDG sur six à 8 semaines chez des rats âgés (n = 4 dans la rTMS 1 Hz et n = 2 dans le groupe rTMS fictifs), l'absorption de 18 F-FDG dans les régions d' intérêt a été calculé comme la moyenne nCi / cc après l'étalonnage des deux corticales cérébrales ipsilatérales et controlatérales dans les mêmes images. La radioactivité dans la zone controlatérale a été utilisé comme référence pour normaliser les données obtenues dans la zone homolatérale, et le rapport de l'absorption différentielle (DUR) a été calculé.Les DURS moyennes obtenues à partir de trois images transversales consécutives ont été moyennées pour obtenir le DURS pour les rats. Ceci est la même méthodologie utilisée dans une étude précédente 21. 18 images FDG-PET ont montré une augmentation focale dans le métabolisme du glucose dans la zone corticale gauche stimulée dans le groupe 1-Hz, supportant le unilatéralité des SMTr (Figure 3).
Dans l'étude des microréseaux d'ARNm, la qualité de l'hybridation et la puce performance globale ont été contrôlées par l'inspection visuelle des deux contrôles de qualité internes et les données brutes numérisées. les données de tableau sont filtrés en fonction d'une valeur de détection de p <0,05 (similaire au rapport signal-bruit) d'au moins 50% d'échantillons (une valeur de signal plus élevée était nécessaire pour obtenir une valeur de détection de p <0,05). La valeur de signal du gène sélectionné a été transformé par logarithme et normalisé en utilisant un procédé de quantile. La signification statistique de l'expression data a été déterminée en utilisant le test U Mann-Whitney et plier le changement, dans lequel l'hypothèse nulle était qu'aucune différence existe entre le 1 Hz rTMS (n = 4) et des groupes fictifs (n = 4). Le taux de faux positifs est contrôlée en ajustant la valeur p en utilisant l'algorithme Benjamini-Hochberg. Après la normalisation et le filtrage, les ARNm montrant des expressions différentielles significatives (| facteur de variation | 1,2, p <0,05) ont été sélectionnés. En conséquence, les niveaux des gènes précoces immédiats d'expression étaient significativement plus élevés dans le groupe rTMS que dans le groupe témoin, avec l'expression de l'arc, JunB et les gènes régulés à la hausse EGR2 (figure 4A).
En outre, nous avons mesuré les expressions d'ARNm du BDNF dans le cortex contralateral stimulé et au bout de 5 jours consécutifs de 20 min rTMS (n = 5 chacune dans le 1 Hz et 20 Hz-groupes). Après stimulation de 1 Hz, l' expression de l' ARNm de BDNF était significativement higher dans le cortex stimulée que dans l'une controlatérale (figure 4B). Cette étude a révélé rTMS induite par des changements dans les cortex cérébraux stimulés et controlatérale différentielles.
Figure 1. Paramètres expérimentaux. (A) Un cathéter intraveineux est inséré dans une veine de la queue latérale (flèche), et un cône de nez est utilisé pour l' anesthésie avec de l' isoflurane, ainsi que pour le supplément d'oxygène après un passage au propofol par voie intraveineuse. (B ) Dorsale vue antérolatérale pendant rTMS. (C) Dorsale vue postérieure. La surface d'une bobine figure-de-8 est angulation de 45 ° au sol pour minimiser la stimulation directe potentielle du cortex controlatéral. (D) Une illustration schématique de rTMS sham. La bobine est placée à une distance de 2 cm et incliné perpendiculaire (rotation de 90 °)à la calvaria. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Le système de refroidissement utilise une pompe à eau à circulation avec le moteur. D'emballage de glace sur les fils de cuivre de la bobine ne soit pas nécessaire, car le système de refroidissement enveloppant le câble de la bobine est suffisant pour refroidir la chaleur produite au niveau des fils de cuivre. La surface de la bobine est pas en contact direct avec l'eau glacée. Le système de refroidissement est actif au cours des séances de stimulation.
Figure 3. tomographie par émission de positons (TEP) Image. (A) Les coupes coronales des images micro-PETun rat obtenu en utilisant la 2- [F-18] fluoro-désoxyglucose, montrant l' augmentation du métabolisme du glucose locale dans le cortex stimulé après rTMS 1 Hz pendant 10 min à 100% des MT (flèches). (B) Le rapport de FDG dans stimulé le cortex / controlatérale dans le 1-Hz (n = 4) et sham groupe rTMS (n = 2). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. L'ARNm biopuces des gènes précoces immédiats et BDNF. (A) Arc, JunB et EGR2 ont été exprimés de manière différentielle, qui ont été identifiés sur la puce obtenus 5 min après 1 session de 1 Hz SMTr, commandé par le changement de pliage. Les niveaux d'expression des gènes étaient significativement plus élevés dans le groupe rTMS (n = 4) than dans le groupe témoin (n = 4) (p <0,05 avec le test de Mann-Whitney U), avec les expressions des gènes Arc, JunB et EGR2 surexprimés. (B) Après 5 jours consécutifs de 20 min 1-Hz rTMS, expression de l' ARNm de BDNF était significativement plus élevée dans le cortex stimulé que dans le côté controlatéral (* p <0,05, Wilcoxon test signé rang). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le but principal de cette étude était d'introduire un modèle animal de la rTMS unilatérales. Bien que la stimulation unilatérale est l'une des caractéristiques les plus fondamentales de la recherche rTMS humaines, de nombreuses études ont pas adopté dans les petits animaux. Cependant, Rotenberg et al. 15 enregistré MPE controlatéral avec une stimulation de 100% de MT en utilisant une bobine de chiffre 8 d'un diamètre de lobe extérieur de 20 mm, tandis que la stimulation avec 112,5% et 133,3% MT produit ipsilatéral ainsi que MPE controlatéral. Cela pourrait être parce que le grand champ électrique induit peut affecter l'hémisphère controlatéral. Ainsi, notre étude est une extension de ce travail précédent 15,24, en déplaçant la bobine plus latérale et en l' inclinant pour accentuer la stimulation unilatérale. L'objectif principal de cette étude a été réalisée parce que nous avons confirmé que les micro-PET a révélé une augmentation locale dans le métabolisme du glucose dans le cortex cérébral stimulé après rTMS (Figure 3).
jove_content "> Localisation et angulation de la bobine sont des étapes importantes dans cette expérience. stimulation unilatérale est possible en plaçant le centre de la rTMS bobine 1 cm latérale au sommet sur la ligne biauricular et angulation la bobine 45 ° par rapport au sol. La stimulation site peut être différent du cortex moteur primaire (M1), en fonction de la condition que les enquêteurs veulent cibler à la rTMS. par exemple, pour améliorer la dépression, le cortex préfrontal dorsolateral (DLPFC) est stimulé par la rTMS, mais le seuil moteur, qui est également mesurée en M1, détermine l'intensité de la stimulation même pour DLPFC rTMS de même, le point chaud -. 0,5 cm latéralement au sommet sur la ligne biauricular - a été utilisée pour déterminer le seuil moteur dans la présente étude le cortex latéral plus -. 1 cm latérale au sommet - a été volontairement choisi pour assurer la unilatéralité de stimulation et étudier les changements moléculaires SMTr-induites. ve_content "> En ce qui concerne l'intensité du champ magnétique à l'intérieur du tissu, dans une étude de modélisation par éléments finis précédent sur le champ électrique induit dans le cerveau de la souris, le champ électrique induit par le 70 mm figure-8 bobine à 75% MSO a atteint environ 150 V / m sur la surface du cerveau et dans le cortex. l'intensité du champ électrique a considérablement diminué lorsque la distance augmente, montrant la profondeur maximale de plus de 100 V / m , la force était de 1,9 mm pour la bobine de la figure-8 70 mm 25. dans un autre rat étude, à 10 mm de profondeur l'intensité du champ électrique induit une diminution de 25% de celle de la surface du cerveau 26. Il est intéressant, dans la région de la moitié de puissance (HPR) est aussi large que ~ 7 x 7 mm (0,51 cm 2) , même si un 25 mm figure-8 bobine a été utilisé 25. Bien que des chiffres concrets ne sont pas prévues pour le 70 mm figure-8 bobine, Salvador et Miranda fait remarquer que l'HPR pour la bobine de 70 mm était plus grande que celle de la bobine de 25 mm. Comme nous voulions empêcher l'HPR de couvrir lahémisphère controlatéral, nous avons sélectionné une tache 1 cm en dehors de la ligne médiane. Tilting était inévitable pour assurer un contact direct entre le centre de la bobine et la surface du crâne au point de stimulation.L'anesthésie peut potentiellement déprimer l'excitabilité neuronale, du métabolisme du glucose et l'expression du gène. Haghighi et al. a révélé que l' isoflurane à une concentration de 0,5% nettement déprimés députés transcrânienne électriques enregistrés chez des rats 17. D'autre part, les députés ont été conservés pendant propofol infusion aussi élevée que 40 mg / [kg · h], avec des amplitudes restant importante chez les rats 18. Dans une étude humaine, aucun potentiel d'action musculaire composé (CMAP) ont été détectés au cours de l'anesthésie isoflurane. Cependant, 333 Hz, la stimulation magnétique à quatre impulsions évoqué CMAP dans le muscle hypothénar dans 75% des patients, et dans le muscle tibial antérieur dans 65% des patients, au cours de l' anesthésie au propofol 19. L'utilisation d'animaux réveillées peut être un meilleur choix dans les physaspects siologiques, mais ils ne sont pas faciles à retenir lors de la SMTr et sont sujettes à des conditions stressantes.
Comme dépannage, un refroidisseur simple qui utilise une pompe de circulation d'eau nous a permis de prolonger la durée de stimulation pendant plus de 20 minutes, même à une fréquence de stimulation de 20 Hz. Ceci est important car il permet aussi de stimulations comme dans les protocoles rTMS pour des sujets humains. Le refroidissement de la bobine figure-8 avec seulement un sac d'eau de poche glacée ne suffisait pas à assurer une stimulation de plus de 20 min. Longue durée rTMS chez les petits animaux sera l'occasion pour enquête approfondie des mécanismes moléculaires de la SMTr. Disponibles dans le commerce des bobines de rat refroidis seront alternatives raisonnables.
Il y avait plusieurs limitations dans cette expérience. Tout d'abord, seule une impulsion à deux états est disponible, ce qui est une limitation de la machine rTMS nous avons utilisé. Les futures études enquêtant sur l'effet de diverses impulsions et formes d'onde seront nécessaires.Deuxièmement, nous avons adopté une approche pragmatique pour déterminer le seuil du moteur par palpation. Bien que cette méthode peut être inférieure aux techniques EMG en termes de précision, il est facilement reproductible et applicable à de nombreuses hypothèses de recherche. Par exemple, si le but principal d'un chercheur devait étudier les différences entre le cortex moteur primaire et subcortices adjacents dans le gène rTMS-induite ou l'expression de la protéine, la détermination plus précise du seuil moteur serait nécessaire. Si un chercheur, cependant, a voulu analyser rTMS induite profils d'expression des gènes dans le tissu cortical préfrontal dorsolatéral, l'approche pragmatique actuelle peut suffire, car la distance et l'angle entre le tissu cible et la bobine peuvent varier légèrement au cours du mouvement de la bobine de la M1 à la zone de DLPFC. Troisièmement, bien que rTMS nous avons appliqué avec succès sur l'hémisphère unilatérale du cerveau de rat, encore la stimulation est pas aussi focale que rTMS dans la recherche humaine. La forte fi électrique induitdomaine d'environ 0,5 cm 2 à moins de 10 cm 2 de la surface du cerveau du rat semble relativement plus diffuse que dans la surface de l' hémisphère humain de ~ 2500 cm 2 27. Nous pensons toutefois que le modèle présenté ici peut être utilisé pour l' élucidation les mécanismes moléculaires de la rTMS en permettant une analyse de la différence inter-hémisphérique dans son effet.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Homeothermic blanket with a rectal probe | Harvard apparatus | 507222F | |
| Isoflurane (Forane sol.) | Choongwae | ||
| Propofol (Provive Inj. 1% 20 ml) | Claris Lifesciences | ||
| Repetitive magnetic stimulator (Magstim Rapid2) | Magstim Company Ltd | ||
| 25 mm figure-of-8 coil | Magstim Company Ltd | 1165-00 | |
| PET-CT | GE Healthcare | ||
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | (US Patent No. 5,346,994) | |
| RNeasy Lipid Tissue Mini Kit | Qiagen | 74804 | |
| RNeasy Mini Spin Columns | Qiagen | (Mat No. 1011708) | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Ambion Illumina RNA amplification kit | Ambion | ||
| Nanodrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| Illumina RatRef-12 Expression BeadChip | Illumina, Inc. | ||
| Amersham fluorolink streptavidin-Cy3 | GE Healthcare Bio-Sciences |
References
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