Introduction
Mesenchymal stromacellers (MSC'er) er af relevante kliniske værdi for deres multi-slægt differentiering kapacitet og deres evne til at understøtte hæmopoiese, at udskille vækstfaktorer / cytokiner samt at spille en rolle i immunregulering 1. I definitionen af MSC-baserede terapier celle produktion og anvendelse har været genstand for omfattende klinisk og præklinisk forskning 2, med særlig vægt på specifikke internationale regler for sikkerhed og effekt af cellebaserede lægemiddel (CBMP) behandlinger 3. Humane MSC'er er udførligt dyrkes i medier indeholdende supplementer og reagenser af animalsk oprindelse, såsom føtalt bovint serum (FBS) og bovin trypsin. Derfor sammen med smittefare forbundet med celle manipulation, patienterne også står prion eksponering samt immunologiske risici forbundet med proteiner, peptider eller andre biomolekyler af animalsk oprindelse, der kunne fortsætte efter celle høst og Transplanførelsen 4.
For at omgå problemet, vi dyrkede humane knoglemarv (HBM)-afledte MSC'er i dyr-frit medium, der erstatter FBS med poolet humant AB typen serum (PhABS). Under disse betingelser, parallelt med voksende MSC'er vi identificeret et hidtil ukendt cellepopulation. Disse celler var morfologisk og fænotypisk forskellige fra MSC'er og viste en markant genekspressionsprofil samt karakteristiske voksende / adhæsionsegenskaber. De bevaret både mesengenic og angiogene potentiale og derfor blev opkaldt mesodermal progenitorceller (MPCS) 5. Efterfølgende var vi i stand til at definere selektive og reproducerbare dyrkningsbetingelser at generere Middelhavspartnerlandene ved høj grad af renhed 6.
Vi undersøgt yderligere morfologiske og biologiske egenskaber Middelhavspartnerlandene. Middelhavspartnerlandene viste sig at være nestin-positive, langsom i cykling, Ki-67-negative, og med kromosomer karakteriseret ved lange telomerer 5. De udtrykte PLURipotency-associeret transskription faktorer Oct-4 og Nanog snarere end MSC master-regulatorer Runx2 og Sox9 7. Fænotypisk, Middelhavspartnerlandene udtrykte endoglin (CD105) på lavere niveau end MSC mens mangler mesenkymale markører CD73, CD90, CD166. Middelhavspartnerlandene viste også en karakteristisk mønster af adhæsionsmolekyler karakteriseret ved konsekvent ekspression af PECAM (CD31), integriner aL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11) samt integrin β2 (CD18), som specifikt opretholder podosome-lignende strukturer 8 . I standard MSC ekspansion medier, Middelhavspartnerlandene omgående differentieret i MSC gennem en mellemliggende etape byder aktiveringen af Wnt5 / calmodulin celle signalering 9. Middelhavspartnerlandene beholdt også angiogene egenskaber, som demonstreret ved deres evne til at spire fra sfæroider i murine ekstracellulære matrix (ECM) protein 3D kulturer. Den angiogene potentiale blev hurtigt tabt efter MPC differentiering langs mesengenic afstamning.
Her præsenterer vi proprotokoller optimeret til at isolere og karakterisere højt oprensede Middelhavspartnerlandene fra HBM blodprøver. Reproducerbare protokoller for MPC mesengenic og angiogen differentiering er også beskrevet.
Protocol
BEMÆRK: Efter skriftlig tilladelse blev HBM prøver opnået under ortopædisk kirurgi for hofte udskiftning. Umiddelbart efter lårbenshalsen osteotomi og før femoral rivning en 20 ml sprøjte indeholdende 500 UI af heparin, blev anvendt til at opsuge frisk BM. Protokollen skal betragtes bredt anvendelig til enhver BM kilde.
1. Isolering af human knoglemarv mononukleære celler (HBM-multinationale selskaber)
- Fortynd 5 - 10 ml frisk BM til 50 ml under anvendelse Dulbeccos phosphatbufret saltopløsning (D-PBS) og blandes ved inversion. Ligeledes distribuere 25 ml i to nye 50 ml koniske rør, tilsættes 25 ml D-PBS til hvert rør og blandes ved inversion.
- Tillad rørene stå i 10 minutter ved stuetemperatur, til separation af mineralske knoglefragmenter og fedt fra opløsning.
- Fjern forsigtigt flydende fedt med en steril Pasteur-pipette og filter cellesuspensionen gennem 70 um filtre uden at forstyrre den mineralske knoglefragment pellet. <li> Sæt fire 50 ml rør med 15 ml medium til diskontinuerlig densitetsgradientcentrifugering (1,077 g / ml). Sørg for, at dette medie er ved stuetemperatur.
- Læg forsigtigt 20 - 25 ml fortyndet BM på toppen af densitetsgradient-medium. Udfør denne operation omhyggeligt, lade cellesuspension sive på røret vægge til at forhindre blanding lag.
- Udfør densitetsgradientcentrifugering ved 400 xg i 30 minutter ved stuetemperatur med bremse deaktiveret.
- Opsaml hvidligt ring af celler placeret mellem de to faser under anvendelse af en steril Pasteur-pipette og overføre det til et frisk 50 ml rør.
- Vask cellerne med frisk dyrkningsmedium: phenolrødfri, lav glucose (1.000 mg / l) Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) samlet humant AB-type serum (PhABS), 2 mM L-glutamin og antibiotika (DMEM / 10% PhABS). Centrifuger ved 400 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og re-suspendere pellet i 5 - 10 ml frisk DMEM / 10% PhABS.
- Fortsæt til celletælling.Bestem antallet af hvide blodlegemer ved 1: 1 fortynding i trypan. Anvende dette til hæmocytometeret, og observation i et fasekontrastmikroskop. Udelukke små og perfekt afrundede erythrocytter og blåfarvede døde celler fra celletal.
BEMÆRK: Det anbefales stærkt at skærmen PhABS partier for deres præstationer i MPC opsving. PhABS fra USA kilder har givet de bedste resultater, mens de fleste sera af forskellig oprindelse resulterede i MPC kulturer med højere procentdele af MSC-lignende celler.
2. Isolering af Middelhavspartnerlandene fra HBM-multinationale selskaber
- Set hydrofobe T-75-kolber med 15 ml frisk DMEM / 10% PhABS og lad pH og temperatur ækvilibrere ved præ-inkubering ved 37 ° C i 5% CO2 i 30 min.
- Seed 4 - 6 x 10 7 HBM-MNC pr kolbe og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i 48 timer.
- Aspirer og kassér medium og ikke-adhærente celler fra kolber. Tilsættes 15 ml frisk DMEM / 10% PhABS og inkuberes ved 37 ° Ci 5% CO2. Vedligehold kulturer i 6 - 8 dage, skiftende medium hver 48 timer.
EKSTRA: At øge MPC udbytte, ikke-klæbende celler fra 2,3 kunne være re-belagte i en ny kultur kolbe og vedligeholdes som beskrevet for de primære kulturer. - Aspirer og kassér medium fra kolber, vask med frisk DMEM og tilsæt 2 ml af animalsk fri protease afmonterer løsning. Der inkuberes ved 37 ° C 5 - 15 min (undgå langvarig inkubation).
- Der tilsættes 10 ml frisk DMEM / 10% PhABS, aspireres cellesuspensionen og centrifugeres ved 400 xg i 5 min
- Aspirer og kassér supernatanten og re-suspendere pellet i 1 - 2 ml frisk DMEM / 10% PhABS. Fortsæt til celletal som beskrevet i trin 1.10.
BEMÆRK: Brug ikke trypsin / EDTA som afmonterer reagens. Middelhavspartnerlandene er trypsin resistente. Morfologisk screening af kulturerne, før cellehøst, anbefales for at vurdere tilstedeværelsen af tenformede MSC-lignende celler. I tilfælde betydelig mængde MSC-lignende celler detected, øge renheden af cellen produkt ved selektiv fjernelse af de forurenede celler. For at gøre dette, kan trypsin fordøjelse udføres før MPC høst, ved tilsætning af 2 ml trypsin / EDTA 0,05% i 2 min. Vask kulturer to gange med 5 ml DMEM / 10% PhABS, derefter gå videre til protease behandling som ovenfor.
3. Cell Karakterisering
- flowcytometri
- Oprettet dobbeltprøver af 10 5 frisk løsnede celler i vaskeopløsning: D-PBS suppleret med 0,5% (vol / vol) bovint serumalbumin (BSA) og 0,02% (vægt / volumen) natriumazid. Centrifuger ved 400 xg i 5 min.
ADVARSEL: Natriumazid er toksisk. - Re-suspendere pellets i 200 pi vaskeopløsning og tilføje anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 og anti-CD31 antistoffer konjugeret med fluorescerende farvestoffer ( "test"); parallelt oprettet isotypekontroller ( "Ctrl").
BEMÆRK: Mængden af farvning antistoffer bør bestemmes ved titrering eller according til producentens anvisninger. - Inkuber prøverne ved 4 ° C i 30 minutter.
- Centrifuger ved 400 xg i 5 min. Re-suspendere celler i 500 pi vaskeopløsning og erhverve mindst 5 x 10 4 arrangementer på flerfarvet flowcytometer 7 9 10.
- Analyser resultater efter dot-plots og bruge "Ctrl" optagede hændelser til at indstille kvadranter.
BEMÆRK: For at definere kultur som MPC kultur procentdelen af CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + celler skal være over 95%. Til nogle specifikke anvendelser, dvs. genanalyse, genopretning afskæring skal øges til 97 - med 98%.
- Oprettet dobbeltprøver af 10 5 frisk løsnede celler i vaskeopløsning: D-PBS suppleret med 0,5% (vol / vol) bovint serumalbumin (BSA) og 0,02% (vægt / volumen) natriumazid. Centrifuger ved 400 xg i 5 min.
- Nestin afsløring og F-actin organisation analyse
- Plate frisk isolerede Middelhavspartnerlandene om kultur chamber slides (20.000 / cm2). Tillad celler til at klæbe ved inkubation natten over ved 37 ° C i 5% CO2.
- Vask cellerne i vaskeopløsning og fix i 4% (vægt / volumen) paraformaldehyd ved stuetemperatur i 15 min. For at fjerne fiksativ tilføje vaske løsning, inkuberes i 2 min og hæld.
- Gentag vask to gange.
- Permeabilisere celler i D-PBS suppleret med 0,05% (volumen / volumen) Triton X-100 i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Stop reaktionen ved proteinfrit signal enhancer (30 minutter ved stuetemperatur) eller standard blokerende opløsning (D-PBS tilsat 3% (vægt / volumen) BSA).
- Fjern signal enhancer / blokeringsopløsning.
- Tilsættes 7 ug / ml (vægt / volumen) af anti-humant nestin primært antistof og inkuberes ved 4 ° C natten over i et fugtigt kammer. Sideløbende bruge isotypekontrollen antistoffer til at evaluere ikke specifikke fluorescens-signaler.
- Vask slides ved at tilføje D-PBS, orlov i 2 min og hæld. Gentag to gange.
- Tilsæt 2 ug / ml (vægt / volumen) af fluorescerende farvestof konjugeret sekundært antistof og inkuberes ved 4 ° C i 1 time i mørke.
- Vask glider som ovenfor.
- Tilføj fluorescerende Phalloidin (5 IE / ml), orlov ved stuetemperatur i 30 mi i mørke og vaskes 3 gange i D-PBS.
- Fjern kammervæggene og montere objektglassene i vandigt montering medium suppleret med antifade reagens og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) for kerner detektion. Fortsæt til billeddannelse 7 9 10.
4. Mesengenic Differentiering af Middelhavspartnerlandene
- Plade 2 x 10 4 / cm2 frisk isolerede Middelhavspartnerlandene i TC-behandlede T75 dyrkningskolber og lad adhærerer natten over i DMEM / 10% PhABS ved 37 ° C i 5% CO2.
- Erstat DMEM / 10% PhABS med standard reduceret serummedium, ca. 200 pl / cm2, designet til mesenchymale stromale celle ekspansion (MSC-RS-medium). Grow celler til konfluens (P1-MSC'er), typisk fra 7 til 10 dage fra induktion. Refresh medium hver 2 dage.
- Aspirer og kassér medium fra kolber, vask med frisk MSC-RS medium og tilsæt 2 ml af animalsk fri protease afmonterer løsning. Der inkuberes ved 3776; C 5 - 15 min (undgå langvarig inkubation).
- Der tilsættes 10 ml frisk MSC-RS medium, aspireres cellesuspensionen og centrifugeres ved 400 xg i 5 min
- Aspirer supernatanten og re-suspendere pellet i 1 - 2 ud ml frisk MSC-RS medium. Fortsæt til celletal som beskrevet i trin 1.10
- Fortsæt til subkultur dem ved såning 3 - 5 x 10 3 celler / cm2. Grow celler til konfluens (P2-MSC'er).
- Harvest celler ved protease fordøjelse som beskrevet fra trin 4.3 til trin 4,5 og fortsæt til karakterisering som beskrevet i afsnit 3.
BEMÆRK: En procentdel af CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg celler lavere end 95% ville indikere kun delvis differentiering og kræve en yderligere kultur passage. - Plate P2-MSC'er på 2 x 10 4 / cm 2 i seks godt TC-behandlede plader og vokse til konfluens i MSC-RS medium.
- Mark to brønde som "Ingen Diff" og opdatere MSC-RS medium.
- Mark to godts som "Osteo" og erstatte medie med 200 pi / cm2 af standard osteogent medium, specielt designet til MSC differentiering.
- Mark to brønde som "Adipo" og erstatte medium med 200 pi / cm2 af standard adipogenisk medium, specielt designet til MSC differentiering.
- Opretholde kulturer ved 37 ° C i 5% CO2 ved at ændre hele medier hver 48 timer.
BEMÆRK: Det anbefales stærkt at bruge standard kommercielt tilgængelige differentierende medier for prøvernes reproducerbarhed. Efter 2/3 uger under differentiere betingelser, kalkaflejringer vises i osteogene inducerede kulturer, mens intracellulære lipid dråber akkumulation er tydelig i adipogeniske inducerede celler. - Aspirer og kassér dyrkningsmedier vask derefter med D-PBS.
- Fix kulturerne ved tilsætning af 1 ml 4% (vægt / volumen) paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur.
- For at fjerne fiksativ tilføje D-PBS, inkuberes i 2 min og hæld. Gentag vaskto gange.
- Farv en "Ingen Diff" sammen med de to "Osteo" markerede brønde i hydroxyapatit specifikke fluorescerende løsning og en "Ingen Diff" sammen med de to "Adipo" markerede brønde i 200 nM Nile Rød opløsning. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur 11,12.
- Fjern farvning løsninger og vask i D-PBS to gange.
- Fjern D-PBS, tilsættes D-PBS suppleret med 50% (v / v) glycerin og fortsæt til billeddannelse 7 9 10.
5. MPC Sfæroide Sprouting Assay
- For at producere 3D sfæroider, lå 20 pi dråber frisk isoleret MPC suspension (1,5 x 10 4 celler / dråbe) på den indre overflade af en petriskål låg.
BEMÆRK: Som håndtering dråber kan føre til deres brud, er det meget anbefalelsesværdigt at lægge dem i overskud. - Brug forsigtigt låget at opsummere en petriskål indeholdende D-PBS for at forhindre hængende dråber fordampning. Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2natten over for at tillade celler til at samle i 3D sfæroider.
- Indstil en tyk gel af murine ekstracellulære matrix (ECM) proteiner ved tilsætning 300 pi alikvoter af standard ECM-proteiner i en præ-kølede 24-brønds dyrkningsplade og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
- tip forsigtigt over petriskålen låget og forsigtigt afhente sfæroiderne anvendelse af en steril Pasteur-pipette.
- Lægge sfæroider på ECM proteingel, tilsættes 700 pi alikvoter af standard VEGF-rige endotelcellevækst-medium og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2.
- Efter 24 timer og ved 7 dages kultur, tage billeder af 3D-kulturer på 4X forstørrelse magt. Evaluere spiring fra sfæroider anvender billedanalysesoftware ved at måle radiale afstand mellem sidste invaderende celle og sfæroiden kant. Gentag foranstaltninger langs mindst 20 forskellige retninger. Gennemsnitlig distance anses som positivt, når 50 um eller derover.
Representative Results
De selektive dyrkningsbetingelser beskrevet her har tilladt isoleringen af et hidtil ukendt vedhængende og næsten monomorf cellepopulation som 1,0% af HBM-MNC'er (0,5 - 2,0 x 10 6 HBM-MNC'er fra 5 - 10 ml frisk BM prøver) 5,6 . Vi identificerede disse store (i 40 - 60 um i diameter), afrundet, hvilende, Ki-67-negative celler som Middelhavspartnerlandene 5. Morfologisk er de karakteriseret ved en karakteristisk stegt æg-form med en tyk kerneområde omgivet af en flad tynd periferi viser masser af filopodia ved højere forstørrelse (hvide pile i figur 1 A.1). Polar forlængelse af den ydre cellegrænsen observeres ofte (sorte pile i figur 1 A.1). En sådan morfologi er klart forskellig fra den typiske spindel-formet mesenkymale stromale celle udseende rapporteret i standard MSC kulturer. Flowcytometri viste over 95% af frisk isolerede Middelhavspartnerlandene til at udtrykke CD31 og CD45, mens mesenchymal tilknyttede CD90 og CD73 13 var målbart (Figur 1 A.2). Vi betragter dette begrænsede sæt af fire antigener som vejledende for Middelhavspartnerlandene. Yderligere karakteristiske træk ved Middelhavspartnerlandene er punkteret F-actin fordeling afslører en række podosome-lignende strukturer (rød i figur 1 A.3) og intens ekspression af nestin (green i figur 1 A.3), som ikke detekteres i cellerne farvet med isotypekontrol-antistof (data ikke vist).
Dyrkning af Middelhavspartnerlandene i standard RS medium designet til MSC ekspansion resulterer i hurtig differentiering i eksponentielt voksende MSC-lignende celler (figur 1 B.1). Efter to passager endelig celler skifte deres fænotype fra CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + til CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg (Figur 1 B.2). I processen Middelhavspartnerlandene re-organize F-actin i stress fibre mens nestin udtryk bliver begrænset til få sjældne celler (figur 1 B.3). MPC mesengenic differentiering til en bestemt MSC-lignende fænotype foregår gennem to adskilte trin afsløret af forskellige celle morfologier. Efter en uge i MSC RS medium en resterende population af MPC-lignende celler er stadig påviselig i et konfluent lag af flade, polygonale flerforgrenede celler (P1-MSC'er i figur 2 A). En yderligere passage er nødvendig for at opnå en næsten monomorf kultur af spindel-formet MSC-lignende celler (P2-MSC i figur 2 A). Disse eksponentielt voksende celler kan let differentiere til osteoblaster eller adipocytter når overført til selektive medier i mindst 2 uger, hvilket således bekræfter deres MSC karakter. I osteogene inducerede kulturer, kan kalkaflejringer påvises ved enten kolorimetrisk Alizarin-S plet eller specifikke fluorescerende farvestoffer (grøn i figur 2 B). Efter adipogeniske induktion cellerviser ophobning lipid dråbe som afsløret ved enten kolorimetrisk Oil Red eller fluorescerende Nile rød plet (rød i figur 2 B).
MPC typebestemmelse blev bekræftet ved spiring angiogenese assay. Middelhavspartnerlandene viste deres evne til at invadere (over 50 um) murint ECM proteingel fra 3D sfæroider efter 24 timers VEGF-stimulus (figur 2 C). Efter en uge invaderende celler blev detekteret ved 300 - 600 um afstand. Omvendt blev invasion kapacitet tabt i P2-MSC'er efter mesengenic differentiering (Figur 2 D).
Figur 1. frisk isolerede Middelhavspartnerlandene har særlige kendetegn. Dyrkning HBM-multinationale selskaber i DMEM / 10% PhABS i syv dage giver anledning til en population af hvilende Middelhavspartnerlandene (A) let skelnes fra MSC'er (B) klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Middelhavspartnerlandene differentiere til Standard MSC og Show Sprouting Angiogenese in vitro. Udskiftning af DMEM / PhABS med kommercielt tilgængelige RS medium designet til MSC udvidelse udløser mesengenic induktion af Middelhavspartnerlandene. Efter en uge i kultur få resterende Middelhavspartnerlandene er stadig påviselige (P1-MSC), mens en yderligere passage i MSC-RS medium fører til en population af sammenflydende MSC-lignende celler (P2-MSC, en skala barer = 100 um). P2-MSC'er terminalt differentiere til osteocytter eller adipocytter under ordentlige stimuli som afsløret ved calcium deposition (grøn i B) og akkumulering lipid dråbe (rød i B, skala barer = 200 um), hhv. Middelhavspartnerlandene viser konsekvent spiring fra sfæroider i murine ECM protein gel (C) ved en forskel med P2-MSC'er (D, skala barer = 1,0 mm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Acknowledgments
Forfatterne vil især gerne takke Dr. Paolo Parchi, Kirurgisk Afdeling, Medicinsk og Molekylær Patologi og Critical Care Medicine, University of Pisa, for at give knoglemarv prøver og hans ekspertise i humane osteo-stamfædre
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Bioscience (San Jose, CA-USA) | 354230 | Murine ECM proteins Stock Concentration: 100% (9 - 12 mg/ml) Final Concentration: 100% |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | Sigma (St. Louis, MO, USA) | D8537 | |
| 70 μm Filters | Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-823 | |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare (Uppsala, Sweden) | 17-5442-03 | medium for discontinuos density gradient centrifugation |
| Pooled human AB type serum (PhABS) | LONZA (Walkersville MD-USA) | 14-490E | Final Concentration: 10% |
| Glutamax-I | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 35050-038 | Stabilized L-Glutamine Stock Concentration: 100x Final Concentration: 2 mM |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | Stock Concentration: 7.5% Final Concentration: 0.5% |
| Sodium Azide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | S8032 | Final Concentration: 0.02% |
| Penicillin/Streptomycin (Pen Strep) | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | Antibiotics Stock Concentration: 5,000 UI/ml penicillin, 5,000 μg/ml Streptomycin Final Concentration: 50 UI/ml penicillin, 50 μg/ml Streptomycin |
| T-75 culture flask for suspension cultures | Greiner Bio-one (Frickenhausen, Germany) | 658 190 | |
| T-75 culture flask TC treated | Greiner Bio-one (Frickenhausen, Germany) | 658170 | |
| TrypLE Select | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 12563-011 | Animal-free proteases detaching solution Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| Trypsin/EDTA | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 15400-054 | Phenol red free Stock Concentration: 0.5% Final Concentration: 0.25% |
| anti-CD90 APC antibody (CD90) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-402 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD45 APC-Vio770 antibody (CD45) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-096-609 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD73 PE antibody (CD73) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-182 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD31 PE Vio-770 antibody (CD31) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-105-260 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 APC antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-846 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG2a APC Vio770 antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-096-637 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 PE antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-845 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 PE Vio-770 antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-563 | Final Concentration: 1:40 |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 13-1331-82 | Phenol red-free minimal essential medium Stock Concentration: 1,000 mg/L glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 10500 | Stock Concentration:0.2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml |
| Prolong Gold antifade reagent with 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | P-36931 | Aqueous mounting medium + DAPI Final Concentration: 1x |
| Paraformaldehyde | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P6148 | Fixative Final Concentration: 4% |
| LAB-TEK two-well chamber slides | Sigma (St. Louis, MO, USA) | C6682 | |
| Anti-Nestin antibody [clone 10C2] | Abcam (Cambridge, UK) | ab2035 | Stock Concentration: 1 mg/ml Final Concentration: 7 μg/ml |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | A34055 | Stock Concentration: 200 UI/ml Final Concentration: 5 UI/ml |
| Triton X-100 | Euroclone (Milan, Italy) | EMR237500 | Final Concentration: 0.05% |
| MesenPRO RS Medium (MSC-RS medium) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 12746-012 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse SFX kit | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | A31619 | Goat anti-mouse secondary antibody + Signal enhancer Stock Concentration: 2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml |
| Pasteur Pipette | Kartell Labware (Noviglio (MI), ITALY ) | 329 | |
| StemMACS AdipoDiff Media | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-091-679 | |
| StemMACS OsteoDiff Media | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-091-678 | |
| Osteoimage Bone mineralization Assay | LONZA (Walkersville MD-USA) | PA-1503 | Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution |
| 50 ml Polystyrene conical tube | Greiner bio-one (Kremsmünster Austria) |
227261 | |
| Nile Red | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | N1142 | Fluorescent staining solution for lipids Stock Concentration: 100 mM Final Concentration: 200 Nm |
| Glycerin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | G2289 | Final Concentration: 50% |
| Polistirene Petri dishes | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P5606 | |
| 24-well plates TC-treated | Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germany) | 662160 | |
| Endothelial Growth Medium, EGM-2 BulletKit (EGM-2) | LONZA (Walkersville MD-USA) | CC-3162 | VEGF-rich endothelial cell growth medium |
| Leica Qwin Image Analisys Software | Leica (Wetzlar, Germany) | Image analysis software |
References
- Stoltz, J. F., et al. Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century. Stem Cells Int. 2015, 734731 (2015).
- Pacini, S. Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs). Front Cell Dev Biol. 2, 50 (2014).
- Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union. Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).
- Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29 (2011).
- Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
- Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
- Pacini, S., et al. Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs). PLoS One. 5 (3), 9861 (2010).
- Pacini, S., et al. Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).
- Fazzi, R., et al. Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway. PLoS One. 6 (9), 25600 (2011).
- Tormin, A., et al. CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization. Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes. Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns. Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
- Phinney, D. G. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy. Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
- Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells. Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).
- Bieback, K., et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).
- Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51 (2014).
- Pacini, S., Petrini, I. Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells. Front Cell Dev Biol. 2, 20 (2014).
