Introduction
Mesenchymale stromacellen (MSC's) zijn van relevante klinische waarde voor de multi-lijn differentiatie vermogen en hun vermogen om hemopoiesis ondersteunen, groeifactoren / cytokinen uitscheiden en een rol spelen bij immuunregulatie 1. In de definitie van MSC-gebaseerde therapieën cel productie en toepassing zijn het voorwerp van uitgebreide klinische en pre-klinisch onderzoek 2 geweest, met bijzondere aandacht voor specifieke internationale regelgeving voor de veiligheid en de werkzaamheid van cellen gebaseerde geneesmiddelen (CBMP) behandelingen 3. Menselijke MSCs zijn uitvoerig gekweekt in media die supplementen en reagentia van dierlijke oorsprong, zoals foetaal runderserum (FBS) en runder trypsine. Daarom opzij met besmettelijke risico's celmanipulatie patiënten ook te prion blootstelling en immunologische risico's van eiwitten, peptiden of andere biomoleculen van dierlijke oorsprong die kunnen blijven bestaan na verzamelen van cellen en Transplantatie 4.
Om het probleem te omzeilen, gekweekt we humaan beenmerg (HBM) afgeleide MSC's in dier-vrij medium, ter vervanging van FBS met gepoolde humaan type AB serum (PhABS). Onder deze omstandigheden Daarnaast groeit MSCs identificeerden we een nieuwe celpopulatie. Deze cellen waren morfologisch en fenotypische verschillen van MSC's en toonde een opvallende genexpressieprofiel evenals kenmerkende teelt / hechting. Ze behield zowel mesengenic en angiogene potentieel en daarom werden genoemd mesodermale Progenitor Cells (MTR) 5. Vervolgens waren we in staat om selectieve en reproduceerbare kweekomstandigheden definiëren mediterrane partnerlanden bij hoge graad van zuiverheid 6 te genereren.
We verder onderzocht de morfologische en biologische eigenschappen van de mediterrane partnerlanden. De mediterrane partnerlanden toonde nestin-positief, langzaam in de wielersport te zijn, Ki-67-negatief, en met chromosomen gekenmerkt door lange telomeren 5. Zij spraken pluripotency-geassocieerde transcriptiefactoren Oct-4 en Nanog plaats van MSC meester toezichthouders Runx2 en SOX9 7. Fenotypisch, mediterrane partnerlanden uitgedrukt endoglin (CD105) op een lager niveau dan MSC's, terwijl ontbreekt mesenchymale markers CD73, CD90, CD166. MPL toonde ook een kenmerkend patroon van adhesiemoleculen gekenmerkt door consistente expressie van PECAM (CD31), integrines aL (CD 11), αM (CD11b), ax (CD 11 c) en integrine β2 (CD18) die specifiek ondersteunt de voetjes structuren 8 . In standaard MSC expansie media, MTR prompt gedifferentieerd in MSC's via een tussenstap met de activering van Wnt5 / Calmodulin cell signaling 9. Mediterrane partnerlanden ook behouden angiogene eigenschappen, zoals aangetoond door hun vermogen om te ontkiemen van sferoïden in muizen extracellulaire matrix (ECM) eiwitten 3D culturen. De angiogene potentiële werd snel verloren na MPC differentiatie langs de mesengenic lineage.
Hier presenteren we proprotocollen geoptimaliseerd om te isoleren en zeer gezuiverd mediterrane partnerlanden van HBM bloedmonsters te karakteriseren. Reproduceerbare protocollen voor MPC mesengenic en angiogene differentiatie beschreven.
Protocol
NB: Na schriftelijke toestemming, werden HBM monsters verkregen tijdens orthopedische chirurgie voor heupprothese. Direct na femorale hals osteotomie en voor femorale ruimen een 20 ml spuit met 500 UI heparine, werd gebruikt om vers BM zuigen. Het protocol is breed toepasbaar op elke BM bron worden beschouwd.
1. Isolatie van Human Bone Marrow mononucleaire cellen (HBM-multinationals)
- Verdun 5-10 ml vers BM 50 ml, toepassing Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) en meng door omkeren. Verdeel eveneens 25 ml in twee nieuwe 50 ml conische buizen, voeg 25 ml D-PBS aan elke buis en meng door omkeren.
- Laat de buizen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur staan, voor het scheiden van minerale botfragmenten en vet uit oplossing.
- Verwijder voorzichtig drijvende vet met een steriele Pasteur pipet en filter celsuspensie door middel van 70 micrometer filters zonder verstoring van de mineraal bot fragment pellet. <li> Stel vier 50 ml buizen met 15 ml medium voor discontinue dichtheidsgradiënt centrifugatie (1,077 g / ml). Zorg ervoor dat dit medium bij kamertemperatuur.
- Leg zacht 20-25 ml verdund BM op de top van dichtheidsgradiënt medium. Voer deze operatie zorgvuldig, zodat celsuspensie trickle op de buis muren om het mengen van lagen te voorkomen.
- Voeren dichtheidsgradiënt centrifugatie bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur met rem uitgeschakeld.
- Verzamel de witachtige ring van cellen die zich tussen de twee fasen met een steriel pasteurpipet en overgebracht naar een verse 50 ml buis.
- Was de cellen met vers kweekmedium: fenolrood-vrij, laag glucose (1000 mg / l) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) samengevoegd humaan type AB serum (PhABS), 2 mM L-glutamine en antibiotica (DMEM / 10% PhABS). Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig supernatant en resuspendeer pellet in 5-10 ml vers DMEM / 10% PhABS.
- Ga verder met celgetal.Bepaal het aantal witte bloedcellen door 1: 1 verdunning in trypan. Breng dit aan de hemocytometer en observeren onder een fasecontrastmicroscoop. Uitsluiten klein en perfect afgeronde erytrocyten en blauw-gekleurde dode cellen van het aantal cellen.
LET OP: Het wordt sterk aanbevolen om het scherm PhABS partijen voor hun prestaties in MPC herstel. PhABS uit de VS bronnen hebben het beste resultaat gegeven, terwijl de meeste sera van verschillende afkomst resulteerde in MPC kweken met hogere percentages van MSC-achtige cellen.
2. Isolatie van mediterrane partnerlanden van HBM-multinationals
- Set hydrofobe T-75 kolven met 15 ml vers DMEM / 10% PhABS en laat pH en temperatuur evenwicht door pre-incubatie bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 30 minuten.
- Seed 4-6 x 10 7 HBM-MDL per kolf en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 48 uur.
- Zuig en gooi middelgrote en niet-hechtende cellen uit flessen. Voeg 15 ml vers DMEM / 10% PhABS en incubeer bij 37 ° Cin 5% CO2. Handhaaf culturen 6-8 dagen, veranderen medium elke 48 uur.
Optioneel: MPC opbrengst te verhogen, niet-hechtende cellen van 2,3 opnieuw kunnen worden uitgeplaat in een nieuwe kolf en gehandhaafd zoals beschreven voor de primaire kweken. - Zuig en gooi medium uit flessen, wassen met verse DMEM en voeg 2 ml van dierlijke vrije protease losmaken oplossing. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 - 15 min (vermijd verlengde incubatie).
- Voeg 10 ml vers DMEM / 10% PhABS, zuigen de celsuspensie en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten
- Zuig en gooi supernatant en resuspendeer pellet in 1-2 ml vers DMEM / 10% PhABS. Ga verder met celgetal zoals beschreven in stap 1.10.
LET OP: Gebruik geen trypsine / EDTA als los reagens. MTR zijn trypsine resistent. Morfologische screening van de culturen vóór verzamelen van cellen, wordt sterk aanbevolen om de aanwezigheid van spoelvormige MSC-achtige cellen te evalueren. Bij aanzienlijke hoeveelheid MSC-achtige cellen detected, verhoging van de zuiverheid van het celproduct door het selectief verwijderen van de besmette cellen. Hiervoor trypsine digestie kan worden uitgevoerd voordat MPC oogsten uitgevoerd door toevoeging van 2 ml trypsine / EDTA 0,05% gedurende 2 minuten. Was de cultures tweemaal met 5 ml DMEM / 10% PhABS, ga dan verder met de behandeling zoals hierboven protease.
3. Cell karakterisering
- flowcytometrie
- Opgericht duplo monsters van 10 5 vers losgemaakte cellen in wasoplossing: D-PBS aangevuld met 0,5% (v / v) runderserumalbumine (BSA) en 0,02% (w / v) natriumazide. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten.
LET OP: Natriumazide is giftig. - Resuspendeer pellets in 200 pl wasoplossing en voeg anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 en anti-CD31-antilichamen geconjugeerd met fluorescente kleurstoffen ( "test"); parallel opgezet isotype controles ( "CTRL").
LET OP: Bedragen van kleuring antilichamen moet worden bepaald door titratie of According instructies van de fabrikant. - Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten. Re-schorten cellen in 500 pi wasoplossing en het verwerven van ten minste 5 x 10 4 evenementen op multicolor flowcytometer 7 9 10.
- Analyseer resultaten op dot-plots en gebruik "CTRL" opgenomen gebeurtenissen te kwadranten te stellen.
Opmerking: Om de cultuur als MPC cultuur definieert het percentage van CD73 neg neg CD90 CD45 + CD31 + cellen moet meer dan 95%. Voor sommige specifieke toepassingen, dat wil zeggen analyse van genexpressie, het herstel cut-off moet worden verhoogd tot 97-98%.
- Opgericht duplo monsters van 10 5 vers losgemaakte cellen in wasoplossing: D-PBS aangevuld met 0,5% (v / v) runderserumalbumine (BSA) en 0,02% (w / v) natriumazide. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten.
- Nestin detectie en F-actine organisatie analyse
- Plaat vers geïsoleerde MTR over cultuur kamer dia's (20.000 / cm2). Sta cellen hechten door overnacht incubatie bij 37 ° C in 5% CO2.
- Was de cellen in wasoplossing en fix in 4% (w / v) paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Voor het verwijderen van fixerende toevoegen wasoplossing, incubeer gedurende 2 minuten en giet.
- Herhaal het wassen tweemaal.
- Doorlaatbaar cellen in D-PBS aangevuld met 0,05% (v / v) Triton X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Stop reactie door eiwitvrije signaal versterker (30 min bij kamertemperatuur) of standaard blokkerende oplossing (D-PBS gesupplementeerd met 3% (w / v) BSA).
- Verwijder signaal versterker / blokkeren oplossing.
- Voeg 7 ug / ml (w / v) anti-humaan nestine primair antilichaam en incuberen bij 4 ° C geïncubeerd in een bevochtigde kamer. Daarnaast gebruiken isotype controle antilichamen niet specifiek fluorescentiesignalen evalueren.
- Was de dia's door het toevoegen van D-PBS, laat gedurende 2 minuten en giet. Herhaal dit twee keer.
- Voeg 2 ug / ml (w / v) van fluorescente kleurstof geconjugeerd secundair antilichaam en incuberen bij 4 ° C gedurende 1 uur in het donker.
- Was de dia's zoals hierboven.
- Voeg fluorescerende Phalloidin (5 UI / ml), vertrekken bij KT 30 min in het donker en was 3 maal in D-PBS.
- Verwijder de kamerwanden en dia monteren montage waterig medium aangevuld met antifade reagens en 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) voor detectie kernen. Ga verder met het afbeelden van 7 9 10.
4. Mesengenic Differentiatie van MTR
- Plaat 2 x 10 4 / cm 2 vers geïsoleerde MPL in TC behandelde T75 kweekflessen en laat cellen zich overnacht in DMEM / 10% PhABS bij 37 ° C in 5% CO2.
- Vervang DMEM / 10% PhABS met standaard gereduceerd serum medium, ongeveer 200 pl / cm2, ontworpen voor mesenchymale stromale cellen expansie (MSC-RS gemiddeld). Cellen groeien tot confluentie (P1-MSC's), kenmerkend van 7 tot 10 dagen na de inductie. Vernieuwen medium om de 2 dagen.
- Zuig en gooi medium uit flessen, wassen met verse MSC-RS medium en voeg 2 ml van dierlijke vrije protease losmaken oplossing. Incubeer bij 3776; C gedurende 5 - 15 min (vermijd langdurige incubatie).
- Voeg 10 ml van verse MSC-RS medium, zuigen de celsuspensie en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten
- Zuig supernatant en resuspendeer pellet in 1-2 ml vers MSC-RS medium. Ga verder met celgetal zoals beschreven in stap 1.10
- Ga verder met subcultuur hen door zaaien 3-5 x 10 3 cellen / cm2. Cellen groeien tot confluentie (P2-MSC's).
- Oogst cellen door protease spijsvertering zoals beschreven van stap 4,3 naar stap 4.5 en ga verder met de karakterisering zoals beschreven in paragraaf 3.
LET OP: Een percentage van CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg cellen lager is dan 95% zou slechts een gedeeltelijke differentiatie aan te geven en om een aanvullend cultuur passage. - Plaat P2-MSC's bij 2 x 10 4 / cm 2 in zes goed TC-behandelde platen en te groeien tot confluentie in MSC-RS medium.
- Mark twee putten als "No Diff" en vernieuwen MSC-RS medium.
- Mark twee goeds als "Osteo" en medium te vervangen door 200 ul / cm2 standaard osteogene medium, speciaal ontworpen voor MSC differentiatie.
- Mark twee putten als "Adipo" en medium te vervangen door 200 ul / cm2 standaard adipogenic medium, speciaal ontworpen voor MSC differentiatie.
- Handhaaf kweken bij 37 ° C in 5% CO 2 door het veranderen van het gehele medium elke 48 uur.
LET OP: Het wordt sterk aangeraden om standaard in de handel verkrijgbare differentiëren media te gebruiken voor de test reproduceerbaarheid. Na 2/3 weken onder differentiërende omstandigheden, kalkafzettingen verschijnen in osteogene geïnduceerde kweken, terwijl intracellulaire vetdruppels accumulatie is duidelijk in adipogenic geïnduceerde cellen. - Aspireren en gooi kweekmedium daarna wassen met D-PBS.
- Bevestig de kweken door toevoegen van 1 ml 4% (w / v) paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voor het verwijderen van fixatief toevoegen D-PBS, incubeer gedurende 2 minuten en giet. Herhaal het wassentwee keer.
- Vlekken op een "No Diff" samen met de twee "Osteo" gemarkeerd putten in hydroxyapatiet specifieke tl-oplossing en een "No Diff" samen met de twee "Adipo" putten in 200 nm Nile Rode oplossing gemarkeerd. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur 11,12.
- Verwijder vlekken oplossingen en wassen in D-PBS twee keer.
- Verwijder D-PBS, voeg D-PBS gesupplementeerd met 50% (v / v) glycerol en ga naar grafische 7 9 10.
5. MPC Sferoïde Sprouting Assay
- 3D sferoïden produceren lag 20 ul druppels vers geïsoleerde MPC suspensie (1,5 x 10 4 cellen / drop) op het binnenoppervlak van een petrischaal deksel.
LET OP: Als handling druppels zou kunnen leiden tot hun breuk, is het zeer aan te bevelen om ze lag in overmaat. - Gebruik het deksel voorzichtig naar een petrischaal met D-PBS om te voorkomen dat hangende druppels verdampen recapituleren. Incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2's nachts om cellen te aggregeren in 3D bolletjes.
- Stel een dikke gel van muizen extracellulaire matrix (ECM) eiwitten door toevoeging van 300 ul aliquots van standaard ECM eiwitten in een voorgekoelde 24 putjes kweekplaat, en incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- tip voorzichtig over de petrischaal deksel en voorzichtig pak de bolletjes met behulp van een steriele Pasteur pipet.
- Leg sferoïden op de ECM eiwitgel, voeg 700 ul aliquots van standaard VEGF-rijke endotheliale celgroei medium en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2.
- Na 24 uur en 7 dagen cultuur, nemen foto's van de 3D kweken bij 4X vergrotingsfactor. Evalueer ontspruit uit bolletjes toepassing van beeldanalyse software door het meten van de radiale afstand tussen de laatste invasie cel en de bolvormige rand. Herhaal maatregelen langs ten minste 20 verschillende richtingen. De gemiddelde afstand wordt beschouwd als positief als 50 urn of meer.
Representative Results
De hier beschreven selectieve kweekomstandigheden hebben de isolatie van een nieuw hechtende en bijna monomorphic celpopulatie toegelaten 1,0% van de HBM-multinationals (0,5-2,0 x 10 6 HBM-multinationals 5-10 ml vers BM monsters) 5,6 . We identificeerden deze grote (40 - 60 micrometer in diameter), afgerond, rustige, Ki-67-negatieve cellen als MTR 5. Morfologisch, worden ze gekenmerkt door een opvallende gebakken ei-vorm met een dikke kerngebied omgeven door een vlakke dunne periferie blijkt veel filopodia bij een hogere vergrotingsfactor (witte pijlen in figuur 1 A.1). Polaire verlenging van de buitenste celbegrenzing wordt vaak waargenomen (zwarte pijlen in figuur 1 A.1). Dergelijke morfologie duidelijk verschilt van de typische spoelvormige mesenchymale stromale cel verschijning gerapporteerd in standaard MSC-culturen. Flowcytometrie toonde meer dan 95% van de vers geïsoleerde mediterrane partnerlanden aan CD31 en CD45, terwijl m uitdrukkenesenchymal geassocieerde merkers CD90 en CD73 13 niet detecteerbaar (Figuur 1 A.2). Wij beschouwen deze beperkte set van vier antigenen als indicatief voor MTR. Verdere onderscheidende kenmerken van MPL zijn bezaaid F-actine distributie onthullen een aantal van de voetjes structuren (rood in figuur 1 A.3) en intense expressie van nestin (groen in figuur 1 A.3), die niet gedetecteerd in de cellen gekleurd met isotype controle antilichaam (gegevens niet getoond).
Het kweken van MTR in standaard RS medium ontworpen voor MSC expansie resulteert in een snelle differentiatie in exponentieel groeiende MSC-achtige cellen (Figuur 1 B.1). Na twee passages cellen uiteindelijk schakelen hun fenotype van CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + aan CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg (figuur 1 B.2). In het proces, MTR re-organize F-actine in stress-vezels terwijl nestin expressie beperkt wordt tot enkele zeldzame cellen (figuur 1 B.3). MPC mesengenic differentiatie tot een bepaalde MSC-fenotype ontstaat door twee afzonderlijke stappen blijkt uit andere cel morfologie. Na een week in MSC RS medium een resterende populatie van MPC-achtige cellen is nog steeds waarneembaar binnen een confluente laag van platte, veelhoekige multi-vertakte cellen (P1-MSC's in figuur 2 A). Een verdere doorgang moet bijna monomorfisch cultuur van spoelvormige MSC-achtige cellen te verkrijgen (P2-MSC in figuur 2 A). Deze exponentieel groeiende cellen kan gemakkelijk differentiëren tot osteoblasten of adipocyten wanneer overgebracht in selectief medium gedurende ten minste 2 weken, waardoor hun MSC aard bevestigd. In osteogene geïnduceerde kweken, kan kalkaanslag worden gedetecteerd door ofwel colorimetrisch alizarine-S vlek of specifieke fluorescente kleurstoffen (groen in figuur 2 B). Na adipogenic inductie cellentonen lipide droplet accumulatie blijkt uit ofwel colorimetrisch of fluorescent Oil Red Nile Red kleuring (rood in figuur 2 B).
MPC typering werd bevestigd door kiemen angiogenese assay. Mediterrane partnerlanden toonden hun vermogen om binnenvallen (meer dan 50 micrometer) muizen ECM eiwit gel van 3D bolletjes na 24 hr VEGF-stimulus (figuur 2 C). Na één week binnendringende cellen werden gedetecteerd bij 300-600 urn afstand. Omgekeerd werd invasie capaciteit verloren in P2-MSC's na mesengenic differentiatie (figuur 2 D).
Aanleiding tot een populatie van rustende MTR (A) gemakkelijk te onderscheiden van MSC's (B) Figuur 1. vers geïsoleerde MTR hebben onderscheidende kenmerken. Het kweken HBM-multinationals in DMEM / 10% PhABS zeven dagen geeft klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. mediterrane partnerlanden differentiëren naar Standard MSC's en Show Kiemen Angiogenese in vitro. Vervanging van DMEM / PhABS met commercieel verkrijgbare RS medium ontworpen voor MSC expansie triggers mesengenic inductie van de mediterrane partnerlanden. Na een week in de cultuur paar resterende MTR nog aantoonbaar (P1-MSC's), terwijl een verdere passage in MSC-RS medium leidt tot een populatie van confluente MSC-achtige cellen (P2-MSC, A schaal bars = 100 pm). P2-MSC's terminaal differentiëren in osteocytes of adipocyten onder de juiste stimuli zoals blijkt uit calcium afzetting (groen in B) en lipide-druppel accumulatie (rood in B, schaal bars = 200 pm), respectievelijk. Mediterrane partnerlanden tonen consistente ontspruit uit sferoïden in muizen ECM eiwit gel (C) bij een verschil met P2-MSC's (D, schaal bars = 1,0 mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Acknowledgments
De auteurs willen vooral graag bedanken Dr. Paolo Parchi, afdeling Chirurgische, Medische en Moleculaire Pathologie en Critical Care Medicine, Universiteit van Pisa, voor het verstrekken van beenmerg samples en zijn expertise in de menselijke osteo-voorlopers
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Bioscience (San Jose, CA-USA) | 354230 | Murine ECM proteins Stock Concentration: 100% (9 - 12 mg/ml) Final Concentration: 100% |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | Sigma (St. Louis, MO, USA) | D8537 | |
| 70 μm Filters | Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-823 | |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare (Uppsala, Sweden) | 17-5442-03 | medium for discontinuos density gradient centrifugation |
| Pooled human AB type serum (PhABS) | LONZA (Walkersville MD-USA) | 14-490E | Final Concentration: 10% |
| Glutamax-I | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 35050-038 | Stabilized L-Glutamine Stock Concentration: 100x Final Concentration: 2 mM |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | Stock Concentration: 7.5% Final Concentration: 0.5% |
| Sodium Azide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | S8032 | Final Concentration: 0.02% |
| Penicillin/Streptomycin (Pen Strep) | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | Antibiotics Stock Concentration: 5,000 UI/ml penicillin, 5,000 μg/ml Streptomycin Final Concentration: 50 UI/ml penicillin, 50 μg/ml Streptomycin |
| T-75 culture flask for suspension cultures | Greiner Bio-one (Frickenhausen, Germany) | 658 190 | |
| T-75 culture flask TC treated | Greiner Bio-one (Frickenhausen, Germany) | 658170 | |
| TrypLE Select | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 12563-011 | Animal-free proteases detaching solution Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| Trypsin/EDTA | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 15400-054 | Phenol red free Stock Concentration: 0.5% Final Concentration: 0.25% |
| anti-CD90 APC antibody (CD90) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-402 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD45 APC-Vio770 antibody (CD45) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-096-609 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD73 PE antibody (CD73) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-182 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD31 PE Vio-770 antibody (CD31) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-105-260 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 APC antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-846 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG2a APC Vio770 antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-096-637 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 PE antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-845 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 PE Vio-770 antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-563 | Final Concentration: 1:40 |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 13-1331-82 | Phenol red-free minimal essential medium Stock Concentration: 1,000 mg/L glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 10500 | Stock Concentration:0.2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml |
| Prolong Gold antifade reagent with 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | P-36931 | Aqueous mounting medium + DAPI Final Concentration: 1x |
| Paraformaldehyde | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P6148 | Fixative Final Concentration: 4% |
| LAB-TEK two-well chamber slides | Sigma (St. Louis, MO, USA) | C6682 | |
| Anti-Nestin antibody [clone 10C2] | Abcam (Cambridge, UK) | ab2035 | Stock Concentration: 1 mg/ml Final Concentration: 7 μg/ml |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | A34055 | Stock Concentration: 200 UI/ml Final Concentration: 5 UI/ml |
| Triton X-100 | Euroclone (Milan, Italy) | EMR237500 | Final Concentration: 0.05% |
| MesenPRO RS Medium (MSC-RS medium) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 12746-012 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse SFX kit | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | A31619 | Goat anti-mouse secondary antibody + Signal enhancer Stock Concentration: 2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml |
| Pasteur Pipette | Kartell Labware (Noviglio (MI), ITALY ) | 329 | |
| StemMACS AdipoDiff Media | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-091-679 | |
| StemMACS OsteoDiff Media | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-091-678 | |
| Osteoimage Bone mineralization Assay | LONZA (Walkersville MD-USA) | PA-1503 | Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution |
| 50 ml Polystyrene conical tube | Greiner bio-one (Kremsmünster Austria) |
227261 | |
| Nile Red | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | N1142 | Fluorescent staining solution for lipids Stock Concentration: 100 mM Final Concentration: 200 Nm |
| Glycerin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | G2289 | Final Concentration: 50% |
| Polistirene Petri dishes | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P5606 | |
| 24-well plates TC-treated | Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germany) | 662160 | |
| Endothelial Growth Medium, EGM-2 BulletKit (EGM-2) | LONZA (Walkersville MD-USA) | CC-3162 | VEGF-rich endothelial cell growth medium |
| Leica Qwin Image Analisys Software | Leica (Wetzlar, Germany) | Image analysis software |
References
- Stoltz, J. F., et al. Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century. Stem Cells Int. 2015, 734731 (2015).
- Pacini, S. Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs). Front Cell Dev Biol. 2, 50 (2014).
- Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union. Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).
- Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29 (2011).
- Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
- Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
- Pacini, S., et al. Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs). PLoS One. 5 (3), 9861 (2010).
- Pacini, S., et al. Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).
- Fazzi, R., et al. Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway. PLoS One. 6 (9), 25600 (2011).
- Tormin, A., et al. CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization. Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes. Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns. Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
- Phinney, D. G. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy. Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
- Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells. Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).
- Bieback, K., et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).
- Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51 (2014).
- Pacini, S., Petrini, I. Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells. Front Cell Dev Biol. 2, 20 (2014).
