Introduction
תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) הם בעלי ערך קליני רלוונטי עבור קיבולת בידול רב השושלת שלהם ואת יכולתם לתמוך hemopoiesis, להפריש גורמי גדילה / ציטוקינים כמו גם לשחק תפקיד immunoregulation 1. בהגדרה של ייצור ויישום תא טיפולים מבוססים MSC כבר מושא המחקר קליני הנרחב טרום קליני 2, תוך שימת דגש מיוחד ברגולציה בינלאומית ספציפית את הבטיחות והיעילות של תא מבוסס מוצר רפואי (CBMP) טיפולים 3. MSCs אדם מתורבתים בהרחבה בתקשורת המכיל תוספי ריאגנטים מן החי, כגון בסרום שור העובר (FBS) טריפסין שור. לכן, לצד סיכונים זיהומיות הקשורות מניפולצית תא, חולים גם להתמודד עם חשיפת פריון וכן סיכונים אימונולוגיים צמודים חלבונים, פפטידים או ביומולקולות אחרות מן החי שיכולים נמשך לאחר תא קציר transplantation 4.
כדי לעקוף את הבעיה, אנחנו מתורבתי מח עצמות אדם (HBM) MSCs -derived במדיום חיה ללא, החלפת FBS עם סרום סוג AB אדם אסף (PhABS). בתנאים אלה, לצד MSCs גדל זיהינו אוכלוסיית תא רומן. תאים אלה היו מורפולוגית phenotypically שונה MSCs והראו פרופיל ביטוי גנים ייחודי וכן נכסי הידבקות מאפיין גידול /. הם שמרו הוא mesengenic ו angiogenic פוטנציאל ולכן נקראו תאי mesodermal ובתאים (MPCs) 5. בהמשך לכך, הצלחנו להגדיר תנאי תרבות סלקטיבית לשחזור כדי ליצור MPCs על ציון גבוה של טוהר 6.
בנוסף, אנו חקרנו את תכונות מורפולוגיות ביולוגיות של MPCs. MPCs הראה להיות nestin החיובי, איטי ב אופניים, Ki-67-שליליים, ועם הכרומוזומים מאופיינים טלומרים ארוכים 5. הם הביעו plurשעתוק הקשורים ipotency גורמי אוק-4 ו Nanog ולא רגולטורים MSC Runx2 ו Sox9 7. Phenotypically, MPCs הביע endoglin (CD105) ברמה נמוכה יותר מאשר MSCs כאשר לא היתה להם mesenchymal סמנים CD73, CD90, CD166. MPCs גם הראה בדפוס ייחודי של מולקולות הדבקה מאופיין ביטוי עקבי של PECAM (CD31), integrins αL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11c) וכן β2 integrin (CD18) באופן ספציפי ומקיים מבנים podosome דמוי 8 . במדיה הרחבים MSC סטנדרטיים, MPCs הבדיל מייד לתוך MSCs דרך שלב ביניים המציג את הפעלת תא Wnt5 / calmodulin איתות 9. MPCs גם שומרים על תכונותיהם angiogenic, כפי שהוכח על ידי יכולתם צומחים מתוך spheroids ב מטריקס בעכברים (ECM) תרבויות 3D חלבון. פוטנציאל angiogenic אבד במהירות לאחר בידול MPC לאורך שושלת mesengenic.
כאן אנו מציגים פרוtocols אופטימיזציה לבודד ולאפיין MPCs נקיים במיוחד מדגימות דם HBM. פרוטוקולים לשחזור עבור mesengenic MPC והבחנה angiogenic מתוארים גם.
Protocol
הערה: לאחר הסכמה בכתב, דגימות HBM התקבלו במהלך ניתוח אורתופדי עבור החלפת מפרק הירך. מיד לאחר osteotomy בצוואר הירך ולפני הירך קודחות מזרק 20 מ"ל המכיל 500 UI של הפרין, שימש לשאוב בע"מ טריים. הפרוטוקול הוא ייחשב נרחב החלים על כל מקור בע"מ.
1. בידוד של תאים mononuclear מח האדם עצם (HBM-MNCs)
- לדלל 5 - 10 מ"ל של BM טרי 50 מ"ל, החלת פתרון בופר פוספט של Dulbecco (D-PBS) ומערבבים על ידי היפוך. לא פחות להפיץ 25 מ"ל בשני צינורות חרוטי חדש 50 מ"ל, להוסיף 25 מ"ל של D-PBS על צינור אחד ומערבבים על ידי היפוך.
- אפשר הצינורות לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, להפרדת שברי עצם ושומן מפתרון.
- מוציאים בזהירות שומן צף עם ההשעיה תא פיפטה ולסנן פסטר סטרילית דרך 70 מיקרומטר מסננים מבלי להפריע גלולה שבר העצם. <li> הגדר ארבעה צינורות 50 מ"ל עם 15 מ"ל של מדיום עבור צנטריפוגה שיפוע צפיפות רציפה (1.077 גרם / מ"ל). ודא כי המדיום הזה הוא בטמפרטורת החדר.
- בעדינות שכבה 20 - 25 מ"ל של בדילול BM על גבי בינוני שיפוע צפיפות. בצע פעולה זו בזהירות, לתת זרזיף השעית תא על קירות הצינור כדי למנוע שכבות ערבוב.
- לבצע צנטריפוגה שיפוע צפיפות ב 400 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם נכים.
- אסוף את הטבעת לבנבן של תאים הממוקמים בין שני השלבים בעזרת פיפטה פסטר סטרילי ולהעביר אותו צינור 50 מ"ל טרי.
- שטוף תאים עם מדיום תרבות טרי: גלוקוז נמוך, אדום ללא פנול (1,000 מ"ג / ליטר) הבינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) ואקווה א.ב. בסרום סוג האדם (PhABS), 2 מ"מ L- גלוטמין ו אנטיביוטיקה (DMEM / 10% PhABS). צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 5 - 10 מ"ל של DMEM טריים / 10% PhABS.
- המשך ספירת תאים.לקבוע את מספר תאי הדם הלבנים ע"י 1: 1 דילול trypan. זה החל על hemocytometer, ולבחון תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. אל תכלול אריתרוציטים קטן ומעוגל מושלם ותאים מתים כחולים מוכתם מן ספירת התאים.
הערה: מומלץ מאוד כדי אצוות מסך PhABS לביצועים שלהם בהחלמה MPC. PhABS ממקורות ארה"ב נתן תוצאות הטובות ביותר בעוד רוב סר ממוצא שונה הביא תרבויות MPC עם אחוזים גבוהים של תאי MSC הדמויים.
בידוד 2. של MPCs מ-MNCs HBM
- הגדר צלוחיות T-75 הידרופובי עם 15 מ"ל של PhABS טרי DMEM / 10% ולתת לאזן pH וטמפרטורה ידי הדגירה טרום ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 30 דקות.
- 4 זרע - 6 x 10 7 HBM-MNCs לכל בקבוק לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 48 שעות.
- לשאוב ולזרוק תאים בינוניים שאינם חסיד צלוחיות. הוסף 15 מ"ל של PhABS DMEM / 10% טרי לדגור על 37 מעלות צלזיוסב 5% CO 2. לשמור על תרבויות למשך 6 - 8 ימים, שינוי בינוני כל 48 שעות.
אופציונאלי: כדי להגדיל את תשואת MPC, לא חסידי תאי 2.3 יכולים להיות מחדש מצופים בבקבוק התרבות חדש ומתוחזק כמתואר עבור התרבויות העיקריות. - לשאוב ולזרוק בינוני צלוחיות, לשטוף עם DMEM טריים להוסיף 2 מ"ל של פרוטאז חינם בעלי חיים ניתוק פתרון. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 - 15 דקות (למנוע דגירה ממושכת).
- הוסף 10 מ"ל של PhABS טרי DMEM / 10%, לשאוב את ההשעיה תא צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות
- לשאוב ולזרוק supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 - 2 מ"ל של DMEM טריים / 10 PhABS%. המשך ספירת תאים כמתוארים בשלב 1.10.
הערה: אל תשתמש טריפסין / EDTA כמו ניתוק מגיב. MPCs הוא טריפסין עמיד. הקרנה מורפולוגי של התרבויות, לפני קטיף תא, מומלצת מאוד כדי להעריך הנוכחות של תאי MSC הדמוי דמוי כישור. בסכום תיקים רב של תאי MSC הדמויים הם דetected, להגדיל את הטוהר של מוצר התא על ידי הסרת התאים המזוהמים באופן סלקטיבי. לשם כך, עיכול טריפסין יכול להתבצע לפני קצירת MPC, על ידי הוספת 2 מ"ל של טריפסין / EDTA 0.05% למשך 2 דקות. תרבויות שטפו פעמיים עם 5 מ"ל של DMEM / 10% PhABS, ולאחר מכן להמשיך פרוטאז טיפול כנ"ל.
אפיון Cell 3.
- cytometry זרימה
- גדר דגימות כפולות של 10 תאים 5 טריים מנותקים בתמיסת כביסה: D-PBS בתוספת 0.5% (v / v) אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 0.02% (w / v) יזיד הנתרן. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות.
זהירות: אזיד הנתרן הוא רעיל. - Re- להשעות כדורים ב 200 μl של פתרון כביסה ולהוסיף אנטי CD90, אנטי CD45, אנטי CD73 נוגדנים נגד CD31 מצומדות עם צבעי ניאון ( "TEST"); במקביל להגדיר בקרת isotype ( "CTRL").
הערה: סכומים של מכתים נוגדנים צריכים להיקבע על ידי טיטרציה או אקורדינג להוראות היצרן. - דגירת דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות. Re להשעות תאי 500 μl של פתרון כביסה ולרכוש לפחות 5 x 10 4 אירועים על תזרים ססגוני cytometer 7 9 10.
- נתח את התוצאות על ידי חלקות-נקודה ולהשתמש "CTRL" אירועים שנרשמו להגדיר רביעים.
הערה: על מנת להגדיר את התרבות כתרבות MPC אחוז CD73 נג CD90 נג CD45 + CD31 + תאים צריך להיות מעל 95%. עבור יישומים ספציפיים מסוימים, כלומר, ניתוח ביטוי גנים, חתוכי ההתאוששות צריך להיות מוגברים עד 97 - 98%.
- גדר דגימות כפולות של 10 תאים 5 טריים מנותקים בתמיסת כביסה: D-PBS בתוספת 0.5% (v / v) אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 0.02% (w / v) יזיד הנתרן. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות.
- זיהוי Nestin וניתוח ארגון F- אקטין
- פלייט MPCs טרי הפרד, שקופיות קאמרית תרבות (20,000 / 2 ס"מ). אפשר תאים לדבוק ידי דגירת לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2.
- שטפו תאים בתמיסה וסיבי כביסהx ב 4% (w / v) פסקה פורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי להסיר מקבע ולהוסיף פתרון כביסה, דגירה במשך 2 דקות ויוצקים.
- חזור כביסה פעמיים.
- תאי Permeabilize ברה-PBS בתוספת 0.05% (v / v) טריטון X-100 במשך 15 דקות ב RT.
- בקצוות ידי משפר אות בחינם חלבון (30 דקות 'ב RT) או פתרון חסימה סטנדרטי (D-PBS בתוספת 3% (w / v) BSA).
- סר משפר אות / חסימת פתרון.
- להוסיף 7 מיקרוגרם / מ"ל (w / v) של נוגדן ראשוני nestin אנטי אנושי דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא humidified. במקביל, השתמש נוגדנים לשלוט isotypic להעריך אותות קרינה ספציפיים לא.
- לשטוף שקופיות על ידי הוספת D-PBS, להשאיר למשך 2 דקות ויוצקים. חזור פעמיים.
- הוסף 2 מיקרוגרם / מ"ל (w / v) של נוגדנים משני מצומדות צבע פלואורסצנטי דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בחושך.
- לשטוף מחליק כנ"ל.
- להוסיף Phalloidin ניאון (5 UI / ml), לעזוב ב RT במשך 30 מ 'ב בחושך לשטוף 3 פעמים ב D-PBS.
- הסר את הקירות קאמריים הר שקופיות במדיום הרכבה מימית בתוספת antifade מגיב 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לגילוי גרעינים. המשך הדמיה 7 9 10.
4. בידול Mesengenic של MPCs
- פלייט 2 x 10 4/2 ס"מ MPCs מבודדים טרי צלוחיות תרבות T75 TC שטופלו ולתת תאים לדבוק לילה DMEM / 10% PhABS על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- החלף DMEM / 10% PhABS עם המדיום סרום מופחת רגיל, כ -200 μl / 2 ס"מ, המיועד (בינוני MSC-RS) הרחבת התא סטרומה mesenchymal. לגדל תאים כדי מפגש (P1-MSCs), בדרך כלל 7 עד 10 ימים מיום האינדוקציה. רענן בינוני כל 2 ימים.
- לשאוב ולזרוק בינוני צלוחיות, לשטוף עם המדיום MSC-RS טריים להוסיף 2 מ"ל של פרוטאז חינם בעלי חיים ניתוק פתרון. לדגור על 3776; צלזיוס למשך 5 - 15 דקות (למנוע דגירה ממושכת).
- הוסף 10 מ"ל של מדיום MSC-RS טריים, לשאוב את ההשעיה תא צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות
- לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 - 2 מ"ל של מדיום MSC-RS טריים. המשך ספירת תאים כמתואר בשלב 1.10
- המשך-תת תרבות להם על ידי זריעת 3 - 5 x 10 תאים 3/2 ס"מ. לגדל תאים כדי מפגש (P2-MSCs).
- קציר תאים על ידי עיכול פרוטאז כמתואר משלב 4.3 לשלב 4.5 והמשך אפיון כמפורט בסעיף 3.
הערה: אחוז של CD73 + CD90 + CD45 נג תאי CD31 נג נמוך מ -95% היה מצביע רק בידול חלקי ודורש מעבר תרבות נוספת. - P2-MSCs פלייט ב 2 x 10 4 / cm 2 בשישה גם צלחות TC שטופלו ולגדול מפגש במדיום MSC-RS.
- מארק שתי בארות כמו "אין הבדל" ולרענן בינוני MSC-RS.
- מארק שני גםים כמו "osteo" ולהחליף בינוני עם 200 μl / 2 ס"מ של מדיום osteogenic סטנדרטי, שתוכננה במיוחד עבור בידול MSC.
- מארק שתי בארות כמו "Adipo" ולהחליף בינוני עם 200 μl / 2 ס"מ של מדיום adipogenic סטנדרטי, שתוכננה במיוחד עבור בידול MSC.
- לשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 על ידי שינוי התקשורת כולה כל 48 שעות.
הערה: מומלץ מאוד להשתמש תקן זמינה מסחרי מדיה הבחנה עבור שחזור מבחן. אחרי 2/3 שבועות בתנאי הבחנה, משקעי סידן להופיע בתרבויות מושרות osteogenic, תוך הצטברות טיפות שומנים תאיות ניכרת בתא מושרה adipogenic. - לשאוב ולזרוק תקשורת ותרבות ולאחר מכן לשטוף עם D-PBS.
- תקן התרבויות על ידי הוספת 1 מ"ל של 4% (w / v) פסקה פורמלדהיד במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- כדי להסיר מקבע להוסיף D-PBS, דגירה במשך 2 דקות ויוצקים. חזור כביסהפעמיים.
- כתם אחד "אין הבדל" יחד עם שני "osteo" מסומן בארות בתמיסת ניאון ספציפית hydroxyapatite ואחד "אין הבדל" יחד עם שני "Adipo" מסומן בארות 200 פתרון אדום ננומטר הנילוס. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 11,12.
- הסר מכתים פתרונות ולשטוף D-PBS פעמיים.
- הסר D-PBS, להוסיף D-PBS בתוספת 50% (v / v) גליצרין והמשך הדמיה 7 9 10.
5. MPC אליפטית Assay הנבטה
- כדי לייצר spheroids 3D, שכב 20 טיפות μl של השעיה MPC מבודדים טרי (1.5 x 10 4 תאים / ירידה) על המשטח הפנימי של מכסה צלחת פטרי.
הערה: ככל טיפות טיפול עלולות להוביל לקרע שלהם, זה מאוד לא מומלץ להניח להם עודף. - בזהירות להשתמש במכסה כדי לסכם בצלחת פטרי המכילות D-PBS כדי למנוע תלוי טיפות אידוי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2לילה כדי לאפשר לתאים המצרפי spheroids 3D.
- גדר ג'ל סמיך של מטריקס בעכברים (ECM) חלבונים על ידי הוספת 300 aliquots μl של חלבוני ECM סטנדרטיים צלחת תרבות מראש בקירור 24 גם, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- בזהירות להתהפך מכסת צלחת פטרי בעדינות להרים את spheroids בעזרת פיפטה פסטר סטרילית.
- נח spheroids על ג'ל חלבון ECM, להוסיף 700 aliquots μl של מדיום גידול תא האנדותל VEGF-עשיר רגיל ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- לאחר 24 שעות ו 7 ימים של תרבות, לצלם את תרבויות 3D בהספק הגדלת 4X. להעריך מבצבצות spheroids החלת תוכנת ניתוח תמונה על ידי מדידת המרחק הרדיאלי בין תא הפולש האחרון והקצה אליפטית. צעדים חזרו יחד לפחות 20 בכיוונים שונים. המרחק הממוצע הוא ייחשב כחיובי כאשר 50 מיקרומטר או מעל.
Representative Results
התנאים תרבות סלקטיבית המתואר כאן אפשרו את הבידוד של רומן חסיד וכמעט חַד צוּרָתִי אוכלוסיית תאים כמו 1.0% של HBM-MNCs (0.5 - 2.0 x 10 6 HBM-MNCs מן 5 - 10 מ"ל של דגימות BM טרי) 5,6 . זיהינו הגדולות האלה (40 - 60 מיקרומטר קוטר), מעוגל, שוקט, תאים Ki-67-שליליים כמו MPCs 5. מורפולוגית, הם מאופיינים בכושר-ביצת עין ייחודי עם אזור ליבה עבה מוקף בפריפריה דקה שטוחה מראה המון filopodia בהספק בהגדלה גבוה יותר (חצים לבנים ב א 1. איור 1). התארכות פולאר של גבול התא החיצוני הוא נצפה לעיתים קרובות (חיצים שחורים ב א 1. איור 1). מורפולוגיה כזו היא שונה בבירור מן מראה תא סטרומה mesenchymal הטיפוסי בצורת הכישור דיווח בתרבויות MSC סטנדרטיות. Cytometry זרימה הראתה מעל 95% של MPCs המבודד טרי להביע CD31 ו CD45 בעוד מ 'esenchymal סמנים הקשורים CD90 ו CD73 13 היו (א .2 איור 1) לגילוי. אנו רואים קבוצה המוגבלת הזאת של ארבעה אנטיגנים כמו אינדיקציות על MPCs. בהמשך סימני ההיכר של MPCs הם הפצה המקווקו F- אקטין חושף מספר מבנים דמויי podosome (אדום באיור 1 א .3) וביטוי אינטנסיבי של nestin (ירוק באיור 1 א .3), אשר לא זוהה בתאים מוכתם נוגדן שליטה isotypic (מידע לא מוצג).
MPCs Culturing ב RS סטנדרטי שנועד בינוני עבור תוצאות הרחבה MSC התמיינות מהירה לתאים MSC דמוי גדל באופן אקספוננציאלי (איור 1 ב'1). לאחר שני קטעים תאים לבסוף לעבור הפנוטיפ שלהם CD73 נג CD90 נג CD45 + CD31 + כדי CD73 + CD90 + CD45 נג CD31 נג (איור 1 ב .2). תוך כדי כך, MPCs מחדש organize F- אקטין לתוך סיבי מתח תוך ביטוי nestin הופך מרותק כמה תאים נדירים (איור 1 ב .3). בידול MPC mesengenic לתוך פנוטיפ MSC הדמוי מובהק מתרחש באמצעות שני צעדים ברורים שעולים מורפולוגיה תאים שונות. לאחר שבוע במדיום MSC RS אוכלוסייה שיורית של תאים דמויי MPC עדיין לזיהוי בתוך שכבת ומחוברות של שטוח, תאים רב-קנים מצולעים (P1-MSCs באיור 2 א). קטע נוסף נדרש כדי להשיג תרבות חַד צוּרָתִי כמעט של תאי MSC הדמוי דמוי כישור (P2-MSCs באיור 2 א). אקספוננציאלית גדל אלה תאים יכולים להתמיין אוסטאובלסטים או adipocytes בקלות כאשר מועברים לתוך התקשורת סלקטיבית עבור 2 שבועות לפחות, ובכך אישר הטבע MSC שלהם. בתרבויות מושרות osteogenic, משקעי סידן יכולים להיות מזוהים על ידי או כתם Alizarin-S colorimetric או צבעי ניאון ספציפיים (ירוק B איור 2). לאחר תאים אינדוקציה adipogenicלהראות הצטברות אגל השומנים כפי שעולה גם כתם אדום אדום שמן colorimetric או פלורסנט הנילוס (אדום B איור 2).
הקלדת MPC אושרה על ידי הנבטת assay אנגיוגנזה. MPCs הראה יכולתם לפלוש (למעלה מ -50 מיקרומטר) ג'ל murine ECM חלבון מן spheroids 3D לאחר 24 שעות VEGF-גירוי (איור 2 ג). לאחר תאים פולשים שבוע התגלו ב 300 - 600 מרחק מיקרומטר. לעומת זאת, יכולת פלישה אבדה P2-MSCs לאחר בידול mesengenic (איור 2 ד).
איור 1. MPCs מבודדים טרי יש מאפיינים ייחודיים. Culturing HBM-MNCs ב DMEM / 10% PhABS במשך שבעה ימים מוליד אוכלוסייה של MPCs שקט (א) להבחין בקלות בין MSCs (B) נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. MPCs להתמיין MSCs Standard ו- הצג הנבטה אנגיוגנזה במבחנה. החלפת DMEM / PhABS עם RS זמינים מסחרית שנועדה בינוני להרחבת MSC מפעילה אינדוקציה mesengenic של MPCs. אחרי שבוע בתרבות כמה MPCs שיורית עדיין לגילוי (P1-MSCs) תוך מעבר נוסף במדיום MSC-RS מוביל אוכלוסייה של תאים MSC דמוי ומחוברות (P2-MSCs, ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר). P2-MSCs סופני להתמיין osteocytes או adipocytes תחת הגירוי הנכון, כפי שהיא מתגלה על ידי בתצהיר סידן (ירוק B) וצבירת אגל השומנים (אדום B, ברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר), בהתאמה. MPCs להראות הנבטה עקבית spheroids ב ג'ל חלבון murine ECM (C) בשעה הבדל עם P2-MSCs (D, ברים בקנה מידה = 1.0 מ"מ). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Acknowledgments
מחברים במיוחד רוצה להודות ד"ר פאולו פרחי, במחלקה כירורגית, רפואיים לפתולוגיה מולקולרית Critical Care Medicine, אוניברסיטת פיזה, למתן דגימות מח עצם ובקיאותו-אבות osteo אדם
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD Bioscience (San Jose, CA-USA) | 354230 | Murine ECM proteins Stock Concentration: 100% (9 - 12 mg/ml) Final Concentration: 100% |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) | Sigma (St. Louis, MO, USA) | D8537 | |
| 70 μm Filters | Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-823 | |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare (Uppsala, Sweden) | 17-5442-03 | medium for discontinuos density gradient centrifugation |
| Pooled human AB type serum (PhABS) | LONZA (Walkersville MD-USA) | 14-490E | Final Concentration: 10% |
| Glutamax-I | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 35050-038 | Stabilized L-Glutamine Stock Concentration: 100x Final Concentration: 2 mM |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | Stock Concentration: 7.5% Final Concentration: 0.5% |
| Sodium Azide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | S8032 | Final Concentration: 0.02% |
| Penicillin/Streptomycin (Pen Strep) | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | Antibiotics Stock Concentration: 5,000 UI/ml penicillin, 5,000 μg/ml Streptomycin Final Concentration: 50 UI/ml penicillin, 50 μg/ml Streptomycin |
| T-75 culture flask for suspension cultures | Greiner Bio-one (Frickenhausen, Germany) | 658 190 | |
| T-75 culture flask TC treated | Greiner Bio-one (Frickenhausen, Germany) | 658170 | |
| TrypLE Select | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 12563-011 | Animal-free proteases detaching solution Stock Concentration: 1x Final Concentration: 1x |
| Trypsin/EDTA | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 15400-054 | Phenol red free Stock Concentration: 0.5% Final Concentration: 0.25% |
| anti-CD90 APC antibody (CD90) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-402 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD45 APC-Vio770 antibody (CD45) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-096-609 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD73 PE antibody (CD73) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-095-182 | Final Concentration: 1:40 |
| anti-CD31 PE Vio-770 antibody (CD31) | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-105-260 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 APC antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-846 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG2a APC Vio770 antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-096-637 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 PE antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-845 | Final Concentration: 1:40 |
| Mouse IgG1 PE Vio-770 antibody | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-098-563 | Final Concentration: 1:40 |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 13-1331-82 | Phenol red-free minimal essential medium Stock Concentration: 1,000 mg/L glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 10500 | Stock Concentration:0.2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml |
| Prolong Gold antifade reagent with 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | P-36931 | Aqueous mounting medium + DAPI Final Concentration: 1x |
| Paraformaldehyde | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P6148 | Fixative Final Concentration: 4% |
| LAB-TEK two-well chamber slides | Sigma (St. Louis, MO, USA) | C6682 | |
| Anti-Nestin antibody [clone 10C2] | Abcam (Cambridge, UK) | ab2035 | Stock Concentration: 1 mg/ml Final Concentration: 7 μg/ml |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | A34055 | Stock Concentration: 200 UI/ml Final Concentration: 5 UI/ml |
| Triton X-100 | Euroclone (Milan, Italy) | EMR237500 | Final Concentration: 0.05% |
| MesenPRO RS Medium (MSC-RS medium) | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | 12746-012 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse SFX kit | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | A31619 | Goat anti-mouse secondary antibody + Signal enhancer Stock Concentration: 2 mg/ml Final Concentration: 2 μg/ml |
| Pasteur Pipette | Kartell Labware (Noviglio (MI), ITALY ) | 329 | |
| StemMACS AdipoDiff Media | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-091-679 | |
| StemMACS OsteoDiff Media | MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Germany) | 130-091-678 | |
| Osteoimage Bone mineralization Assay | LONZA (Walkersville MD-USA) | PA-1503 | Hydroxyapatite specific fluorescent staining solution |
| 50 ml Polystyrene conical tube | Greiner bio-one (Kremsmünster Austria) |
227261 | |
| Nile Red | ThermoFisher (Waltham, MA USA) | N1142 | Fluorescent staining solution for lipids Stock Concentration: 100 mM Final Concentration: 200 Nm |
| Glycerin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | G2289 | Final Concentration: 50% |
| Polistirene Petri dishes | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P5606 | |
| 24-well plates TC-treated | Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Germany) | 662160 | |
| Endothelial Growth Medium, EGM-2 BulletKit (EGM-2) | LONZA (Walkersville MD-USA) | CC-3162 | VEGF-rich endothelial cell growth medium |
| Leica Qwin Image Analisys Software | Leica (Wetzlar, Germany) | Image analysis software |
References
- Stoltz, J. F., et al. Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century. Stem Cells Int. 2015, 734731 (2015).
- Pacini, S. Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs). Front Cell Dev Biol. 2, 50 (2014).
- Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union. Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).
- Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29 (2011).
- Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
- Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
- Pacini, S., et al. Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs). PLoS One. 5 (3), 9861 (2010).
- Pacini, S., et al. Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).
- Fazzi, R., et al. Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway. PLoS One. 6 (9), 25600 (2011).
- Tormin, A., et al. CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization. Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes. Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns. Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
- Phinney, D. G. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy. Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
- Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells. Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).
- Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).
- Bieback, K., et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).
- Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51 (2014).
- Pacini, S., Petrini, I. Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells. Front Cell Dev Biol. 2, 20 (2014).
