Summary
Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.
Abstract
Creciente evidencia indica que la hematopoyesis normal está regulada por distintas señales microambiental en el BM, que incluyen nichos celulares especializadas modulación crítica de células madre hematopoyéticas (HSC) funciones1,2. De hecho, un cuadro más detallado del microambiente hematopoyético ahora surge, en el cual los endoóseos y los nichos endoteliales forman unidades funcionales para la regulación de HSC normal y su progenie3,4,5 . Nuevos estudios han revelado la importancia de las células perivasculares, adipocitos y células neuronales en el mantenimiento y regulación de la función HSC6,7,8. Además, hay evidencias de que células de diferentes linajes, es decir, las células mieloides y linfoides, hogar y residen en nichos específicos dentro del microambiente de BM. Sin embargo, una asignación completa del microambiente del BM y de sus ocupantes aún está en progreso.
Cepas de ratón transgénico que expresan marcadores fluorescentes específicos de linaje o ratones genéticamente modificados para carecer de las moléculas en células específicas del nicho BM están ahora disponibles. Knock-out y linaje seguimiento de modelos, en combinación con métodos de trasplante, proporcionan la oportunidad de perfeccionar el conocimiento sobre el papel de específicas "niche" células para poblaciones hematopoyéticas definidas como HSC, de células B, células T, células mieloides y células eritroides. Esta estrategia puede ser potenciada aún más combinando el uso de la microscopía de dos fotones de la bóveda craneal. Proporcionando en vivo imágenes de alta resolución y 3D Render de la bóveda de BM, ahora podemos determinar precisamente el lugar donde subconjuntos hematopoyéticos específicos Inicio en el BM y evaluar la cinética de su expansión en el tiempo. Aquí, Lys-GFP ratones transgénicos (marcando las células mieloides)9 y RBPJ ratones knock-out (falta de señalización de Notch canónica)10 se utilizan en combinación con IVFM determinar el engraftment de células mieloides en un microambiente de BM defectuoso de muesca.
Introduction
La microscopia intravital de fluorescencia multifotón (IVFM) es una técnica de imagen de gran alcance que permite la alta resolución y en tiempo real la proyección de imagen de tejidos con profundidad hasta 1mm, dependiendo del tejido. Cuando se aplica a la bóveda del ratón, permite observar el comportamiento de las células hematopoyéticas en el BM en una manera no invasiva hasta 60-100 μm11. Aquí se utiliza este enfoque para determinar la cinética del engraftment de progenitores mieloides normales en los ratones knock-out de BM de RBPJ falta de señalización de Notch canónica.
Trabajos recientes de nuestro grupo demostraron defectuosa señalización canónica de muesca en el BM microambiente conduce a una Enfermedad mieloproliferativa como12. Pérdida de la señalización de Notch se obtuvo por supresión condicional del dominio de unión de ADN de RBPJ, el factor de transcripción crítico aguas abajo de la muesca canónica de señalización, utilizando Mx1-Cre inducida por recombinación10. En este estudio, se utilizó el modelo de ratones de Mx1-Cre/RBPJlox/lox . Supresión condicional adorno DNA-obligatorio del RBPJ de resultados en la pérdida de la señalización de los receptores Notch. En el modelo Mx1-Cre Cre expresión es conducida por el promotor de Mx1 activado tras la administración de polyI:C dando por resultado la inducción específica de canceladura del gene en células de la sangre así como en componentes stromal de múltiples órganos, incluyendo el BM, el bazo y el hígado.
MX1-Cre+/RBPJlox/lox y Mx1-Cre–/RBPJlox/lox ratones inducidos con polyI:C (aquí en adelante denominadas RBPJKO y RBPJWT, respectivamente) fueron irradiados letalmente y trasplantados con las células hematopoyéticas normales, tipo salvaje. A partir de la 4 semana después del trasplante, los receptores RBPJKO desarrollaron leucocitosis significativa seguido por esplenomegalia. Aunque ratones RBPJKO presentaron mayor porcentaje de progenitores mieloides en el BM en la semana 8 después del trasplante y en momentos más adelante, el análisis de BM en las semanas 4 y 6 no reveló diferencias llamativas en su contenido de células mieloides en comparación con el control RBPJWT destinatarios. Esta observación, junto con el hecho de que Cre Mx1 se expresa en diferentes órganos hematopoyéticos, planteó la cuestión de si el microambiente del BM tuvo impacto directo en la iniciación del fenotipo mieloproliferativo.
Para determinar si el BM era un sitio crítico inicial de desarrollo de la enfermedad, IVFM de la bóveda de ratón se usa en combinación con BM trasplante el modelo knock-out RBPJ y un sistema de seguimiento de linaje. Ratones transgénicos que expresaban EGFP bajo el control del promotor (Lys-GFP) lisozima específico9 fueron utilizados para obtener células de un donante que podrían visualizarse durante BM imagen después de BMT. Expresión de lisozima es específica de las células mieloides y Lys-GFP marca células del progenitor mieloide común (CMP) para los granulocitos maduros13.
IVFM del BM en diferentes puntos temporales demostró que las células GFP Lys alojados de manera similar a los destinatarios BM de RBPJWT y RBPJKO, pero ampliaron y engrafted rápidamente en los receptores de la BM de RBPJKO. Esta diferencia fue dramática en el momento anterior (semana 2) y disminuye con el tiempo (semanas 4 y 6). Sin embargo, en estos momentos más adelante, evaluación del compartimiento hematopoyético en el mismo recipiente demostró un aumento constante del número de células mieloides circulantes en la PB y localizados en el bazo de los ratones RBPJKO, lo que indica un aumento de la producción de células del BM en la circulación. Análisis de localización de células Lys-GFP en el BM de ratones trasplantados a las 6 semanas reveló que las células mieloides residían más lejos de la vasculatura en el microambiente de la RBPJKO que en el control.
Colectivamente, la combinación de IVFM con estos modelos animales específicos proporciona penetraciones en la dinámica del engraftment de células mieloides en el microambiente RBPJKO BM. El diseño experimental y el enfoque cuantitativo que se descrito aquí se propone como un paradigma que puede ser aplicado para hacer frente a preguntas similares. Por ejemplo, puede permitir el uso de otro linaje específico celular seguimiento de modelos, tales como GFP RAG114 o Gata1-GFP15 ratones, siguiendo el comportamiento de linfoide o progenitores eritroides, respectivamente, en el BM.
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Protocol
Se realizaron todos los procedimientos que implican el uso de animales con autorización de cuidado Animal y Use Comité de Indiana University School of Medicine. Asegurar que se adhieran a la legislación sobre experimentación animal del país donde se realiza el trabajo.
1. preparación de Mx1CreRBPJ- / - ratones receptores
- Cruzar ratones RBPJlox/lox ratones10 para obtener Cre Mx1 Mx1-Cre+ positivo RBPJlox/lox ratones12 y Mx1-Cre negativo hermanos de camada delox/lox RBPJ utilizar como controles. Verifique que el genotipo por PCR10.
- Use 6-8 semanas-viejo Mx1Cre+/RBPJlox/lox y Mx1Cre–/RBPJlox/lox ratones con realizar la inducción de polyI:C.
-
Inyectar polyI:C 200 μg i.p. en Cre+ y Cre– ratones. Dar una inyección de polyI:C diariamente durante 3 días la primera semana. Dar una inyección de polyI:C la segunda semana, 7 días después de la inyección anterior (cuatro inyecciones en total).
- Usar RBPJKO (inducida por Mx1Cre+/RBPJlox/lox) y RBPJWT (inducida por Mx1Cre–/RBPJlox/lox) ratones como destinatarios 3 semanas después de la última inyección de polyI:C.
Nota: Se recomienda utilizar ratones inducidos por pI: pC 3 semanas después de la inyección. La respuesta IFNα desencadenada por polyI:C induce cambios significativos en el BM, dando como resultado la expansión de immunophenotypic de HSC y disminución del gasto de progenitores maduros en la sangre periférica16,17. Representación de los subconjuntos hematopoyéticos es normalizados 3 semanas después de la inyección y los ratones pueden ser utilizados sin los efectos de confusión de la inflamación. Este protocolo de inducción ha sido optimizado para RBPJ. Si eliminar un gen distinto, el protocolo de inducción puede variar dependiendo de la construcción, y eliminación debe estar validada. Validamos la canceladura de ~ 100% de la región RBPJ entre loxP sitios por RT-PCR después de un total de cuatro inyecciones de polyI:C.
- Usar RBPJKO (inducida por Mx1Cre+/RBPJlox/lox) y RBPJWT (inducida por Mx1Cre–/RBPJlox/lox) ratones como destinatarios 3 semanas después de la última inyección de polyI:C.
2. preparación de células de Lys-EGFP donantes de médula ósea para el trasplante
- Eutanasia a un ratón de Lys-EGFP (dióxido de carbono seguido por dislocación cervical) 1 o 2 h antes del trasplante.
- Rocíe la superficie del cuerpo animal con etanol al 70%.
- Utilice tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la piel en ambas piernas alrededor del tobillo y con fórceps quirúrgico separe la piel y piel para exponer tejido muscular limpio.
- Utilice tijeras quirúrgicas para quitar tanto músculo de las piernas como sea posible. Utilizando unas tijeras, cortar los huesos (en la rodilla y la articulación del tobillo) y limpie cualquier tejido remanente del músculo de los fémures y tibias usando esponjas de Gasa. Coloque los huesos (dos fémures y dos tibias) en una placa de 6 pozos con DMEM 10% FBS.
- Machacar los huesos en un mortero con 10 mL frío 2mM EDTA PBS y pipetear las células de la médula ósea para poner las células en suspensión unicelular. También lavar los huesos con tiempos de 2 mM EDTA PBS 3 de cada lado con una jeringa de 1 mL.
- Filtro de las células de la médula ósea mediante el uso de un filtro de 70 μm en un tubo de centrífuga de 15 mL. Enjuague el filtro con 2-3 mL de PBS. Centrifugar las células a 10 min a 460 x g y resuspender las células en 10 mL de DMEM fresco 10% FBS.
- Contar las células de la médula ósea en un hemocitómetro y ajustar la concentración a 1.5 x 107 células/mL de IMDM sin suero. Utilice el 3 x 106 células por animal con un volumen de 200 μl. Células de aproximadamente 1/3 del total BM son células GFP + mieloides. Dejar las células en hielo hasta que esté listo para la inyección. Usar 0,5 x 105 células para determinar la expresión de GFP por FACS9.
3. médula ósea trasplante de Lys-GFP de células en ratones RBPJKO
- Refrenar el receptoras ratones en una jaula de pie. Irradiar a ratones con una dosis letal de radiación gamma (1.200 Rad) en un irradiador de 137 Cs. Utilizar un protocolo de dosis divididas: 900 rads en la noche seguido por 300 rads a la mañana siguiente (16 h aparte).
- Trasplante los ratones receptores RBPJWT y RBPJKO letalmente irradiados 5-6 h después de la segunda dosis de la radiación. BM de inyectar células de ratones de Lys-EGFP en una concentración de 3 x 106 células por animal vía cola inyección en la vena (ver detalles para la recolección de las células en la sección 2).
- Cohortes independientes de ratones trasplantados por IVFM en momentos diferentes de la imagen: 24 h y a las semanas 2, 4 y 6, como se describe a continuación (véase la sección 4 y 5 para en vivo imágenes de procedimiento).
4. quirúrgico preparación imagen Intravital
- Esterilizar los instrumentos quirúrgicos. Dos finas pinzas (una recta, un ángulo), un par de tijeras finas y un par de sostenedores de la aguja. Preparar el área operativa con todos los suministros necesarios para el procedimiento.
- Poner el ratón una inyección IP de ketamina anestésico cóctel (xilacina 2.5-5 mg/kg + acepromacina 1.0-2.5 mg/kg + ketamina 90-100 mg/kg) utilizando una jeringa de aguja de 26-28 G. Animal se monitorearán cada 15 min durante el procedimiento y anestesia se complementarán según sea necesario en 1/4 de la dosis original.
- Coloque el ratón sobre una fuente de calor adecuada (37 ° C almohada, animal protegido del contacto directo con el cojín de calefacción) y monitorear visualmente la frecuencia respiratoria.
- Controlar reflejos utilizando el dedo pizca de respuesta. Asegúrese que el animal esté completamente bajo anestesia antes de iniciar cualquier procedimiento quirúrgico.
- Uso un 26-28 calibre aguja jeringa darle ratones una inyección de vena de la cola de un marcador fluorescente vascular (dextrano, 100 μL de solución de 20 mg/mL).
- Aplicar ungüento oftálmico de veterinario en ambos ojos. Clip de la superficie dorsal de la cabeza del animal con cortauñas eléctricos pequeño. Aplicar una crema para esponjas de Gasa de uso 5 minutos retirar la crema y luego enjuague con una solución salina de la depilación. Preparar el cuero cabelludo limpio con alcohol al 70% utilizando un hisopo de algodón.
- Use finas pinzas y tijera para hacer una incisión en la piel pequeña de la línea media (10-20 mm) en el cuero cabelludo para exponer la superficie dorsal del cráneo subyacente. Utilizar seda quirúrgica de 5-0 colocar dos suturas de estancia en la piel a cada lado de la incisión, creando una aleta para dejar al descubierto la calota para la proyección de imagen.
- Coloque el ratón en su parte posterior y sumerja el cuero cabelludo expuesto en un plato de fondo de cristal con aceite de microscopio. Transportar al animal a la mutiphoton sala de proyección de imagen.
- Coloque el animal en la platina del microscopio con la bóveda craneal colocado sobre el plato de vidrio sobre el objetivo y luego cubrir con una 37cojín de calentamiento ° C (el animal debe ser protegido de contacto directo con el calor).
5. in Vivo proyección de imagen de alta resolución de la bóveda de ratón
- Utilizar un sistema confocal invertido modificado para la proyección de imagen multifotón (véase tablade materiales ). Siguientes instrucciones sintonizar un laser de 2 fotones a 830 nm, ponga un 20 X W, NA 0.95 objetivo en el pedazo de nariz de microscopio y comprobar la alineación de haz láser.
Nota: Sistemas de microscopio vertical son más comúnmente utilizados para estos estudios, pero también puede utilizarse un sistema invertido de multifotón. En este estudio, se utilizó un dispositivo estereotáctica personalizado diseño atraumático. Aunque hay varios dispositivos disponibles comercialmente estereotáctica para sistemas del microscopio vertical, no hay ningún dispositivo estereotáxicas comercialmente disponible para un sistema de microscopio invertido encaminado a lograr el cráneo de ratón. Como alternativa a un dispositivo estereotáctica personalizado, el cráneo puede fijarse en posición sobre el objetivo utilizando varios métodos de cinta o goma para la estabilidad. - Abra un software de adquisición de imagen. En la"adquisición" panel comprobar si se ha seleccionado un modo de análisis direccional. Configurar la velocidad de escaneo de 4 μs/píxeles, velocidad de fotogramas a 512 x 512 píxeles y zoom a 1,5. Seleccione el objetivo 20 X W Na 0.95 de la lista de disponibles lentes del objetivo para que coincida con la lente colocada en la boquilla.
- Acceder a la "lista de tinte» desde el panel de"Control de adquisición de imagen"y seleccione"Dos fotones". Abrir la ventana de "Luz camino y colorantes" y seleccione DM690 980 excitación DM. abierto el obturador de laser P 2 marcando la casilla de verificación en la unidad de láser 2. En la ventana "Controlador de microscopio", seleccione RDM690 espejo.
- Selecciona "Lámpara EPI", elegir cubo de epi-filtro B/G y enfocar el objetivo en la muestra para visualizar el flujo vascular y el nicho de la médula ósea bóveda craneal, utilizando como referencia la bifurcación de la vena central (a) y la sutura coronaria (b) (figura 2A).
-
Recoger imágenes usando el modo no descanned. Seleccione tres detectores externos: detector1 PMT para recoger señal SHG de colágeno (filtro de emisión - 430/100 nm), detector2 de GaAsP para recoger señal GFP (filtro de emisión - 525/50) y detector3 de GaAsP para recoger señal de dextrano TRITC (filtro de emisión - 605/90 nm).
- Realizar la proyección de imagen a una velocidad de exploración de 4μs/pixel con ningún promedio para minimizar la fototoxicidad. Recoger imágenes en un aumento de potencia y detector de láser constante ajustado para utilizar el rango dinámico completo del detector con mínima saturación.
- Recoger serie de secciones a través de la profundidad del tejido (60 x 1 μm Z stacks) de 6 regiones de la médula de la bóveda craneal. Utilizar la configuración de tamaño de paso de 1 μm, zoom de 1,5 y tamaño de fotograma de 512 x 512 píxeles (423 μm x 423 μm).
Nota: En general el tiempo total requerido para un ratón de la imagen es 1-1.5 h.
6. análisis cuantitativo
- Realizar las reconstrucciones de cuantificación y 3D de imagen utilizando un software de cuantificación y visualización de imagen 3D/4D dedicada según las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales). Visualizar interactivamente Z-pilas en 3D utilizando proyección de intensidad máxima (MIP), mezcla de alfa o algoritmos de renderizado de volumen de proyección de sombra.
- Segmento las células GFP utilizando el "módulo de segmentación de punto objeto". Aplicar el procesamiento aritmético de pila (resta de canal) para eliminar falsos positiva cuenta de células GFP (Esto elimina la señal de las células óseas mostrando fuerte fluorescencia en los canales rojos y verdes).
- Realizar segmentación de vasculatura y hueso superficie utilizando el módulo de la segmentación superficial. Si es necesario, calcular distancias de células a cualquiera de las anteriores superficies aplicando algoritmos de X-tension, denominadas "distancia de punto a la superficie".
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Representative Results
Cohortes de 2 RBPJKO y 2 RBPJWT beneficiarios se reflejada en una sesión de imágenes individual en diferentes puntos temporales: 24 h y 2, 4 y 6 semanas después del trasplante de las células del BM Lys-GFP (flujo de trabajo se ilustra en la figura 1A).
En cada ratón, se adquirieron imágenes de 6 regiones estándar de la bóveda de la BM, identificados por su posición en relación con la bifurcación de la vena central (figura 2A, un) y la sutura coronaria (figura 2A, b). Inyección de dextrano Texas-Red antes de la proyección de imagen permite la identificación de estos puntos de referencia y la selección de 6 regiones (figura 2A): parte superior izquierda, medio y derecho (UL, UM, UR) y abajo a la izquierda, medio y derecho (LL, LM, LR). 60 x 1 μm z-pilas se recogen de cada región y prestadas como 3D máxima intensidad de proyección (MIP), (figura 2B); 3-proyección de sombra, que incluye el componente óseo (gris) generado por la microscopia generación armónico (SHG) segundo sondeo organización de colágeno (figura 2); y por último, una imagen 3D, segmentado, que permite la cuantificación de las células y la medición de sus Distancias desde el hueso y los vasos (Figura 2D).
Debido a diferencias de potencial en las preferencias de recalada de células hematopoyéticas en las diferentes regiones de la bóveda craneal BM después del trasplante, es importante probar varias regiones en la bóveda de cada ratón. La figura 3 muestra un ejemplo de distribución de células en las 6 regiones analizadas en un RBPJWT y un receptor RBPJKO a las 2 semanas después de BMT (verde - gris-hueso, con células mieloides) utilizando algoritmo de renderizado 3D de proyección de sombra. Número de células por región varió de 64 a 258 en el ratón RBPJWT y 265 a 573 en el ratón RBPJKO. Resultados finales entonces se expresan como promedio de las 6 regiones analizados: número de células por región y ratón (promedio 135 en RBPJWT vs 469 en RBPJKO). Este experimento representativo indica que hay una variación más grande en la distribución de la célula por región en el RBPJWT que en el recipiente RBPJKO. Por otra parte, además de la variación encontrada en las regiones de la bóveda craneal en un ratón, que es común, existen variaciones entre ratones individuales dentro del mismo grupo. Por lo tanto, es importante que para cada punto del tiempo por lo menos 4 ratones son evaluados por experimento para obtener un mínimo de una total regiones de 24 a 30 para ser analizados por condición.
La figura 4 muestra la dinámica de expansión mieloide progenitor en un microambiente de BM defectuoso muesca, en comparación con el control de más de 6 semanas después del trasplante. En este experimento representativo, RBPJWT 8 y 8 ratones RBPJKO fueron trasplantados y reflejadas en los puntos de tiempo indicado (2 ratones RBPJWT y 2 ratones RBPJKO en cada momento). Figura 4A muestra una reconstrucción 3-d representante de 1 de 6 regiones adquirido. Se contaron las células en cada una de las 6 regiones y el número promedio de células o región de dos ratones en cada momento (total 12 regiones) se calculó para los receptores RBPJWT y RBPJKO (figura 4). Este análisis indica que: (i) las células donantes Lys-GFP en los receptores de RBPJWT y RBPJKO tienen una eficacia similar de autoguiados hacia el blanco; II) las células en los receptores RBPJKO amplían más rápidamente y son dos veces el número de células en los receptores RBPJWT en la semana 2 después de BMT; III) las células en los receptores de RBPJWT amplían más adelante y son 2 más altas que las células en los receptores de RBPJKO en la semana 4 después de BMT; y iv) el número de células en los receptores de RBPJWT y RBPJKO llegan a ser similares en la semana 6 después de BMT. Análisis de las células mieloides del donante en el PB indica una salida más alta de células mieloides de los destinatarios de la BM de RBPJKO que de los destinatarios de la BM de RBPJWT en la semana 4, en el momento cuando el BM de RBPJKO los ratones mostraron un menor contenido de células de Lys-GFP. El análisis combinado de células mieloides en el BM y de las células mieloides circulantes en la PB, indican que en el BM RBPJKO células de Lys-GFP microambiente ampliaran y están listas para movilizar más rápidamente. Análisis paralelo de la FACS de células Lys-GFP en huesos largos BM de los mismos ratones mostraron una tendencia similar a la observada por IVFM; sin embargo, las diferencias entre las condiciones fueron que menos pronunciada (Figura 4B).
Medición de la distancia de las células individuales de Lys-GFP de hueso o de la vasculatura se muestra en la figura 5. En este estudio representativo, se utilizó análisis de segmentación 3-d de la región de LM de la bóveda RBPJWT y RBPJKO a las 6 semanas de BMT (figura 5A). Cerca del hueso y los vasos se calcularon para cada celda de la región: 200 células en 255 células en RBPJKO y RBPJWT y por lo tanto, expresada como un promedio. El análisis muestra que las células de Lys-GFP localización a una distancia similar del hueso en los ratones RBPJWT y RBPJKO (11 μm), pero que residen más distante de la vasculatura en los ratones RBPJKO que en los ratones RBPJWT (15 μm vs 5 μm, respectivamente). Este resultado es interesante, como en el RBPJKO de ratones células GFP Lys movilizaron en la circulación más que en ratones RBJWT y sería así esperar localizar más cerca a los vasos. Sin embargo, es posible que la diferencia en la localización refleja una etapa diferente de la diferenciación de estas dos poblaciones (en RBPJWT y RBPJKO), un punto que no puede abordarse en este análisis. La importancia de este resultado se se seguimiento con un conjunto más amplio de las células en todas las 6 regiones y combinando análisis FACS.
En generales, menos resultados se obtienen cuando un pequeño número de regiones se analiza por ratón. Proyección de imagen es especialmente difícil en los primeros momentos después de BMT, como irradiación letal daña la vasculatura y fuga de dextrano de capilares reduce la definición de la imagen. Por lo tanto, es importante contar con un gran número de repeticiones, sobre todo en los primeros momentos.
SHG es una herramienta útil para la investigación de organización de la fibra de colágeno en 3D. Es un proceso óptico no lineal de segundo orden que origina estructuras tales como las fibras de colágeno que posee no centrosymmetry y un alto coeficiente no lineal de segundo orden. Cuando intensa luz incidente interactúa con estas estructuras, que genera luz al doble de la frecuencia incidente o media la longitud de onda incidente. Por lo tanto, no etiquetado es necesario para capturar señal SHG durante 2 fotones microscopía. Con 830 onda de excitación de nm, captamos la señal de la SHG en el canal azul con emisión filtro 430/100 nm.
Figura 1: Flujo de trabajo experimental. (A) ratones delox/lox inducción de Mx1-Cre/RBPJ para generar RBPJKO y RBPJWT ratones ~ 4 semanas antes de la proyección de imagen; (B) preparación de BM con células de ratones transgénicos GFP Lys; (C) trasplante de BM Lys-GFP de células en letalmente irradiados RBPJKO o RBPJWT los receptores; (D) IVFM del calvarium de ratón a las 24 h, 2, 4 y 6 semanas después de BMT, seguido de la eutanasia y el análisis del BM por FACS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: IVFM del nicho Vascular BM. (A) la imagen de mosaico multi-photon de calvarium de ratón de Lys-EGFP mostrando las 6 regiones estándar de proyección de imagen (UL: superior izquierdo, UM: medio superior, UR: arriba a la derecha, va: inferior izquierda, LM: baja media, LR: abajo a la derecha) (células mieloides; rojo, vasculatura; gris, hueso) 10 aumentos; (B-D) Detalle de nicho BM rendido como: MIP (B), (C) proyección de sombra 3-d, (D) imagen 3-d de segmentación. Imágenes se procesaron - utilizando un software de visualización y cuantificación de imagen 3D/4D dedicado (tabla 1). Barras de escala = 50 μm en B, C, D. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Engraftment de células mieloides en la semana 2. Imágenes de células de Lys-GFP (verde) y hueso superficial (gris) en las 6 regiones de BM del hueso de la bóveda craneal de un RBPJWT y un ratón RBPJKO (U: superior, L: izquierda, M: medio, R: derecho). Barras de escala = 50 μm. Gráficos de barras (derecha) indica el número de células contadas en cada región (gama RBPJWT 64-258; RBPJKO gama 265-573) y su promedio 135 STD +-73 y 469 STD +-121. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cinética de BMT Engraftment de células mieloides y siguiente de la salida. (A) células de imágenes de Lys-GFP (verde) y la superficie del hueso (gris) en una región representativa de la bóveda craneal de un ratón RBPJWT y RBPJKO en cada uno de los puntos del tiempo indicaron. Barras de escala = 50 μm; (B) Dot blots mostrar porcentaje de Lys-GFP de células positivas por citometría de flujo en el BM de los huesos largos del mismo ratón fotografiadas en vivo (arriba). (C) barras indican el promedio del número de células o región de 2 ratones (total 12 regiones) en cada punto del tiempo, +-línea estándar (D) el gráfico muestra veces incremento en el número total de neutrófilos (enumerados por contador celular) presentó en la PB de los ratones de la misma que en (A) en los puntos de tiempo indicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Localización de células mieloides en la BM relativa al hueso y a la vasculatura. (A) 3-segmentadas imágenes representativas de las células de Lys-GFP y vasculatura y células de Lys-GFP y hueso en la misma región del hueso de la bóveda craneal en los receptores de RBPJWT y RBPJKO en la semana 6 de BMT. Barras de escala = 50 μm. (B) gráfico de barras resume la distancia media en μm +-de células de la superficie del hueso o la vasculatura de SEM de Lys-GFP. Número de células se mide en: RBPJWT n = 200 células y RBPJKO n = 255 células. Distancia de las células de la vasculatura de Lys-GFP es mayor en RBPJKO que los ratones RBPJWT, p < 0.001 (prueba t de Student). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un diseño optimizado para estudiar la cinética del engraftment de células hematopoyéticas por microscopia Intravital de fluorescentes. En este estudio, la expansión de las células progenitoras mieloides en un BM de WT o en una muesca señalización defectuosa BM fue localizada en la bóveda ósea por células mieloides positivas siguientes de Lys-GFP después de BMT en recipientes RBPJWT o RBPJKO. Este enfoque se propone como un modelo que puede aplicarse para responder preguntas similares, por ejemplo: i) para determinar la extensión y localización en los nichos del BM de las células de otros linajes, como eritroide, linfoide o células megakaryocytic, utilizando células de un donante células hematopoyéticas con promotores específicos de linaje conduce GFP o rojo tomate; II) para evaluar diferentes determinantes micro-ambientales mediante otros KO específico o ratones transgénicos como receptores.
La fuerza de este protocolo de imagen en el hueso de la bóveda craneal, es que los hitos anatómicos utilizados para seleccionar las regiones de BM, bifurcación de la vena central y la sutura coronaria, se conservan razonablemente en todos los ratones, permitiendo coherencia entre individuo experimentos al renunciar el requisito de una etapa automatizada. Además, el uso del modelo GFP para rastrear las células hematopoyéticas demostró para ser muy eficaz, como GFP proporciona una señal estable en condiciones subóptimas, como después de la irradiación. Finalmente, describe la configuración de imagen, usando un microscopio invertido y un dispositivo estereotáctica personalizado en el que el ratón está en posición supina, grandemente reducir al mínimo los artefactos de respiración.
Dos aspectos de este diseño experimental, de aplicarse, podrían conducir a un uso más amplio y más eficaz de IVFM de la bóveda craneal. En primer lugar, será importante optimizar y estandarizar protocolos de longitudinal proyección de imagen que permite la observación del mismo ratón en momentos diferentes (desde el día 2 hasta varias semanas) después de la intervención (es decir, BMT o terapia) en lugar de utilizar cohortes independientes de ratones. Según este enfoque las condiciones apropiadas para la recuperación después de la cirugía y el uso de medidas para contrarrestar la inflamación, infección y cicatrización en el sitio de la proyección de imagen, su aplicación es actualmente limitado. En segundo lugar, será valioso para el desarrollo de una matriz de seguimiento de modelos de ratón con proteínas fluorescentes en células específicas del nicho de BM de linaje (vascular, endosteal, perivascular y neuronal) combinar funciones de las células hematopoyéticas con específicas características de los nichos de BM.
Proyección de imagen del hueso todavía tiene algunos retos y limitaciones en comparación con otros tejidos. Aunque el microscopio de dos fotones puede penetrar los tejidos en las profundidades de 100-1.000 micras, es todavía un desafío a la imagen a través de todo el espesor de los huesos de la bóveda craneal. Imágenes pierden calidad con el aumento de profundidad por lo que el protocolo aquí describe análisis fiable de las regiones de BM de pilas gruesas 60 micrones. Otro factor que puede resultar en imágenes subóptimas o inconsistencia es la curvatura del hueso de la bóveda craneal, que puede traer la imagen fuera de foco. Es crucial que el cráneo colocado perfectamente en el plato de vidrio sobre el objetivo, posiblemente con un dispositivo estereotáxicas. De hecho, es importante el tamaño del cráneo: cráneo de ratones muy jóvenes o demasiado pequeños no puede caber perfectamente en un determinado dispositivo estereotáxicas. Por ejemplo, el dispositivo utilizado aquí no cabe ratones menores de 6 semanas y menos de 20 g.
Una limitación adicional es que el sistema de imagen utilizado en este estudio se limita a 3 canales. Como el canal azul se asigna automáticamente a recoger no etiquetado basado en señal SHG del colágeno del hueso, sólo 2 canales están disponibles para el etiquetado de fluorescencia específica. Además, este sistema tiene una limitación de velocidad de 1 frame/s a 2 μs/pixel Moran tiempo y tamaño de fotograma de 512 x 512 píxeles, que no es ideal para procesos de dinámicos rápida (como medida del flujo sanguíneo y evaluación de la movilización de la célula en la corriente sanguínea).
Un desafío importante es que la irradiación realizó compromisos de BMT la integridad de la vasculatura. La fuga vascular presente en el BM después de la irradiación causa dificultades con segmentación/cuantificación de estructuras individuales, que pueden presentar dificultad en el análisis cuantitativo.
Por último, es importante considerar que la proyección de imagen de un ratón toma aproximadamente 1 hora, y el número de ratones que puede ser reflejada en un día dado es limitado (~ 4 a 6 ratones). Por lo tanto, aumento de tamaño de la muestra para obtener poder de análisis puede requerir múltiples experimentos independientes, que pueden aumentar la variabilidad.
Siguiendo este protocolo, el número de células hematopoyéticas células Lys-GFP+ detectadas por IVFM en el BM después de 24 h de BMT es ~ 30 células o región y es un número pequeño en comparación con la entrada inicial de células (3 x 106). Aunque parte de este problema es debido a célula captura en pulmón y hígado antes de autoguiado hacia el blanco a BM después de la inyección i.v., queda por explorar si existen regiones en la bóveda craneal que no sean los seleccionados donde las células trasplantadas Inicio en mayor eficiencia.
Autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células en el BM después de BMT son comúnmente seguidas por citometría de flujo medición de marcadores CD45.1/CD45.2, GFP, éster de succinimidyl Carboxyfluorescein (CFSE) o combinación de linaje y marcadores de células madre. El uso de IVFM, especialmente en los primeros momentos, hace disponible información única y adicional que no se puede proporcionar mediante citometría de flujo. Por ejemplo, a menudo no es fácil de distinguir por los acontecimientos de la FACS que son "células" de eventos que son "artefactos", en particular cuando se recoge un número bajo de eventos positivos (es decir, a las 24 h del BMT). IVFM proporciona información sobre la morfología y localización de las células que ayuda a esta distinción. Del mismo modo, análisis FACS de células hematopoyéticas BM cosechadas o chocar los huesos incluye células que ya estaban en circulación en el sistema vascular y las células que residían en el lugar. De hecho, IVFM permite la distinción y la evaluación de células dentro del nicho del BM y las células que se están movilizando en el torrente sanguíneo. Esta distinción es de gran valor al estudiar la cinética de autoguiado hacia el blanco, la localización, la diferenciación y la movilización en un modelo dado. Lo importante, IVFM puede proporcionar información sobre la posición de las células hematopoyéticas en comparación con las células del microambiente que constituyen un nicho específico.
Se han utilizado otros métodos utilizados para abordar la composición del nicho BM, tales análisis histológico. Comparación entre la microscopia intravital de la BM y el análisis histológico por microscopía confocal ha sido elegante y bien discutido por Lo Celso et al. 18.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La proyección de imagen se llevó a cabo en el centro de Indiana para microscopia biológica en la Universidad de Indiana, dirigido por el Dr. Ken Dunn. El dispositivo estereotáctica es un prototipo diseñado y realizado por Mark Soonpaa, Wells Center for Pediatric Research. Este trabajo fue financiado por NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), la investigación MPN Fundación (NC) y la colaboración de CTSI proyecto íntimamente/Notre Dame (NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2 x 2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28 g, 1/2 cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
References
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