Summary
İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.
Abstract
Kanıt artan o normal hematopoiesis kritik hematopoetik kök hücre (HSC) işlevleri1,2oransal özel hücresel nişler dahil farklı microenvironmental cues BM içinde düzenlenir gösterir. Nitekim, hematopoetik microenvironment daha ayrıntılı bir resim şimdi, endosteal ve endotel nişler normal HSC ve onların döl3,4,5 düzenlenmesi için işlevsel birimler şeklinde ortaya çıkmaktadır . Yeni çalışmalar Perivasküler hücreleri, adipositler ve bakımı ve HSC işlevi6,7,8düzenleyen nöronal hücre önemini ortaya koymuştur. Ayrıca, kanıt hücreleri farklı soy, Yani myeloid ve lenfoid hücrelerin, ev ve BM microenvironment içinde belirli niş yer alır. Ancak, tam eşleme BM microenvironment ve onun işgalcilere hala devam ediyor.
Lineage belirli floresan işaretçileri veya BM niş belirli hücreleri seçili molekülleri eksikliği için genetik olarak fareler ifade transgenik fare suşları are şimdi elde edilebilir. Knock-out ve modelleri, nakli yaklaşımlar, birlikte izleme soyu sağlamak bilgi özel "niş" rolünü iyileştirmek için fırsatın hücreleri gibi HSC, tanımlanmış hematopoetik nüfus için B-hücreleri, T-hücreleri, myeloid hücrelerin ve erythroid hücreleri. Bu strateji daha fazla hasta İki fotonlu mikroskobu kullanımını birleştirerek potentiated. Vivo içinde yüksek kararlılık düşsel ve 3-b BM hasta işlenmesini sağlayarak, Şimdi tam olarak nerede belirli hematopoetik alt kümeleri içinde BM ana sayfa ve zaman içinde kendi genişleme Kinetik değerlendirmek yerini belirleyebilirsiniz. Burada, Lys-GFP transgenik fareler (myeloid hücrelerin işaretleme)9 ve RBPJ knock-out fareler (kurallı çentik sinyal eksik)10 IVFM ile birlikte bir çentik arızalı BM microenvironment myeloid hücrelerin engraftment belirlemek için kullanılır.
Introduction
İntravital multiphoton Floresans mikroskobu (IVFM) yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı derin dokuların kadar görüntüleme için izin veren bir tekniktir güçlü görüntüleme doku bağlı olarak 1mm. Fare hasta uygulandığında, 60-100 mikron11' e non-invaziv bir şekilde hematopoetik hücrelerin içinde BM davranışını gözlemlemek izin verir. Bu yaklaşım burada normal Miyeloid ataları kurallı çentik sinyal eksik RBPJ BM knock-out farelerde engraftment Kinetik belirlemek için kullanılır.
Bizim grup son işten o arızalı kurallı çentik BM microenvironment yol miyoproliferatif benzeri hastalık12içinde sinyal gösterdi. Çentik sinyal kaybı DNA bağlayıcı etki RBPJ, nehrin aşağısında kurallı çentik sinyal, Rekombinasyon10indüklenen Mx1-Cre kullanarak, kritik transkripsiyon faktörü, koşullu silme tarafından elde edildi. Bu çalışmada, Mx1-Cre/RBPJfüme balığı/füme balığı fare modeli kullanılmıştır. Tüm çentik reseptörleri sinyal kaybı RBPJ DNA'ya bağlanıcı motif koşullu silinmesiyle sonuçlanır. Mx1-Cre modelinde, ifade birden çok organlar, kan hücrelerinde de stromal bileşenleri gibi hedeflenen gen silinmesi indüksiyon içinde kaynaklanan polyI:C İdaresi üzerine harekete geçirmek Mx1 organizatörü tarafından tahrik edilmektedir Cre BM, dalak ve karaciğer de dahil olmak üzere.
Mx1-Cre+/RBPJfüme balığı/füme balığı ve Mx1-Cre-/RBPJfüme balığı/füme balığı fare (Bu andan RBPJKO ve RBPJWT, sırasıyla gösterilir) polyI:C ile indüklenen öğrenirim ışınlanmış ve normal, vahşi türü hematopoetik hücreler ile nakledilmektedir. Hafta 4 nakli sonra başlayarak, RBPJKO alıcıları önemli lökositoz splenomegali tarafından takip geliştirdi. BM analizi 4 ve 6 hafta olmadığını göstermiştir RBPJKO fareler Miyeloid ataları artış yüzdesi BM hafta 8 nakli sonra ve daha sonra zaman noktalarda sunulan rağmen myeloid hücre içeriklerini kontrol RBPJWT göre çarpıcı farklılıklar alıcılar. BM microenvironment miyoproliferatif fenotip başlatılması üzerinde doğrudan etkisi olup olmadığını Mx1-Cre farklı hematopoetik organlarda ifade edilir aslında birlikte bu gözlem soru kaldırdı.
BM hastalığın gelişiminin kritik bir başlangıç sitesi olup olmadığını belirlemek için fare hasta IVFM BM nakli (BMT), RBPJ knock-out modeli ve izleme sistemi bir soyu ile birlikte kullanılmıştır. Transgenik fareler EGFP belirli lizozim organizatörü (Lys-GFP)9 kontrol altında ifade BM BMT sonra görüntüleme sırasında görüntülenmeyecektir donör hücreleri elde etmek için kullanılmıştır. Lizozim ifade myeloid hücrelerin belirli ve ortak Miyeloid yaratıcı (CMP) hücrelerden olgun granülosit13Lys-GFP işaretler.
Farklı zaman noktalarda BM IVFM Lys-GFP hücreleri benzer şekilde RBPJWT BM ve RBPJKO alıcıya bağlantılı ama genişletilmiş ve daha hızlı RBPJKO BM alıcıları engrafted gösterdi. Bu fark daha önceki zaman noktada (2. hafta) dramatik ve zamanla azalmıştır (hafta 4 ve 6). Ancak, daha sonra bu zaman noktalarda aynı alıcının hematopoetik kompartımanda değerlendirilmesi karton kapak dolaşan myeloid hücrelerin sayısı sürekli bir artış gösterdi ve RBPJKO fareler, hücreleri artan bir çıkışını gösteren dalak lokalize kan dolaşımı içine BM. Lys-GFP hücreleri yerelleştirme BM içinde transplante farelerin 6 hafta analizi myeloid hücrelerin RBPJKO microenvironment denetimdeki damarlara kadar uzak ikamet ortaya koydu.
Toplu olarak, bu belirli hayvan modelleri ile IVFM birlikte anlayışlar engraftment dynamics RBPJKO BM microenvironment myeloid hücrelerin içinde sağlanan. Deneysel tasarım ve kantitatif yaklaşım burada açıklanan benzer soruları gidermek için uygulanan bir paradigma olarak önerilmiştir. Örneğin, RAG1-GFP14 ya da Gata1-GFP15 fareler gibi modeller, izleme diğer hücre belirli lineage kullanımı lenfoid davranışını izin verebilir veya erythroid ataları, sırasıyla, BM içinde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar kullanımını içeren tüm yordamları kullanmak Komitesi, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi ve hayvan bakım onay ile gerçekleştirilmiştir. Hayvan deney çalışma yapılacağı yeri ülke mevzuatına uymak için emin olun.
1. Mx1CreRBPJ- / - alıcı fareler hazırlanması
- Mx1-Cre+ fareler Mx1-Cre elde etmek için RBPJfüme balığı/füme balığı fareler10 ile çaprazolumlu RBPJfüme balığı/füme balığı fareler12 ve Mx1-Cre negatif RBPJfüme balığı/füme balığı littermates denetimleri kullanmak için. Genotip PCR10tarafından doğrulayın.
- 6-8 hafta kullanın-eski Mx1Cre+/RBPJfüme balığı/füme balığı ve Mx1Cre-/RBPJfüme balığı/füme balığı fareler polyI:C indüksiyon gerçekleştirmek için.
-
PolyI:C 200 µg ı.p. Cre+ ve Cre- fareler enjekte. Bir polyI:C iğne 3 gündür ilk hafta her gün yapın. Bir polyI:C enjeksiyonu ikinci haftanın 7 gün önceki enjeksiyon (Toplam dört enjeksiyon) sonra yap.
- Kullanmak RBPJKO (Mx1Cre indüklenen+/RBPJfüme balığı/lox) ve RBPJWT (Mx1Cre indüklenen-/RBPJfüme balığı/lox) alıcılar 3 hafta sonra son polyI:C enjeksiyon olarak fareler.
Not: Bu 3 hafta sonra enjeksiyon PI: pC tarafından indüklenen fare kullanmak için tavsiye edilir. PolyI:C tarafından tetiklenen IFNα yanıt HSC immunophenotypic genişlemesi sonucunda BM, önemli değişikliklere neden olmaktadır ve olgun ataları çıkışını periferik kan16,17düşmüştür. Normalleştirilmiş 3 hafta sonra enjeksiyon ve fare-ebilmek var olmak kullanmak iltihap karıştırıcı etkileri olmadan hematopoetik alt kümeleri gösterimidir. Bu indüksiyon Protokolü RBPJ için optimize edilmiştir. Eğer farklı bir gen silme, indüksiyon Protokolü yapı bağlı olarak değişiklik gösterebilir ve silme doğrulanması gerekir. ~ %100 silme loxP siteler arasında RT-PCR tarafından sonra dört polyI:C enjeksiyonları toplam RBPJ bölgesinin geçerliliği.
- Kullanmak RBPJKO (Mx1Cre indüklenen+/RBPJfüme balığı/lox) ve RBPJWT (Mx1Cre indüklenen-/RBPJfüme balığı/lox) alıcılar 3 hafta sonra son polyI:C enjeksiyon olarak fareler.
2. nakli için hazırlık Lys-EGFP donör kemik iliği hücrelerinin
- Bir Lys-EGFP fare (karbon dioksit servikal çıkığı tarafından takip) ötenazi 1 veya 2 önce nakli s.
- Hayvan vücudun % 70 etanol ile sprey.
- Cerrahi makas kullanmak her iki ayak bileklerinden üzerinde bir cilt kesi yapmak ve cerrahi Forseps ile uzak deri ve kürk birlikte temiz kas dokusu ortaya çıkarmak için çekin.
- Cerrahi makas kadar kas mümkün olduğunca legs--dan kaldırmak için kullanın. Bir makas kullanırken, kemiklere (diz ve bilek) kesme ve uyluk ve gazlı bez sünger kullanarak yırtılmalarıteşhis kalan herhangi bir kas dokusu temiz. Kemikleri (iki uyluk ve iki yırtılmalarıteşhis) DMEM % 10 içeren bir 6-şey plaka yerleştirin FBS.
- 10 mL soğuk 2 mM EDTA PBS ve damlalıklı harçla kemiklerde hücreleri tek hücre süspansiyon getirmek için kemik iliği hücreleri ezmek. Alternatif olarak, kemikleri 2 mM EDTA PBS 3 kez ile her taraftan 1 mL şırınga ile yıkayın.
- Kemik iliği hücreleri bir 15 mL santrifüj tüpüne 70 µm filtre kullanarak filtre. 2-3 mL PBS filtresiyle durulayın. Hücre 10 dk 460 x g az aşağı spin, taze DMEM 10 mL hücrelerde % 10 resuspend FBS.
- Bir hemasitometre üzerinde kemik iliği hücreleri saymak ve konsantrasyon 1.5 x 107 hücre/mL IMDM serum olmadan için ayarlayın. 3 x 106 hücre, hayvan başına 200 µL hacmi ile kullanın. Toplam BM hücrelerinin yaklaşık 1/3 ü Miyeloid GFP + hücreler vardır. Hücreleri enjeksiyon için hazır kadar buz üzerinde bırakın. 0.5 x 105 hücreleri GFP ifade FACS9tarafından belirlemek için kullanın.
3. kemik iliği nakli Lys-GFP hücre içine RBPJKO fareler
- Bir pasta kafeste alıcı fareler dizginlemek. Öldürücü dozda gama radyasyon ile fareler ışınlatayım (1.200 Rad) bir Cs 137 irradiator üzerinde. Bir bölünmüş doz protokolünü kullanan: 900 rad akşam takip tarafından 300 rad ertesi sabah (16 h dışında).
- Öğrenirim radyoaktif RBPJWT ve RBPJKO alıcı fareler nakli 5-6 h sonra ikinci dozda radyasyon. BM enjekte hayvan ile kuyruk ven enjeksiyon (Bölüm 2 hücrelerinde hasat için detaylar See) başına 3 x 106 hücre bir konsantrasyon, Lys-EGFP fareler gelen hasat hücreleri.
- Görüntü farklı zaman noktalarda IVFM tarafından nakledilen farelerin bağımsız tabur: 24 h ve 2, 4 ve 6, açıklandığı gibi altı haftalıkken (4 ve 5 için yordam Imaging vivo içinde bölümüne bakın).
4. cerrahi hazırlık Intravital görüntüleme için
- Cerrahi aletler sterilize. İki güzel forseps (bir düz, açılı bir tane), ince makas ve iğne sahipleri bir çift bir çift. Yordam için gerekli tüm malzemeleri ile operatif alan hazırlamak.
- Fareyi bir IP iğne ketamin kokteyl anestezi (Xylazine 2.5-5 mg/kg + acepromazine 1.0-2.5 mg/kg + ketamin 90-100 mg/kg) 26-28 G iğne kullanarak. Hayvan her 15 dk işlem sırasında izlenecek ve anestezi özgün doz ¼, gerektiği gibi takıma.
- Fareyi bir uygun ısı kaynağı (37 ° C Isıtma yastığını, hayvan yastık Isıtma ile doğrudan temas korunuyorsunuz) yerleştirin ve görsel olarak solunum hızı izlemek.
- Ayak parmağı kullanarak refleksleri yanıt çimdik kontrol edin. Hayvan tamamen herhangi bir cerrahi işlemler başlamadan önce anestezi altında olduğundan emin olun.
- Kullanım bir 26-28 fareler bir kuyruk ven floresan vasküler işaretleyici (Dextran, 20 mg/mL solüsyon 100 μL) iğne için iğne şırınga ölçmek.
- Veteriner göz merhem her iki gözde için geçerlidir. Hayvanın kafası dorsal yüzeyi küçük elektrik makasları ile küçük. Epilasyon 5 dk. kullanım gazlı bez sünger krem kaldırmak ve serum durulama için krem uygulayın. Temiz kafa derisi bir pamuklu çubukla kullanarak % 70 alkol ile hazırlayın.
- Bir küçük deri Ensizyon (10-20 mm) yapmak için iyi forseps ve makas kafa derisi üzerinde temel dorsal kafatası yüzey göstermek için kullanın. 5-0 cerrahi ipek cilt kesi hasta görüntüleme için ortaya çıkarmak için bir flep oluşturma, her tarafında iki konaklama dikiş eklemenizi sağlar.
- Fareler onların arkasına getirin ve mikroskop yağ dolu bir cam alt tabak içinde maruz kafa derisi daldırın. Oda Imaging mutiphoton için hayvan taşıma.
- Hayvan hedefi yukarıda cam tabak üzerinde konumlandırılmış hasta ile mikroskop sahnesinde yerini ve 37 ile kapak° C Isıtma yastığını (hayvan gerekir korumalı gelen ısı ile doğrudan temas).
5. in Vivo fare hasta yüksek kararlılık düşsel
- Ters bir confocal sistemi multiphoton görüntüleme için kullanın ( malzemeler tablobakın). Aşağıdaki prosedürü yerine getirin ayarlamak için 830 2-Foton lazer nm, yerime gel 20 X W, NA 0,95 objektif lens mikroskop temizler ve onay lazer ışını hizalama.
Not: Dik mikroskop sistemleri en yaygın bu çalışmalar için kullanılır, ama ters bir multiphoton sistemi de kullanılan. Bu çalışmada, bir özel tasarlanmış Atravmatik stereotaksik cihaz kullanıldı. Birkaç ticari olarak mevcut stereotaksik aygıt dik mikroskop sistemler olmakla birlikte, piyasada bulunan hiçbir stereotaksik aygıtı için fare kafatası güvenliğini sağlama amaçlı bir ters mikroskop sistemi vardır. Alternatif olarak özel bir stereotaksik aygıt, kafatası istikrar için çeşitli bant veya yapıştırıcı yöntemler kullanan hedef konumda güvenli olabilir. - Bir görüntü alma yazılımını açın. "Satın alma ayarları" paneli kontrol edin tek yönlü tarama modunu seçtiyseniz. 4 μs/piksel, kare hızı 512 x 512 piksel için tarama hızını ayarlayın ve 1.5 için yakınlaştırma. 20 X W Na 0,95 amaç lenslerin kullanılabilir amaç yangın gövdeler içinde konumlandırılmış objektif eşleştirmek için listeden seçin.
- "Görüntü edinme kontrol" panelinde erişim "Boya listesi" ve "İki foton" seçin. "Işık yolu & boya" penceresini açın ve DM690-980 uyarma DM. açık 2 P lazer çekim 2 lazer birimi onay kutusunu işaretleyerek seçin. "Mikroskop denetleyicisi" penceresinde RDM690 mirror seçeneini seçin.
- "EPI lamba" seçin, B/G epi-filtre küp seçmek ve amaç vasküler akışı ve çatallanma Merkezi ven (a) ve (b) (şekil 2A) koroner dikiş referans olarak kullanarak hasta kemik iliği niş görselleştirmek için numune üzerine odaklanır.
-
Sigara descanned modu kullanarak görüntüleri toplamak. Üç harici dedektörleri seçin: kollajen SHG sinyal toplamak için Devresel_ödeme detector1 (emisyon filtre - 430/100 nm), GaAsP detector2 toplamak GFP sinyal (emisyon filtre - 525/50) ve TRITC-dextran sinyal toplamak için GaAsP detector3 (emisyon filtre - 605/90 nm).
- Görüntüleme yok fototoksisite en aza indirmek için ortalama ile 4μs/pixel inceden inceye gözden geçirmek oranında gerçekleştirmek. Görüntüleri değerinde bulmak en az doygunluk ile tam dinamik aralığını kullanmak için ayarlanmış sabit lazer güç ve Dedektör kazanç toplamak.
- Doku (60 x 1 mikron Z-yığınlar) derinliği aracılığıyla bölümleri dizi hasta kemik iliği 6 bölgelerden toplamak. 1 mikron, adım boyutu ayarlarını kullanın, 1.5 ve 512 x 512 piksel çerçeve boyutu (423 µm x 423 µm) zoom.
Not: Genel olarak 1-1.5 saat toplam süre bir fare görüntü için gerekli olduğunu.
6. kantitatif analiz
- Üreticinin talimatlarına göre özel 3D/4 D resim Nefelometri ve görselleştirme yazılımı kullanarak görüntü Nefelometri ve 3D rekonstrüksiyonlar gerçekleştirmek ( Malzeme tabloyabakın). Etkileşimli olarak Z yığınlarının maksimum yoğunluk projeksiyon (MIP) kullanan 3D Alfa-karıştırma veya gölge projeksiyon ses işleme algoritmaları gözünde canlandır.
- GFP hücreleri kullanarak segment "nokta nesne bölümleme modülü". Yanlış pozitif sayısı (Bu sinyal güçlü floresan yeşil ve kırmızı kanalları görüntüleme kemik hücrelerinin ortadan kaldırır) GFP hücrelerinin ortadan kaldırmak için yığın aritmetik işlemi (kanal çıkarma) uygulama.
- Segmentasyon damarlara ve kemik yüzeyi yüzey segmentlere ayırma modülünü kullanarak gerçekleştirin. Gerekirse, "mesafe yüzeye spot" denilen X-gerilim algoritmaları uygulayarak mesafeler hücre herhangi yukarıdaki yüzeylerin hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabur 2 RBPJKO ve 2 RBPJWT alıcıların farklı zaman noktalarda bir bireysel görüntüleme oturumda görüntüsü: 24 h ve 2, 4 ve 6 hafta sonra ( şekil 1A' iş akışı resimli) BM Lys-GFP hücre nakli.
Her fare görüntüleri Merkezi ven (şekil 2A, bir) ve koroner dikiş (şekil 2A, b) ile ilgili olarak bifurkasyon konumlarını tarafından tanımlanan BM hasta 6 standart bölgelerinden elde. Enjeksiyon Dextran Texas-kırmızı önce görüntüleme sağlar bu yerler tanımlaması ve 6 bölgeleri (şekil 2A) yelpazesi: sol üst, orta ve sağ (UL, UM, UR) ve sol alt, orta ve sağ (LL, LM, LR). 60 x 1 mikron z-yığınlar her bölgeden toplanan ve işlenen 3-b maksimal yoğunluk projeksiyon (MIP olarak), (şekil 2B); 3-b gölge izdüşüm, kemik bileşeni (gri) kolajen organizasyon (şekil 2C); sondalama ikinci harmonik üretimi (SHG) mikroskopi tarafından oluşturulan içerir ve Nefelometri hücre ve uzaklıkları kemik ve gemiler (şekil 2B) ölçümü sağlar son olarak, bir 3-b Segmented yansıması.
Organ nakli sonra BM hasta değişik bölgelerinde hematopoetik hücrelerin izleme tercihlerinde potansiyel farkları nedeniyle birden fazla her fare hasta bölgelerde örnek önemlidir. Şekil 3 2 hafta sonra BMT (yeşil - myeloid hücrelerin, gri-kemik) adlı bir RBPJWT ve bir RBPJKO alıcı analiz 6 bölgelerde hücre dağıtım örneği gösterir gölge projeksiyon 3D render algoritmasıyla. 64'e 258 RBPJWT Mouse ve 265 573 RBPJKO Mouse için değişiyordu bölge başına hücre sayısı. Kesin sonuçları daha sonra analiz 6 bölgeler ortalama sayısı ifade edilen: hücre bölge başına / fare (ortalama 135 RBPJKO RBPJWT vs 469) başına sayı. Temsilcisi bu deney hücre dağıtım RBPJWT RBPJKO alıcı içinde bölgede başına daha büyük bir varyasyon olduğunu gösterir. Ayrıca, ek olarak hasta bölgelerde yaygındır, bir fare içinde bulunan değişim biçimi vardır aynı grup içindeki bireysel fareler arasında. Böylece, her zaman noktası için koşul çözümlenmesi için bir toplam 24-30 bölgeleri en az elde etmek için deney başına en az 4 fareler değerlendirilir önemlidir.
Şekil 4 6 hafta sonra nakli denetimine göre çentik arızalı BM microenvironment myeloid yaratıcı genişleme dinamikleri gösterir. Temsilcisi bu deneyde, 8 RBPJWT ve 8 RBPJKO fareler nakledilen ve belirtilen süre noktalarda (2 RBPJWT fareler ve 2 RBPJKO fareler, her zaman bir noktada) görüntüsü. Şekil 4A elde 1, 6 bölge temsilcisi bir 3-b yeniden inşası gösterir. Hücreleri her 6 bölgede sayıldı ve hücre/bölge, her zaman bir noktada (Toplam 12 bölgede) iki farelerin ortalama sayısı RBPJWT ve RBPJKO alıcılarına (şekil 4 c) hesaplanır. Bu analiz gösterir: (i) RBPJWT ve RBPJKO alıcılar hücrelerde donör Lys-GFP var benzer bir yön belirleme verimliliği; II) RBPJKO alıcılar hücrelerinde daha hızla genişler ve hafta 2 BMT sonra iki kez RBPJWT alıcılar hücre sayısı altındadır; III) RBPJWT alıcılar hücrelerinde daha sonra genişletin ve Haftası 4 BMT sonra 2 kat RBPJKO alıcılar hücrelerinde daha yüksektir; ve IV) RBPJWT ve RBPJKO alıcılar hücre sayı haline benzer Haftası 6 BMT sonra. Analiz PB donör myeloid hücrelerin RBPJKO BM alıcılardan RBPJWT BM alıcılardan gelen myeloid hücrelerin daha yüksek bir çıkış Haftası 4, BM RBPJKO fareler Lys-GFP hücrelerinin bir alt içerik gösterdiğimde zaman gösterir. Kombine analizi myeloid hücre içinde BM ikamet ve Türkçe içinde dolaşan myeloid hücrelerin RBPJKO BM microenvironment Lys-GFP hücreleri genişletin ve daha hızlı harekete geçmeye hazır olduğunu gösterir. Uzun kemiklerin BM üzerinden aynı fare hücrelerinde Lys-GFP paralel FACS analizi bir eğilim IVFM tarafından gözlenen benzer gösterdi; Ancak, koşulları arasındaki farklar (şekil 4B) daha az belirgin edildi.
Bireysel Lys-GFP hücrelerden kemik veya damarlara mesafe ölçümü şekil 5' te gösterilen. Temsilcisi bu çalışmada, RBPJWT ve RBPJKO hasta BMT üzerinden 6 hafta LM bölgesinin 3-b segment analizi kullanılmıştır (şekil 5A). Kemik ve gemilerin bölgede her hücre için hesaplanan: 200 RBPJWT ve RBPJKO içinde 255 hücre hücreleri ve böylece, ortalama dile getirdi. Lys-GFP hücreler kemik RBPJWT ve RBPJKO fareler (11 mikron) içinde benzer bir mesafede yerelleştirmek ama onlar daha uzak damarlara gelen RBPJWT farelerde RBPJKO farelerde bulunması analiz göstermektedir (15 μm kalınlığında vs 5 mikron, sırasıyla). Bu sonuç RBPJKO Lys-GFP hücre içine RBJWT fareler daha fazla dolaşımda seferber ve böylece istiyorsunuz fareler daha yakın gemiler için yerelleştirmek için tahmin gibi merak uyandırıcı. Ancak, yerelleştirme farkı (in RBPJWT ve RBPJKO), bu iki popülasyonun farklılaşma farklı bir sahne yansıtır mümkündür bir nokta, bu analiz tarafından ele alınamaz. Bu sonuç önemini hücre tüm 6 bölgelerde ve FACS analiz birleştirerek daha büyük bir havuzu ile takip.
Bölgeler az sayıda fare analiz edilir, genel olarak, suboptimal sonuçlar alınır. Görüntüleme gibi öldürücü ışınlama damarlara zarar verir ve kaçağı dextran kılcal damarlar üzerinden görüntü tanımı azaltır BMT, takip erken zaman noktalarda özellikle meydan okuyor. Böylece, çok sayıda tekrarlar, özellikle en erken zaman noktalarda olması önemlidir.
SHG kollajen lif organizasyon 3D soruşturma için yararlı bir araçtır. Bu centrosymmetry sigara ve yüksek bir ikinci dereceden doğrusal olmayan katsayısı sahip kollajen lifler gibi yapılardan kaynaklanan bir ikinci dereceden doğrusal olmayan optik süreçtir. Yoğun olay ışık ile bu tür yapıların etkileşim kurduğunda, ışık iki kez olay sıklığı veya olay yarım dalga boyu oluşturur. Bu nedenle, hiçbir etiketleme sırasında 2-Foton mikroskobu SHG sinyal yakalamak için gereklidir. 830 nm uyarma dalgaboyu ile emisyon filtre 430/100 nm ile mavi kanaldaki SHG sinyal yakalamak.
Şekil 1: Deneysel iş akışı. (A)RBPJKO ve RBPJWT fareler ~ 4 hafta önceki görüntüleme; oluşturmak için indüksiyon, Mx1-Cre/RBPJfüme balığı/füme balığı fareler (B) hazırlık BM Lys-GFP transgenik fareler hücreleri; (C) ekimi, BM Lys-GFP hücreleri öğrenirim radyoaktif RBPJKO veya RBPJWT alıcılar; Fare hasta, 24 h, 2, 4 ve 6 hafta sonra BMT, ardından ötenazi ve FACS göre BM analiz (D) IVFM. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: IVFM BM vasküler niş. (A)mozaik çok foton görüntüsünü görüntüleme 6 standart bölgelerinde gösterilen Lys-EGFP fare hasta (UL: üst sol, UM: üst orta, UR: sağ üst, LL: alt sol, LM: düşük orta, LR: sağ alt) (yeşil, myeloid hücrelerin; kırmızı, damarlara; gri, kemik) 10 X büyütme; (B-D) BM niş ayrıntı işlenen olarak: MIP (B), (C) 3-b gölge izdüşüm, (D) 3-b segment oluşturma resim. Görüntüleri - bir adanmış 3D/4 D resim Nefelometri ve görselleştirme yazılımı (tablo 1) kullanarak işlendi. Ölçek çubukları 50 mikron B, C, d = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Myeloid hücrelerin Engraftment haftası 2. Lys-GFP hücreleri (yeşil) ve kemik görüntüleri (gri) bir RBPJWT ve bir RBPJKO fare (U: üst, sol L:, M: Orta, R: sağ) hasta kemiğinden 6 BM bölgelerde yüzey. Ölçek çubukları 50 mikron =. Çubuk grafikler (sağda) her bölgede (RBPJWT Aralık 64-258; sayılan hücre sayısını belirleyin RBPJKO 265-573 aralığı) ve onların ortalama sayısı 135 STD + /-73 ve 469 STD + /-121. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Myeloid hücrelerin Engraftment ve çıkış aşağıdaki BMT Kinetik. (A)Lys GFP görüntüleri hücreleri (yeşil) ve kemik yüzeyden (gri) bir temsilci bölgesinde bir RBPJWT ve RBPJKO fare her zaman Puan hasta belirtti. Ölçek çubukları 50 mikron; = (B) nokta Lys-GFP Akış Sitometresi içinde uzun kemiklerde aynı fare hasat BM tarafından pozitif hücrelerinin (üstte) vivo görüntüsü yüzdesini göstermek engelliyor. (C) çubuk grafikler hücre/2 fareler (Toplam 12 bölgede), her zaman bir noktada bölgede ortalama sayısını gösterir, standart (D) hattı + /-grafik kat artış aynı fareler karton kapak sunulan nötrofil (hücre sayaç tarafından numaralandırılan) toplam sayısını gösterir. daha içinde (A) belirtilen süre noktalarda. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Kemik ve damarlara BM göreli Myeloid hücrelerin yerelleştirme. (A)temsilcisi 3-b kesimli görüntülerini Lys-GFP hücreleri ve damarlara ve Lys-GFP hücreleri ve kemik RBPJWT ve RBPJKO alıcılar, BMT 6 haftadan içinde hasta kemik aynı bölgede. Ölçek çubukları 50 mikron =. (B) çubuk grafik özetler mikron Lys GFP SEM hücrelerden kemik yüzeyine veya damarlara +/-ortalama mesafe. Hücre sayısı ölçülen: RBPJWT n = 200 hücreleri ve RBPJKO n = 255 hücre. Lys-GFP hücrelerden damarlara mesafesindedir RBPJWT fareler, p RBPJKO içinde büyük < 0,001 (Öğrenci t-Testi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı hematopoetik hücrelerin engraftment Kinetik çalışmaya Intravital floresan mikroskopi tarafından en iyi duruma getirilmiş bir deneysel tasarım açıklar. Bu çalışmada, myeloid progenitör hücre WT BM veya arızalı BM sinyal bir çentik genişlemesi kemik hasta aşağıdaki Lys-GFP olumlu Miyeloid hücreleri tarafından BMT sonra RBPJWT veya RBPJKO alıcı takip edildi. Bu yaklaşım için adresi benzer sorular, örneğin uygulanabilir bir model olarak önerilmiştir: Ben) genişleme ve diğer soy BM nişler hücre yerelleştirme gibi belirlemek için lenfoid, erythroid veya megakaryocytic hücreleri donör hücreleri olarak kullanarak, hematopoetik hücrelerin lineage belirli rehberleri GFP veya domates kırmızısı sürüş taşıyan; II) alıcıların diğer belirli KO veya transgenik fareler kullanarak farklı mikro çevre belirleyicileri değerlendirmek için.
Bu görüntüleme protokol için hasta kemik gücüdür BM bölgeler, Merkezi ven ve koroner dikiş çatallanma seçmek için kullanılan anatomik yerlerinden makul birey arasında tutarlılığı izin tüm farelerde konservasyonu bir otomatik sahne şartı gittiğiniçin süre deneyler. Buna ek olarak, hematopoetik hücrelerin izlemek için GFP model kullanımı GFP suboptimal koşullarında istikrarlı bir sinyal gibi ışınlama sonra koşuluyla, çok etkili olduğu ortaya çıktı. Son olarak, bir ters mikroskobu ve fare sırtüstü pozisyonda olduğu özelleştirilmiş stereotaksik aygıt kullanarak görüntüleme ayarı açıklanır büyük ölçüde nefes eserler en aza indirmek.
İki yönü bu deneysel tasarım, Eğer uygulanabilirse, hasta IVFM daha geniş ve daha etkili kullanmak için neden olabilir. İlk olarak, en iyi duruma getirme ve boyuna görüntüleme (2. gün ile birkaç hafta)'dan farklı zaman noktalarda aynı fare gözlenmesi müdahaleden sonra (Yani BMT ya da terapi) kullanmak yerine sağlayan protokolleri standartlaştırmak önemli olacaktır farelerin bağımsız tabur kadar. Ameliyat sonrası kurtarma ve iltihap, enfeksiyon, karşı koymak ve sitesinde oluşumu görüntüleme yara izi için önlemler kullanımı için uygun koşullar bu yaklaşım gerektirir gibi onun şu anda sınırlı bir uygulamadır. İkinci olarak, BM niş belirli hücreleri floresan proteinler taşıyan fare modelleri izleme lineage bir dizi geliştirmek için değerli olacaktır (damar, endosteal, Perivasküler ve nöronal) hematopoietik hücre fonksiyonları özel ile birleştirmek için BM nişler özellikleri.
Görüntüleme kemik hala bazı sorunlar ve diğer dokulara göre sınırlamalar vardır. İki fotonlu mikroskop 100-1000 mikron derin dokulara nüfuz edebilir rağmen hasta kemik tüm kalınlığı ile görüntü hala zordur. Görüntüleri burada protokolünü güvenilir BM bölgeleri 60 mikron kalınlığında yığında analizini açıklar yüzden ile derinliği artan kalitesi kaybetmek. Tutarsızlık veya suboptimal görüntüleme ile sonuçlanabilir bir başka faktör görüntünün odağını getirebilir hasta kemik kavisli şekli olduğunu. Mükemmel cam tabak amacı, yukarıda üzerinde muhtemelen konumlandırılmış stereotaksik bir cihazla kafatası çok önemlidir. Nitekim, kafatası boyutu önemlidir: kafatası farelerin çok genç ya da çok küçük değil mükemmel bir verilen stereotaksik cihazda uygun. Örnek olarak, burada kullanılan aygıt fareler 6 hafta ve daha az 20 g genç uygun değil.
Bu çalışmada kullanılan görüntüleme sistemi 3 kanal için sınırlı bir ek kısıtlamadır. Mavi kanal otomatik olarak etiketleme tabanlı SHG sinyal kemik kollajen toplamak için atanmış olarak sadece 2 kanal belirli Floresans etiketleme için kullanılabilir. Ayrıca, bu sistem zaman ve hızlı dinamik işlemler (örneğin, kan akımı ve kan akışında hücre mobilizasyonu değerlendirilmesi ölçüsü) için ideal değildir 512 x 512 piksel kare boyutunu yaşamak 1 kare/s 2 μs/piksel bir hız sınırlaması vardır.
Işınlama için BMT uzlaşmalar Pres'teki bütünlüğünü gerçekleştirilen bir önemli sorundur. Vasküler sızıntı ışınlama sonra BM mevcut segmentasyon/Nefelometri kantitatif analiz zorluk-ebilmek poz vermek bireysel yapıları ile zorluğa neden oluyor.
Son olarak, tek bir fare görüntüleme yaklaşık 1 saat sürer ve bir gün içinde yansıma fareler sayısı sınırlıdır dikkate almak önemlidir (~ 4-6 fareler). Böylece, analiz güç elde etmek için örnek boyutu artış değişkenlik arttırabilirsiniz birden çok bağımsız deneyler gerektirebilir.
Bu iletişim kuralı hücreleri (3 x 106) ilk giriş için karşılaştırıldığında oldukça az sayıda hematopoetik hücreler BMT 24 h ~ 30 hücreler/bölge olup sonra IVFM yılında BM tarafından algılanan Lys-GFP+ hücrelerin sayısıdır. Bindirme akciğer hücre ve seçili olanlar dışında hasta bölgeler olup keşfedilmeyi posta damardan enjeksiyon takip BM için önce karaciğer, kalır nedeniyle bu sorunun bir parçası olmasına rağmen nerede nakledilen hücreler, daha yüksek ana sayfa verimlilik.
Sık posta ve hücreleri BMT sonra engraftment BM içine Akış Sitometresi tarafından CD45.1/CD45.2 işaretleri, ölçüm GFP, Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) veya soy ve kök hücre işaretleri kombinasyonu tarafından takip edilmektedir. IVFM, özellikle erken zaman noktalarında akış sitometresi tarafından sağlanan kullanılabilir benzersiz ve ek bilgileri kullanır. Örneğin, sık sık ne zaman olumlu olayların düşük bir sayı toplanır "eserler", özellikle olaylar "hücrelerden" FACS olaylar tarafından ayırt etmek kolay değil (Yani , BMT üzerinden 24 h). IVFM morfoloji ve bu ayrım AIDS hücreleri yerelleştirme hakkında bilgi sağlar. Benzer şekilde, FACS analiz BM hematopoetik hücrelerin kızarma veya kemikleri çökmesini hasat niş içinde bulunan hücreler ve damar sisteminde dolaşımda bulunan hücreler içerir. Gerçekten de, IVFM ayrım ve BM niş ve kan dolaşımına seferber hücreleri içinde dinlenme hücreleri değerlendirilmesi izin verir. Bu ayrım büyük posta, yerelleştirme, farklılaşma ve belirli bir modeli mobilizasyon Kinetik okurken değeridir. Önemlisi, IVFM göre belirli bir niş oluşturan microenvironment hücreleri hematopoetik hücrelerin konumunu benzersiz bilgiler sağlayabilir.
BM niş, histolojik böyle analiz bileşimi gidermek için kullanılan diğer yöntemler kullanılmaktadır. BM intravital mikroskobu ve histolojik analizi confocal mikroskobu ile arasında karşılaştırma iyice ve zarif Lo Celso vd tarafından tartışıldı 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Görüntüleme Indiana merkezinde Dr. Ken Dunn tarafından Yönetmen: Indiana Üniversitesi'nde biyolojik mikroskopi için gerçekleştirilmiştir. Stereotaksik aygıtı tasarlanmış ve Mark Soonpaa, Wells Pediatrik Araştırmaları Merkezi tarafından yapılan bir prototiptir. IUSM/Notre Dame (NC) proje NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN Araştırma Vakfı (NC) ve CTSI işbirlikçi, bu eser NIH/R01DK097837-09 (NC) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2 x 2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28 g, 1/2 cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
References
- Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
- Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
- Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
- Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
- Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
- Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
- Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
- Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).
