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Developmental Biology

Combinant la microscopie intravitale Fluorescent (IVFM) avec des modèles génétiques pour étudier la dynamique de la prise de greffe de cellules hématopoïétiques à des Niches de la moelle osseuse

Published: March 21, 2017 doi: 10.3791/54253
Automatic Translation
*1, *2, 3, 3
1Wells Center for Pediatric Research, Department of Pediatrics, Indiana University School of Medicine, 2Indiana Center for Biological Microscopy, Department of Medicine, Indiana University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Indiana University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

La microscopie intravitale fluorescence (IVFM) de la voûte crânienne est appliquée en combinaison avec des modèles animaux génétiques pour étudier la domiciliation et la greffe de cellules hématopoïétiques dans la moelle osseuse (BM) niches.

Abstract

Augmentant la preuve indique que l’hématopoïèse normale est régulée par des signaux micro-environnementales distinctes dans le BM, incluent des niches cellulaires spécialisés modulant critique de cellules souches hématopoïétiques (CSH) fonctions1,2. En effet, un tableau plus détaillé du microenvironnement hématopoïétique est maintenant émergents, où les endostéale et les niches endothéliales forment des unités fonctionnelles pour la réglementation des HSC normale et leurs descendants3,,4,5 . De nouvelles études ont révélé l’importance des cellules périvasculaires, les adipocytes et les cellules neuronales dans le maintien et la régulation HSC fonction6,7,8. En outre, il y a des preuves que les cellules de lignées différentes, c'est-à-dire des cellules myéloïdes et lymphoïdes, accueil et résident dans des créneaux précis dans le microenvironnement de la BM. Toutefois, une cartographie complète du microenvironnement de la BM et de ses occupants est toujours en cours.

Des lignées de souris transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents spécifiques de lignée ou des souris génétiquement modifiées pour manque de molécules sélectionnées dans des cellules spécifiques de la niche de la BM sont maintenant disponibles. Knock out et lignée suivi de modèles, en combinaison avec des approches de transplantation, fournissent l’occasion d’affiner les connaissances sur le rôle particulier « niche » cellules pour des populations hématopoïétiques définies, telles que HSC, lymphocytes B, lymphocytes T, cellules myéloïdes et cellules érythroïdes. Cette stratégie peut encore être potentialisée par la fusion de l’utilisation de la microscopie biphotonique de la voûte crânienne. En fournissant en vivo imagerie à haute résolution et rendu 3D de la voûte crânienne BM, nous pouvons maintenant déterminer précisément l’emplacement où des sous-ensembles spécifiques hématopoïétiques maison dans le BM et évaluer la cinétique de leur expansion au fil du temps. Ici, Lys-GFP souris transgéniques (marquage des cellules myéloïdes)9 et RBPJ souris knock out (manque de signalisation canonique de Notch)10 sont utilisés en association avec IVFM pour déterminer la prise de la greffe des cellules myéloïdes à un micro-environnement encoche de la BM défectueux.

Introduction

La microscopie intravitale fluorescence multiphotonique (IVFM) est une puissante technique d’imagerie qui permet l’imagerie haute résolution, en temps réel de tissus avec la profondeur jusqu'à 1mm, selon le tissu. Lorsqu’elle est appliquée à la voûte crânienne de souris, il permet d’observer le comportement des cellules hématopoïétiques au sein de la BM de manière non invasive vers le haut à 60-100 μm11. Cette approche est utilisée ici pour déterminer la cinétique de prise de greffe des progéniteurs myéloïdes normales dans les souris knock-out BM de RBPJ manque de signalisation canonique de Notch.

Des travaux récents de notre groupe a démontré cette signalisation Notch canonique défectueux dans le microenvironnement BM entraîne une maladie myéloproliférative semblable à12. Perte de la signalisation Notch a été obtenu par suppression conditionnelle de la domaine obligatoire d’ADN de RBPJ, le facteur de transcription critique en aval de la protéine Notch canonique, de signalisation, à l’aide de Mx1-Cre induite par recombinaison10. Dans cette étude, on a utilisé le modèle de souris delox/lox de Mx1-Cre/RBPJ. Suppression conditionnelle du motif de liaison à l’ADN de RBPJ entraîne la perte de la signalisation de tous les récepteurs Notch. Dans le modèle de Mx1-Cre, Cre expression est entraînée par le promoteur de Mx1 activé par voie de c résultant dans l’induction de la délétion de gène ciblé en cellules de sang ainsi que dans composants stromales d’organes multiples, y compris les BM, rate et le foie.

MX1-Cre+/RBPJlox/lox et Mx1-Cre–/RBPJlox/lox souris induite avec c (indiqué sur le connaissement comme RBPJKO et RBPJWT, respectivement) ont été mortellement irradiés et transplantées avec cellules hématopoïétiques normales, type sauvage. À partir de la semaine 4 après la transplantation, destinataires RBPJKO développé leucocytose importante suivie d’une splénomégalie. Bien que souris RBPJKO présenté augmentation du pourcentage des progéniteurs myéloïdes dans le BM en semaine 8 après la transplantation et à des moments plus tard, analyse de la BM aux semaines 4 et 6 n’ont pas révélé de différences marquantes dans leur contenu cellulaire myéloïde par rapport au contrôle RBPJWT bénéficiaires. Cette observation, combinée au fait que Mx1-Cre est exprimé dans les différents organes hématopoïétiques, a demandé si le microenvironnement de la BM avait un impact direct sur l’initiation du phénotype syndromes myéloprolifératif.

Pour déterminer si la BM a un site critique initial du développement de la maladie, IVFM de la voûte crânienne de souris a été utilisé en combinaison avec la BM transplantation (BMT), le modèle de knock out RBPJ et une lignée de système de suivi. Des souris transgéniques exprimant EGFP sous le contrôle du promoteur (Lys-GFP) lysozyme spécifique9 ont été utilisés pour obtenir des cellules du donneur qui pourraient être visualisés au cours de la BM d’imagerie après BMT. Expression de lysozyme est spécifique aux cellules myéloïdes et Lys-GFP marque cellules du progéniteur myéloïde commun (CMP) pour les granulocytes mature13.

IVFM de la BM à des moments différents a démontré que les cellules de Lys-GFP Hébergement de la même façon aux destinataires BM de RBPJWT et RBPJKO, mais développé et implanté plus rapidement chez les receveurs de BM de RBPJKO. Cette différence a été dramatique au point antérieur dans le temps (semaine 2) et diminuait avec le temps (semaines 4 et 6). Cependant, à ces moments plus tard, évaluation du compartiment hématopoïétique chez le receveur même a montré une augmentation constante du nombre de cellules myéloïdes circulant dans le PB et localisée dans la rate des souris RBPJKO, indiquant une augmentation de la production de cellules de la BM dans la circulation. Analyse de la localisation de cellules Lys-GFP dans le BM de souris transplantées à 6 semaines a révélé que les cellules myéloïdes résidaient plus éloigné de la vascularisation dans le microenvironnement de la RBPJKO que dans le contrôle.

Collectivement, la combinaison de IVFM avec ces modèles animaux spécifiques fournies aperçus dans la dynamique de la prise de greffe de cellules myéloïdes dans le microenvironnement RBPJKO BM. La conception expérimentale et l’approche quantitative décrit ici est proposé comme un paradigme qui peut être appliqué pour répondre à des questions similaires. Par exemple, l’utilisation d’une autre lignée de cellule spécifique suivi de modèles, tels que RAG1-GFP14 ou15 souris Gata1-GFP peut permettre à la suite du comportement de lymphoïdes ou progéniteurs érythroïdes, respectivement, à la BM.

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Protocol

Toutes les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été effectuées avec l’autorisation des utiliser Comité d’Indiana University School of Medicine et animalier. S’assurer qu’elle respecte la législation sur l’expérimentation animale du pays où le travail est exécuté.

1. préparation des Mx1CreRBPJ- / - souris destinataire

  1. Traverser la souris Mx1-Cre+ avec RBPJlox/lox souris10 pour obtenir Mx1-Crepositive RBPJlox/lox souris12 et Mx1-Cre négatif mêmelox/lox RBPJ à utiliser en tant que contrôles. Vérifiez le génotype par PCR10.
  2. Utiliser 6-8 semaines-vieux Mx1Cre+/RBPJlox/lox et Mx1Cre–/RBPJlox/lox souris pour effectuer l’induction c.
  3. Injecter c 200 µg i.p. Cre+ et Cre– souris. Donner une injection c tous les deux jours pendant 3 jours la première semaine. Donner une injection c la deuxième semaine, 7 jours après l’injection précédente (quatre injections au total).
    1. Utilisez RBPJKO (induite par Mx1Cre+/RBPJlox/lox) et RBPJWT (induit Mx1Cre–/RBPJlox/lox) souris comme bénéficiaires 3 semaines après la dernière injection de c.
      Remarque : Il est recommandé d’utiliser des souris induites par pI : pC 3 semaines après l’injection. La réponse de l’IFNα déclenchée par c induit des changements importants dans le BM, ayant pour résultat l’expansion immunophénotypiques des HSC et diminution du débit des progéniteurs matures dans le sang périphérique16,17. Représentation des sous-ensembles hématopoïétiques est normalisé à 3 semaines après que l’injection et les souris peuvent être utilisés sans les effets confondants de l’inflammation. Ce protocole d’induction a été optimisé pour RBPJ. Si la suppression d’un gène différent, le protocole d’induction peut varier en fonction de la construction, et la suppression doit être validée. Nous avons validé la suppression de ~ 100 % de la région RBPJ entre les sites loxP par RT-PCR après un total de quatre injections de c.

2. préparation des cellules de moelle osseuse pour le donateur Lys-EGFP destinés à la Transplantation

  1. Euthanasier un souris Lys-EGFP (dioxyde de carbone suivie par dislocation cervicale) 1 ou 2 h avant la transplantation.
  2. Vaporiser sur la surface du corps animal avec l’éthanol à 70 %.
  3. Utiliser des ciseaux chirurgicaux à faire une incision de la peau sur les deux jambes autour de la cheville avec une pince chirurgicale arracher la peau et fourrure pour exposer le tissu musculaire propre.
  4. Utiliser des ciseaux chirurgicaux pour retirer les jambes autant musculaire que possible. À l’aide d’une paire de ciseaux, couper les os (au genou et articulation de la cheville) et nettoyer n’importe quel tissu de muscle restants des fémurs et des tibias à l’aide de gaze éponges. Placer les os (deux fémurs et deux tibias) dans une plaque 6 puits contenant DMEM 10 % FBS.
  5. Broyer les os dans un mortier avec 10 mL froid 2mM EDTA PBS et pipette les cellules de la moelle osseuse pour mettre les cellules en suspension monocellulaire. Vous pouvez également rincer les os avec des temps de 2 mM EDTA PBS 3 de chaque côté avec une seringue de 1 mL.
  6. Filtrer les cellules de la moelle osseuse en utilisant un filtre de 70 µm dans un tube à centrifuger 15 mL. Rincer le filtre avec 2-3 mL de PBS. Tourner les cellules vers le bas de 10 min à 460 x g, remettre en suspension les cellules dans 10 mL de DMEM frais 10 % FBS.
  7. Compter les cellules de moelle osseuse sur un hémocytomètre et ajuster la concentration de 1,5 x 107 cellules/mL dans IMDM sans sérum. Utiliser 3 x 106 cellules / animal ayant un volume de 200 µL. Cellules d’environ 1/3 du total BM sont GFP + cellules myéloïdes. Laissez les cellules sur la glace jusqu’au moment de l’injection. Utilisation de 0,5 x 105 cellules afin de déterminer l’expression de la GFP par FACS9.

3. moelle osseuse Transplantation de cellules de Lys-GFP dans des souris RBPJKO

  1. Retenir le destinataires souris dans une cage de la tarte. Irradier la souris avec une dose mortelle de rayonnement gamma (1 200 Rad) sur un irradiateur Cs 137. Utiliser un protocole de dose de split : 900 rads le soir suivi par 300 rads le lendemain matin (16 h d’intervalle).
  2. Transplanter les mortellement irradiés souris destinataires, RBPJWT et RBPJKO 5-6 h après la deuxième dose de rayonnement. Injecter la BM cellules prélevées chez des souris de Lys-EGFP à une concentration de 3 x 106 cellules / animaux via queue injection dans la veine (voir détails pour la récolte des cellules à l’article 2).
  3. Cohortes indépendantes des souris transplantées par IVFM à des moments différents de l’image : 24 h et à la semaine 2, 4 et 6, comme décrit ci-dessous (voir la section 4 & 5 pour in vivo procédure d’imagerie).

4. chirurgie préparation pour l’imagerie intravitale

  1. Stériliser les instruments chirurgicaux. Deux fines pinces (une Quinte, un angle), une paire de ciseaux fines et une paire de porte-aiguilles. Préparez la zone opératoire avec toutes les fournitures nécessaires à la procédure.
  2. Donnez la souris une injection Intrapéritonéale de kétamine anesthésique cocktail (Xylazine 2,5 à 5 mg/kg + acépromazine 1,0 à 2,5 mg/kg + kétamine 90-100 mg/kg) à l’aide d’une seringue à aiguille 26-28 G.  Animal se fera toutes les 15 min pendant la procédure et anesthésique sera complété si nécessaire à un quart de la dose originale.
  3. Placez la souris sur une source de chaleur appropriée (coussin chauffant de 37 ° C, animal protégé contre les contacts directs avec le coussin chauffant) et surveiller visuellement la fréquence respiratoire.
  4. Vérifier la réponse de pincement de réflexes à l’aide de l’orteil. Veiller à ce que l’animal est complètement sous anesthésie avant d’entamer toute procédure chirurgicale.
  5. Utilisez un 26-28 calibre aiguille seringue pour donner des souris une injection dans la veine queue d’un marqueur fluorescent vasculaire (Dextran, 100 μL de solution de 20 mg/mL).
  6. Appliquer pommade ophtalmique vétérinaire sur les deux yeux. Inciser la surface dorsale de la tête de l’animal avec une petite tondeuse électrique. Appliquer une épilation crème pour 5 min. utilisation gaze éponges pour enlever la crème et ensuite rincer avec du sérum physiologique. Préparer le cuir chevelu propre avec de l’alcool 70 % à l’aide d’un coton-tige.
  7. Utilisez fines pinces et ciseaux à faire une incision de la peau de petites médiane (10-20 mm) sur le cuir chevelu pour exposer la surface dorsale crâne sous-jacente. 5-0 soie chirurgicale permet de placer deux sutures de séjour dans la peau de chaque côté de l’incision, créant un lambeau pour exposer la voûte crânienne pour l’imagerie.
  8. Positionnez les souris sur leur dos et submerger l’exposés du cuir chevelu dans un fond plat en verre rempli d’huile de microscope. Le transport de l’animal à la mutiphoton salle d’imagerie.
  9. Placez l’animal sur la platine du microscope avec la voûte crânienne positionné sur le plat de verre au-dessus de l’objectif et puis couvrir avec un 37coussin chauffant ° C (les animaux doit être protégé contre un contact direct avec la chaleur).

5. in Vivo imagerie à haute résolution de la voûte crânienne de souris

  1. Utiliser un système confocal inversé modifié pour l’imagerie multiphoton (voir la Tablede matières ). Instructions du fabricant suivant tune un laser 2 photons à 830 nm, placez une 20 W X, NA 0,95 objectif dans le morceau de nez de microscope et vérifier l’alignement du faisceau laser.
    NOTE : Systèmes de microscope droit sont plus couramment utilisés pour ces études, mais un système multiphoton inversé peut également être utilisé. Dans cette étude, un appareil stéréotaxique atraumatique conçu personnalisé a été utilisé. Il existe plusieurs dispositifs stéréotaxiques commercialement disponibles pour les systèmes de microscope vertical, il n’y a aucun appareil stéréotaxique commercialement disponible pour un système de microscope inversé qui vise à assurer le crâne de souris. Comme alternative à un appareil stéréotaxique personnalisé, le crâne peut être fixé en position au-dessus de l’objectif en utilisant diverses méthodes de ruban ou de la colle pour la stabilité.
  2. Ouvrez un logiciel d’acquisition image. Dans les « paramètres d’Acquisition » panneau de vérifier si un mode de balayage directionnel est sélectionné. Configurer la vitesse de balayage de 4 μs/pixel, cadence à 512 x 512 pixels et zoom à 1,5. Sélectionnez 20 objectif Na W X 0,95 dans la liste des objectifs disponibles pour assortir la lentille placée dans l’embout.
  3. Accéder à la liste « colorant » de le « Image Acquisition » panneau de configuration et sélectionnez « Deux photons ». Ouvrez la fenêtre « Chemin de lumière & colorants », puis sélectionnez excitation DM690-980 DM. ouvrir l’obturateur de laser 2p en cochant la case à cocher dans l’appareil Laser 2. Dans la fenêtre de « Contrôleur de Microscope », sélectionnez RDM690 miroir.
  4. Sélectionnez « EPI LAMP », choisissez cube epi-filtre B/G et concentrer l’objectif sur le spécimen de visualiser le flux vasculaire et le créneau de la moelle osseuse voûte crânienne, en utilisant comme référence la bifurcation de la veine centrale (a) et la suture coronaire (b) (Figure 2 a).
  5. Recueillir les images en mode non-descanned. Sélectionnez les trois détecteurs externes : PMT detector1 de recueillir le signal SHG de collagène (filtre d’émission - 430/100 nm), GaAsP detector2 à frais virés GFP signal (filtre d’émission - 525/50) et detector3 GaAsP de recueillir le signal de TRITC-dextran (filtre d’émission - 605/90 nm).
    1. Effectuer la formation image à une vitesse de balayage de 4μs/pixel avec aucun étalement pour minimiser la phototoxicité. Recueillir les images à un gain de puissance et détecteur laser constant ajusté pour utiliser la plage dynamique complète du détecteur avec saturation minimale.
    2. Recueillir série des sections par le biais de la profondeur du tissu (60 x 1 μm Z-stacks) de 6 régions de moelle osseuse voûte crânienne. Utilisez les paramètres de taille d’étape de 1 μm, zoom 1,5 et taille d’image de 512 x 512 pixels (423 µm x 423 µm).
      Remarque : Dans l’ensemble temps total nécessaire à l’image d’une souris est 1 à 1,5 h.

6. Analyse Quantitative

  1. Effectuer des reconstructions de quantification et 3D image en utilisant un logiciel de visualisation et d’analyse quantitative dédié image 3D/4D selon les instructions du fabricant (voir Table des matières). Visualiser interactivement Z-piles en 3D utilisant la Projection maximale d’intensité (MIP), alpha-blend ou algorithmes de rendu volume shadow projection.
  2. Segmenter les cellules GFP en utilisant le "module de segmentation Spot objet ». Appliquer le traitement arithmétique de la pile (soustraction de canal) pour éliminer les faux positif compte de cellules GFP (cela élimine les signaux des cellules osseuses affichant forte fluorescence dans les canaux vert et rouge).
  3. Effectuer la segmentation de surface système vasculaire et l’OS en utilisant le module de Surface de segmentation. Le cas échéant, calculer les distances des cellules à l’une des surfaces ci-dessus en appliquant des algorithmes de X-tension appelées « distance de spot à surface ».

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Representative Results

Cohortes de 2 RBPJKO et 2 RBPJWT bénéficiaires ont été photographiés dans une session individuelle d’imagerie à des moments différents : 24h et 2, 4 et 6 semaines après la transplantation de cellules BM Lys-GFP (flux de travail est illustré dans la Figure 1 a).

Dans chacune des souris, les images ont été acquises de 6 régions standards de la voûte crânienne BM, identifiées par leur position par rapport à la bifurcation de la veine centrale (Figure 2 a, a) et la suture coronaire (Figure 2 a, b). Injection de Dextran Texas-rouge avant l’imagerie permet l’identification de ces repères et la sélection des 6 régions (Figure 2 a) : en haut à gauche, médium et droit (UL, UM, UR) et en bas à gauche, milieu et droite (LL, LM, LR). 60 x 1 μm z-piles seront prélevés dans chaque région et rendus en 3D Maximal intensité Projection (MIP), (Figure 2 b) ; 3D Projection d’ombre, qui inclut la composante osseuse (grise) générée par la microscopie de génération d’harmoniques (SHG) deuxième sondage Organisation de collagène (Figure 2) ; et enfin, une image segmenté 3D, qui permet la quantification des cellules et la mesure de leurs distances de l’os et les vaisseaux (Figure 2D).

En raison de différences de potentiel dans les préférences de radioralliement de cellules hématopoïétiques dans les différentes régions de la voûte crânienne BM après la transplantation, il est important de goûter plusieurs régions dans la voûte crânienne de chaque souris. La figure 3 montre un exemple de distribution de cellules dans 6 régions analysées dans un RBPJWT et un récipiendaire de le RBPJKO 2 semaines après le BMT (vert - cellules myéloïdes, gris-OS) utilisant l’algorithme de rendu 3D projection ombre. Nombre de cellules par région comprise entre 64 à 258 chez la souris RBPJWT et de 265 à 573 chez la souris RBPJKO. Résultats finaux sont alors exprimées en nombre moyen de 6 régions analysées : nombre de cellules par région / par souris (moyenne 135 en RBPJWT contre 469 en RBPJKO). Cette expérience de représentant indique qu’il y a une plus grande variation dans la distribution de la cellule par région dans la RBPJWT que chez le receveur RBPJKO. En outre, en plus de la variation dans les régions de la voûte crânienne dans une souris, ce qui est fréquent, il existe des variantes chez les souris individuels au sein du même groupe. Ainsi, il est important que pour chaque point dans le temps au moins 4 souris sont évalués par expérience pour obtenir un minimum d’un total 24 à 30 régions à être analysé par l’État.

La figure 4 montre la dynamique d’expansion progéniteur myéloïde dans un micro-environnement encoche de la BM défectueux par rapport au témoin de plus de 6 semaines après la transplantation. Dans cette expérience de représentant, 8 RBPJWT et 8 RBPJKO souris ont été transplantés et imagées aux points heure indiquée (2 souris RBPJWT et 2 RBPJKO souris à chaque point dans le temps). Figure 4 a montre une reconstitution 3D représentative de 1 sur 6 régions acquises. Cellules dans chacune des 6 régions ont été dénombrés et le nombre moyen de cellules/région de deux souris à chaque fois (totales 12 régions) a été calculé pour les bénéficiaires de le RBPJWT et RBPJKO (Figure 4). Cette analyse indique que : (i) cellules donneuses Lys-GFP chez des receveurs de RBPJWT et RBPJKO ont un rendement de radioralliement similaire ; II) des cellules chez les receveurs RBPJKO développer plus rapidement et sont deux fois le nombre de cellules chez les receveurs RBPJWT à la semaine 2 après BMT ; III) cellules chez des receveurs de RBPJWT développer plus tard et sont 2 fois plus élevées que les cellules chez des receveurs de RBPJKO à la semaine 4 après BMT ; et iv) nombre de cellules chez les receveurs des RBPJWT et RBPJKO deviennent semblables à la semaine 6 après BMT. L’analyse des cellules myéloïdes donneur dans le PB indique un rendement plus élevé de cellules myéloïdes auprès des bénéficiaires de la BM de RBPJKO qu’auprès des bénéficiaires de la BM de RBPJWT à la semaine 4, au moment où les souris de la BM de RBPJKO ont montré une teneur plus faible de cellules de Lys-GFP. L’analyse combinée des cellules myéloïdes résidents dans le BM et des cellules myéloïdes circulant dans le PB, indiquent que la BM RBPJKO cellules de Lys-GFP microenvironnement élargir et sont prêts à mobiliser plus rapidement. Analyse de FACS parallèle des cellules de la Lys-GFP dans les os longs BM des souris mêmes montre une tendance similaire à celle observée par IVFM ; Toutefois, les différences entre les conditions étaient que moins prononcés (Figure 4 b).

Mesure de la distance des cellules individuelles de Lys-GFP de l’os ou le système vasculaire est illustré à la Figure 5. Dans cette étude représentative, analyse par segmentation 3D de la région de LM de RBPJWT et RBPJKO de voûte crânienne à 6 semaines de BMT a été utilisé (Figure 5 a). Distance de l’os et les vaisseaux ont été calculés pour chaque cellule dans la région : 200 cellules RBPJWT et 255 cellules en RBPJKO et ainsi, exprimées en moyenne. L’analyse montre que les cellules de la Lys-GFP localiser à la même distance de l’os chez les souris RBPJWT et RBPJKO (11 μm), mais qu’ils résident plus éloigné de la vascularisation chez les souris RBPJKO que chez les souris RBPJWT (15 μm vs 5 μm, respectivement). Ce résultat est fascinant, comme dans la RBPJKO souris mobilisent dans la circulation plus que chez les souris RBJWT cellules de Lys-GFP et seraient donc s’attendre à localiser plus près aux navires. Cependant, il est possible que la différence de localisation correspond à une étape différente de la différenciation de ces deux populations (voir RBPJWT et RBPJKO), un point qui ne peut pas être résolu par cette analyse. L’importance de ce résultat va être suivi avec un plus grand bassin de cellules dans les 6 régions et en combinant l’analyse FACS.

On obtient des résultats dans l’ensemble, pas optimale lorsqu’un petit nombre de régions est analysé par la souris. L’imagerie est particulièrement difficile aux points temps précoce après BMT, comme l’irradiation mortelle endommage le système vasculaire et fuite de dextran de capillaires réduit la définition d’image. Ainsi, il est important d’avoir un grand nombre de répétitions, surtout dans les premiers points dans le temps.

SHG est un outil utile pour étudier l’organisation de fibres de collagène en 3D. C’est un processus optique non linéaire de second ordre qui provient des structures telles que les fibres de collagène, possédant non-centrosymétrie et un fort coefficient non linéaire de second ordre. Lors de l’intense lumière incidente interagit avec ces structures, il génère de la lumière à deux fois la fréquence d’incidents ou de moitié la longueur d’onde incidente. Par conséquent, aucun étiquetage n’est nécessaire afin de capter le signal SHG pendant 2 photons microscopie. Avec 830 longueur d’onde excitation nm, nous captons le signal SHG dans la couche bleue avec émission filtre 430/100 nm.

Figure 1
Figure 1 : Expérimental Workflow. (A) sourislox/lox Induction de Mx1-Cre/RBPJ pour générer l’imagerie préalable ~ 4 semaines RBPJKO et RBPJWT à souris ; (B) préparation de la BM les cellules de souris transgéniques de Lys-GFP ; (C) Transplantation de BM Lys-GFP cellules mortellement irradiés de RBPJKO ou de RBPJWT bénéficiaires ; IVFM (D) de la voûte crânienne souris après 24 h, 2, 4 et 6 semaines après BMT, suivie de l’euthanasie et l’analyse de la BM de FACS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : IVFM de la Niche vasculaire BM. (A) image de multiphotonique mosaïque de la voûte crânienne la souris du Lys-EGFP montrant les 6 régions standards de l’imagerie (UL : supérieure gauche, UM : moyenne supérieure, UR : haut à droite, LL : inférieur gauche, LM : Lower middle, LR : en bas à droite) (cellules myéloïdes, verts, rouge, système vasculaire ; gris, OS) Grossissement de 10 X ; (B-D) Détail de créneau BM rendu sous la forme : MIP (B), (C) Projection d’ombre 3D, image en Segmentation 3D (D). Des images ont été traitées - en utilisant un logiciel de visualisation et de quantification des dédié image 3D/4D (tableau 1). Barreaux de l’échelle = 50 μm à B, C, D. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Greffe de cellules myéloïdes à la semaine 2. Images de cellules de Lys-GFP (verts) et d’os de surface (gris) dans les régions de BM 6 de l’os de la voûte crânienne d’un RBPJWT et une souris RBPJKO (L: gauche, sup : semelle, m : moyen, R: droit). Barreaux de l’échelle = 50 μm. Graphiques à barres (à droite) indiquent le nombre de cellules comptées dans chaque région (gamme RBPJWT 64-258 ; RBPJKO fourchette 265-573) et leur nombre moyen 135 de STD + /-73 et 469 STD +/-121. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Cinétique de greffe de cellules myéloïdes et sortie suit BMT. (A) cellules de Images de Lys-GFP (verts) et la surface osseuse (gris) dans une région représentative de la voûte crânienne d’une souris RBPJWT et RBPJKO à chacun des points de temps indiquent. Barreaux de l’échelle = 50 μm ; (B) Dot blots Voir la pourcentage de Lys-GFP positives cellules par cytométrie de flux au sein de la BM des os longs-récoltées dans la même souris image in vivo (ci-dessus). (C) graphiques à barres indiquent nombre moyen de cellules/région 2 souris (totales 12 régions) à chaque instant, +/-STD (D) ligne graphique présente multiplication du nombre des neutrophiles (énumérés par compteur de cellules) présentée dans le PB des mêmes souris que dans la (A) dans les points de l’heure indiquée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Localisation des cellules myéloïdes in the Relative de la BM à l’os et à la vascularisation. (A) 3D segmentés images représentatives de cellules de Lys-GFP et système vasculaire et cellules de Lys-GFP et os dans la même région de l’os de la voûte crânienne chez les receveurs RBPJWT et RBPJKO à la semaine 6 du BMT. Barreaux de l’échelle = 50 μm. (B) barre graphe résume la distance moyenne en μm +/-cellules SEM de Lys-GFP de la surface de l’os ou le système vasculaire. Nombre de cellules mesuré en : n RBPJWT = 200 cellules et RBPJKO n = 255 cellules. Distance des cellules de la Lys-GFP de la vascularisation est supérieur à RBPJKO souris RBPJWT, p < 0,001 (test t de Student). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit un modèle expérimental optimisé pour étudier la cinétique de prise de greffe de cellules hématopoïétiques de la microscopie intravitale fluorescentes. Dans cette étude, l’expansion des cellules myéloïdes progénitrices dans un BM WT ou dans une encoche de signalisation défectueux BM a été suivie dans la voûte crânienne osseuse de cellules myéloïdes de Lys-GFP positives suivantes après les OGEC dans RBPJWT ou RBPJKO destinataires. Cette approche est proposée comme un modèle qui peut être appliqué à adresser des questions similaires, par exemple : J’ai) pour déterminer l’extension et la localisation dans les niches de la BM de cellules des autres lignées, tels qu’érythroïdes lymphoïdes, ou cellules megakaryocytic, en utilisant comme cellules donneuses cellules hématopoïétiques portant des instigateurs spécifique de lignée conduite GFP ou tomate-rouge ; II) d’évaluer les différents déterminants micro-environnementales en utilisant les autres KO spécifique ou les souris transgéniques comme bénéficiaires.

Force de ce protocole d’imagerie dans l’os de la voûte crânienne, c’est que les points de repère anatomiques permet de sélectionner les régions de BM, bifurcation de la veine centrale et la suture coronaire, sont raisonnablement conservées chez toutes les souris, permettant la cohérence entre les individus expériences tout en renonçant à l’exigence d’un stade automatisé. En outre, l’utilisation du modèle pour effectuer le suivi des cellules hématopoïétiques GFP s’est avérée très efficace, GFP a prévu un signal stable dans des conditions sous-optimales, comme après l’irradiation. Enfin, l’installation d’imagerie décrite, à l’aide d’un microscope inversé et un appareil stéréotaxique personnalisé dans lequel la souris est en décubitus dorsal, minimiser grandement les artefacts respiratoires.

Deux aspects de cette conception expérimentale, si mis en œuvre, pourraient conduire à une utilisation plus large et plus efficace des IVFM de la voûte crânienne. Tout d’abord, il sera important d’optimiser et uniformiser les procédures de longitudinale d’imagerie permettant l’observation de la souris même à des moments différents (du jour 2 à plusieurs semaines) après intervention (c.-à-d. BMT ou thérapie) au lieu d’utiliser cohortes indépendantes des souris. Comme cette approche exige des conditions appropriées pour la récupération après la chirurgie et l’utilisation de mesures visant à lutter contre l’inflammation, infection et formation sur le site de l’imagerie de la cicatrice, son application est actuellement limitée. En second lieu, il sera utile d’élaborer un tableau de lignée suivi de modèles murins transportant des protéines fluorescentes dans certaines cellules de la niche de BM (périvasculaires vasculaires, endostéale et neuronaux) de combiner les fonctions des cellules hématopoïétiques spécifiques caractéristiques des niches BM.

Imagerie de l’OS a toujours certains défis et les limites par rapport à d’autres tissus. Bien que le microscope biphotonique peut pénétrer les tissus en profondeur 100-1 000 microns, il est toujours difficile d’imager à travers toute l’épaisseur de l’os de la voûte crânienne. Images perdent la qualité avec la profondeur, donc le protocole ici décrit une analyse fiable des régions BM par les cheminées épaisseur 60 microns. Un autre facteur qui peut provoquer incohérence ou imagerie sous-optimale est la forme incurvée de l’os de la voûte crânienne, qui peut apporter l’image floue. Il est crucial d’avoir le crâne positionné parfaitement sur le plat de verre au-dessus de l’objectif, éventuellement avec un appareil stéréotaxique. En effet, la taille du crâne est importante : crâne de souris trop jeunes ou trop petits peut-être ne pas correspondre parfaitement à un périphérique donné stéréotaxique. À titre d’exemple, le dispositif utilisé ici ne rentre pas de souris âgés de moins de 6 semaines et moins de 20 g.

Une autre limite est que le système d’imagerie utilisé dans cette étude se limite à 3 canaux. Comme la couche bleue est automatiquement assignée à recueillir non étiquetage selon SHG signal du collagène osseux, seulement 2 canaux sont disponibles pour l’étiquetage de la fluorescence spécifique. En outre, ce système a une limite de vitesse de 1 image/s à 2 μs/pixel habiter le temps et la taille de trame de 512 x 512 pixels, qui n’est pas idéale pour les processus dynamiques rapide (comme la mesure du débit sanguin et l’évaluation de la mobilisation de cellules dans le sang).

Un défi important est que l’irradiation effectuées pour des compromis BMT l’intégrité du système vasculaire. Les fuites vasculaires présentes dans le BM après l’irradiation provoque des difficultés avec segmentation/quantification des structures individuelles, ce qui peut poser des difficultés dans l’analyse quantitative.

Enfin, il est important de considérer que l’imagerie d’une souris prend environ 1 h, et le nombre de souris qui peut être photographiée sur un jour donné est limité (environ 4 à 6 souris). Par conséquent, augmentation de la taille de l’échantillon pour obtenir la puissance d’analyse peut exiger plusieurs expériences indépendantes, ce qui peuvent augmenter la variabilité.

Suite à ce protocole, le nombre de cellules hématopoïétiques, cellules de Lys-GFP+ détectées par IVFM dans le BM après que 24 h de BMT est ~ 30 cellules/région et il est tout à fait un petit nombre par rapport à l’apport initial de cellules (3 x 10-6). Bien que, à la partie de ce problème est dû à cellule de piégeage dans les poumons et du foie avant le retour vers la BM après une injection i.v., il reste à étudier s’il existe des régions dans la voûte crânienne autres que ceux sélectionnés où les cellules transplantées Accueil au plus haut efficacité.

Homing et greffe de cellules dans le BM après BMT sont souvent suivis par cytométrie par mesure des marqueurs CD45.1/CD45.2, GFP, carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) ou combinaison de marqueurs de cellules souches et de la lignée. L’utilisation de IVFM, surtout au début points dans le temps, rend disponibles uniques et des précisions supplémentaires qui ne peuvent pas être fournies par cytométrie en flux. Par exemple, souvent il n’est pas facile de distinguer par des événements de FACS qui sont des « cellules » des événements qui sont des « artefacts », en particulier lorsqu’un faible nombre d’événements positifs est collecté (c'est-à-dire après 24 h de BMT). IVFM fournit des informations sur la morphologie et la localisation des cellules qui favorise cette distinction. De même, FACS analyse de cellules hématopoïétiques BM récoltés par des bouffées de chaleur ou de se briser les os comprendra des cellules qui résidaient dans la niche et les cellules qui étaient déjà en circulation dans le système vasculaire. En effet, le IVFM permet la distinction et l’évaluation des cellules au repos dans la niche de la BM et les cellules qui sont mobilisent dans la circulation sanguine. Cette distinction est d’une grande utilité lorsque l'on étudie la cinétique de domiciliation, de localisation, de différenciation et de mobilisation dans un modèle donné. Ce qui est important, IVFM peut fournir des informations uniques sur la position des cellules hématopoïétiques par rapport à des cellules du microenvironnement constituant une niche spécifique.

Autres méthodes utilisées pour traiter la composition de la niche de la BM, une telle analyse histologique ont été utilisés. Comparaison entre la microscopie intravitale de la BM et de faire une analyse histologique en microscopie confocale a été examinée minutieusement et avec élégance par Lo Celso et al. 18.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

L’imagerie a été réalisée dans le centre de l’Indiana pour microscopie biologique à l’Université de l’Indiana, dirigé par le Dr Ken Dunn. L’appareil stéréotaxique est un prototype conçu et réalisé par Mark Soonpaa, puits Center for Pediatric Research. Ce travail a été soutenu par le NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), la recherche MPN Foundation (NC) et la collaboration de l’ILEC IUSM/Notre Dame (NC) du projet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine cocktail IU School of Medicine Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran Tdb Consultancy TD150-100mg Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer Braintree Scientific CLP-323 75
Gauze sponge Med Vet International PK224 4-ply, 2 x 2
Nair depilatory cream Commercial store
Saline Med Vet International RXSAL-POD1LT 0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe Fisher Scientific 14-826-79 28 g, 1/2 cc
Fine Forceps Fine Science Tools 00108-11, 00109-11 straight forcep, angled forcep
Scissor Fine Science Tools 15018-10
Needle holder Fine Science Tools 12002-14
5-0 silk suture Fisher Scientific MV-682 Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish WillCo GWSt-5040
Optical microscope oil Leica
Stereotaxic stage insert  IU School of Medicine Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system  Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective  Olympus
Small heating pad Commercial store Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software Bitplane 3/4 D Image Visualization and Analysis software

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References

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Biologie du développement numéro 121 la régénération des cellules myéloïdes imagerie In vivo suivi de lignée Niche de la moelle osseuse Notch signalisation greffe de moelle osseuse
Combinant la microscopie intravitale Fluorescent (IVFM) avec des modèles génétiques pour étudier la dynamique de la prise de greffe de cellules hématopoïétiques à des Niches de la moelle osseuse
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Wang, L., Kamocka, M. M., Zollman,… More

Wang, L., Kamocka, M. M., Zollman, A., Carlesso, N. Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches. J. Vis. Exp. (121), e54253, doi:10.3791/54253 (2017).

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