Summary
Прижизненные флуоресцентной микроскопии (IVFM) calvarium применяется в сочетании с генетическим животных моделей для изучения самонаведения и приживления гемопоэтических клеток в костном (БМ) ниши.
Abstract
Все больше фактов указывает, что это нормальное кроветворение регулируется собственный microenvironmental подсказки в БМ, которые включают специализированные сотовой ниши, модулирует критических гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) функции1,2. Действительно более подробную картину гемопоэтических микроокружения теперь формируется, в котором endosteal и эндотелиальных ниши образуют функциональные единицы для регулирования обычных HSC и их потомства3,4,5 . Новые исследования показали важность периваскулярной клеток, адипоциты и нейрональные клетки в сохранении и регулировании HSC функции6,,78. Кроме того есть свидетельства того, что клетки от различных линий, т.е. миелоидного и лимфоидных клеток, дома и проживают в конкретных нишах в BM микроокружения. Однако полное картирование BM микроокружения и его обитатели все еще продолжается.
Трансгенные мыши штаммов, выражая линии конкретных флуоресцентные маркеры или мышей, генетически не хватает отдельных молекул в определенные ячейки BM нишу теперь доступны. Нокаут- и линии отслеживания модели, в сочетании с подходами, трансплантация, предоставляют возможность уточнить знания о роли конкретных «нишу» клетки для определенных гемопоэтических населения, например HSC, B-клетки, Т-клетки, миелоидных клеток и эритроидных клеток. Эта стратегия может быть далее потенцированные путем слияния использование двух Фотон микроскопии calvarium. Предоставляя в vivo изображений высокого разрешения и 3-D визуализации BM calvarium, мы теперь местоположение можно определить точно где конкретных подмножеств гемопоэтических дома в BM и оценить кинетику их расширения с течением времени. Здесь Lys-GFP трансгенных мышей (маркировка миелоидных клеток)9 и RBPJ нокаут-мышей (без канонических Notch сигнализации)10 используются в сочетании с IVFM для определения приживления миелоидных клеток к вырезка дефектных BM микроокружения.
Introduction
Прижизненные multiphoton флуоресцентной микроскопии (IVFM) – это мощный изображений метод, который позволяет с высоким разрешением в реальном времени визуализации тканей с глубиной до 1 мм, в зависимости от ткани. При применении к calvarium мыши, позволяет наблюдения за поведением гемопоэтических клеток в BM неинвазивным способом до 60-100 мкм11. Этот подход используется здесь для определения кинетика приживления нормальной миелоидного прародителями мышей нокаут-БМ RBPJ, не хватает канонические Notch сигнализации.
Последние работы из нашей группы продемонстрировали, что дефектных канонические Notch сигнализации в BM микроокружения приводит к болезни миелопролиферативных как12. Потеря Notch сигнализации был получен условного удаления ДНК привязки домена RBPJ, критических транскрипционный фактор, вниз по течению канонических выемки, сигнализации, используя Mx1-Cre индуцированной рекомбинации10. В этом исследовании была использована модель мышиаргона/lox Mx1-Cre/RBPJ. Условного удаления ДНК связывающих мотив RBPJ приводит к потере сигнализации от всех Notch рецепторов. В модели Mx1-Cre, КРР, выражение управляется промоутер Mx1, активируется после отправления polyI:C, что приводит к индукции удаления целевых генов в клетки крови, а также стромальные компонентов нескольких органов, в том числе BM, селезенки и печени.
Mx1-Cre+/RBPJжидкий кислород/lox и мышейаргона/lox Mx1-Cre–/RBPJ индуцированных с polyI:C (расписка указано как RBPJKO и RBPJWT, соответственно) были смертельно облученных и пересадить с нормальной, дикого типа гемопоэтических клеток. Начиная с 4 недели после пересадки, RBPJKO получателей разработали значительное лейкоцитоза, следуют спленомегалия. Хотя RBPJKO мышей представил увеличение доли миелоидного прародителями БМ на неделе 8 после пересадки и позднее момента времени, анализ БМ на 4 и 6 недель не выявить различия в их содержание миелоидных клеток, по сравнению с контролем RBPJWT получателей. Это наблюдение, а также тот факт, что Mx1-Cre выражается в различных кроветворных органов, возникает вопрос, ли BM микроокружения имел непосредственное влияние на возбуждение миелопролиферативных фенотип.
Чтобы определить, является ли BM критическим местом первоначального развития болезни, IVFM мыши calvarium был использован в сочетании с BM трансплантации (БМТ), нокаут-модель RBPJ и линии, системы слежения. Трансгенных мышей, выражая EGFP под контролем конкретных лизоцима промоутер (Lys-GFP)9 были использованы для получения клеток донора, которые могут быть визуализированы в BM изображений после ТКМ. Лизоцим выражение для миелоидных клеток и Lys-GFP знаменует клетки от общей миелоидного progenitor (CMP) до зрелых гранулоцитов13.
IVFM BM в разное время точках продемонстрировали, что Lys-GFP клетки указаны аналогичным получателям БМ RBPJWT и RBPJKO, но расширена и быстрее прижившимися, в БМ RBPJKO получателей. Эта разница была резко на предшествующий момент времени (2 недели) и со временем (недели 4 и 6). Однако в этих более поздних точках времени, оценки гемопоэтических отсека в же получателю показал устойчивый рост числа миелоидных клеток, циркулирующих в PB и локализованы в селезенке RBPJKO мышей, показывающее увеличение производства клеток от БМ в кровоток. Анализ Lys-GFP клетки локализации в BM пересаженных мышей на 6 недель показали, что миелоидных клеток проживало дальше сосудистую в RBPJKO микроокружения чем в элементе управления.
Коллективно сочетание IVFM с этих конкретных животных моделей позволило получить информацию в динамике приживления миелоидных клеток в RBPJKO BM микроокружения. Экспериментальный дизайн и количественный подход, описанный здесь предлагается в качестве парадигмы, которые могут применяться для решения подобных вопросов. Например, может разрешить использование других клеток конкретных линии отслеживания модели, такие как RAG1-GFP14 или15 мышей Gata1-GFP, после поведение лимфоидной или эритроидные предшественники, соответственно, в BM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
С разрешения животное уход и использовать Комитет по Индиана школы медицины университета были выполнены все процедуры, связанные с использованием животных. Обеспечить, чтобы придерживаться законодательства о животных экспериментов страны, где выполняется работа.
1. Подготовка Mx1CreRBPJ- / - получателей мышей
- Крест Mx1-Cre+ мышей с RBPJжидкий кислород/lox мышей10 для получения Mx1-Creположительные RBPJжидкий кислород/lox мышей12 и Mx1-Cre негативных RBPJжидкий кислород/lox однопометники для использования в качестве элементов управления. Проверьте генотипа, ПЦР10.
- Использовать 6-8 недели-старый Mx1Cre+/RBPJжидкий кислород/lox и Mx1Cre–/RBPJжидкий кислород/lox мышей для выполнения polyI:C индукции.
-
Придать polyI:C 200 мкг и.п. в Cre+ и Cre– мышей. Дать один polyI:C инъекции через день в течение 3 дней первой недели. Дать один polyI:C инъекции второй недели, через 7 дней после предыдущей инъекции (четыре инъекции в общей сложности).
- Использовать RBPJKO (индуцированных Mx1Cre+/RBPJжидкий кислород/lox) и RBPJWT (индуцированных Mx1Cre–/RBPJжидкий кислород/lox) мышах как получатели 3 недели после последней инъекции polyI:C.
Примечание: Рекомендуется использовать мышей, вызванных Пи: ПК 3 недели после инъекции. IFNα реакции, вызванные polyI:C вызывает значительные изменения в БМ, что приводит к расширению иммунофенотипических HSC и пониженной мощности зрелых прародителей в периферической крови16,17. Представление гемопоэтических подмножеств является нормализованный 3 недели после инъекции и мышей может использоваться без смешанные эффекты воспаления. Этот протокол индукции была оптимизирована для RBPJ. Если удаление различных генов, протокол индукции может варьироваться в зависимости от конструкции, и исключения должны быть проверены. Мы проверить ~ 100% удаление RBPJ региона между сайтами loxP по RT-PCR после всего четыре инъекции polyI:C.
- Использовать RBPJKO (индуцированных Mx1Cre+/RBPJжидкий кислород/lox) и RBPJWT (индуцированных Mx1Cre–/RBPJжидкий кислород/lox) мышах как получатели 3 недели после последней инъекции polyI:C.
2. Подготовка Lys-EGFP клеток костного мозга доноров для трансплантации
- Усыпить один Lys-EGFP мышь (диоксид углерода, следуют шейки матки дислокации) 1 или 2 h до пересадки.
- Брызг поверхность тела животного с 70% этиловом спирте.
- Используйте Ножницы хирургические сделать разрез кожи по обе ноги вокруг лодыжки и с Щипцы хирургические тронуться кожи и меха вместе, чтобы разоблачить чистой мышечной ткани.
- Используйте Ножницы хирургические для удаления столько мышц из ноги как можно скорее. Ножницами, вырезать кости (на коленного и голеностопного сустава) и очистить любые оставшиеся мышечной ткани от бедра и tibias с помощью губки марлей. Поместите кости (два бедра и два tibias) в 6-ну пластины, содержащие DMEM 10% FBS.
- Раздавить кости в ступке с 10 мл холодной 2 мм ЭДТА PBS и пипетки клеток костного мозга для приведения ячеек в одну ячейку подвеска. Кроме того промойте кости с 2 мм ЭДТА PBS 3 раза с каждой стороны 1 мл шприц.
- Фильтр клеток костного мозга в 15 мл пластиковых пробирок с помощью 70 мкм фильтром. Промойте фильтр с 2-3 мл ФСБ. Спиновые клетки вниз 10 мин на 460 x g, Ресуспензируйте клетки в 10 мл свежего DMEM 10% FBS.
- Подсчет клеток костного мозга на Горяева и регулировка концентрации 1,5 x 107 кл/мл в IMDM без сыворотки. Используйте 3 x 106 клеток на животное с объемом 200 мкл. Около 1/3 клетки всего BM являются миелоидных GFP + клеток. Оставьте клетки на льду до готовности для инъекций. Для определения экспрессия гена GFP в СУИМ9использовать 0,5 x 105 клеток.
3. костного мозга Lys-GFP клеток в RBPJKO мышей
- Ограничения получателей мышей в клетке пирог. Облучить мышей с смертельной дозой гамма-излучения (1200 Rad) на Cs 137 облучателя. Использовать протокол дозы Сплит: 900 заявках вечером следуют 300 заявках следующее утро (16 h друг от друга).
- Пересадка смертельно облученного получателей мышей RBPJWT и RBPJKO 5-6 часов после второй дозы радиации. Придать BM клетки заготавливаемым от Lys-EGFP мышей в концентрации 3 х 106 клеток / животных через инъекции Вену хвост (см. детали для уборки клеток в разделе 2).
- Изображение независимых когорты пересаженных мышей, IVFM в разное время точках: 24 h и недели 2, 4 и 6, как описано ниже (см. раздел 4 и 5 для в vivo imaging процедуры).
4. Хирургическая подготовка для прижизненной визуализации
- Стерилизуйте хирургические инструменты. Два хорошо щипцы (один прямой, один угловой), одна пара тонкой ножницы и одна пара Иглодержатели. Подготовка оперативного района с все материалы, необходимые для процедуры.
- Дать мыши IP инъекции коктейль кетамин анестезии (Ксилазина 2,5-5 мг/кг + acepromazine 1,0-2,5 мг/кг + кетамин 90-100 мг/кг) с помощью 26-28 G иглу шприца. Животное будет контролироваться каждые 15 минут во время процедуры и анестезии будут дополняться при необходимости на ¼ первоначальная доза.
- Поместите курсор мыши на соответствующий тепловой источник (37 ° C грелку, животное, защищены от прямого контакта с грелка) и визуально контролировать частоту дыхания.
- Проверьте что рефлексы, используя палец щепотка ответ. Убедитесь, что животное находится полностью под наркозом, до начала каких-либо хирургических процедур.
- Использование 26-28 калибровочных иглой шприца дать мышей инъекции Вену хвост флуоресцентные сосудистой маркера (декстрана, 100 мкл раствора 20 мг/мл).
- Применять мазь глаз ветеринара для обоих глаз. Клип дорсальной поверхности головы животного с небольшой электрической машинки. Применение крема для 5 минут использования марлевых губки для удаления крема и затем промыть соленой удаления волос. Подготовьте чистую кожу головы с 70% алкоголя с помощью ватного тампона.
- Используйте тонкой щипцами и ножницы сделать небольшой срединной Кожный разрез (10-20 мм) на кожу головы, чтобы разоблачить подстилающей поверхности спинной черепа. Используйте 5-0 Хирургический Шелковый поставить два пребывания швы на коже на каждой стороне разреза, создавая лоскут подвергать calvarium для воображения.
- Поместите мышь на их обратно и погрузите подвергаются головы в блюдо дно стекла заполнены маслом микроскопа. Транспорт животных для визуализации номер mutiphoton.
- Поместите животное на микроскопа с calvarium позиционируется на стеклянную посуду выше цели и затем накрыть 37° C грелку (животное должно быть защищено от прямого контакта с теплом).
5. in Vivo высоким разрешением изображений Calvarium мыши
- Использовать систему Перевернутый конфокальный, модифицированные для multiphoton изображений (см. материалы таблицу). Инструкции производителя следующие настройки 2-Фотон лазер 830 нм, место 20 X W, NA 0,95 объектива микроскопа носа кусок и проверка выравнивания лазерного луча.
Примечание: Вертикальном Микроскоп системы наиболее часто используются для этих исследований, однако Перевернутый multiphoton системы также могут быть использованы. В этом исследовании пользовательских разработана атравматической стереотаксического устройство было использовано. Хотя существует несколько коммерчески доступных стереотаксического устройств для систем вертикально микроскопа, существует не коммерчески доступных стереотаксического устройство для системы инвертированным микроскопом, направленных на обеспечение мыши черепа. Как альтернатива пользовательских стереотаксического устройство черепа может быть обеспечено в положение над задачей, используя различные методы ленты или клея для стабильности. - Откройте изображение приобретение программного обеспечения. В параметрах «приобретение» группа проверить, если выбран один направленный режим сканирования. Установите скорость сканирования до 4 μs/пикселей, частота кадров до 512 x 512 пикселов и увеличить до 1,5. Выберите из списка доступных объективов для соответствия объектив, дислоцированные в Стволы пожарные 20 X W Na 0,95 цель.
- Доступ к «Краситель список» на панели «Изображения приобретения контроля» и выберите «Два фотона». Открыть окно «Свет путь & красителей» и выберите DM690-980 возбуждения DM. Откройте затвор лазера 2P, установив флажок в лазерный блок 2. В окне «Микроскоп контроллер» выберите RDM690 зеркало.
- Выберите «EPI лампа», выберите куб epi фильтр B/G и сосредоточиться цель на образец для визуализации кровоток и calvarium костного нишу, с использованием в качестве образца бифуркации центральной жилки (а) и коронарного шва (b) (рис. 2A).
-
Собирайте изображения с помощью-descanned режим. Выберите три внешние датчики: detector1 ПЛТ для сбора сигнала ГСП коллагена (выбросов фильтр - 430/100 Нм), ХААСП detector2 собирать GFP сигнал (выбросов фильтр - 525/50) и Хаасп detector3 для сбора сигналов TRITC-декстрана (выбросов фильтр - 605/90 Нм).
- Выполнение визуализации со скоростью сканирования 4μs/пиксель с не усреднения для сведения к минимуму Фототоксичность. Собирайте изображения на постоянный лазерная мощности и детектор выгоды скорректирована использовать полный динамический диапазон детектора с минимальными насыщения.
- Соберите серию разделов через глубины ткани (60 x 1 мкм Z-стеки) из 6 регионов calvarium костного мозга. Используйте параметры Размер шага 1 мкм, zoom 1.5 и размер кадра: 512 x 512 пикселей (423 мкм x 423 мкм).
Примечание: В целом общее время, необходимое для изображения одним нажатием-1-1,5 ч.
6. количественный анализ
- Выполните реконструкций количественный и 3D изображения, с помощью выделенного изображения 3D / 4D количественный и визуализации программного обеспечения в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Визуализируйте интерактивно Z-стеки в 3D, используя максимальная интенсивность проекции (ПМС), альфа смесь или теневой проекции объем визуализации алгоритмов.
- Сегмент GFP клеток с использованием «модуль сегментация месте объекта». Примените стека арифметические обработки (канал вычитание) для ликвидации ложных положительных количество клеток GFP (это устраняет сигнал костных клеток, отображение сильная флуоресценция в красный и зеленый каналы).
- Выполнение сегментации сосудистую и костной поверхности, используя модуль поверхности сегментации. При необходимости расчета расстояний клеток к любой из выше поверхности путем применения алгоритмов X-напряжение, под названием «расстояние места на поверхности».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Когорты 2 RBPJKO и 2 RBPJWT получателей были отражаться в отдельных изображений сессии в разное время точках: 24 h и 2, 4 и 6 недель после пересадки BM Lys-GFP клеток (рабочий процесс проиллюстрирован на рисунке 1A).
В каждой мыши изображения были приобретены от 6 стандартных областей BM calvarium, определены их позиции по отношению к бифуркации центральной жилки (рисунок 2A, ) и коронарного шва (рис. 2A, b). Инъекции декстрана Техас-красного до изображений позволяет идентификации этих ориентиров и выбор из 6 областей (рисунок 2A): вверху слева, средний и право (UL, UM, UR) и нижний левый, средний и права (LL, лм, LR). 60 x 1 мкм z стеки собираются от каждого региона и просмотру как 3-D максимальной интенсивности проекции (МИП), (рис. 2B); 3-D проекции тени, которая включает компонент костей (серый) порожденных второй гармоники поколения (SHG) микроскопии зондирующего коллаген Организации (рис. 2 c); и наконец, 3-D сегментированных изображения, который позволяет количественный клеток и измерения их расстояний от костей и сосудов (Рисунок 2D).
Из-за потенциальных различий в самонаведения предпочтения гемопоэтических клеток в различных регионах calvarium БМ после трансплантации важно попробовать несколько областей в calvarium каждой мыши. На рисунке 3 показан пример распределения клеток в 6 регионах, анализируются в одном RBPJWT и одного получателя RBPJKO на 2 недели после BMT (зеленый - миелоидных клеток, серый кость) с использованием теневой проекции 3D рендеринга алгоритма. Количество ячеек на регион, варьировались от 64 до 258 в RBPJWT мышь и 265 до 573 RBPJKO мыши. Окончательные результаты затем выражаются как среднее количество 6 регионов проанализирована: количество ячеек одного региона / мышь (в среднем 135 в vs 469 RBPJWT в RBPJKO). Этот представитель эксперимент показывает, что есть большие различия в ячейке распределения каждого региона в RBPJWT чем в RBPJKO получателя. Кроме того помимо различия в регионах calvarium мышь, которая является общим, существуют различия между отдельными мышей в рамках той же группы. Таким образом важно, что для каждой точки время по крайней мере 4 мышей, оцениваются в эксперимент для получения как минимум всего 24-30 регионов для анализа за состояние.
Рисунок 4 показывает динамику миелоидного progenitor экспансии в вырезка дефектных микроокружения БМ по сравнению с контролем в течение 6 недель после пересадки. В этом эксперименте представителя 8 RBPJWT и 8 RBPJKO мышей были трансплантированы и образы в назначенное время точках (2 RBPJWT мышей и 2 RBPJKO мышей в каждый момент времени). На рисунке 4A показывает представитель 3-D реконструкция 1 из 6 регионов приобретены. Ячейки в каждом из 6 регионов были подсчитаны и среднее количество клеток/региона двух мышей в каждый момент времени (всего 12 регионов) было рассчитано для получателей, RBPJWT и RBPJKO (рис. 4 c). Этот анализ показывает, что: (i) клеток донора Lys-ГФП в RBPJWT и RBPJKO получатели имеют аналогичные самонаведения эффективность; II) клетки в RBPJKO получателей более быстро расширяться и вдвое превышает количество клеток в RBPJWT получателей на 2 недели после БМТ; III) клетки в RBPJWT получателей расширять позже и 2 раза выше, чем клетки в RBPJKO получателей на неделе 4 после БМТ; и iv) номер ячейки в RBPJWT и RBPJKO получателей становятся похожими на неделе 6 после ТКМ. Анализ миелоидных клеток донора в PB указывает выше вывода миелоидных клеток от БМ RBPJKO получателей, чем от БМ RBPJWT получателей на неделе 4, в то время, когда БМ RBPJKO мышей показало более низкое содержание Lys-GFP клеток. Совокупный анализ миелоидных клеток, проживающих в РС и миелоидных клеток, циркулирующих в PB, показывают, что в RBPJKO BM микроокружения клеток Lys-GFP расширить и готовы мобилизовать более быстрыми темпами. Параллельный анализ СУИМ Lys-GFP клеток в длинных костей BM от же мышей показало тенденция аналогичен наблюдением IVFM; Однако различия между условиями были менее выраженными (рис. 4В).
Измерение расстояния отдельных клеток Lys-GFP из кости или сосудистую показано на рисунке 5. В этом исследовании представитель, использовался 3-D сегментация анализ LM региона RBPJWT и RBPJKO calvarium на 6 недель с BMT (Рисунок 5A). Расстояние от костей и сосудов были рассчитаны для каждой ячейки в регионе: 200 клеток в RBPJWT и 255 ячеек в RBPJKO и таким образом, выраженные как в среднем. Анализ показывает, что клетки Lys-GFP локализовать на таком же расстоянии от кости в RBPJWT и RBPJKO мышей (11 мкм), но что они проживают более отдаленные от сосудистую RBPJKO мышей чем RBPJWT мышей (15 мкм против 5 мкм, соответственно). Этот результат является интригующей, как в RBPJKO мышей Lys-GFP клетки мобилизованы в оборот более чем в RBJWT мышей и, таким образом, как ожидается, локализовать ближе к судам. Однако, вполне возможно, что разница в локализации отражает различные стадии разграничения этих двух групп населения (в RBPJWT и RBPJKO), точка, которая не может решаться этот анализ. Значимость этого результата будет следовать вверх с большего числа клеток во всех 6 регионах и объединяя анализ СУИМ.
В целом, субоптимальные результаты получаются при небольшое количество регионов, анализируются на мышь. Визуализация является особенно сложной в начале моменты времени после ТКМ, как смертоносные облучение повреждает сосудистую и утечки декстрана из капилляров уменьшает изображение определения. Таким образом важно иметь большое количество повторений, особенно в ранние моменты времени.
ГСП является полезным инструментом для изучения Организации волокна коллагена в 3D. Это второго порядка нелинейных оптических процесс, который происходит от структур, таких как коллагеновых волокон, обладающих не centrosymmetry и высокий коэффициент нелинейных второго порядка. При интенсивной падающий свет взаимодействует с такими структурами, он генерирует свет на два инцидента частоты или половину инцидента волны. Поэтому без маркировки требуется для того, чтобы захватить SHG сигнала во время 2-Фотон микроскопии. С длиной волны возбуждения, 830 нм мы захвата сигнала ГСП в синий канал с выбросов фильтр 430/100 Нм.
Рисунок 1: Экспериментального процесса. (A) мышейаргона/lox индукции Mx1-Cre/RBPJ для создания RBPJKO и RBPJWT мышей ~ 4 недель до изображений; (B) подготовка BM клетки от Lys-GFP трансгенных мышей; (C) трансплантации BM Lys-GFP клетки в смертельно облученного RBPJKO или RBPJWT получателей; (D) IVFM мыши calvarium на 24 ч, 2, 4 и 6 недель после ТКМ, следуют эвтаназии и BM анализ СУИМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: IVFM сосудистого нишу BM. (A) мозаика мульти Фотон образ Lys-EGFP мыши calvarium показаны 6 стандартных областей изображения (UL: верхний левый, UM: верхней середине, UR: правый верхний угол, LL: Нижняя слева, ЛМ: ниже среднего, LR: внизу справа) (зеленый, миелоидные клетки, красный, сосудистую Грей, кость) 10 крат; (B-D) BM нишу подробно отображаются как: MIP (B), (C) 3-D теневой проекции, (D) 3-D сегментации изображения. Изображения были обработаны - использование выделенного изображения 3D / 4D количественный и визуализации программного обеспечения (таблица 1). Масштаб баров = 50 мкм в B, C, D. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Приживления миелоидных клеток в неделю 2. Образы Lys-GFP клеток (зеленый) и костной поверхности (серый) в 6 регионах BM от calvarium кости одной RBPJWT и одна RBPJKO мышь (U: Верхняя, L: слева, M: среднего, R: право). Масштаб баров = 50 мкм. Столбчатые диаграммы (справа) укажите количество клеток в каждом регионе (RBPJWT диапазон 64-258; RBPJKO диапазон 265-573) и их среднее число 135 STD + / 73 и 469 STD + /-121. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Кинетика приживления миелоидных клеток и после вывода БМТ. (A) изображения Lys-GFP клетки (зеленый) и костной поверхности (серый) в одном регионе представителя от calvarium один RBPJWT и RBPJKO мыши на каждой из точек, время указано. Масштаб баров = 50 мкм; (B) точка помарок Показать процент Lys-GFP позитивные клетки подачей cytometry в BM длинных костей, добываемых из же мыши образы в естественных условиях (см. выше). (C) бар графики показывают среднее количество клеток/региона 2 мышей (всего 12 регионов) в каждой точке времени, + / STD. (D) линия график показывает раз увеличение общего числа нейтрофилов (перечисленных на счетчик соматических клеток) представлены в PB же мышей чем в (A) в точках указанного времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Локализация миелоидных клеток в BM родственник кости и сосудистую. (A) представитель 3-D сегментирована образы Lys-GFP клеток и сосудистую и Lys-GFP клеток кости в том же регионе calvarium кости в RBPJWT и RBPJKO получателей в неделю 6 с BMT. Масштаб баров = 50 мкм. (B) гистограммы кратко среднее расстояние в мкм + / SEM Lys-GFP клетки от поверхности кости или сосудистую. Количество клеток измеряется в: RBPJWT n = 200 клеток и RBPJKO n = 255 ячеек. Расстояние Lys-GFP клеток от сосудистую больше, чем RBPJWT мышей, p в RBPJKO < 0,001 (t критерия Стьюдента). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает экспериментальный дизайн, оптимизированный для изучения кинетики приживления гемопоэтических клеток с флуоресцентными прижизненной микроскопии. В этом исследовании расширение клеток миелоидного progenitor в WT BM или в зазубрине сигнализации дефектных BM был отслеживается в кости calvarium следующих Lys-GFP позитивные миелоидных клеток после ТКМ в RBPJWT или RBPJKO получателей. Этот подход предлагается как модель, которая может применяться для решения подобных вопросов, например: я) для определения расширения и локализации в нишах BM клеток других линий, таких как эритроидные лимфоидной, или мегакариоцитарная клетки, используя в качестве донора клеток гемопоэтические клетки, переноски линии конкретных промоутеров вождения GFP или томат красный; II) для оценки различных микро экологические детерминанты, используя другие конкретные KO или трансгенных мышей в качестве получателей.
Сила этой визуализации протокола в calvarium кости, является, что анатомические ориентиры для выбора BM регионов, бифуркации центральной жилки и коронарного шва, разумно сохраняется у всех мышей, позволяя согласованности между отдельными эксперименты во время отказ от требования об автоматизированной стадии. Кроме того использование модели GFP отслеживать гемопоэтических клеток оказалась очень эффективной, как GFP предусмотрено стабильный сигнал в неоптимальных условиях, таких как после облучения. Наконец дыхание артефакты изображения настройки описанных, с помощью инвертированного микроскопа и заказной стереотаксического устройство, в котором указатель мыши находится в лежачем положении, значительно Минимизируйте.
Два аспекта этого экспериментального дизайна, если выполнены, может привести к более широкому и эффективному использованию IVFM calvarium. Во-первых это будет важно для оптимизации и унифицировать продольных изображений позволяет наблюдение и та же мышь в разное время точек (от 2 дней до нескольких недель) после вмешательства (т.е. ТКМ или терапии) вместо независимые когорты мышей. Поскольку этот подход требует надлежащих условий для послеоперационного восстановления и использования мер по противодействию воспаления, инфекции и шрам формирования изображений на сайте, его применение в настоящее время ограничен. Во-вторых, он будет ценным для развивать массив линии отслеживания мыши модели ношение флуоресцентные белки в определенные ячейки BM нишу (сосудистой, endosteal, периваскулярной и нейрональных) объединить функции кроветворных клеток с конкретными характеристики BM ниш.
Томография костей все еще имеет некоторые проблемы и ограничения, по сравнению с другими тканями. Хотя микроскоп двух фотон может проникать глубоко в ткани 100-1000 микрон, это все еще сложно изображения сквозь всю толщу calvarium кости. Образы теряют качество с увеличением глубины, поэтому здесь протокол описывает надежный анализ BM регионов от 60 микрон толщиной стеки. Еще одним фактором, который может привести к несогласованности или неоптимальной изображений является изогнутая форма calvarium кости, которая может принести изображение вне фокуса. Важно иметь идеально расположены на стеклянную посуду выше цели, возможно с устройством стереотаксического черепа. Действительно, размер черепа имеет важное значение: черепа мышей слишком маленькими, или слишком мало может не вписываются в стереотаксического данного устройства. Например устройство, используемых здесь не подходят мышей, моложе, чем 6 недель и менее 20 g.
Дополнительное ограничение, является ограничение до 3 каналов изображений системы, используемые в данном исследовании. Как синий канал автоматически назначается для сбора-маркировки на основе сигнала ГСП костного коллагена, только 2 канала доступны для конкретных флуоресценции маркировки. Кроме того эта система имеет ограничение скорости 1 кадр/сек на 2 μs/пиксель останавливаться время и размер кадра 512 x 512 пикселей, который не является идеальным для быстрого динамических процессов (например, измерения потока крови и оценки мобилизации клеток в крови).
Важной задачей является что облучение БМТ компромиссов целостность сосудистую. Сосудистые утечки в БМ после облучения вызывает трудности с сегментации/количественный отдельных структур, которые могут представлять трудность количественного анализа.
Наконец, важно рассматривать что изображений одной мыши занимает примерно 1 h, и количество мышей, которые могут отражаться в данный день ограничено (~ 4-6 мышей). Таким образом увеличение размера выборки для получения питания анализа может потребоваться несколько независимых экспериментов, которые могут увеличить изменчивости.
После этого протокола количество гемопоэтических клеток Lys-GFP+ обнаружен IVFM в БМ после 24 ч с BMT ~ 30 клеток/региона и является довольно небольшой по сравнению с начального ввода клеток (3 x 10-6). Хотя, часть этой проблемы из-за мобильный треппинга в легких и печени до самонаведения для БМ после инъекции и.в., предстоит изучить ли есть регионы в calvarium помимо выбранные где пересаженные клетки домой в выше эффективность.
Самонаведения и приживления клеток в БМ после ТКМ часто сопровождаются подачей cytometry измерения CD45.1/CD45.2 маркеров, GFP, Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE) или комбинации линии и маркеры стволовых клеток. Использование IVFM, особенно в ранние моменты времени, делает доступны уникальные и дополнительную информацию, которая не может быть предоставлена проточной цитометрии. Например, часто это не легко отличить СУИМ событиями, которые являются «клетки» от событий, которые являются «дефекты», в частности при сборе низкое количество положительных событий (т.е. в 24 ч с BMT). IVFM содержит сведения о морфологии и локализации клеток, что СПИД это различие. Аналогичным образом анализ СУИМ BM гемопоэтических клеток, найденным путем промывки или врезаться костей будет включать в себя клетки, которые проживали в нише и клетки, которые уже были в обращении в сердечно-сосудистой системы. Действительно IVFM разрешает различия и оценки клеток, отдыхая в BM ниши и клетки, которые мобилизуются в кровоток. Это различие имеет большое значение при изучении кинетика самонаведения, локализация, дифференциация и мобилизации в данной модели. Важно отметить, что IVFM может предоставить уникальную информацию о позиции гемопоэтических клеток по отношению к микроокружения клеток, составляющих конкретную нишу.
Были использованы другие методы, используемые для решения состав BM ниши, такие гистологический анализ. Сравнение между прижизненной микроскопии BM и гистологический анализ confocal микроскопии тщательно и элегантно обсуждался Селсу Ло и др. 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Визуализация была проведена в центре Индиана для биологических микроскопии в университете Индианы, режиссер доктор Кен Dunn. Стереотаксическая устройство является прототипом разработана и изготовлена, Марк Soonpaa, центр Уэллс педиатрических исследований. Эта работа была поддержана NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (Размыкающих), MPN исследовательский фонд (NC) и CTSI совместных проектов IUSM/Нотр Дам (NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2 x 2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28 g, 1/2 cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
References
- Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
- Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
- Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
- Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
- Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
- Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
- Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
- Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).
