Summary
Microscopia de fluorescência intravital (IVFM) da calvária é aplicada em combinação com modelos de animais geneticamente para estudar o homing e enxertia das células hematopoiéticas em nichos de medula óssea (BM).
Abstract
Aumentando a evidência indica que hematopoiese normal é regulada por distintas pistas microenvironmental na BM, que incluem especializados nichos celulares modulando funções de células-tronco hematopoiéticas crítico (HSC)1,2. De fato, uma imagem mais detalhada do microambiente hematopoiético está a emergir, no qual o endosteal e nichos endoteliais formam unidades funcionais para a regulação da HSC normal e sua progênie3,4,5 . Novos estudos têm revelado a importância das células perivasculares, adipócitos e células neuronais para manutenção e regulamenta HSC função6,7,8. Além disso, há evidências de que células de linhagens diferentes, ou seja, células mieloides e linfoides, lar e residam em nichos específicos dentro do microambiente BM. No entanto, um mapeamento completo do microambiente BM e seus ocupantes ainda está em andamento.
Cepas de rato transgênicas expressando marcadores fluorescentes específicos de linhagem ou camundongos geneticamente modificados para falta de moléculas selecionadas em células específicas do nicho BM estão agora disponíveis. Mata-mata e linhagem rastreamento modelos, em combinação com abordagens de transplante, proporcionam a oportunidade de aperfeiçoar o conhecimento sobre o papel dos específicos "nicho" de células para populações hematopoiéticas definidas como HSC, células B, células T, células mieloides e eritroide de células. Esta estratégia pode ser ainda mais potencializada, mesclando-se o uso da microscopia de dois fotões da calvária. Fornecendo imagens de alta resolução na vivo e renderização 3D da calvária BM, agora podemos determinar precisamente o local onde subconjuntos específicos hematopoiéticos para casa em BM e avaliar a cinética de sua expansão ao longo do tempo. Aqui, Lys-GFP ratos transgénicos (marcação de células mieloides)9 e RBPJ mata-mata ratos (falta de sinalização de entalhe canônico)10 são usados em combinação com IVFM para determinar a enxertia das células mieloides de um microambiente BM defeituoso de entalhe.
Introduction
Microscopia de fluorescência do multiphoton intravital (IVFM) é uma poderosa técnica de imagem que permite para o de alta resolução, em tempo real de imagens de tecidos com profundidade de até 1mm, dependendo do tecido. Quando aplicado a calvária de rato, permite observar o comportamento das células hematopoiéticas dentro da BM de forma não-invasiva acima de 60-100 μm11. Esta abordagem é usada aqui para determinar a cinética de enxertia de progenitores mieloides normais nos ratos nocaute BM de RBPJ falta canônica de sinalização Notch.
Trabalho recente do nosso grupo demonstrou que defeituoso sinalização de entalhe canônico na BM microambiente conduzem a uma doença mieloproliferativa, como12. Perda de sinalização Notch foi obtida pela exclusão condicional do domínio de ligação do DNA de RBPJ, o fator de transcrição crítica a jusante de entalhe canônico, sinalização, usar Mx1-Cre induzida por recombinação10. Neste estudo, utilizou-se o modelo de ratos desalmão/salmão Mx1-Cre/RBPJ. Exclusão condicional do motivo do DNA-ligando de RBPJ resulta na perda de sinalização de todos os receptores Notch. No modelo de Mx1-Cre, Cre expressão é conduzido pelo promotor Mx1 ativado após administração de polyI:C resultando na indução de supressão do gene alvo em células do sangue, bem como em componentes estromais de múltiplos órgãos, incluindo a BM, o baço e o fígado.
Mx1-Cre+/RBPJsalmão/salmão fumado e Mx1-Cre–/RBPJsalmão/salmão ratos induzida com polyI:C (aqui indicado como RBPJKO e RBPJWT, respectivamente) foram letalmente irradiados e transplantado com células hematopoiéticas normais, de tipo selvagem. A partir da semana 4 após transplante, destinatários RBPJKO desenvolveram leucocitose significativa, seguido por esplenomegalia. Apesar de ratos RBPJKO apresentaram aumento percentual de progenitores mieloides no BM na semana 8 após transplante e nos pontos de tempo mais tarde, análise do BM em semanas 4 e 6 não revelou diferenças marcantes em seu conteúdo de células mieloides em relação ao controle RBPJWT destinatários. Esta observação, juntamente com o fato de que a Mx1-Cre é expresso em diferentes órgãos hematopoiéticos, levantou a questão se o microambiente BM teve impacto direto sobre a iniciação do fenótipo mieloproliferativa.
Para determinar se a BM foi um crítico site inicial do desenvolvimento da doença, IVFM da calvária de rato foi usado em combinação com BM transplante (BMT), o modelo de mata-mata RBPJ e uma sistema de rastreamento de linhagem. Ratos transgênicos expressando EGFP sob o controle do promotor (Lys-GFP) lisozima específica9 foram usados para obter células de doador que podem ser visualizadas durante a BM de imagem após TMO. Expressão de lisozima é específico para células mieloides e Lys-GFP marca células do progenitor mieloide comum (CMP) para os granulócitos maduros13.
IVFM do BM em pontos diferentes do tempo demonstrou que células de Lys-GFP homed da mesma forma para os destinatários BM de RBPJWT e RBPJKO, mas expandido e incorporada mais rápido em destinatários BM de RBPJKO. Esta diferença foi dramática no ponto anterior de tempo (semana 2) e diminuiu ao longo do tempo (semanas 4 e 6). No entanto, estes pontos de tempo mais tarde, avaliação do compartimento hematopoiética do receptor, mesmo mostrou um aumento constante no número de células mieloides circulantes em PB e localizadas no baço de ratos RBPJKO, indicando um aumento da produção de células partir do BM na circulação. Análise de Lys-GFP células localização na BM de ratos transplantados com 6 semanas revelou que células mieloides residiam mais longe da vasculatura no microambiente RBPJKO do que no controle.
Coletivamente, a combinação de IVFM com estes modelos animais específicos fornecidos introspecções na dinâmica das células mieloides no microambiente BM RBPJKO enxertia. O delineamento experimental e abordagem quantitativa descrita aqui é proposto como um paradigma que pode ser aplicado para resolver questões semelhantes. Por exemplo, o uso de outra linhagem de células específicas rastreamento modelos, tais como RAG1-GFP14 ou15 ratos Gata1-GFP pode permitir seguindo o comportamento linfoide ou eritroide progenitores, respectivamente, no BM.
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Protocol
Todos os procedimentos que envolvem a utilização de animais foram realizados com autorização do cuidado Animal e usar o Comité da Indiana University School of Medicine. Certifique-se para aderir à legislação na experimentação animal do país onde o trabalho é realizado.
1. preparação dos ratos de destinatário Mx1CreRBPJ- / -
- Cruzar os ratos Mx1-Cre+ com RBPJsalmão/salmão ratos10 para obter Mx1-Crenegativo para positivo RBPJsalmão/salmão ratos12 e Mx1-Cre littermates desalmão/salmão RBPJ para usar como controles. Verifique se o genótipo por PCR10.
- Usar de 6-8 semanas-velho Mx1Cre+/RBPJsalmão/salmão fumado e Mx1Cre ratos desalmão/salmão –/RBPJ para realizar a indução de polyI:C.
-
Injete polyI:C 200 µ g i.p. em Cre+ e Cre– ratos. Dê uma injeção de polyI:C todos os dias durante 3 dias na primeira semana. Dê uma injeção de polyI:C na segunda semana, 7 dias depois da injeção anterior (quatro injeções no total).
- Use RBPJKO (induzida Mx1Cre+/RBPJsalmão/salmão) e RBPJWT (induzido por Mx1Cre–/RBPJsalmão/lox) ratos como destinatários 3 semanas após a última injecção de polyI:C.
Nota: É recomendável usar ratos induzidos por pI: pC 3 semanas após a injeção. A resposta IFNα desencadeada por polyI:C induz mudanças significativas na BM, resultando na expansão imunofenotípica do HSC e diminuição da saída de progenitores maduros para o sangue periférico16,17. Representação de subconjuntos hematopoiéticos é normalizado a 3 semanas após a injeção e os ratos podem ser utilizados sem os confundimento efeitos da inflamação. Este protocolo de indução foi otimizado para RBPJ. Se a exclusão de um gene diferente, o protocolo de indução pode variar dependendo da construção, e exclusão deve ser validado. Nós validado ~ 100% exclusão da região entre sites loxP por RT-PCR após um total de quatro injeções de polyI:C RBPJ.
- Use RBPJKO (induzida Mx1Cre+/RBPJsalmão/salmão) e RBPJWT (induzido por Mx1Cre–/RBPJsalmão/lox) ratos como destinatários 3 semanas após a última injecção de polyI:C.
2. preparação de Lys-EGFP células de medula óssea de doador para transplante
- Eutanásia em um rato de Lys-EGFP (dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical) 1 ou 2 h antes do transplante.
- Borrife a superfície do corpo animal com etanol a 70%.
- Use tesoura cirúrgica para fazer uma incisão na pele em ambas as pernas ao redor do tornozelo e com fórceps cirúrgico afastar pele e pele juntos para expor o tecido muscular limpa.
- Use uma tesoura cirúrgica para remover tanto músculo das pernas quanto possível. Usando uma tesoura, corte os ossos (no joelho e articulação do tornozelo) e limpar qualquer tecido muscular remanescente dos fêmures e tíbias usando esponjas de gaze. Coloque os ossos (dois fêmures e dois tíbias) em uma placa de 6 contendo DMEM 10% FBS.
- Esmaga os ossos em um almofariz com 10ml frio 2mM EDTA PBS e pipetar as células da medula óssea para trazer as células em suspensão de célula única. Alternativamente, limpar os ossos com tempos de 2 mM EDTA PBS 3 de cada lado com uma seringa de 1 mL.
- Filtre as células de medula óssea usando um filtro de 70 µm em um tubo de centrífuga de 15 mL. Lave o filtro com 2-3 mL de PBS. Girar as células para baixo de 10 min a 460 x g, Ressuspender as células em 10 mL de DMEM fresco 10% FBS.
- Contar as células de medula óssea em um hemocytometer e ajustar a concentração de 1,5 x 107 células/mL em IMDM sem soro. Use 3 x 106 células por animal com um volume de 200 µ l. Cerca de 1/3 do total BM são células GFP + mieloides. Embora as células no gelo até que esteja pronto para a injeção. Use 0.5 x 105 células para determinar a expressão de GFP por FACS9.
3. medula óssea transplante de células de Lys-GFP em ratos RBPJKO
- Contenha o destinatários ratos em uma gaiola de torta. A irradiação de ratos com uma dose letal de radiação gama (1.200 Rad) sobre uma difusora de Cs-137. Usar um protocolo de dose dividida: 900 rads à noite seguido por 300 rads (16 h separado) na manhã seguinte.
- Os ratos de destinatário letalmente irradiados RBPJWT e RBPJKO de transplante 5-6 h após a segunda dose de radiação. BM de injetar células colhidas de ratos de Lys-EGFP em uma concentração de 3 x 106 células por animais através de injecção veia cauda (veja mais detalhes para a colheita de células na secção 2).
- Coortes independentes dos ratos transplantados por IVFM nos pontos de tempo diferente da imagem: 24 h e em semanas 2, 4 e 6, conforme descrito abaixo (ver secção 4 & 5 na vivo procedimento de imagem).
4. cirúrgica preparação para a imagem latente Intravital
- Esterilize instrumentos cirúrgicos. Dois belos fórceps (um direto, um ângulo), um par de tesouras bem e um par de suportes de agulha. Prepare a área operacional com todos os suprimentos necessários para o procedimento.
- Dê o mouse uma injeção de IP de coquetel anestésico cetamina (xilazina 2,5-5 mg/kg + acepromazina 1.0-2.5 mg/kg + cetamina 90-100 mg/kg) usando uma seringa de agulha de 26-28 G. Animal será monitorizada cada 15 minutos durante o procedimento e anestesia será complementada conforme necessário em ¼ da dose da original.
- Coloque o mouse sobre uma fonte de calor adequada (almofada de aquecimento de 37 ° C, animal protegido do contato direto com a almofada de aquecimento) e monitorar visualmente a taxa respiratória.
- Verifica reflexos usando o dedo beliscar a resposta. Certifique-se de que o animal está sob anestesia antes de iniciar qualquer procedimento cirúrgico.
- Uso um 26-28 gauge agulha seringa para dar ratos uma injeção de veia da cauda de um marcador fluorescente de vascular (dextrano, 100 μL de solução 20 mg/mL).
- Aplica pomada de vet para ambos os olhos. Grampeie a superfície dorsal da cabeça do animal com tosquiadeiras elétricas pequenas. Aplica uma creme para esponjas de gaze de uso de 5 min. remover o creme e em seguida enxaguar com solução salina de depilação. Prepare o couro cabeludo limpo com álcool 70%, usando um cotonete.
- Use pinça fina e tesoura para fazer uma pequena incisão de pele (10-20 mm) no couro cabeludo para expor a superfície dorsal do crânio subjacente. Use seda cirúrgica 5-0 para colocar duas suturas de estadia na pele de cada lado da incisão, criando uma aba para expor a calvária para a imagem latente.
- Posicionar os ratos em suas costas e couro cabeludo exposto em um prato fundo de vidro enchido com o óleo do microscópio, mergulhe. Transporte o animal para o mutiphoton sala de imagem.
- Coloque o animal no palco microscópio com a calvária posicionada sobre o prato de vidro acima do objectivo e, em seguida, cubra com um 37almofada de aquecimento ° C (animal deve ser protegido do contato direto com o calor).
5. in Vivo imagens de alta resolução da calvária de rato
- Usar um sistema confocal invertido modificado para a imagem latente do multiphoton (ver tabelade materiais ). Seguir indicações do fabricante sintonizar um 2-fóton laser de 830 nm, lugar a 20 W X, at 0.95 lente objetiva no pedaço de nariz de microscópio e verificar o alinhamento do feixe de laser.
Nota: Microscópio vertical sistemas são mais comumente utilizados para estes estudos, mas também pode ser utilizado um sistema do multiphoton invertido. Neste estudo, utilizou-se um dispositivo estereotáxica atraumática projetada personalizada. Embora haja vários dispositivos estereotáxicos comercialmente disponíveis para sistemas de microscópio vertical, não há nenhum dispositivo disponível comercialmente estereotáxica para um sistema de microscópio invertido que visavam garantir o crânio do mouse. Como alternativa a um dispositivo personalizado estereotáxica, o crânio pode ser fixado na posição acima o objetivo utilizando vários métodos de fita ou cola para a estabilidade. - Abra um software de aquisição de imagem. Nas configurações de"aquisição" painel Verifique se um modo de digitalização direcional é selecionado. Configurar a velocidade de varredura de 4 μs/pixel, taxa de quadros para 512 x 512 pixels e zoom para 1,5. Selecione 20 objetivo X W at 0,95 de lista de disponíveis lentes objetivas para coincidir com a lente posicionada no inalador nasal.
- Acessar a lista de"tintura" no painel de "Controle de aquisição de imagem" e selecione "Dois fótons". Abra a janela "Caminho da luz & corantes" e selecione DM690-980 excitação DM. Open o obturador de laser 2P, marcando a caixa de verificação na unidade Laser 2. Na janela "Controlador de microscópio", selecione RDM690 espelho.
- Selecione "Lâmpada de EPI", escolha o cubo do epi-filtro B/G e focar o objetivo para o espécime para visualizar fluxo vascular e o nicho de medula óssea de calvária, usando como referência a bifurcação da veia central (a) e a sutura coronária (b) (Figura 2A).
-
Recolha imagens usando o modo de não-descanned. Selecione três detectores externos: PGTO detector1 para coletar o sinal SHG de colágeno (filtro de emissão - 430/100 nm), GaAsP detector2 para coletar sinal GFP (filtro de emissão - 525/50) e GaAsP detector3 para coletar o sinal do TRITC-dextran (filtro de emissão - 605/90 nm).
- Realize imagens a uma taxa de varredura de 4μs/pixel com nenhuma média para minimizar a fototoxicidade. Recolha imagens em um ganho de potência e detector laser constante ajustada para utilizar a gama dinâmica plena do detector com saturação mínima.
- Recolha série de secções através da profundidade do tecido (60 x 1 μm Z-pilhas) de 6 regiões da medula óssea de calvária. Use as configurações de tamanho de passo de 1 μm, zoom 1.5 e 512 x 512 pixels tamanho do quadro (423 µm x 423 µm).
Nota: Total, tempo total necessário para a imagem de um rato é 1-1,5 h.
6. análise quantitativa
- Executar as reconstruções de quantificação e 3D de imagem usando um software de visualização e quantificação de dedicado imagem 3D/4D conforme as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais). Visualize interativamente Z-pilhas em 3D utilizando a projeção de intensidade máxima (MIP), alfa-mistura ou algoritmos de processamento de volume de projeção sombra.
- Segmento de células GFP usando o "módulo de segmentação local objeto". Aplica processamento aritmético de pilha (subtração de canal) para eliminar falsa positiva contagem de células GFP (isso elimina o sinal das células ósseas exibindo forte fluorescência nos canais verdes e vermelhos).
- Execute a segmentação da vasculatura e osso superfície usando o módulo de superfície de segmentação. Se necessário, calcule distâncias de células para qualquer das superfícies acima aplicando algoritmos X-tensão, chamados "distância do ponto à superfície".
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Representative Results
Coortes de 2 RBPJKO e 2 RBPJWT de destinatários foram fotografadas em uma sessão individual de imagens em pontos diferentes do tempo: 24h e 2, 4 e 6 semanas após o transplante de células de BM Lys-GFP (fluxo de trabalho é ilustrado na figura 1A).
Em cada rato, imagens foram adquiridas de 6 regiões padrão da calvária BM, identificado por sua posição em relação a bifurcação da veia central (Figura 2A, um) e a sutura coronária (Figura 2A, b). Injeção de dextrano Texas-vermelho antes da imagem permite a identificação desses Marcos e a seleção de 6 regiões (Figura 2A): superior, médio e direito (UL, hum, UR) e inferior esquerdo, médio Lefte (LL, LM, LR). 60 x 1 μm z-pilhas são coletadas de cada região e processados como 3D máxima intensidade Projection (MIP), (Figura 2B); Projeção de sombra em 3D, que inclui o componente de osso (cinzento) gerado pela microscopia de geração harmônica (SHG) segunda sondagem organização de colágeno (Figura 2); e finalmente, uma imagem de segmentado em 3D, que permite a quantificação das células e medição das distâncias de osso e os vasos (Figura 2D).
Por causa de diferenças de potencial nas preferências do localizador de células hematopoiéticas em diferentes regiões da calvária BM após o transplante, é importante para várias regiões a calvária de cada rato da amostra. A Figura 3 mostra um exemplo de distribuição de célula nas 6 regiões analisadas em um RBPJWT e um RBPJKO de destinatário em 2 semanas após o TMO (verde - células mieloides, cinza de ossos) usando o algoritmo de renderização 3D de projeção de sombra. Número de células por região variou de 64 a 258 no mouse RBPJWT e de 265 para 573 no mouse RBPJKO. Os resultados finais são então expressos como número médio de 6 regiões analisadas: número de células por região / rato (média 135 em RBPJWT vs 469 em RBPJKO). Esta experiência representativa indica que há uma maior variação na distribuição de célula por região na RBPJWT do que o receptor de RBPJKO. Além disso, além da variação encontrada nas regiões de calvária dentro de um rato, que é comum, existem variações entre ratos individuais dentro do mesmo grupo. Assim, é importante que, para cada ponto de tempo, pelo menos 4 ratos são avaliados por experimento para obter um mínimo de uma total regiões de 24 a 30, para ser analisado por condição.
A Figura 4 mostra a dinâmica da expansão progenitoras mieloides em um microambiente BM entalhe defeituoso em relação ao controle de mais de 6 semanas após o transplante. Neste experimento representativos, RBPJWT 8 e 8 RBPJKO de ratos foram transplantada e fotografada nos pontos de tempo indicado (2 ratos RBPJWT e 2 ratos RBPJKO em cada ponto de tempo). A figura 4A mostra uma reconstrução 3D representativa de 1 de 6 regiões adquirida. Células em cada uma das 6 regiões foram contadas e o número médio de células/região de dois ratos em cada ponto do tempo (totais 12 regiões) foi calculado para destinatários RBPJWT e RBPJKO (Figura 4). Esta análise indica que: (i) células de doador Lys-GFP em receptores RBPJWT e RBPJKO têm uma eficiência de sinalização semelhante; II) células os destinatários RBPJKO expandir-se mais rapidamente e são duas vezes o número de células em destinatários RBPJWT na semana 2 após TMO; III) células em destinatários RBPJWT expandir mais tarde e são 2 dobras superiores células em receptores RBPJKO na semana 4 após TMO; e iv) número de celular em receptores tanto RBPJWT e RBPJKO tornam-se semelhantes na semana 6 após TMO. Análise de células mieloides doador em PB indica uma maior produção de células mieloides de destinatários BM de RBPJKO do que dos destinatários da BM de RBPJWT na semana 4, no momento quando os ratos BM de RBPJKO mostraram um teor mais baixo de células GFP-Lys. A análise combinada de células mieloides residentes em BM e de células mieloides circulantes em PB, indicam que na BM RBPJKO células de Lys-GFP microambiente expandir em estão prontas para mobilizar mais rapidamente. Análise de FACS paralela de células GFP-Lys em ossos longos BM de ratos a mesma mostrou uma tendência semelhante ao observado por IVFM; no entanto, as diferenças entre as condições eram que menos pronunciada (Figura 4B).
Medição da distância das células individuais de Lys-GFP do osso ou da vasculatura é mostrada na Figura 5. Neste estudo representativo, utilizou-se análise de segmentação de 3-d da região LM da calvária RBPJWT e RBPJKO com 6 semanas de TMO (Figura 5A). Distância do osso e os vasos foram calculadas para cada célula na região: 200 células em 255 células em RBPJKO e RBPJWT e assim, expressas como média. A análise mostra que as células de Lys-GFP localizar a uma distância similar do osso nos ratos RBPJWT e RBPJKO (11 μm), mas que residem mais distante da vasculatura em camundongos RBPJKO do que em ratos RBPJWT (15 μm vs 5 μm, respectivamente). Este resultado é intrigante, como no RBPJKO ratos células Lys-GFP mobilizaram na circulação mais do que em ratos RBJWT e seria, portanto, ser esperado para localizar mais perto para os vasos. No entanto, é possível que a diferença de localização reflete um estágio diferente da diferenciação dessas duas populações (em RBPJWT e RBPJKO), um ponto que não pode ser enfrentado por esta análise. O significado deste resultado irá ser seguiu-se com um grande número de células em todas as 6 regiões e combinando análise FACS.
Globais, gerando resultados são obtidos quando um pequeno número de regiões é analisado por rato. Imagem é particularmente desafiadora em pontos de tempo inicial após o TMO, como irradiação letal danifica o sistema vascular e escapamento de dextrano dos capilares reduz a definição da imagem. Assim, é importante ter um grande número de repetições, especialmente para os primeiros pontos de tempo.
SHG é uma ferramenta útil para investigar a organização de fibras de colágeno em 3D. É um segunda ordem não-linear processo óptico que origina estruturas tais como possuindo não-centrosymmetry e um coeficiente de não-linear de segunda ordem elevado de fibras de colágeno. Quando intensa luz incidente interage com tais estruturas, gera luz em duas vezes a frequência de incidentes ou metade do comprimento de onda incidente. Portanto, sem rotulagem é necessária para captar o sinal SHG durante 2-fotão microscopia. Com comprimento de onda da excitação 830 nm, capturamos o sinal SHG no canal azul com emissão filtro 430/100 nm.
Figura 1: Fluxo de trabalho experimental. (A) ratos desalmão/salmão de indução de Mx1-Cre/RBPJ para gerar RBPJKO e RBPJWT ratos ~ 4 semanas anteriores de imagem; (B) preparação de BM células de ratos transgénicos Lys-GFP; (C) transplante de BM Lys-GFP células em letalmente irradiados RBPJKO ou RBPJWT destinatários; (D) IVFM de calvária de rato em 24h, 2, 4 e 6 semanas após o TMO, seguido de análise de BM por FACS e eutanásia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: IVFM do nicho Vascular BM. (A) imagem em mosaico multi fóton de calvária de rato de Lys-EGFP mostrando as 6 regiões padrão de imagem (UL: superior esquerdo, UM: média alta, UR: superior direita, LL: inferior esquerda, LM: baixa média, LR: canto inferior direito) (células mieloides, verdes vermelho, vasculatura; cinza, osso) Ampliação de 10x; (B-D) Detalhe do nicho BM processado como: MIP (B), (C) projeção de sombra 3D, imagem 3D de segmentação (D). Imagens foram processadas - usando um software de visualização e quantificação de dedicado imagem 3D/4D (tabela 1). Barras de escala = 50 μm em B, C, D. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Células mieloides enxertia na semana 2. Imagens de células de Lys-GFP (verdes) e osso de superfície (cinza) em 6 regiões BM partir o osso de calvária de um RBPJWT e um rato RBPJKO (u: Upper, l: à esquerda, m: médio, r: direito). Barras de escala = 50 μm. Gráficos de barras (à direita) indicam o número de células contadas em cada região (gama RBPJWT 64-258; RBPJKO faixa de 265-573) e seu número médio 135 STD + /-73 e 469 STD + /-121. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Cinética da enxertia de células mieloides e saída seguinte BMT. (A) células de imagens de Lys-GFP (verdes) e a superfície óssea (cinza) em uma região representativa da calvária de um mouse RBPJWT e RBPJKO em cada um dos pontos de tempo indicaram. Barras de escala = 50 μm; (B) Dot borrões mostrar porcentagem de Lys-GFP células positivas por citometria de fluxo dentro do BM de ossos longos-colhidos o mesmo mouse fotografadas em vivo (acima). (C) barra de gráficos indicam o número médio de células/região em 2 ratos (totais 12 regiões) em cada ponto de tempo, + /-linha STD (D) o gráfico mostra aumento de vezes o número total de neutrófilos (enumerados pelo contador de célula) apresentado em PB dos ratos mesmos do que em (A) nos pontos de tempo indicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Localização de células mieloides em BM relativo ao osso e a vasculatura. (A) representante segmentado imagens 3D de células GFP-Lys e vascularização e células de Lys-GFP e osso na mesma região do osso de calvária em receptores RBPJWT e RBPJKO na semana 6 do TMO. Barras de escala = 50 μm. (B) gráfico de barras resume a distância média em μm + /-SEM de Lys-GFP as células da superfície óssea ou o sistema vascular. Número de células medido em: RBPJWT n = 200 células e RBPJKO n = 255 células. Distância de Lys-GFP as células da vasculatura é maior em RBPJKO que os ratos RBPJWT, p < 0,001 (teste t de Student). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um delineamento experimental otimizado para estudar a cinética da enxertia de células hematopoiéticas por microscopia Intravital fluorescente. Neste estudo, a expansão de células progenitoras mieloides em um BM WT ou em um entalhe sinalização defeituoso BM foi controlada a calvária óssea por células mieloides positivas seguintes de Lys-GFP após TMO em destinatários RBPJWT ou RBPJKO. Esta abordagem é proposta como um modelo que pode ser aplicado para responder a perguntas semelhantes, por exemplo: eu) para determinar a expansão e localização nos nichos BM de células de outras linhagens, como eritroide linfoide, ou células megakaryocytic, usando-se como células de doador células hematopoiéticas carreg linhagem específica promotores dirigindo GFP ou tomate-vermelho; II) para avaliar diferentes determinantes microambientais usando outros específico KO ou ratos transgénicos como destinatários.
Força do presente protocolo de imagem no osso de calvária, é que os marcos anatômicos usados para selecionar as regiões de BM, bifurcação da veia central e a sutura coronária, são razoavelmente conservados em todos os mouses, permitindo consistência entre indivíduo experiências enquanto renunciar a exigência de um estágio automatizado. Além disso, o uso do modelo para rastrear as células hematopoiéticas GFP provou para ser muito eficaz, como GFP fornecido um sinal estável em condições ideais, tais como após a irradiação. Finalmente, o set-up de imagem descrita, usando um microscópio invertido e um dispositivo estereotáxica personalizado em que o mouse está em posição supina, extremamente minimize artefatos de respiração.
Dois aspectos desse design experimental, se implementada, podem levar a um uso mais amplo e mais eficaz do IVFM da calvária. Primeiro, será importante otimizar e padronizar protocolos de longitudinal de imagem que permite a observação do mouse mesmo em pontos de tempo diferente (a partir de dia 2 para várias semanas) após a intervenção (ou seja, BMT ou terapia) em vez de usar divisões independentes dos ratos. Como essa abordagem requer condições adequadas para a recuperação de pós-operatório e o uso de medidas para combater a inflamação, infecção e formação no local de imagem latente da cicatriz, sua aplicação é atualmente limitada. Em segundo lugar, será valiosa para desenvolver uma matriz de linhagem rastreamento modelos rato carregando proteínas fluorescentes em células específicas do nicho BM (vascular, endosteal, perivascular e neuronal) combinar funções de células hematopoiéticas com específicos características dos nichos BM.
Imagem latente do osso ainda tem alguns desafios e limitações em comparação com outros tecidos. Embora o microscópio de dois fotões pode penetrar profundamente em tecidos de 100-1.000 mícron, é ainda um desafio para a imagem através de toda espessura do osso de calvária. Imagens perdem qualidade com o aumento da profundidade para que o protocolo aqui descreve análise confiável das regiões de BM de pilhas grossa 60 mícron. Outro fator que pode resultar em inconsistência ou imagem de qualidade inferior é a forma curvada no osso de calvária, que pode trazer a imagem fora de foco. É crucial ter o crânio posicionado perfeitamente sobre o prato de vidro acima do objectivo, possivelmente com um dispositivo estereotáxica. Na verdade, o tamanho do crânio é importante: crânio de ratos muito jovens ou muito pequenos pode não se encaixar perfeitamente em um determinado dispositivo estereotáxica. Como exemplo, o dispositivo utilizado aqui não couber mais jovens que 6 semanas e menos de 20 g de ratos.
Uma limitação adicional é que o sistema de imagens utilizado neste estudo é limitado a 3 canais. Como o canal azul é automaticamente atribuído a coletar o sinal SHG com base não-rotulagem do colágeno ósseo, apenas 2 canais estão disponíveis para a rotulagem específica fluorescência. Além disso, este sistema tem uma limitação de velocidade de 1 frame/s em 2 μs/pixel habitar o tempo e tamanho de frame de 512 x 512 pixels, o que não é ideal para processos dinâmicos rápido (tais como a medida do fluxo sanguíneo e de avaliação da mobilização de células na corrente sanguínea).
Um desafio significativo é que a irradiação realizada para compromissos de TMO a integridade da vasculatura. O escapamento vascular presente no BM após a irradiação provoca dificuldades com segmentação/quantificação de estruturas individuais, que podem apresentar dificuldade na análise quantitativa.
Finalmente, é importante considerar que a imagem de um rato leva aproximadamente 1 h, e o número de ratos que pode ser fotografada em um determinado dia é limitado (~ 4 a 6 ratos). Assim, o aumento do tamanho da amostra para obter o poder de análise pode exigir vários experimentos independentes, que podem aumentar a variabilidade.
Na sequência deste protocolo, o número de células hematopoiéticas, células de Lys-GFP+ detectadas pelo IVFM no BM após 24h de TMO é ~ 30 células/região e é um número pequeno em comparação com a entrada inicial de células (3 x 106). Embora, parte deste problema é devido a célula captura no pulmão e fígado antes de orientação para o BM após injeção intravenosa, resta ser explorado se existem regiões na calvária que não sejam aquelas selecionadas onde as células transplantadas em casa no mais alto eficiência.
Homing e enxertia das células para o BM após TMO são comumente seguidos por citometria de fluxo medida de marcadores CD45.1/CD45.2, GFP, Carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE) ou combinação de linhagem e marcadores de células estaminais. O uso de IVFM, especialmente em pontos de tempo inicial, torna disponível informação adicional e exclusiva que não pode ser fornecida por citometria de fluxo. Por exemplo, muitas vezes não é fácil distinguir por eventos de FACS que são "células" de eventos que são "artefatos", em particular quando é coletado um número baixo de eventos positivos (ou seja, em 24h de TMO). IVFM fornece informações sobre a morfologia e a localização das células que auxilia esta distinção. Da mesma forma, análise de FACS de células hematopoiéticas BM, colhidas por lavagem ou bater os ossos irá incluir células que residiam no nicho e células que já estavam em circulação no sistema vascular. Com efeito, o IVFM permite a distinção e a avaliação das células descansando dentro do nicho de BM e células que estão se mobilizando para a corrente sanguínea. Esta distinção é de grande valor, ao estudar a cinética de homing, localização, diferenciação e mobilização em um determinado modelo. Importante, IVFM pode fornecer informações exclusivas sobre a posição das células hematopoiéticas em relação as células do microambiente que constituem um nicho específico.
Têm sido utilizados outros métodos usados para tratar a composição do nicho BM, tal análise histológica. Comparação entre microscopia intravital da BM e análise histológica por microscopia confocal tem sido discutida exaustivamente e elegantemente por Lo Celso et al . 18.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Imagem latente foi realizado no centro de Indiana para microscopia biológica na Universidade de Indiana, dirigido pelo Dr. Ken Dunn. O dispositivo estereotáxica é um protótipo projetado e feito por Mark Soonpaa, centro de poços de pesquisa pediátrica. Este trabalho foi financiado pelo NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), a pesquisa do MPN Foundation (NC) e o CTSI Collaborative projeto Importantíssima/Notre Dame (NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2 x 2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28 g, 1/2 cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
References
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