Summary
Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gebaseerd op inherente trilling van molecuul obligaties maakt label-free chemisch selectieve live cell imaging. Dit werk toont de uitvoering van een aanvullende microscopietechniek op een standaard multifoton laser scanning microscoop gebaseerd op een femtoseconde Ti: saffier laser en een OPO laser.
Abstract
Laser scanning microscopen combineren van een femtoseconde Ti: saffier laser en een optische parametrische oscillator (OPO) om de laser lijn te dupliceren zijn beschikbaar voor biologen geworden. Deze systemen zijn voornamelijk ontworpen voor multi-channel twee-foton fluorescentiemicroscopie. Echter, zonder enige wijziging, aanvullende non-lineaire optische microscopie, zoals de tweede-harmonische generatie (SHG) of derde harmonische generatie (THG) kan ook worden uitgevoerd met deze set-up, waardoor label-free imaging van gestructureerde moleculen of waterige middellange lipide interfaces. Deze technieken zijn zeer geschikt voor in-vivo observatie, maar zijn beperkt chemische specificiteit. Chemisch selectieve beeldvorming kan worden verkregen uit inherent trillingen signalen op basis van Raman scattering. Confocale Raman microscopie biedt 3D-ruimtelijke resolutie, maar het vereist een hoge gemiddelde vermogen en lange acquisitie tijd. Om deze problemen op te lossen, hebben recente ontwikkelingen in lasertechnologie de ont toegestaanwikkeling van niet-lineaire optische vibratie microscopie, in het bijzonder coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopie Daarom heeft ontpopt als een krachtig instrument voor biologische en live cell imaging, door het chemisch mapping lipiden (via CH stretch trillingen), water (via OH stretch trillingen), eiwitten of DNA. In dit werk beschrijven we de uitvoering van de CARS-techniek op een standaard-OPO gekoppeld multiphoton laser scanning microscoop. Het is gebaseerd op de in-tijdsynchronisatie van de twee laserlijnen door de lengte van een van de laserstraal pad. Wij presenteren een stap-voor-stap uitvoering van deze techniek op een bestaande multiphoton systeem. Een eenvoudige achtergrond in experimentele optiek is behulpzaam en de gepresenteerde systeem vereist geen dure aanvullende apparatuur. We tonen ook CARS afbeelden opgehaald op myelineschede van heupzenuw van knaagdieren, en laten we zien dat deze beeldvorming gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd met andere niet-lineaire optische beeldvorming, zoals standaardtwo-foton fluorescentie-techniek en de tweede-harmonische generatie.
Introduction
Optische microscopie is een belangrijke techniek voor destructieve visualisatie van dynamische processen in levende biologische systemen met een subcellulaire resolutie. Fluorescentiemicroscopie is momenteel de meest populaire imaging contrast gebruikt in levende cellen door zijn hoge specificiteit en gevoeligheid 1. Een groot palet van fluorescerende probes is ontstaan (exogene kleurstoffen, genetisch gecodeerde eiwitten, halfgeleider nanodeeltjes). Verschillende sample belichting fluorescerende gebaseerde technieken bloeide (zoals confocale of twee-foton microscopie) voor 3D beeldvorming uit te voeren en een grootste nadeel van deze techniek is fotobleken 2 verminderen. Andere beperkingen zijn de verplichting fluorofoor labeling aangezien de meeste moleculaire soorten niet intrinsiek fluorescerend en bijgevolg worden fluoroforen moeten kunstmatig worden geïntroduceerd in de afgebeelde monster. Deze kunstmatige manipulatie kan in het bijzonder storend zijn voor kleine moleculen of induceert pottiële foto-toxiciteit. Deze redenen maken fluorescentiemicroscopie niet goed geschikt voor in-vivo observaties. Derhalve wordt de toepassing van optische beeldvorming met een hoge gevoeligheid en specifieke moleculaire contrasten zonder gebruik van fluorescerende moleculen in biomedische wetenschap zeer wenselijk.
Verschillende niet-lineaire optische beeldvorming zonder etikettering of vlekken ontstaan, met inbegrip van de tweede-harmonische generatie (SHG) 3,4 en derde-harmonische generatie (THG) 5. SHG microscopie werd gebruikt om het structurele regeling op supramoleculaire niveau zoals microtubuli of collageen 6. THG wordt opgewekt uit optische heterogeniteiten als interface tussen een waterig medium en lipiden 7. THG werd ook aangetoond dat het myeline 8,9. Beide technieken kunnen worden uitgevoerd op een twee-foton fluorescentiemicroscoop en vereisen slechts een laserstraal. Maar ze vereisen een hoog vermogen laser-intensiteit (doorgaans 50mW bij 860 nm voor SHG 10, 25 - 50 mW bij 1180 nm voor THG 9), die schadelijk is in levende monsters, en voorzien niet in de chemische specificiteit die nodig is om op ondubbelzinnige wijze het specifieke biologische structuren.
Chemisch selectieve beeldvorming kan worden verkregen uit inherent vibratiespectroscopie signalen op basis van Raman scattering. Wanneer een lichtstraal raakt Overigens kan fotonen worden geabsorbeerd en verstrooid door atomen of moleculen. De meeste van de verstrooide fotonen wordt dezelfde energie, dat wil zeggen, frequentie als de invallende fotonen. Dit proces heet Rayleigh verstrooiing. Echter een klein aantal fotonen verstrooid op een optische frequentie verschillend van de frequentie van de invallende fotonen, dwz een inelastische verstrooiing genoemd Raman verstrooiing. Het verschil in energie is afkomstig van excitatie van vibrationele modes afhankelijk van de moleculaire structuur en milieu. Daarom spontane Raman scattering provides chemisch selectieve beeldvorming als verschillende moleculen hebben specifieke trillingsfrequenties. Het is echter beperkt vanwege de extreem zwak signaal. Confocale Raman microscopie ontwikkeld en biedt 3D ruimtelijke resolutie, maar vereist hoog gemiddeld vermogen en lange acquisitietijd 11. Om deze moeilijkheden te overwinnen, recente ontwikkelingen in de lasertechnologie hebben toegelaten dat de opkomst van niet-lineaire optische vibratie microscopie, in het bijzonder coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) 11,12,13.
CARS is een derde-orde niet-lineaire optische proces. Drie laserstralen, bestaande uit een pompbundel bij frequentie ω P, een Stokes straal bij frequentie ω S en een testbundel (meestal zijn de pomp) gericht in een monster en het genereren van een anti-Stokes straal bij frequentie ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. De anti-Stokes signaal kan aanzienlijk worden versterkt wanneer het frequentieverschiltussen de pomp en de Stokes balken is afgestemd op een Raman vibratiespectroscopie Ω = R (ω P - ω S). CARS signaal op basis van meerdere fotonen interactie. Het genereert dan ook een coherent signaal ordes van grootte sterker dan spontane Raman scattering.
CARS microscopie werd eerst experimenteel aangetoond door Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Verbeterde vervolgens de techniek door twee gerichte nabij-infrarood femtoseconde laserbundels met een objectieflens van een hoge numerieke apertuur, waardoor de phase matching voorwaarde CARS en worden de twee-foton niet-resonante 16 achtergrond. CARS microscopy heeft daarom ontwikkeld tot een krachtig hulpmiddel voor in levende cellen en weefsels imaging, door chemische detecteren moleculen zoals lipiden (via CH strekvibratie) 17,18, water (via OH rek trillingen), eiwitten, DNA in levende cellen 19,20 maar ook gedeutereerde chemische verbindings voor de farmaceutische en cosmetische toepassingen 21 22.
De belangrijkste beperking van lineaire microscopie afkomstig van de complexiteit en de kosten van de optische bronnen. Een CARS systeem vereist twee golflengte afstembare lasers met korte puls duur en met tijd en ruimte gesynchroniseerde puls treinen. Vroege CARS microscopen waren gebaseerd op twee gesynchroniseerde picoseconde Ti: saffier lasers 20. CARS imaging werd ook verkregen uit één femtoseconde Ti: saffier laser genereren van een supercontinuum lichtbron 23. Onlangs laserbronnen uit één enkel femtoseconde Ti: saffier laser is het pompen van een afstembare optische parametrische oscillatoren (OPO) gebruikt voor CARS microscopie. Deze set-up maakt intrinsiek tijdelijk gesynchroniseerd balken met een verschil van frequentie tussen de pomp en de Stokes bundel die het volledige moleculaire vibratiespectrum 24. Bovendien laser scanning microscoop gebaseerd op omzetkey fs laser en een OPO, in de eerste plaats gebruikt voor twee-foton fluorescentie (TPF) zijn nu beschikbaar voor niet-fysici. Het potentieel van een dergelijke set-ups kan sterk worden verbeterd, zonder dat aanvullende investeringen door de incorporatie van andere niet-lineaire optische beeldvorming, aangezien elke niet-lineaire (NLO) beeldvormingmodaliteit gevoelig is voor specifieke structuren of moleculen. Multimodale beeldvorming NLO kapitaliseert dus het potentieel van NLO microscopie voor complexe biologische monsters 25. De koppeling van deze technieken is het onderzoeken van vele biologische vragen toegestaan, met name op de vetstofwisseling, huid of kanker ontwikkelen 26, skeletspier ontwikkeling 27, atherosclerotische lesies 28. Bovendien is de toepassing van laserstralen met CARS geeft het vermogen van hoge frequentie imaging, dwz een aantrekkelijk middel om dynamische processen in vivo.
Het doel van dit werk is om elke stap uit te voeren t tonenhij CARS-techniek op een standaard multiphoton laser scanning microscoop. De microscoop is gebaseerd op een FSEC Ti: saffier laser en een OPO (door de gepompte Ti: saffier laser) bediend door een software voor biologen. De integratie werd uitgevoerd door de lengte van een van de laserstraal pad om te synchroniseren tijdig de twee bundels. We beschrijven de stap-voor-stap uitvoering van deze techniek die op basisachtergrond experimentele optica nodig. We illustreren ook CARS beeldvorming verkregen op myelineschede van heupzenuw van knaagdieren, en laten we deze beeldvorming kan gelijktijdig worden uitgevoerd met andere niet-lineaire optische beeldvorming, zoals standaard twee-foton fluorescentie-techniek en de tweede-harmonische generatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figuur 1. Schematische weergave van de algemene set-up Het omvat de Ti:. Sapphire (680 - 1080 nm) en de OPO (1050 - 1300 nm) lasers, de vertraging lijn met de 4 spiegels (M 1 tot 4 M), de snelle oscilloscoop, de fotodiode en twee vaste iris diafragma I 1 en I 2. Spiegels M 2 en M 3 zijn bevestigd op een lineaire vertaling podium waardoor de vertraging lijn lengte te veranderen met een micrometer resolutie. A 660 -. 685 nm band pass filter werd geplaatst in de voorkant van de fotomultiplicatorbuis (PMT) gebruikt voor CARS imaging Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Startup van het lasersysteem
- Controleer of de Ti: saffier golflengte is ingesteld op 800 nm of definieerdeze golflengte op de Ti: saffier voedingsbronbesturingsorgaan. Draai de sleutel uit Standby naar On om over te schakelen op de Ti: saffier laser.
- Zet de OPO laser op de achterkant van de OPO controller en open de Ti: saffier sluiter op de Ti: saffier voedingsbronbesturingsorgaan.
- Schakel de tablet-computer op te pompen het OPO. Klik op de OPO Connected en Remote Connected pictogrammen op de tablet. Wacht 30 - 40 minuten op te warmen.
- Schakel de microscoop computer en zet de "Microscope Components" switches. Start de software door te dubbelklikken op het pictogram op het bureaublad.
- In het tabblad software Acquisition, opent u de Laser gereedschap in de Setup Manager om zowel lasers opereren vanuit de software. Selecteer Ti: saffier laser On en OPO laser On. Controleer de waarde van de optische laservermogen (specifieke waarden van 3700 mW bij 800 nm en 700 mW bij 1000 nm).
- Om de bundel pad en lasers te configureren,Open het lichtpad gereedschap in de Setup Manager gereedschapsgroep en controleer doos de eerste Photomultiplier buis (PMT).
- Om de Ti controleren: saffier laser spot aan de uitgang van de doelstelling, opent u de Kanalen gereedschap in de Verwerving Parameter gereedschap groep. Selecteer de Ti: saffier vermogen bij lage waarde (ongeveer 1%), vermindering van de winst op 0 (geen afbeelding nodig is in dit stadium) en klik op de Continue-knop om het scannen procedure te starten om de laserstraal te lanceren door de microscoop doelstelling. Controleer de aanwezigheid van een rode vlek door directe waarneming door het positioneren van de IR laser smartcard aan de uitgang van de lucht microscoopobjectief (10X).
- Om de OPO laser ter plaatse controleren, stopt de scan van de Ti: saffier laser door te klikken op de knop Stop. Selecteer de OPO vermogen bij lage waarde in het venster Kanalen en klik op de Continue knop.
2. Microscoop Instellingen
- Handmatig op de dichroïsche spiegel met een cutoff golflengte bij 760 nm in de SidePort schuif in de oneindige ruimte boven de doelstelling neusstuk om het licht tot 760 nm van het monster te lanceren in de PMT's in niet-descanned detectie (NDD) mode.
- Stel de nauwe band pass filter bij 660-685 nm in de NDD reflector kubus in de voorkant van PMT1 op te nemen alleen de CARS signaal bij 670 nm om de resultaten die in dit werk te verveelvoudigen.
- Plaats een smalle band filter van 500 tot 550 nm in de NDD reflector kubus voor pMT3 op fluorescentie waarneming van het myeline. Plaats een smalle band filter, variërend 565-610 nm in de reflector kubus voor pMT4 voor SHG observatie.
- Om te selecteren in de software van de opname van het signaal op de detector met de ad hoc band pass filter, opent het lichtpad gereedschap in het menu Instellingen Manager tabblad Verwerving. Activeer de gewenste PMT (selectievakje) en selecteer een kleur voor dit kanaal. In dit werk, werd de groene gekozen voor auto's, rood voor fluorescentie en magenta voor SHG.
3. Temporal Synchronisatie
Opmerking: De twee laserstralen uit dezelfde Ti: saffier laser maar de OPO bundel wordt vertraagd wanneer het wordt gegenereerd zodat de twee bundels niet worden gesynchroniseerd ogenblik dat zij de microscoop bereiken. Het doel hier is om een van de twee bundels vertraging opnieuw synchroniseren ze tijdig voordat ze de microscoop bereiken.
- Contact maken met BNC kabels het ingangskanaal CH1 van de oscilloscoop om de elektrische BNC laservermogen (Sync. Out). Verbind de ingang kanaal CH2 van de oscilloscoop aan de fotodiode en kies de CH1 kanaal als de trigger kanaal door te drukken op het menu Trigger, dan is de main-menuknop Bron en dan is de side-menu-knop die overeenkomt met de geselecteerde C-kanaalH1.
- Positie en bevestig met optische montage berichten de fotodiode in het brandvlak van een lucht microscoop doelstelling (10X), of in de bundel pad van de microscoop na het verwijderen van de doelstelling. Opmerking: Verwijder indien nodig de condensor en zijn drager.
- In het Kanalen gereedschap (Acquisitie Parameter gereedschap groep), bepalen de Ti: saffier laser golflengte bij 830 nm bij laag vermogen (dat wil zeggen, minder dan 1% van het volledige vermogen). In het gereedschap acquisitiemodus, verminderen het scangebied op één punt om de fotodiode met de kleinste straal verlichten. Schakel de laser scan door te klikken op de Continue knop.
- Druk AUTOSET op de oscilloscoop voorpaneel en handmatig verplaatsen van de positie van de fotodiode op de pulstreinen te krijgen op het scherm. Druk op RUN / STOP-knop om het scherm te bevriezen.
- Om een kopie van de oscilloscoop scherm op te slaan, plaatst u een 3,5inch diskette in het diskettestation of sluit de GPIB-poort aan de achterzijde op een computer. Druk vervolgens op SHIFT HARDCOPY MENU drukt FORMAT (hoofd) naar TIFF beeldformaat te selecteren en geef in het menu Port de uitgang kanaal. Druk HARDCOPY knop om de oscilloscoop weergave van de puls treinen van de Ti op te nemen: saffier laser.
- Schakel de Ti: saffier laser scan door te klikken op de knop Stop. Door te klikken op Channels gereedschap bepalen de OPO signaal bij 1107 nm en een laag stroomverbruik. Schakel de OPO laser scan en noteer de pols treinen van de OPO laser op de oscilloscoop. Schakel de OPO laser scan.
- Vergelijk de tijdelijke verschuiving tussen de Ti: saffier en de OPO signalen.
LET OP: De tijdelijke verschuiving t verschuiving geeft de duur van de vertraging lijn L DelayLine die moet worden uitgevoerd naar aanleiding van de vergelijking: L delayLine = c5; t verschuiving waarbij c de snelheid van het licht. - Kies een van de laserlijnen.
LET OP: In dit werk, de Ti: saffier laser werd lijn gekozen omdat vrije ruimte beschikbaar is in de buurt van deze laser lijn was. Bovendien maakt deze keuze de herschikking van de laserlijn met een zichtbare laserlicht te bereiken. - Open de laserlijn door verwijdering van de beschermende buis op de plaats waar de vertragingslijn worden toegepast.
Let op! Draag geschikte veiligheidsbril en verwijder keten armbanden of kijken uit polsen. - Selecteer een golflengte in het zichtbare gebied om te kunnen gemakkelijk observeren de laserstraal (700 nm bijvoorbeeld bij laag vermogen in de kanalen instrument van de software). Schakel de laser scan.
- Plaats en bezet met optische montage berichten twee iris diafragma langs de open laser lijn. Positie een iris bij de uitgang van de vertraging lijn en plaats de andere iris bij de ingang van de periscoop.
LET OP: De periscope controles door twee gemotoriseerde spiegels bestuurd door de software de hoek van ingang van de laserbundel in de aftastkop van de laser scanning microscoop. - Verlaag het irisdiafragma opening en stel het diafragma posities op de laserstraal pad passen. Bevestig ze op de optische tafel. Stel de verticale positie van een derde mobiele irisdiafragma, om de hoogte van de laserstraal controleren tijdens het achtereenvolgens plaatsen van de vier spiegels van de vertragingslijn.
Opmerking: Deze irisdiafragma dient als controle voor de herschikking procedure die het pad te volgen. - Plaats de spiegel M1 aangebracht op een compacte kinematische spiegelhouder aan de ingang van de vertragingslijn (zie figuur 1) en de positie en de oriëntatie op de balk hoogte met het gebruik van de mobiele irisdiafragma handhaven passen. Plaats spiegels M2 en M3 (ook gemonteerd op compact kinematische spiegel mounts) bij 90 ° op de vertaling podium die op midco zal worden gepositioneerdurse. Plaats ze om de vertraging lijn lengte passen zoals eerder berekend.
- Stel de oriëntatie van M2 en M3 met behulp van de mobiele irisdiafragma. Stel M4 (ook bevestigd op een compacte houder) bij de uitgang van de vertragingslijn (vlak voor iris I 1 zoals getoond in figuur 1) en zorgvuldig pas de positie en hoek ten opzichte van het pad van de laserbundel passen door de twee vaste irisdiafragma.
- Plaats de laser smartcard aan de uitgang van het microscoopobjectief en controleer de laserbundel profiel op de pagina Continue inschakelen van de laser scan. Let op een uniform heldere schijf. Indien nodig, licht pas de oriëntatie van M4.
- Positie weer de snelle fotodiode onder de laserstraal in de steekproef focus vliegtuig van de microscoop. Houd u aan de tijdelijke verschuiving tussen de Ti: saffier laser en de OPO balk op de oscilloscoop.
Opmerking: Wijzig zo nodig de vertraging lijn lengte door het bewegen van het hele systeem M2, M3 gemonteerd op detranslatietrap (zonder de translatietrap tuning) voor beide pulsen synchroniseren. Wijzigingen van enkele centimeters kan worden gevergd.
4. Ruimtelijke Overlap van de balken
Opmerking: Om een CARS signaal te produceren, wordt de ruimtelijke overlapping van de twee laserstralen nodig. De afwisselende verlichting van beide bundels op dezelfde korrels gekleurd door met twee verschillende fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de ruimtelijke verschuiving te geven. Fijne aanpassingen van de spiegel posities kan dan het minimaliseren van de shift.
- Gebruik voorgemonteerd fluorescerende microbolletjes. Of zet microsferen in suspensie op schone microscoopglaasjes zoals hieronder beschreven:
- Voordat bemonstering, mix (op een cortex mixer of door sonicating) de kralen oplossing om zeker te zijn dat de korrels op uniforme wijze worden opgeschort.
- Toepassen 5 ul van de kralensuspensie aan het oppervlak van een glijbaan en verspreid met de pipetpunt. Wacht tot de druppel te drogen en breng daarna 5 ui mounting medium, zoals glycerol, water of onderdompeling olie via droge monster kralen. Bedek het monster met een dekglaasje en sluit de dekglaasje met sneldrogende lijm of gesmolten paraffine.
- Plaats het op een microscoop dia onder de doelstelling 20X water vast fluorescerende polystyreen korrels. Voeg enkele druppels water aan de doelstelling onder te dompelen.
- Om de focus op de parels te bereiken, opent u het tabblad Zoek in de software van de laser scanning-modus te schakelen naar de directe waarneming van het monster met het oog, door op de knop Online. Open het oculair tool om de ad hoc-filter te selecteren en schakel de halogeenlamp door te klikken op de pictogrammen.
- Handmatig verwijderen van de dichroïsche spiegel in de SidePort slider in de oneindigheid ruimte en gebruik maken van de focalisatie van de microscoop om het monster vlak scherpstellen door het observeren van de kralen met de oculairs. Vervang de dichroïsche spiegel.
- In deLokaliseren tab, schakelen naar de laser scanning modus door op de knop Offline. Ga naar het tabblad Overname om de parameters voor het scannen te definiëren: selecteer de grootte van het kader tot 512 pixels, een scansnelheid van 9, een gemiddelde van 1, een beetje diepte van 8 bit en verhoging van de scan gebied tot het maximum.
- In het Kanalen instrument van het tabblad Verwerving, voeg een Track (Track 1) als deze niet al gemaakt. Kies de golflengte van 830 nm en een laag stroomverbruik voor de Ti:. Saffier laserstraal Vink de kleur groen in de Track 1 doos uit het raam kanalen en in de pMT3 of pMT4 box van het lichtpad venster.
- In het Kanalen instrument van het tabblad Verwerving, voeg een tweede Track (Track 2). Kies de golflengte van 1107 nm en een laag stroomverbruik voor het OPO laserstraal. Vink de kleur rood in de Track 2 box van het raam kanalen en in de doos pMT3 uit de
- Pas de winst van beide tracks op 600. Dan, achtereenvolgens van toepassing de scan van de twee bundels op het monster door te klikken op Continue.
- Let op het beeld in het scherm gebied in de 2D-weergave. In het scherm View Option regelblok, past het scherm intensiteit.
Opmerking: Indien nodig verplaatst enigszins de focalisatie om de focus vlak van de parels te vinden. Pas de Crop en zoom het beeld in een enkele kraal of in een groep van aangrenzende kralen.- Gebruik de periscoop controller aan de balken elkaar overlappen in xy-vlak. In de software, opent u het tabblad Onderhoud. Klik op de System Options en gereedschappen venster Gemotoriseerde Periscope weer te geven. Gebruik grove en fijne aanpassingen van de periscoop spiegels van de Ti: saffier laserstraal in om te synchroniseren in de ruimte beide beelden.
- Voor de periscoop manipulatie, gebruik dan de eerste aanpassing bars voor verticale en de second een voor horizontale bewegingen van de laserstraal. Beweeg de balk met de ingang spiegel tot het beeld licht zichtbaar, en vervolgens te compenseren voor de laser intensiteit met de uitvoer spiegel van de periscoop door te klikken op "input" en "output".
- Om verticaal overlappen de balken, in het tabblad onderhouden, opent u de Collimator gereedschap en pas de waarde van de brandpuntsafstand van de Ti: saffier laserstraal.
- Verplaats voorzichtig de doelstelling verticale positie van het verschil in focus te controleren op beide beelden. Of, neem een z-stack van het monster door de opening in het tabblad Overname de Z-Stack gereedschap en kies de verschillende parameters (bereik, het aantal schijfjes). Druk Ortho in het beeld op het scherm gebied om de balken in axiale doorsnede te zien. Maximaliseren van de z-overlap door het doen van dezelfde procedure meerdere malen.
5. De laatste aanpassingen en Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Signal Observation van Olive Oil Droplets
- Doe een druppel olijfolie op een glazen plaat en bedek het met een glazen afdekplaat slip. Voeg enkele druppels water op een 20x water immersie objectief onder te dompelen. Richten op de rand van het dekglas met de oculairs (zoals hierboven in 4,2).
- In het Kanalen instrument van het tabblad Verwerving, selecteert u in Track 1 de golflengte van 830 nm voor de Ti: saffier laser en 1107 nm voor het OPO. Vink beide lasers in Track 1 tot een gelijktijdige scan van beide lasers te krijgen. Set bevoegdheden bij lage waarde voor een begin.
- In het lichtpad venster selecteert PMT1. Schakel de laser scans door te klikken op de Continue knop. Verplaats lichtjes de focus naar het laserlicht te leveren in de olie dunne laag.
- Vergroot zonodig de optische sterkte van beide lasers. Pas de weergave-intensiteit in het scherm View Option control block. Verplaats de vertaling fase van de vertraging lijn totdat het signaal sigdend verbeterd.
- Na de boete rooilijnen compleet zijn, controleer dan of het is echt een CARS signaleren: Verplaats lichtjes De vertaling stadium; de intensiteit van het signaal moet zwakker. En / of schakel een van de laserbundel, hetzij Ti: saffier laser of OPO. Opnieuw is er een sterke verval in intensiteit in vergelijking met de CARS signaal moet zijn.
- Om het maximale CARS signaal te bereiken, selecteert u de optie op de software tot een waarde van de gemiddelde intensiteit van het gehele beeld te bieden (in het Histo van het tabblad scherm gebied). Stel de golflengte (enkele nm), vervolgens de x, y, z posities van de focus bundel de gemiddelde intensiteit te maximaliseren.
6. Behuizing van het lichtpad van de Delay Line
- Aangezien het uiteindelijke systeem is gewijd aan niet-fysici, omsluiten het lichtpad van de vertraging lijn met buizen of een behuizing box, de rechtstreekse toegang tot schadelijke niet-zichtbare hoog piekvermogen laserstraal te voorkomen. Zorg om een toegang tot de translatietrap biedenknop.
7. Golflengte Tuning voor CARS
- Gebruik de vergelijking
afstemmen de lasergolflengten de gewenste Raman trillingen. Om de resultaten die in dit werk om de afbeelding CARS reproduceren signaal van CH bindingen met stretching trilling van 3015 cm -1, selecteert λ Ti: saffier = 830 nm en λ OPO = 1095 nm.
OPMERKING: Raman kenmerkende trillingsfrequenties waargenomen in biologische monsters, zoals water, kan CH binding worden in Evans et al 13 of Ellis et al 29... - Gebruik de vergelijking
de emissiegolflengte van CARS signaal bepalen. Voor CH binding beeldvorming door CARS, kies dan een smalle band filter bij 670 nm sinds λ CARS = 670 nm met laser golflengten die in 7.1.
OPMERKING: Een mobiele telefoon applicatie is avbaar te λ CARS berekenen op basis van λ P en S λ-waarden (zie referentie 30).
afstemmen de lasergolflengten de gewenste Raman trillingen. Om de resultaten die in dit werk om de afbeelding CARS reproduceren signaal van CH bindingen met stretching trilling van 3015 cm -1, selecteert λ Ti: saffier = 830 nm en λ OPO = 1095 nm. 
de emissiegolflengte van CARS signaal bepalen. Voor CH binding beeldvorming door CARS, kies dan een smalle band filter bij 670 nm sinds λ CARS = 670 nm met laser golflengten die in 7.1. 8. Waarneming van CARS Signal en Stained myeline uit heupzenuw Cuts
Opmerking: Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele regelgeving.
- Bereid de axiale en longitudinale heupzenuw sneden op een microscoopglaasje zoals weergegeven in Ozcelik et al. 31.
- Bereid de fluoromyelin rode vlekken oplossing door verdunning van de voorraadoplossing 300-voudig in PBS. Overspoelen de zenuw snijdt met de kleuroplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing en was 3 maal gedurende 10 min met PBS.
- Plaats de bezuinigingen onder de 20X water immersie objectief. Plaats een dekglaasje. Voeg enkele druppels PBS om de doelstelling te dompelen en de focus van de doelstelling aan te passen om een duidelijk beeld van de bezuinigingen door het oculair te krijgen (zoals eerder beschreven in 4.2). <li> In Track 1 Selecteer de Ti: saffier en de OPO lasers en hun golflengten definiëren tot 830 nm en 1095 nm, respectievelijk. In het lichtpad venster selecteert PMT1 en groene kleur.
- Volg 2, selecteert u de OPO laser enige (golflengte 1095 nm). In het lichtpad venster selecteert pMT4 en rode kleur.
- Voor beide lasers, selecteert u een laag vermogen en stel de winst tot 600 voor een begin. Schakel de laser scant en pas de volgende parameters om auto's te verbeteren en fluorescentie signaal contrasten: vermogenswaarden, vertaling podium knop (zeer licht), golflengten (enkele nm), vertoning intensiteit.
- Tot de uiteindelijke beelden op te nemen met een hoge resolutie, selecteert u in het hulpprogramma Acquisition Mode de volgende parameters: framegrootte van 1024 pixels, scansnelheid van 7, middeling van 4. Klik op de Snap knop voor het opnemen van een enkel beeld. Sla de afbeelding op in de eigen vormbij aan het imago en de volledige overname parameters vast te leggen.
9. Waarneming van CARS en SHG Signalen van heupzenuw Cuts
- Bereid de Ischiaszenuw zoals gepresenteerd in Ozcelik et al. 31.
- Volg de procedure zoals beschreven in deel 8 om een beeld te krijgen door middel van de oculairen en CARS signaalparameter (Track 1) te selecteren.
- Volg 2, selecteert u de OPO laser enige (golflengte 1095 nm). In het lichtpad venster selecteert pMT3 en magenta kleur.
- Volg de procedure zoals beschreven in deel 8 inschakelen van de laser scant en redden hoge resolutie beelden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De pulstrein frequentie van de standaard Ti: saffier laser is meestal rond de 80 MHz. De OPO heeft dezelfde frequentie omdat deze wordt gepompt door de Ti: saffier laser. Een snelle oscilloscoop van ten minste 200 MHz is daarom noodzakelijk. Een snelle fotodiode in het bereik 600 tot 1100 nm is ook vereist. De maximale temporele verschuiving optreedt wanneer de Ti: saffier en de OPO worden verschoven van 1 / (2 x 80 x 10 6) = 6,2 nanoseconden. Het komt overeen met de verschuiving van 1,9 m stralengang Figuur 2 toont de pulstrein opgenomen van de OPO laser (A) en de Ti:. Saffier laser zonder vertragingslijn (B) en de ingestelde vertragingslijn (C ). De pulstreinen worden dus ruwweg gesynchroniseerd in de tijd met de vertragingslijn uitgevoerd zoals getoond in figuur 2A en 2C.
pg "/>
Figuur 2. Laser pulstrein opnames voor de temporale synchronisatie Opname van pulstreinen bij de microscoop monstervlak met een 10X objectief van de OPO balk (A), de Ti:. Sapphire laserstraal zonder (B) en de vertragingslijn (C ). De bovenste curve van elke grafiek plots het signaal direct opgenomen van de BNC connector op de achterkant van de Ti: saffier laser (Sync out connector.). De oscilloscoop trigger is ingesteld op dit signaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De ruimtelijke overlap van de twee bundels kunnen worden verkregen door de visualisatie van fluorescentie op een microscoopglaasje (figuur 3A) vaste polystyreenkorrels. Figuur 3B toont de afbeelding van drie nabijgelegen korrels door deOPO laser op 1107 nm (rood valse kleur) en door de Ti: saffier laser op 830 nm (groen valse kleuren). De ruimtelijke verschuiving tussen beide laserbundels is gecompenseerd volgens de procedure van de ruimtelijke synchronisatie eerder beschreven (Figuur 3C).
Figuur 3. ruimtelijke overlap van de balken. Algemeen beeld van de fluorescerende microbolletjes (A). Inzoomen op 3 aangrenzende microsferen. De verlichting van kralen aan 830 en 1107 nm toont een ruimtelijke verschuiving van de kraal afbeeldingen (valse kleuren) (B). Na x, y, z aanpassingen, worden de kraal beelden samengevoegd (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De laatstestap om de precieze temporele aanpassing CARS activeren bereiken eenvoudig te realiseren door beeldvorming olijfolie druppels (met tientallen CH bindingen 32) en door het bewegen enigszins de spiegels van de vertragingslijn om de synchronisatie te voltooien in de tijd van zowel laser pulstreinen. Figuur 4 toont beelden van olijfolie druppel afgegeven uit de Ti: saffier laser belichting alleen (Figuur 4A) en de OPO alleen verlichting (figuur 4B). Beide bundels gelijktijdig toegepast induceren duidelijk signaalversterking (Figuur 4C) en 670 nm, wat overeenkomt met een intrinsieke CARS signaal van koolstof-waterstof (CH) strekvibratie met een Raman trilling bereik rond 2800 - 3100 cm -1. CARS signaal (C) verdwijnt wanneer men de twee bundels wordt uitgeschakeld. Aangezien olijfolie bevat natuurlijke fluoroforen 33, met name chlorofylmoleculen straling in het bereik 650-670 nm, de zwak signaal in (A) en (B) is een multiphoton fluorescentie proces. De intensiteit van deze signalen is enkele ordes van grootte lager dan de CARS-signaal. Daarom is het niet de meting van het CARS signaal verstoren.
Figuur 4. Final prima tijdelijke regelingen voor auto's signaleren uitbraak. Olijfolie druppels kan worden gebruikt om af te stemmen in de tijd beide bundels door het aanpassen van de vertraging lijn lengte van de lineaire vertaling podium met micrometer drive. De druppeltjes van onder (A) 830 nm laser alleen en onder lichte (B) 1107 nm laserlicht een zwak signaal tonen slechts. Onder gelijktijdig oplichten (C), wordt duidelijk signaal verbetering waargenomen, die overeenkomt met de CARS signaal. Schaal bars zijn 100 micrometer. Raman trillingen piek bij 3015 cm -1. Klik op haare voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De myelineschede is een biologische structuur door specifieke cellen die wikkel en de plasmamembraan condensaat rond axonen van neuronen in centrale en perifere zenuwstelsel 34. Deze mantel is sterk verrijkt in verschillende lipiden. We gebruikten hier de myelineschede van de beenzenuw van een muis. Transversale en longitudinale heupzenuw dwarsdoorsnede segmenten zijn gekleurd voor twee-foton fluorescentie beeldvorming van myeline bij 1095 nm zoals getoond in figuur 5B en figuur 5E, respectievelijk. Een fluoromyelin rode kleurstof, die selectiviteit voor myeline heeft werd gebruikt 35. Deze monsters zijn tegelijkertijd verlicht bij 830 en 1095 nm en de CARS signaal werd waargenomen (Figuur 5A en figuur 5D). In figuur 5A-C, de cirkels komen overeen met myelineschede rond de axonen (lege ruimte inde kant van de ringen) in dwarse doorsnede. Zoals getoond in figuur 5C en 5F, wordt dezelfde structuur hebben terwijl overlappen CARS en fluorescentiebeelden. We concluderen dat gelijk niveau vindt verkrijgbaar CARS dus zonder gebruik van fluorescente labeling.
Figuur 5. CARS en gekleurd myeline beeldvorming van heupzenuw bezuinigingen. (A) transversale en (D) longitudinale delen van label-free CARS beeldvorming van myeline. (B) transversale en (E) longitudinale delen van hetzelfde monster gekleurd door de fluoromyelin rode kleurstof onder twee-foton fluorescentie verlichting bij 1095 nm. (C) transversale en (F) langsinsnijding overlap van beide beelden. Schaal bars zijn 10 urn. Gemiddeld optische bevoegdheden waren 5 mW bij 830 nm en 16mW bij 1095 nm voor CARS signaal. Gemiddelde optische vermogen was 8 mW bij 1095 nm twee-foton fluorescentiebeeldvorming. Raman trillingen piek bij 2915 cm -1. CARS signaal verdwijnt door het stoppen van de scan van een van de laser of door het bewegen van de vertaling podium uit de Raman resonantie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bovendien aan CARS beeldvorming beschikbaar microscopie maakt het mogelijk om gelijktijdig genereren tweede harmonische van de collageenvezels in het buitenoppervlak van de heupzenuwen. Deze extra afbeelding vereist alleen het gebruik van een andere detector een signaal op te nemen bij 550 nm (de helft van de golflengte van de OPO) aangezien een smal banddoorlaatfilter 670 nm wordt gebruikt voor het CARS signaalopname. Figuur 6 toont beeld contrast van myeline afgebeeld in valse groene kleur (CARS signaal oply in figuur 6A) omringd door collageenvezels geïllustreerd in valse kleur magenta (SHG alleen in figuur 6B). CARS signaal werd bereikt met een gemiddelde optische bevoegdheden van 4 mW bij 830 nm en 13 mW bij 1095 nm, terwijl het vereiste 50 mW bij 1095 nm om de SHG signaal te verkrijgen. veel lagere optische energie is daarom verplicht CARS verkrijgen signaal vergeleken met SHG of THG (niet getoond) signalen in onze biologische monsters.
Figuur 6. CARS SHG en beeldvorming van de muis heupzenuw. (A) CARS beeldvorming, (B) SHG beeldvorming en (C) gelijktijdig visualisatie van myeline door CARS beeldvorming (groen valse kleur) en door collageen SHG beeldvorming (in magenta) op de muis heupzenuw. Gemiddeld optische bevoegdheden waren 4 mW bij 830 nm en 13 mW bij 1095 nm voor auto's. Gemiddeld optisch vermogen was 50 mW bij 1095nm voor SHG. Schaal bar is 10 micrometer. Raman trillingen piek bij 2915 cm -1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest uitdagende gedeelte van het werk is de tijd synchroniseren van de laserstralen. Het vereist een snelle fotodiode gecombineerd met een snelle oscilloscoop, maar slechts een ruwe overlapping in de tijd kan worden uitgevoerd op het eerste. Dan is een verdere aanpassing van enkele cm is vereist. Tenslotte micrometer beweegt met een lineaire translatietafel maakt het uitvoeren van de uiteindelijke fijnafstelling van de vertragingslijn lengte teneinde het CARS kan activeren. Dit signaal wordt in een smal traject van ongeveer 20 micrometer, zoals waargenomen door het afstemmen van de translatietrap micrometer rijden. Het komt overeen met een piek verschuiving van de bundels van ongeveer de helft van de duur van de puls, dat wil zeggen, 140 FSEC. De ruimtelijke overlapping van de twee lichtbundels die nodig is voor het CARS signaal op een normale koplampen dergelijke laser scanning microscoop systeem.
De uitvoering van de vertragingslijn kan enkele weken worden bereikt door biologen heeft basisachtergrond in experimental optica of in samenwerking met natuurkundigen. Speciale zorg moet worden genomen voor de keuze van de spiegels reflectieverliezen minimaliseren. Als de meerderheid van de materialen om de vertragingslijn bouwen betaalbaar, de oscilloscoop die nodig is geen standaard oscilloscoop. Hieruit volgt dat vanaf enkele dagen zijn voldoende om de synchronisatie procedure tijd te voltooien, het lenen van de oscilloscoop uit een fysieke laboratorium lijkt de beste optie. Ruimtelijke overlapping kan tijdrovend omdat de afstemming van verschillende spiegels en lenzen (die kan worden gemotoriseerd afhankelijk van het laser-scansysteem) vereist zijn. Eerder CARS lasersysteem gebaseerd op twee elektronisch gesynchroniseerde Ti: saffier laser had een probleem met de lange termijn (tientallen minuten tot uren) tijdelijke puls overlappen. Dit probleem is volledig opgelost met OPO gepompt met een unieke laserbron 20,21. Met een dergelijk lasersysteem, en het gebruik stevig vastgeklemd optica, stralen geen temporele walk-off tussen de pomp en Stokes waargenomen overmaanden van de exploitatie.
Een belangrijke beperking van de techniek is dat CARS CARS signaal kan zonder de aanwezigheid van resonante moleculen (van het oplosmiddel of de verspreiders) 11. Deze niet-resonante achtergrond kan de gevoeligheid te beperken. Manieren om deze achtergrond te minimaliseren omvatten de configuratie van detectie (vooruit of achteruit detectie), de kenmerken laser (femtoseconde en picoseconde), de keuze van de methoden voor de doelstelling of beeldbewerkingtechnieken onderdompelen oplossing. Een achterwaartse detectie maakt het mogelijk om de niet-resonante achtergrond 11 minimaliseren het werd gebruikt in dit werk (Figuur 1). Femtoseconde Ti: saffier-lasers bieden een hoge intensiteit van de piek voor de niet-lineaire optische processen zeer gewenst. Echter, in het spectrale domein, de breedte van de meeste Raman lijnen kleiner is dan de spectrale breedte van een femtoseconde puls dat het past de spectrale breedte van een picoseconde puls. Daarom wordt het gebruik van picoseconde laser verhoogt de verhouding of resonant signaal niet-resonante achtergrond. Voor CH bindingen in lipide, vanwege de hoge dichtheid van de banden, de niet-resonante achtergrond verwaarloosbaar voor een femtoseconde laser. Om de achtergrond effect te verminderen, kan het aftrekken een verwijzing beeld opgenomen onder off-resonantie van ook worden toegepast (niet klaar voor dit werk).
Ondanks het gebruik van nabij-infrarode laserstralen waardoor diepe penetratie in het weefsel (200-300 micron), de praktische indringdiepte verkregen in zenuwuiteinden beeldvorming was ongeveer 50 micron, waarbij de experimenten uitgevoerd in dit werk. Maar deze parameter zeer afhankelijk van het biologische weefsel en afgebeeld, omdat alle gemyeliniseerde vezels uitgelijnd en geconcentreerd in een kleine ruimte, waarschijnlijk perifere zenuwen niet vormen de beste monsters voor uw medewerking lichtinval. Bovendien zijn enkele seconden nodig om hoge resolutie beelden (1024 x 1024 pixels), waarbij de visualisatie van in vivo beperken opnemen
CARS microscopie laat chemisch specifieke selectieve beeldvorming met een resolutie in de buurt van de diffractie limiet. Deze techniek geen etikettering, en aangezien de Ti: saffier laser is regelbaar van 700 tot 1000 nm en de OPO laser van 1100 tot 1300 nm, bestrijkt het volledige spectrum regio moleculaire trillingen in biologische systemen (van 500 tot 7000 cm -1). Het is dus toepasbaar en zeer discriminerende DNA, eiwitten, lipiden, of water, terwijl de sterker signaal voort uit de lipide CH halfsteensverband. Photodamage wordt ook verminderd als gevolg van de lage laservermogen gebruikt om het CARS genereren in vergelijking met de tweede harmonische generatie imaging. Aangezien CARS beeldvorming kan worden gerealiseerd met lage laservermogen en zonder invasieve labels is derhalve een middel bij uitstek voor in vivo studies.
Laser scanning microscopen with een femtoseconde Ti: saffier laserbron gecombineerd met een OPO zijn grotendeels beschikbaar voor twee-foton microscopie geworden in vele biologische laboratoria. Sinds de ruimtelijke synchronisatie al deze systemen wordt uitgevoerd, de temporele overlapping procedure van de twee balken in dit werk beschreven, brengt een extra techniek van microscopie zonder dure extra apparatuur. Zo is de gewijzigde set-up zorgt voor gelijktijdige beeldvorming van cellen of levend weefsel met een tweede of derde harmonische generatie (SHG, THG), twee-foton fluorescentie en auto's. CARS techniek een groot potentieel aangetoond voor in vivo beeldvorming van levende dieren die de studie van dynamische processen (zonder vlekken of genetische manipulatie). Veelbelovende toepassingen omvatten in vivo label-free non-invasieve beeldvorming lipide, die bijvoorbeeld gebruikt voor real-time imaging van neuronale myeline in levende spinale weefsels 36, voor het bestuderen van lipide-gerelateerde aandoeningen (obesitas, demyeliniserende en cardiovascular ziekten) 37, de menselijke huid penetratie mechanismen 22 of huidaandoeningen 38. We geloven dat toekomstige verbeteringen betrekking hebben op het gebruik van speciale objectieven, zoals micro-GRIN doelstellingen of miniatuurobjectief de indringdiepte van de CARS signaal versterken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400 - 480 nm; 500 - 550 nm; 465 - 610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480 - 20,000 nm, Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661 - 690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
References
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
- Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
- Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
- Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
- Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. New York. (1995).
- Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
- Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
- Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
- Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
- Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
- Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
- Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X.
- Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
- Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
- Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
- A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from: http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator (2015).
- Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
- Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
- Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
- King, R.
- Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
- Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
- Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).
