Summary
분자 결합의 고유 진동에 따라 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경 레이블없는 화학적으로 선택적 라이브 세포 이미징을 허용합니다. 사파이어 레이저와 OPO 레이저 본 작업은 펨토초의 Ti에 기초한 표준 광자 레이저 스캐닝 현미경에 상보 현미경 기술의 구현을 제공한다.
Abstract
펨토초 티타늄 합성 레이저 스캐닝 현미경 : 레이저 라인을 복제하는 사파이어 레이저 및 광 파라 메트릭 발진 (OPO)은 생물학 가능하게되었다. 이 시스템은 기본적으로 멀티 채널 이광자 형광 현미경을 위해 설계된다. 그러나, 임의의 수정없이, 상기 제 2 고조파 발생 (SHG) 또는 3 고조파 발생 (THG) 보완 비선형 광학 현미경은 구성 분자 또는 수성 중간의 라벨없는 결상을 가능하게 세트해서 수행 될 수있다 지질 인터페이스. 이러한 기술은 생체의 관찰에 적합하지만, 화학적 특성으로 제한된다. 선택적 화학적 이미징 라만 산란에 기초한 고유 진동 신호로부터 얻을 수있다. 공 초점 라만 현미경은 3D 공간 해상도를 제공하지만, 높은 평균 전력 및 긴 획득 시간이 필요하다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 레이저 기술의 최근 발전은 (STABLE)을 허용했다비선형 광학 진동 현미경의 opment, 특히 코 히어 런트 반 스톡스 라만에 (CARS)을 산란. CARS 현미경 따라서 화학적으로 매핑 (OH 신축 진동을 통해) (CH 신축 진동을 통해) 지질, 물, 단백질이나 DNA에 의해 생물학적 라이브 세포 이미징을위한 강력한 도구로 떠오르고있다. 본 연구에서 우리는 표준 OPO 결합 광자 레이저 스캐닝 현미경에 CARS 기술의 구현을 설명한다. 이것은 레이저 빔의 경로 중 하나의 길이를 조정함으로써 2 개의 레이저 라인의 시간 동기에 근거한다. 우리는 기존 광자 시스템에서이 기법의 단계별 구현을 제시한다. 실험 광학의 기본 배경은 도움이되고 제시된 시스템은 고가의 추가 장비가 필요하지 않습니다. 우리는 또한 쥐의 좌골 신경의 수초에 얻은 이미징 CARS을 설명하고, 우리는이 영상이 같은 표준 t 다른 비선형 광학 이미징, 동시에 수행 할 수 있음을 보여WO 광자 형광 기법 및 제 고조파 발생.
Introduction
광학 현미경은 세포 내 해상도로 생물학적 시스템을 살고 동적 프로세스의 비파괴 시각화를위한 주요 기술이되었다. 형광 현미경으로 인해 높은 특이 도와 민감도 1 생균 현재 가장 많이 사용되는 영상의 대비이다. 형광 프로브의 큰 팔레트 (외인성 색소, 유전자 인코딩 단백질, 반도체 나노 입자를) 등장했습니다. 다양한 샘플 조명 형광 기반 기술은 3 차원 영상을 수행하고 2 photobleaching에되는이 기술의 주요 단점을 줄이기 위해 (예 촛점 또는 이광자 현미경 등) 번성하고있다. 분자 종의 대부분은 본질적으로 형광하지 않으며, 따라서 이러한 형광 인위적으로 몇 군데 샘플에 도입 할 필요가 있기 때문에 다른 제한은 형광 라벨의 요구 사항을 포함한다. 이 인공 조작은 작은 분자 특히 파괴적이거나 냄비를 유도 할 수있다ential 사진 독성. 이러한 이유는 생체 관측 형광 현미경하지가 적합합니다. 따라서, 형광성 분자의 사용없이 고감도 특정 분자 대조 광학 이미징 기술의 사용은 바이오 메디컬 사이언스에서 매우 바람직하다.
라벨이나 얼룩없이 여러 비선형 광학 이미징 기술은 두 번째 고조파 세대 (SHG) 3,4와 세 번째 고조파 세대 (THG) 5를 포함 등장했다. SHG 현미경은 미세 소관 또는 콜라겐 6으로 초분자 레벨에서 화상 구조 배치로 사용되어왔다. THG는 수성 매질 및 지질 (7) 사이의 인터페이스로서 광 이질성로부터 생성된다. THG는 이미지 수초 8,9로 증명되었다. 두 기술들은 이광자 형광 현미경상에서 구현 오직 하나의 레이저 빔을 필요로 할 수있다. 이들은 높은 전력 레이저 강도를 필요로하지만 (전형적으로 50생활 샘플에 해로운이며, 명확하게 이미지 특정 생물학적 구조에 필요한 화학적 특이성을 제공하지 않는 THG 9 1,180 ㎚), 50 mW의 - SHG (10), (25) 860 nm에서 mW의.
선택적 화학적 이미징 라만 산란에 기초한 분자 고유 진동 신호로부터 얻을 수있다. 광 빔 상관 닿으 광자 흡수 자나 분자에 의해 산란 될 수있다. 산란 된 광자의 대부분은 입사 광자 에너지와 같은, 즉, 주파수를 가질 것이다. 이 프로세스는 레일리 산란이라고한다. 그러나, 광자 소수 라만 산란이라 비탄성 산란 과정, 즉, 입사 광자의 주파수와 다른 주파수의 광 산란한다. 에너지의 차이는 분자 구조 및 환경에 따라 진동 모드의 여기로부터 기인한다. 따라서, 자발 라만 산란 잠십오 화학적으로 선택적 영상은 다른 분자는 특정 진동 주파수를 가지고있다. 그러나 그것 때문에 매우 약한 신호의 제한됩니다. 공 초점 라만 현미경이 개발 및 3D 공간 해상도를 제공하지만, 높은 평균 전력 및 긴 획득 시간 (11)을 필요로하고있다. 이러한 어려움을 극복하기 위해 레이저 기술의 최근 발전은 특히 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란의 비선형 광학 진동 현미경의 상승 (CARS) 11,12,13 수있다.
CARS는 3 차 비선형 광학 과정이다. 주파수 ω의 P에 펌프광 구성된 세 개의 레이저 빔은 주파수 ω의 S에서 스톡스 광 및 프로브 빔 (주로 펌프 임) 시료에 집중되고 (주파수 ω AS =에서 반 스톡스 빔을 생성 2ω P - ω의 S) 14. 안티 - 스토크 스 신호를 크게 향상시킬 수있을 때, 주파수 차이(- ω S ω P) 펌프와 스톡스 라만 분자 진동 Ω의 R =로 조정되어 빔 사이. CARS 신호는 다수의 광자 상호 작용을 기반으로합니다. 따라서, 자발 라만 산란 강도보다 강한 간섭 신호의 순서를 생성한다.
CARS 현미경은 제 실험적 던컨 등. (15)에 의해 입증되었다. Zumbusch 외는. 높은 개구 수의 대물 렌즈를 두 초점 근적외선 펨토초 레이저 빔을 이용하여 CARS의 위상 정합 조건을 허용하고 이광자 비 공진 배경 (16)을 회피하여, 그 기술을 향상시켰다. CARS 현미경 따라서 화학적으로 살아있는 세포 (19, 20)을로 (CH 신축 진동을 통해) 지질 같은 분자 (17, 18), 물 (OH 신축 진동을 통해), 단백질, DNA를 검출함으로써, 살아있는 세포와 조직 이미징을위한 강력한 도구로 떠오르고있다 또한 화학 물질 화합물을 중수 소화제약 (21) 및 화장품 응용 프로그램 (22)에 대한의.
비선형 현미경의 가장 큰 한계는 복잡성과 광원의 비용에서 기인한다. CARS 시스템은 짧은 펄스 기간과 시간적 및 공간적 동기화 펄스 트레인 두 파장 가변 레이저가 필요합니다. 초기 CARS 현미경은 두 개의 동기화 된 피코 초 티를 기반으로했다 : 사파이어 레이저 (20). 초 연속 광원 (23)을 생성하는 사파이어 레이저 : CARS 이미징은 단일 펨토초 TI의 얻었다. 최근에, 단일 펨토초 Ti로 이루어지는 레이저 소스 : 가변 광 파라 메트릭 발진기 (OPO)를 펌핑 사파이어 레이저는 CARS 현미경에 사용되어왔다. 이 셋업은 본질적으로 일시적으로 펌프와 전체 분자 진동 스펙트럼 (24)을 포함 스톡스 빔 사이의 주파수의 차이 빔을 동기화 허용한다. 또한, 레이저 주사 현미경 턴에 기초주로 두 광자 형광 (TPF)에 사용되는 키 FS 레이저와 OPO가 아닌 물리학에 대해 사용할 수 있습니다. 각 비선형 (NLO) 영상 기법은 특정 구조 나 분자에 민감하기 때문에 이러한 셋업의 전위가 크게 다른 비선형 광학 영상의 혼입에 의해 보충 투자를 필요로하지 않고 향상 될 수있다. 복합 NLO 촬상 따라서 복잡한 생물학적 시료 25 NLO 현미경의 전위 대문자. 이러한 기술의 결합은 지질 대사, 피부 암 개발 (26), 골격 근육 발달 (27), 동맥 경화성 병변 (28)에 특히 많은 생물 학적 질문의 조사를 허용했다. 또한 CARS과 레이저 빔 주사의 구현은 고속 촬상, 즉 생체 역학 과정을 연구하기위한 매력적인 도구의 기능을 제공한다.
이 연구의 목적은 t을 구현하는 각 단계를 보여주는 것입니다표준 광자 레이저 스캐닝 현미경에 그는 CARS 기술. 현미경은 FSEC 티를 기반으로 : 사파이어 레이저와 OPO : 생물 학자를위한 소프트웨어에 의해 동작합니다 (티 의해 펌핑 레이저 사파이어). 통합 시간에 두 개의 빔을 동기화하기 위해 상기 레이저 빔 경로 중 하나의 길이를 조정함으로써 수행 하였다. 우리는 실험 광학의 기본적인 배경을 필요로이 기술의 단계별 구현을 설명합니다. 우리는 또한 CARS는 쥐의 좌골 신경의 수초에서 얻은 영상 설명, 우리는이 영상은 표준 두 광자 형광 기술과 두 번째 고조파 세대로, 다른 비선형 광학 영상을 동시에 수행 할 수 있습니다 보여줍니다.
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Protocol
그림 1. 일반적인 셋업의 개략도 그것은 티타늄과 같습니다. 사파이어 (680 - 1080 ㎚)와 OPO (1,050 - 1,300 ㎚) 레이저, (M 4 M 1) 4 거울 지연 라인을, 빠른 오실로스코프, 포토 다이오드와 두 개의 고정 조리개 진동판 I 1 I 2. 미러 M 2 및 M 3 마이크로 미터의 분해능으로 지연 라인의 길이를 변경할 수 있도록 선형 병진 스테이지 상에 고정된다. 660 -. 685 나노 미터 대역 통과 필터가 CARS 이미징에 사용되는 광전자 증 배관 (PMT)의 전면에 배치 한 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
레이저 시스템의 1 시동
- 사파이어 파장 800 nm의 설정 또는 정의 : TI의가 있는지 확인TI의 에이 파장 : 전원 제어기 사파이어. TI의에 전환 On으로 대기 모드에서 키를 돌려 : 레이저 사파이어.
- OPO 컨트롤러의 뒷면에있는 OPO 레이저를 켜고 티 열기 : 티타늄 사파이어 셔터 : 전원 공급 컨트롤러 사파이어.
- OPO를 펌프 태블릿 컴퓨터를 켭니다. 태블릿에 OPO 연결 및 원격 연결 아이콘을 클릭합니다. 워밍업 40 분 - 30 기다립니다.
- 현미경 컴퓨터에 전환하고 "현미경 구성 요소"스위치를 켭니다. 두 번 클릭하여 바탕 화면에있는 아이콘을 소프트웨어를 시작합니다.
- 소프트웨어 획득 탭에, 소프트웨어에서 모두 레이저를 운영 설치 관리자에 레이저 도구를 엽니 다. 티를 선택 켜짐 사파이어 레이저와 OPO 레이저를. 상기 광학 레이저 출력의 값 (800 nm에서 3,700 mW의 전형적인 값과 700 mW의 1,000 nm에서)에서 확인하십시오.
- 빔 경로와 레이저를 구성하려면,설치 관리자 도구 그룹의 광경 도구를 열고 첫 번째 광전자 증 배관 (PMT)를 상자를 확인합니다.
- TI의 확인하려면 : 목적의 출력에서 사파이어 레이저 스폿을 획득 매개 변수 도구 그룹의 채널 도구를 엽니 다. TI의 선택 : 낮은 값 (1 %)에서 사파이어 전력을 0으로 이득 (더 이미지가이 단계에서 필요하지 않습니다)을 감소시키고 현미경 목표를 통해 레이저 빔을 시작하려면 스캔 절차를 시작 연속 버튼을 클릭합니다. 공기 현미경 대물 렌즈 (10 배)의 출력에서의 IR 레이저 보는 카드를 배치하여 직접 관찰하여 붉은 반점의 존재를 확인한다.
- 의 OPO 레이저 자리를 확인 티의 스캔 중지하려면 중지 버튼을 클릭하여 사파이어 레이저를. [채널] 창에서 낮은 값으로 OPO 전원을 선택하고 C를 클릭ontinuous 버튼을 누릅니다.
2. 현미경 설정
- 수동으로 비 descanned 검출 (NDD) 모드에서의 PMT로 헤어 샘플에서 760 nm의 빛을 발사하는 목적 코 받침 이요 위의 무한 공간에서 sideport 슬라이더에서 760 nm에서 컷오프 파장 다이크로 익 미러를 배치합니다.
- 단지 CARS는이 연구에서 제시된 결과를 재현하기 위해 670 nm에서 신호를 기록하는 PMT1 앞의 NDD 반사 큐브에서 685 나노 미터 - 660에서 협 대역 통과 필터를 설정합니다.
- (500)에서 수초의 형광 관찰 PMT3 앞의 NDD 반사 큐브에서 550 nm의 범위의 협 대역 필터를 놓습니다. 565에서 SHG 관찰을위한 PMT4 앞의 반사 큐브에서 610 nm의 범위의 협 대역 필터를 놓습니다.
- 소프트웨어에 임시 대역 통과 필터와 검출기의 신호의 기록을 선택하고 설치 관리자 메뉴의 광경 도구를 열려면 획득 탭입니다. 원하는 PMT (체크 박스)를 활성화하고이 채널에 대한 색상을 선택합니다. 이 작품에서, 녹색 SHG에 대한 형광 마젠타 색 빨간색 CARS을 위해 선택되었다.
3. 시간적 동기화
주의 : 2 개의 레이저 빔은 동일한 TI의 기원 : 사파이어 레이저하지만 OPO 빔들이 현미경에 도달하면 두 빔들이 시간 동기되지 않도록이 생성 될 때 지연된다. 여기서의 목표는 현미경에 도달하기 전에 시간에 이들을 다시 동기화 개의 광속들 중 하나를 지연하는 것이다.
- BNC 케이블과 전기 BNC 레이저 출력 (동기화. 아웃)에 오실로스코프의 입력 채널 CH1을 연결합니다. 입력 채널 포토 다이오드 오실로스코프의 CH2를 연결 트리거 MENU 다음 메인 메뉴 버튼 자료하고 C 선택된 채널에 해당하는 사이드 메뉴 버튼을 누름으로써 트리거 채널로서 CH1 채널 선택H1.
- 위치 및 목적을 제거한 후 광학 마운팅 포스트에 공기 현미경 대물 렌즈 (10 배) 또는 현미경의 빔 경로에서의 초점면에서의 광 다이오드를 고정한다. 참고 : 필요한 경우, 콘덴서 및 캐리어를 제거합니다.
- [채널 도구 (취득 파라미터 툴 그룹)에서, 티 정의 저전력 830 nm에서 사파이어 레이저 파장 (예를 들어, 최대 전력의 1 % 미만). 획득 모드 도구에서 가장 작은 빔으로 포토 다이오드를 조명하기 위해 하나의 점으로 스캔 영역을 줄일 수 있습니다. 연속 버튼을 클릭하여 레이저 스캔에 전환합니다.
- 를 눌러 오실로스코프 전면 패널의 AUTOSET 수동으로 화면에 펄스 트레인을 얻을 수있는 포토 다이오드의 위치를 이동합니다. 를 눌러 RUN / STOP 버튼 디스플레이를 고정합니다.
- 오실로스코프 화면의 복사본을 저장하려면, 3.5를 삽입플로피 디스크 드라이브에서 플로피 디스크를 인치 또는 컴퓨터 후면 패널의 GPIB 포트를 연결합니다. 그런 다음 출력 채널을 TIFF 이미지 포맷을 선택하고 포트 메뉴에서 지정하는 SHIFT의 하드 카피 메뉴를 눌러 FORMAT (주)를 누릅니다. 를 눌러 하드 카피 버튼 티의 펄스 트레인의 오실로스코프 디스플레이를 기록합니다 : 레이저 사파이어.
- 정지 버튼을 클릭하여 사파이어 레이저 스캔 : TI의 전원을 끕니다. 채널 도구를 클릭하면 1107 나노 저전력의 OPO 신호를 정의합니다. OPO 레이저 스캔에 전환하고 오실로스코프의 OPO 레이저의 펄스 트레인을 기록합니다. OPO 레이저 스캔을 끕니다.
- 사파이어와 OPO 신호 : 시간적 TI의 사이의 변화를 비교.
주 : 시프트 시간 t 시프트 다음 식으로 구현되어야하는 지연 라인 L의 DelayLine의 길이를 제공한다 : L = C delayLine5; C는 빛의 속도이고 t 시프트. - 레이저 라인 중 하나를 선택합니다.
참고 :이 작품에서, 티 : 여유 공간이 레이저 라인 근처 사용할 수 있었기 때문에 사파이어 레이저 라인이 선택되었다. 또한,이 선택은, 가시 레이저 광 레이저 라인의 재 배열을 달성 할 수있다. - 지연 라인이 구현 될 위치에서 상기 보호관을 제거하여 레이저 라인을 연다.
!주의 적절한 안전 고글을 착용하고 체인 팔찌를 제거하거나 손목에서 시계. - 위해서 가시 범위의 파장을 선택하는 것은 용이 (소프트웨어의 채널 도구에서 낮은 전력으로, 예를 들어 700 ㎚) 레이저 광을 관찰 할 수있다. 레이저 스캔에 전환합니다.
- 놓고 두 홍채 조리개 개방 레이저 라인을 따라 광학 장착 게시물로 설정합니다. 위치 한 지연 라인의 출구에서 아이리스와는 잠망경의 입구에 다른 조리개를 배치합니다.
참고 : PE레이저 주사 현미경의 스캐닝 헤드에 소프트웨어에 의해 레이저 빔의 입구 각도를 조종 개의 전동 미러에 의해 제어 riscope. - 홍채 조리개 개구를 감소하고 레이저 빔의 경로에 맞게 조리개 위치를 조정한다. 광학 테이블을 수정합니다. 순차 지연 라인의 네 개의 미러를 배치하는 동안, 레이저 빔의 높이를 검사하는 제 휴대 조리개의 수직 위치를 조정한다.
참고 :이 홍채 조리개가 수행 할 수있는 경로를 표시하여 재 정렬 절차에 대한 제어 역할을합니다. - M1 컴팩트 학적 미러 상에 장착 된 미러 (도 1에 도시 된 바와 같이) 지연 라인의 입구에 장착 및 위치 이동 조리개의 사용과 빔 높이를 유지하는 방향을 조정 놓는다. 장소는 M2와 M3가 midco에 위치한다 번역 무대에 90 °에서 (컴팩트 운동 학적 미러 마운트에 장착) 거울urse. 미리 계산 된 지연 라인의 길이에 맞도록 배치.
- 모바일 홍채 조리개의 사용과 M2와 M3의 방향을 조정한다. 두 개의 고정 된 홍채 조리개를 통해 상기 레이저 빔 경로에 맞게 그것의 위치 및 각도를 조정 신중 (도 1에 도시 된 바와 같이 단지 홍채 I 일 전) 및 M4 설정 지연 라인의 종료시 (또는 소형 마운트 고정).
- 현미경 목적의 출력에서 레이저보기 카드를 놓고 레이저 스캔을 켭니다 연속 클릭하여 레이저 빔 프로파일을 확인합니다. 균일 한 밝은 디스크를 관찰한다. 필요한 경우, 약간 M4의 방향을 조정합니다.
- 다시 위치 현미경의 샘플 초점면에서의 레이저 빔 하에서 고속 다이오드. 사파이어 레이저 빔과 오실로스코프의 OPO 빔 : 상기 티 사이의 시간적 변화를 관찰한다.
주 : 전체 시스템 M2 이동하여 지연 라인 길이를 변경 필요시, M3는 장착(번역 단계 튜닝 변경없이) 변환 스테이지 두 펄스를 동기화한다. 몇 센티미터의 변경이 요구 될 수있다.
빔 4. 공간 오버랩
주 : CARS 신호를 생성하기 위해, 2 개의 레이저 빔의 공간적인 중첩이 필요하다. 두 개의 서로 다른 형광 염료로 염색 걸쳐 동일한 구슬 두 빔의 다른 조명 공간 변화를 나타 내기 위해 사용될 수있다. 거울 위치의 미세 조정은 그 변화를 최소화 할 수있다.
- 사용은 형광 마이크로 스피어를 미리 탑재. 후술하는 바와 같이 또는 깨끗한 현미경 슬라이드에 현탁액 중의 미립자를 마운트
- 샘플링하기 전에 (껍질 믹서 또는 초음파 처리에 의해) 비즈 솔루션 믹스는 구슬이 균일하게 정지되어 있는지 확인합니다.
- 슬라이드의 표면에 비드 현탁액의 5 μL를 적용하고 피펫 팁으로 확산. 마운트의 5 μl를 건조하고 적용 방울 기다립니다같은 구슬의 건조 샘플을 통해 글리세롤, 물 또는 침수 오일, 매체를 보내고. 커버 슬립과 샘플을 커버하고 빠른 건조 접착제 또는 녹은 파라핀으로 커버 슬립을 밀봉.
- 20 배의 물 목표 아래 현미경 슬라이드에 고정 형광 폴리스티렌 비즈를 놓습니다. 목적을 젖어 물 몇 방울을 추가합니다.
- (가) 온라인 버튼을 누름으로써, 눈 시료의 직접 관찰에 상기 스캔 모드로 전환하는 소프트웨어에서 탭의 위치를 열고 비드에 포커스를 달성했다. 임시 필터를 선택하고 아이콘을 클릭하여 할로겐 램프에 전환 할 수있는 안구 도구를 엽니 다.
- 수동 무한 공간에 sideport 슬라이더에 다이크로 익 미러를 분리하고 접안 비드를 관찰하여 시료면을 초점 현미경의 초점 거리를 사용한다. 다이크로 익 미러를 교체합니다.
- 에서탭의 위치를 오프라인 버튼을 눌러 레이저 스캐닝 모드로 전환합니다. 주사를위한 매개 변수를 정의 취득 탭 이동 (512)의 화소에 대한 프레임 크기 (9)의 스캔 속도를, (1)의 평균, 8 비트의 비트 깊이를 선택하고 최대 스캔 영역을 증가시킨다.
- 획득 탭의 채널 도구에서 이미 생성되지 않은 경우 트랙 (트랙 1)를 추가합니다. . TI의에 대한 830 nm의 파장 및 저전력 선택 : 사파이어 레이저 빔을 채널 창에서와 PMT3 또는 광경 창에서 PMT4 상자에 트랙 1 상자에 녹색으로 색상을 선택합니다.
- 획득 탭의 채널 도구에서 두 번째 트랙 (트랙 2)를 추가합니다. OPO 레이저 빔을위한 1107 nm의 낮은 전력으로 파장을 선택합니다. [채널] 창에서와에서 PMT3 상자에 트랙 2 상자에 빨간색으로 색상을 선택합니다
- 순차적으로 연속 클릭하여 샘플에 두 개의 빔의 스캔을 적용, 그리고 600에 두 트랙의 게인을 조정합니다.
- 2 차원보기로 화면 영역에서 이미지를 관찰합니다. 디스플레이 뷰 옵션 제어 블록, 표시 휘도를 조정한다.
참고 : 구슬의 초점 평면을 찾기 위해 약간 초점 거리를 이동해야합니다. 자르기를 조정하고 하나의 구슬 또는 인접 구슬의 그룹의 이미지를 확대합니다.- xy 평면에서 빔을 중첩 잠망경 컨트롤러를 사용합니다. 소프트웨어에서 유지 관리 탭을 엽니 다. 시스템 옵션을 클릭하고 동력 잠망경 도구 창을 표시합니다. 공간에서 두 이미지를 동기화하기 위해 사파이어 레이저 빔 : 일반 및 미세 티의 잠망경 거울의 조정을 사용합니다.
- 잠망경 조작의 경우, 수직 및 세코의 제 1 조정 막대를 사용레이저 빔의 수평 이동을 위해 차의 하나. 이미지가 약간 보일 때까지 입력 미러 빔을 이동 한 다음 "입력"및 "출력"을 클릭하여 잠망경의 출력 거울 레이저 강도를 보상.
- 사파이어 레이저 : 수직으로 유지 탭, 빔 중첩 콜리메이터 툴을 열고 티의 초점 거리의 값을 조정하기 위해.
- 부드럽게 두 이미지에 초점의 차이를 확인하는 목적 수직 위치를 이동합니다. 또는, 취득 탭 Z-스택 도구에 개방하여 샘플의 Z-스택을 가지고 서로 다른 매개 변수 (범위, 조각의 수)를 선택합니다. 화상 표시 영역에 눌러 직교 축 방향 단면에서 광선을 참조한다. 동일한 절차를 여러 번 수행하여 Z-중복을 극대화 할 수 있습니다.
5. 최종 조정 및 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 올리브 오일 박사로부터 신호 관측oplets
- 유리 접시에 올리브 오일 방울을 넣고 그것은 유리 커버 슬립에 의해 커버. 20 배 침수 목표를 젖어 물 몇 방울을 추가합니다. (4.2에서 앞서 설명한 바와 같이)를 사용하여 접안 커버 슬립의 가장자리에 초점.
- 사파이어 레이저 빔과 OPO를위한 1107 nm에서 : 획득 탭의 채널 도구에서 트랙 1의 Ti에 대한 830 nm의 파장에서 선택합니다. 두 레이저의 동시 스캔을 얻기 위해 트랙 1에서 모두 레이저을 선택합니다. 시작 낮은 값으로 설정 능력.
- 빛 경로 창에서 PMT1을 선택합니다. 연속 버튼을 클릭하여 레이저 스캔에 전환합니다. 기름 얇은 층에 레이저 광을 제공하기 위해 약간 초점을 이동합니다.
- 필요한 경우, 두 레이저의 광 출력을 증가시킨다. 디스플레이 뷰 옵션 제어 블록에서의 표시 휘도를 조정한다. 신호가 될 때까지 천천히 SIG 지연 라인의 변환 스테이지 이동이 유의 향상.
- 미세 정렬이 완료되면, 그것은 CARS 신호 정말 여부를 확인 : 약간 이동 스테이지를 이동; 신호의 강도가 약한가되어야합니다. 및 / 또는 하나 인 TI를 상기 레이저 빔 중 하나를 끄 : 사파이어 레이저 또는 OPO한다. 다시 CARS 신호에 비해 강도가 강한 부패가 있어야합니다.
- (화면 영역 탭의 히스보기) 전체 영상의 평균 휘도 값을 제공하기 위해 소프트웨어에 대한 옵션을 선택하는 최대 CARS 신호를 얻을 수있다. 파장 (몇 나노 미터)를 조절하여 초점 빔의 X, Y, Z 위치들은 평균 휘도 값을 최대화한다.
지연 라인의 빛 경로 6. 인클로저
- 최종 시스템은 비 - 물리학에 전용되기 때문에, 유해 비가 높은 피크 전력의 레이저 빔에 대한 직접 액세스를 방지하기 위해, 튜브 또는 외장 상자 지연 라인의 광로를 동봉. 번역 단계에 대한 액세스를 제공하기 위해주의손잡이.
CARS 7. 파장 조정
- 식을 사용하여
원하는 라만 진동 조정할 레이저 파장. 사파이어 = 830 nm이고, λ OPO = 1095 nm의 : 이미지 CARS이 연구에서 제시된 결과를 재현하려면 티 λ 선택 3,015cm -1의 진동을 스트레칭 갖는 CH 결합에서 신호.
참고 :.. 물과 같은 생물학적 시료에서 관찰 라만 특성 진동 주파수는 CH 결합은 에반스 등 13 또는 엘리스 등 (29)에서 찾을 수 있습니다. - 식을 사용하여
CARS 신호의 발광 파장을 결정한다. CARS에 의해 CH 결합 영상의 경우, λ CARS 이후 670 nm에서 협 대역 필터를 선택 = 레이저 파장 670 nm의 7.1에 제시했다.
주 : 휴대 전화 응용 프로그램이 유명하다에서 λ CARS를 계산 ailable λ P 및 λ S 값 (참조 30 참조).
원하는 라만 진동 조정할 레이저 파장. 사파이어 = 830 nm이고, λ OPO = 1095 nm의 : 이미지 CARS이 연구에서 제시된 결과를 재현하려면 티 λ 선택 3,015cm -1의 진동을 스트레칭 갖는 CH 결합에서 신호. 
CARS 신호의 발광 파장을 결정한다. CARS에 의해 CH 결합 영상의 경우, λ CARS 이후 670 nm에서 협 대역 필터를 선택 = 레이저 파장 670 nm의 7.1에 제시했다. 좌골 신경 인하에서 CARS 신호 및 스테인드 미엘린 8. 관측
주 : 모든 동물 실험은 기관의 규정에 따라 실시 하였다.
- Ozçelik 등. (31)에 제시된 바와 같이 현미경 슬라이드의 축 방향 및 종 방향 좌골 신경 인하를 준비합니다.
- PBS에 원액을 300 배 희석하여 fluoromyelin 빨간색 염색 액을 준비합니다. 실온에서 20 분 동안 염색 액에 신경 인하 홍수. 솔루션을 제거하고 PBS로 10 분간 3 회 세척한다.
- 20 배 물 침지 목표 아래 삭감을 배치합니다. 커버 슬립을 놓습니다. 목적을 담그고 (4.2 이전에 설명 됨)을 통해 접안 상처의 선명한 화상을 구하는 목적의 초점을 조절하는 PBS의 몇 방울을 추가한다. <사파이어와 OPO 레이저를 각각 830 nm에서 1095 nm의 그 파장을 정의 트랙 1에서 리>의 티를 선택합니다. 빛 경로 창에서 PMT1과 녹색 색상을 선택합니다.
- 트랙 2에서는, OPO 레이저 만 (1,095 nm의 파장)을 선택합니다. 빛 경로 창에서 PMT4과 붉은 색을 선택합니다.
- 모두 레이저를 들어, 저전력을 선택하고 시작을위한 600 게인을 설정합니다. 레이저 스캔에 전환하고 CARS을 개선하기 위해 다음과 같은 매개 변수를 조정하고 형광 신호는 대조 : 전력 값, 번역 단계 노브 (아주 약간), 파장 (몇 ㎚), 디스플레이 강도를.
- 높은 해상도로 최종 이미지를 기록하려면 획득 모드 도구에서 다음 매개 변수를 선택 : 1,024 픽셀의 프레임 크기, (7)의 스캔 속도, 하나의 이미지를 기록하는 스냅 버튼을 클릭합니다의 평균을. 독점 형식으로 이미지를 저장AT는 전체 이미지 획득 파라미터를 기록한다.
좌골 신경 인하에서 자동차와 SHG 신호 9. 관측
- Ozçelik 등. (31)에 제시된 바와 같이 좌골 신경을 준비합니다.
- 접안를 통해 이미지를 얻을 수 (8) 설명 및 CARS에게 신호 파라미터 (트랙 1)을 선택하도록 절차를 따르십시오.
- 트랙 2에서는, OPO 레이저 만 (1095 nm의 파장)을 선택합니다. 빛 경로 창에서 PMT3 및 마젠타 색상을 선택합니다.
- 레이저 스캔에 전환하고 높은 해상도의 이미지를 저장 부 (8)에 설명 된대로 절차를 따르십시오.
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Representative Results
표준의 Ti 펄스열 주파수 : 사파이어 레이저는 일반적으로 약 80 메가 헤르츠이다. 레이저 사파이어 다음 OPO은 상기 티타늄으로 펌핑되기 때문에, 동일한 주파수를 갖는다. 최소 200 MHz의 빠른 오실로스코프 따라서 필요합니다. 범위의 빠른 포토 다이오드 (600)에 1,100 내지도 필요합니다. 사파이어와 OPO 신호 1 / (2 × 80 × 106) = 6.2 나노초의 시프트 : TI의이 때 최대 시간적 변화가 발생합니다. 이는 1.9 m의 최대 빔 경로 변화에 대응하는 티 2는 OPO 레이저 광 (A)의 기록 펄스 열을 나타낸다 : 그리고. (지연 라인 (B)없이 사파이어 레이저 빔 및 상기 조정 가능 지연 라인으로 C를 ). 도 2a 및도 2c에 도시 된 바와 같이, 펄스 트레인 따라서 대략 구현 지연 라인에 맞춰 동기화된다.
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시간적인 동기화를위한도 2 레이저 펄스 트레인 기록 기록 펄스열의 OPO 빔 (A)의 10 배의 대물 렌즈와 현미경 샘플 평면에서, 티타늄 :. (B)없이 사파이어 레이저 빔 및 상기 지연 라인 (C ). 신호가 직접 티의 뒷면에있는 BNC 커넥터에서 기록 된 각 그래프 플롯의 상단 곡선 : 레이저 (. 동기화 출력 커넥터를) 사파이어. 오실로스코프의 트리거가이 신호를 조절한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
두 빔의 공간적 중첩을 현미경 슬라이드 (도 3a)의 상부에 고정 된 형광 폴리스티렌 비드의 시각화함으로써 얻을 수있다.도 3b는 주어진 세 근처 비드의 형상을 도시TI의에 의해 1107 nm의 (적색 거짓 색상)과의 OPO 레이저 : 830 nm에서 사파이어 레이저 (녹색 거짓 색상). 두 개의 레이저 빔 사이의 공간적 변화는 이전에 (도 3c)에 기술 된 공간 동기화 절차에 따라 보상되고있다.
빔 그림 3. 공간 중복. 형광 마이크로 스피어 (A)의 일반보기. 3 인접한 미소에 확대합니다. 비드 화상의 공간 시프트 (거짓 색) (B)를 도시 내지 830 1107 구슬의 조명. X, Y, Z 조정 한 후, 비드 이미지 (C) 병합됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마지막CARS를 활성화 정확한 시간 조절을 달성하기 위해 공정을 용이 (다수의 CH 결합 (32)을 포함), 올리브 오일 방울을 묘화하여 두 레이저 펄스 트레인의 시간 동기화를 완료하기 위해 지연 라인의 약간 미러를 이동시킴으로써 실현 될 수있다.도 4 사파이어 레이저 조명 만 (그림 4A)와 OPO 조명 만 (그림 4B)에서 다음 티에서 전달 된 올리브 오일 방울의 이미지를 보여줍니다. 3,100cm -1 - 동시에인가 두 빔은 CARS는 2,800 주변의 라만 진동 범위로 진동을 스트레칭 고유의 탄소 - 수소 (CH)에서 신호에 해당하는 670 나노 미터에서 명확한 신호 향상 (그림 4C)를 유도한다. 한 두 개의 빔이 꺼져 때 CARS 신호 (C)가 사라집니다. 올리브유 범위 650 발광 특히 클로로필 분자의 천연 형광 (33)가 포함되어 있기 때문에 - 670 nm의, (A)와 (B)의 약한 신호가있다 MULtiphoton 형광 과정. 이러한 신호의 강도는 CARS 신호보다 몇 배입니다. 따라서, CARS 신호의 측정을 교란하지 않는다.
CARS 그림 4. 최종 미세 시간 조정이 발생 신호. 올리브 오일 방울은 마이크로 드라이브와 선형 변환 스테이지와 지연 라인의 길이를 조절하여 시간 조정을 모두 빔을 사용할 수 있습니다. (A) 830 nm의 레이저 광 만 미만하에 방울 (B) 1107 nm의 레이저 광은 단지 약한 신호를 나타낸다. 동시 조명 (C)에서, 클리어 신호 향상은 CARS 신호에 대응하는 관찰된다. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다. 3,015cm의 라만 진동 피크 -1. 그녀를 클릭하세요전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
수초는 중추 및 말초 신경계에서 신경 세포의 34 축삭 주위들이 세포막을 응축 랩 특정 세포에 의해 생성 된 생체 구조이다. 이 외피는 매우 다른 지질이 풍부한된다. 우리는 여기서 마우스의 좌골 신경의 수초를 사용했다. 각각도 5b 및도 5e에 도시 된 바와 같이 횡 방향 및 종 좌골 신경 횡단면 세그먼트는 1095 nm에서 수초의 이광자 형광 영상에 대해 염색 하였다. 수초에 대한 선택성이있는 fluoromyelin 빨간색 염료, (35)을 사용 하였다. 이 샘플은 동시에 830에서와 1095 nm에서 조명되었으며 CARS 신호는 (그림 5a 및도 5d)이 관찰되었다. 그림 5A-C에서, 원 (축삭 주위에 수초에 빈 공간에 대응횡단 컷의 링)를 좌우. 도 5c 및도 5f에 도시 된 바와 같이 차량과 형광 화상을 중첩하면서 동일한 구조를 알 수있다. 우리는 세부 사항의 비슷한 수준이 CARS에 따라서 형광 표지를 사용하지 않고 얻을 수 있다는 결론 지었다.
그림 5. 자동차와 좌골 신경 인하의 스테인드 수초 영상. (A) 횡단 및 수초의 라벨이없는 CARS 이미징 (D) 길이 잘라냅니다. (B) 및 횡단 (E) 1095 nm에서 이광자 형광 조명 하에서 fluoromyelin 적색 염료로 염색 동일한 샘플의 세로 컷. 두 이미지의 (C) 횡단 및 (F) 세로 컷 중복. 스케일 바는 10 μm의 수 있습니다. 평균 광 파워는 830 nm의 16에서 5 mW의했다CARS 신호를위한 1095 nm에서 mW의. 평균 광 전력은 이광자 형광 이미징 1095 nm에서 8 mW의이었다. 2,915cm-1에서의 라만 진동 피크입니다. CARS 신호는 하나의 레이저 스캔을 중지하거나 라만 공명 밖으로 변환 스테이지를 이동하여 사라집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
또한 CARS 이미징에 사용 가능한 현미경 시스템은 동시에 좌골 신경의 외면에서 콜라겐 섬유의 차 고조파를 생성 할 수있다. 이러한 부가적인 이미지는 6도. 차 신호 기록에 사용되는 670 nm의 협 대역 통과 필터 보낸 550 nm의합니다 (OPO의 반 파장)에서의 신호를 기록하는 다른 검출기의 사용을 필요로 콘트라스트 화상을 도시 거짓 녹색에 묘사 된 수초의 (자동차에 신호거짓 마젠타 색에 도시 콜라겐 섬유에 의해 둘러싸여도 6A)에 LY (에만도 6b에 SHG). 그것은 SHG 신호를 얻기 위해 1095 nm에서 50 mW의 요구하면서 CARS 신호는 평균 광 830 nm에서의 4 mW의 전력 및 1095 nm에서 13 mW의 달성 하였다. 따라서 매우 낮은 광 에너지 차를 구하는 데 필요한 SHG THG 나 (미도시) 우리의 생물학적 시료에서의 신호와 비교하여 신호.
도 6 CARS 마우스 좌골 신경의 SHG 촬상. (A) CARS 이미징, (B) SHG 이미징 (마젠타) SHG 촬상에 의해 (C) 동시에 (녹색 거짓 색) 이미징 CARS 의해 미엘린 시각화 콜라겐 마우스 좌골 신경에. 평균 광 파워는 830 nm에서 4 mW의 자동차에 대한 1095 nm에서 13 mW에 있었다. 평균 광 전력은 1095에서 mW의 50이었다SHG을위한 나노. 스케일 바는 10 μm의입니다. 2,915cm에서 라만 진동 피크 -1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
작품의 가장 어려운 부분은 레이저 빔의 시간 동기화된다. 그것은 빠른 오실로스코프와 결합 된 빠른 광 다이오드를 필요로하지만, 시간 만 거친 중복 처음에 수행 할 수 있습니다. 그 후 몇 cm의 추가적인 조정이 필요하다. 마지막으로, 선형 변환 스테이지 마이크로 미터에 의해 이동은 CARS 신호를 트리거하기 위해 지연 라인 길이의 최종 미세 조정을 행하는 허용한다. 변환 스테이지 마이크로 드라이브를 조정하여 관찰이 신호는, 약 20 마이크로 미터의 좁은 범위로 유지된다. 이는 펄스 폭의 절반 정도, 즉 140 FSEC의 빔의 피크 시프트에 대응한다. 차 신호에 필요한 두 빔의 공간적 중첩은 레이저 주사 현미경 시스템을위한 통상의 광 배향과 유사하다.
지연 라인의 구현은 실험의 기본 배경을 가진 생물 학자에 의해 몇 주 안에 달성 될 수있다물리학 자와 알 광학 또는 협력한다. 특별한주의 반사 손실을 최소화하기 위해 미러의 선택에 대해 수행되어야한다. 지연 라인을 구축하는 물질의 대부분은 경제적 인 경우 필요 오실로스코프 표준 오실로스코프 아니다. 몇 일이 심령 실험실에서 오실로스코프를 빌려, 시간 동기화 절차를 완료하기에 충분하기 때문에 따라서, 최선의 선택이 될 것으로 보인다. 공간적 중복 시간은 (레이저 스캐닝 시스템에 따라 전동 할 수있다) 여러 거울과 렌즈의 조정을 요구하는 이후로 소모 될 수있다. CARS 초 레이저 시스템은 두 개의 전자적으로 동기화 된 티타늄에 기초 : 사파이어 레이저 장기 (시간을 수십 분) 시간적 펄스 겹침에 문제가 있었다. 이 문제는 전체적으로 고유 한 레이저 광원 (20, 21)으로 펌핑 OPO으로 해결한다. 이러한 레이저 시스템 단단히 고정 광학계를 이용하여, 펌프 및 스톡스 간의 시간적 거리 오프를 통해 관찰되지 않았다 빔작업 개월.
자동차 기술의 주요 제한은 CARS 신호 (11) (용매 또는 산란)에서 공진 분자의 존재없이 발생할 수 있다는 것이다. 이러한 비 공진 배경 감도를 제한 할 수있다. 이러한 배경을 최소화하는 방법은 검출 (앞뒤로 검출)의 구성을 포함하는, 레이저 특성 (피코 초 또는 펨토초), 목적이나 화상 처리를 체험하기 위해 사용되는 용액의 선택. 이전 버전과 검출이이 작업 (도 1)에 사용 된 바와 같이 비 - 공진 배경 (11)을 최소화 할 수있다. 펨토초 티타늄 사파이어 레이저가 비선형 광학 프로세스를위한 매우 바람직한 높은 피크 강도를 제공한다. 그것은 피코 초 펄스의 스펙트럼 폭에 맞는 반면 그러나, 스펙트럼 도메인, 가장 라만 라인의 폭은 펨토초 펄스의 스펙트럼 폭보다 작다. 따라서 피코 초 레이저의 사용 비율을 증가 O비 공진 배경에 F 공진 신호. 인해 결합의 고밀도 지질의 CH 결합을 위해, 비 - 공진 배경 펨토초 레이저 무시할 수있다. 배경 효과를 감소시키기 위해, 오프 - 공진 아래에 기록 된 참조 화상의 감산은 (이 일을 수행하지 않음)을 적용 할 수있다.
조직 침투 깊이있게 근적외선 레이저 빔의 이용에도 불구하고 (200-300 미크론), 신경 촬상에서 얻어진 실질적인 침투 깊이는이 연구에서 수행 된 실험과 약 50 마이크론이었다. 모든 유수 섬유가 정렬되고 작은 공간에 집중되어 있기 때문에이 매개 변수, 이미징 생체 조직의 의존하며, 말초 신경은 아마이 빛 침투를 평가하기위한 가장 좋은 샘플을 구성하지 않습니다. 또한, 몇 초 생체의 시각화를 제한 할 수있는 고해상도 화상 (1024 × 1024 픽셀)를 기록하는 데 필요한
CARS 현미경 가까이 회절 한계의 해결과 화학적으로 특정 선택적 이미징 할 수 있습니다. 이 기술은 임의의 표시를 필요로하지 않으며, 티 보낸 사람 : 사파이어 레이저는 700 내지 1,000 nm 내지 1,300 nm 인 1100에서 OPO 레이저에 가변이며, 이는 500 내지 7,000 cm 생물학적 시스템에서 분자 진동의 전체 스펙트럼 영역 (커버 1). 강한 신호가 지질 CH 스트레칭 결합으로부터 발생하는 동안 따라서, 적용 및 DNA, 단백질, 지질, 또는 물에 매우 차별적이다. 광 손상는 또한 두 번째 고조파 발생량 촬상 비교 CARS 신호를 생성하기 위해 사용되는 레이저 파워의 낮은 레벨로 감소된다. CARS 이미징 낮은 레이저 파워와 침습 태그없이 실현할 수 있기 때문에, 생체 내 연구를위한 선택 툴 따라서이다.
레이저 스캐닝 현미경 위스콘신펨토초의 Ti : 제 OPO 결합 사파이어 레이저 광원은 많은 생물 실험실에서 이광자 현미경 크게 유효하게되었다. 공간 동기가 이미 이러한 시스템에서 구현되기 때문에,이 연구에서 기술 된 두 빔의 시간적 중복 절차 비싼 별도의 장비없이 현미경의 추가 기술을 가져온다. 따라서, 수정 된 설정은 세포의 동시 이미징 2 또는 제 3 고조파 생성 (SHG, THG) 이광자 형광 CARS으로 생체 조직을 허용한다. CARS 기술 (얼룩 또는 유전자 조작없이) 역학 과정의 연구를 허용 살아있는 동물의 생체 내 이미징을위한 큰 잠재력을 보여 주었다. 유망한 애플리케이션은 생체 라벨없는 비 침습적 지질 신경 지질 관련 질환을 연구 라이브 척수 조직 36 미엘린 (비만 실시간 이미징 인스턴스에 사용되는 화상, 탈수 초성 및 cardiov에 포함ascular 질환) (37), 인간의 피부 침투 메커니즘 (22) 또는 피부 질환 (38). 향후의 향상으로 CARS 신호의 침투 깊이를 향상시키기 위해 이러한 GRIN 마이크로 미니어처 목적 또는 특수 목적 같은 대물 렌즈의 사용을 염려 것이라고 믿는다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400 - 480 nm; 500 - 550 nm; 465 - 610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480 - 20,000 nm, Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661 - 690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
References
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
- Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
- Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
- Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
- Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. New York. (1995).
- Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
- Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
- Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
- Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
- Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
- Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
- Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X.
- Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
- Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
- Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
- A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from: http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator (2015).
- Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
- Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
- Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
- King, R.
- Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
- Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
- Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).
