Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Implementering av en sammenhengende Anti-Stokes Raman Spredning (CARS) System på en Ti: Sapphire og OPO Laser Basert Standard Laser Scanning Microscope

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54262
Automatic Translation
*1, *2,3, 1,5, 4, 1
1INSERM U1051, Institut des Neurosciences de Montpellier (INM), Université de Montpellier, 2Université de Nîmes, 3CNRS, IES, UMR 5214, 4Aix-Marseille Université, CNRS, École Centrale Marseille, Institut Fresnel, UMR 7249, 5Montpellier RIO Imaging (MRI)
* These authors contributed equally

Summary

Sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) mikroskopi basert på iboende vibrasjoner i molekylet obligasjoner tillater label-fri kjemisk selektiv levende celle bildebehandling. Dette arbeidet viser gjennomføring av en komplementær mikroskopi teknikk på en standard multiphoton laser scanning mikroskop basert på en femtosecond Ti: safir laser og en OPO laser.

Abstract

Laserskanning mikroskoper kombinerer en femtosecond Ti: safir laser og en optisk parametrisk oscillator (OPO) å duplisere laserlinjen har blitt tilgjengelig for biologer. Disse systemene er primært konstruert for multi-kanal to-foton fluorescens mikroskopi. Men uten noen endring, komplementær ikke-lineære optiske mikroskopi som andre-harmonisk generasjon (SHG) eller tredje harmoniske generasjon (THG) kan også utføres med dette oppsettet, slik at etiketten fritt avbildning av strukturerte molekyler eller vandig mellom lipid grensesnitt. Disse teknikkene er godt egnet for in-vivo observasjon, men er begrenset i kjemisk spesifisitet. Kjemisk selektiv bilde kan fås fra iboende vibrasjonssignalene basert på Raman spredning. Confocal Raman mikroskopi gir 3D romlig oppløsning, men det krever høy gjennomsnittlig effekt og lang fangsten. For å overvinne disse vanskelighetene har nylige fremskritt i laser-teknologi tillot utviklling av ikke-lineære optiske vibrasjonsmikroskopi, spesielt sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS). CARS mikroskopi har derfor dukket opp som et kraftig verktøy for biologisk og levende celle bildebehandling, ved kjemisk kartlegging lipider (via CH strekning vibrasjon), vann (via OH strekke vibrasjoner), proteiner eller DNA. I dette arbeidet vil vi beskrive gjennomføringen av CARS teknikken på en standard OPO-coupled multiphoton laser scanning mikroskop. Den er basert på den i-tidssynkroniseringen av de to laserlinjer ved å justere lengden av en av laserstrålens bane. Vi presenterer en trinn-for-trinn gjennomføringen av denne teknikken på et eksisterende system multiphoton. En grunnleggende bakgrunn i eksperimentell optikk er nyttig og presenterte systemet krever ikke dyrt tilleggsutstyr. Vi illustrerer også CARS tenkelig innhentet på myelin hylser av isjiasnerven av gnagere, og vi viser at dette bilde kan utføres samtidig med andre ikke-lineære optiske bildediagnostikk, som for eksempel standard two-foton fluorescens teknikk og andre-harmonisk generering.

Introduction

Optisk mikroskopi har blitt en stor teknikk for ikke-destruktiv visualisering av dynamiske prosesser i levende biologiske systemer med en subcellulære oppløsning. Fluorescens mikroskopi er for tiden den mest populære bildekontrast anvendes i levende celler på grunn av sin høye spesifisitet og sensitivitet 1. En stor palett av fluorescerende prober har dukket opp (eksogene fargestoffer, genetisk kodet proteiner, halvledernanopartikler). Ulike prøve belysning fluorescerende baserte teknikker har blomstret (slik som confocal eller to-foton mikroskopi) til å utføre 3D bildebehandling og for å redusere en største ulempen med denne teknikken som er fotobleking to. Andre begrensninger inkluderer kravet om fluoroforen merking fordi de fleste av molekylære arter er ikke ubetinget fluorescerende og derfor disse fluoroforer må være kunstig innført i den avbildede prøven. Dette kunstig manipulasjon kan være forstyrrende, spesielt for små molekyler eller induserer pottenential foto-toksisitet. Disse grunner gjør fluorescens-mikroskopi ikke godt egnet for in-vivo-observasjoner. Derfor er bruken av optiske avbildningsteknikker med høy følsomhet og spesifikke molekylære kontraster uten bruk av fluorescerende molekyler meget ønskelig i biomedisinsk forskning.

Flere ikke-lineære optiske avbildningsteknikker uten merking eller flekker har dukket opp, inkludert andre-harmonisk generasjon (SHG) 3,4 og tredje harmoniske generasjon (THG) 5. SHG mikroskopi har blitt brukt til bildestrukturordninger på det supra nivå som mikrotubuler eller kollagen 6. THG er generert fra optiske heterogeniteter slik som grensesnitt mellom et vandig medium og lipider 7. THG ble også demonstrert til bilde myelin 8,9. Begge teknikkene kan implementeres på en to-foton fluorescens mikroskop og krever bare en laserstråle. Men de krever høyenergi lasere i intensitet (typisk 50mW ved 860 nm for SHG 10, 25 - 50 mW ved 1180 nm for THG 9), som er skadelig i levende prøver, og gir ikke den kjemiske spesifisitet som er nødvendig for å entydig bilde spesifikke biologiske strukturer.

Kjemisk selektiv bilde kan fås fra iboende molekylære vibrasjonssignalene basert på Raman spredning. Når en lysstråle treffer materie kan fotoner absorberes og spres av atomer eller molekyler. De fleste av de spredte fotoner vil ha samme energi, dvs. frekvens, som de innfallende fotoner. Denne prosessen kalles Rayleigh-spredning. Imidlertid vil et lite antall fotoner bli spredt ved en optisk frekvens forskjellig fra frekvensen for de innfallende fotoner, dvs. med en uelastisk spredende prosess som kalles Raman-spredning. Forskjellen i energi stammer fra eksitering av vibrasjonsmodi avhengig av molekylstrukturen og miljø. Derfor spontan Raman spredning provides kjemisk selektiv bilde som forskjellige molekyler har spesifikke vibrasjonsfrekvenser. Men det er begrenset på grunn av sin ekstremt svakt signal. Confocal Raman mikroskopi har blitt utviklet og gir 3D romlig oppløsning, men det krever høy gjennomsnittlig effekt og lang oppkjøpet tid 11. For å overvinne disse vanskelighetene, har de siste fremskritt innen laserteknologi tillot fremveksten av ikke-lineære optiske vibrasjonsmikroskopi, spesielt sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) 11,12,13.

CARS er et tredje-ordens lineære optiske prosess. Tre laserstråler, bestående av en pumpestråle ved frekvensen ω P, er en Stokes-strålen mot frekvens ω S og en sondestråle (som oftest er den pumpe) fokusert i en prøve og generere et anti-Stokes-strålen mot frekvens ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. Den anti-Stokes-signalet kan bli betydelig forbedret når frekvensforskjellenmellom pumpen og den Stokes bjelker er innstilt på en Raman molekyl vibrasjon Ω R = (ω P - ω S). CARS signal er basert på multiple foton interaksjon. Det genererer derfor et sammenhengende signal størrelsesordener sterkere enn spontan Raman spredning.

CARS mikroskopi ble først eksperimentelt demonstrert av Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Forbedret da teknikken, ved hjelp av to fokusert nær-infrarød femtosecond laserstråler med en objektiv av høy numerisk apertur at fasetilpasning tilstanden på biler og unngå to-foton ikke-resonant bakgrunn 16. CARS Mikroskopi har derfor dukket opp som et kraftig verktøy for levende celle og vev avbildning, ved kjemisk å detektere molekyler slik som lipider (via CH strekning vibrasjon) 17,18, vann (via OH elastiske vibrasjoner), proteiner, DNA i levende celler 19,20 men også deuterert kjemisk forbindelses for farmasøytiske 21 og kosmetiske applikasjoner 22.

Den store begrensning av ikke-lineær mikroskopi stammer fra kompleksiteten og kostnadene av de optiske kilder. En CARS system krever to bølgelengde tunbare lasere med korte pulsvarighetene og med tid og rom synkroniserte pulstogene. Tidlige CARS mikroskoper var basert på to synkronisert picosecond Ti: safir lasere 20. CARS avbildning ble også oppnådd fra en enkelt femtosecond Ti: safir laser generere et supercontinuum lyskilde 23. Nylig, laserkilder består av en enkelt femtosecond Ti: har safir laser pumping en fleksibel optiske para oscillatorer (OPO) blitt brukt for CARS mikroskopi. Dette oppsettet gjør det mulig å egentidsmessig synkronisert bjelker med en forskjell i frekvens mellom pumpen og den Stokes strålen dekker hele molekylære vibrasjonsspektrum 24. I tillegg laser scanning mikroskop basert på en omsetningNøkkelen fs laser og en OPO, først og fremst brukt for to-foton fluorescens (TPF) er nå tilgjengelig for ikke-fysikere. Potensialet av slike oppsett kan bli betydelig forbedret uten å kreve tilleggskostnader ved innlemmelse av andre ikke-lineært optisk avbildning, siden hver ikke-lineær (NLO) avbildingsmodalitet er følsom for spesifikke strukturer eller molekyler. Multimodal NLO bildebehandling kapitaliserer derfor potensialet i NLO mikroskopi for komplekse biologiske prøver 25. Koblingen av disse teknikkene har tillatt etterforskningen av mange biologiske spørsmål, særlig på lipidmetabolismen, hud eller kreftutvikling 26, skjelettmuskelutvikling 27, aterosklerotiske lesjoner 28. Videre gjennomføring av laserstråleskanning med CARS gir mulighet for høy hastighet bildebehandling, dvs. et attraktivt verktøy for å studere dynamiske prosesser in vivo.

Målet med dette arbeidet er å vise hvert trinn å gjennomføre than CARS teknikk på en standard multiphoton laser scanning mikroskop. Mikroskopet er basert på en fsec Ti: safir laser og en OPO (pumpet av Ti: safir laser) som drives av en programvare for biologer. Integreringen ble utført ved å justere lengden av en av laserstrålens bane for å synkronisere klokken de to stråler. Vi beskriver den trinnvise gjennomføring av denne teknikk som krever at bare grunnleggende bakgrunn i eksperimentelle optikk. Vi illustrerer også CARS Imaging innhentet på myelin hylser av isjiasnerven av gnagere, og vi viser dette bildebehandling kan utføres samtidig med andre ikke-lineære optiske bildediagnostikk, slik som standard to-foton fluorescens teknikk og andre-harmonisk generasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figur 1
Figur 1. Skjematisk oversikt over den generelle oppsettet Det inkluderer Ti. Safir (680 - 1080 nm) og OPO (1050 - 1300 nm) lasere, forsinkelseslinjen med 4 speil (M 1 til M 4), den raske oscilloskop, fotodioden og to faste iris membraner i en og jeg 2. Speil M 2 og M 3 er festet på en lineær oversettelse trinn som gjør det mulig å endre forsinkelseslinjelengde med et mikrometer oppløsning. A 660 -. 685 nm band pass filter ble plassert foran fotomultiplikatorrøret (PMT) som brukes for CARS bildebehandling Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. Oppstart av laserstråle

  1. Kontroller at Ti: safir bølgelengde er satt til 800 nm eller defineredenne bølgelengde på Ti: safir strømforsyning kontrolleren. Vri nøkkelen fra Standby til På for å slå på Ti: safir laser.
  2. Slå på OPO laser på baksiden av OPO kontrolleren og åpne Ti: safir lukkeren på Ti: safir strømforsyning kontrolleren.
  3. Slå på tavle-PCen til å pumpe opp OPO. Klikk på OPO Connected og Remote Connected ikoner på tabletten. Vent 30-40 min for å varme opp.
  4. Slå på mikroskopet datamaskinen og slå på "Microscope komponenter" brytere. Start programmet ved å dobbeltklikke på ikonet på skrivebordet.
  5. Into kategorien programvare Acquisition, åpner Laser verktøy i installasjonsprogrammet til å operere både lasere fra programvaren. Velg Ti: safir laser på og OPO laser På. Kontroller verdien av den optiske laser-kraft (typiske verdier for 3700 mW ved 800 nm og 700 mW ved 1000 nm).
  6. For å konfigurere strålebanen og lasere,åpner lys baneverktøyet i installasjonsprogrammet verktøyet gruppe og sjekke boksen første fotomultiplikatorrøret (PMT).
  7. For å sjekke Ti: safir laser spot ved utgangen av den objektive, åpne kanaler verktøy i Acquisition Parameter verktøyet gruppe. Velg Ti: safir strøm ved lav verdi (rundt 1%), redusere gevinsten til 0 (ingen bilde er nødvendig på dette stadiet) og klikk på Kontinuerlig knappen for å starte skanning prosedyren for å starte laserstrålen gjennom mikroskopet målet. Sjekke nærværet av en rød flekk ved direkte observasjon ved plassering av IR-laseren visningskort på utgangen av luftmikroskopobjektiv (10X).
  8. For å sjekke OPO laser spot, stoppe skanning av Ti: safir laser ved å klikke på Stopp-knappen. Velg OPO effekt ved lav verdi i kanalvinduet og klikk på CONTINUOUS knappen.

2. Mikroskop Innstillinger

  1. plassere manuelt dichroic speil med en cutoff bølgelengde på 760 nm i sideport glideren i evighetsrommet over målet revolveren for å starte lys opp til 760 nm fra prøven inn i PMTs i ikke-descanned deteksjon modus (NDD).
  2. Angi at smalbåndpassfilter ved 660-685 nm i NDD reflektoren kuben foran PMT1 til å registrere bare de CARS signal ved 670 nm for å reprodusere resultatene presentert i dette arbeidet.
  3. Plassere et smalbåndsfilter som strekker 500-550 nm i den NDD reflektoren kuben foran PMT3 for fluorescens observasjon av myelin. Plassere et smalbåndsfilter som strekker 565-610 nm i reflektoren kuben foran pMT4 for SHG observasjon.
  4. For å velge i programvaren innspillingen av signalet på detektoren med ad hoc band pass filter, åpne lysbanen verktøy i Setup Manager-menyen kategorien Acquisition. Aktiver ønsket PMT (boksen) og velger en farge for denne kanalen. I dette arbeidet ble det grønne valgt for biler, rød for fluorescens og magenta for SHG.

3. Temporal Synkronisering

Merk: De to laserstråler fra samme Ti: safir laser, men OPO bjelken er forsinket når det blir generert slik at de to bjelker ikke er synkronisert i tid når de når mikroskop. Målet her er å utsette en av de to stråler for å re-synkronisere dem før de når mikroskop.

  1. Koble med BNC kabler input kanal CH1 av oscilloskop til det elektriske BNC laserutskrifter (Sync. Out). Koble inngangskanal CH2 av oscilloskop til fotodioden og velg CH1 kanal som trigger kanalen ved å trykke TRIGGER MENU og hovedmenyen knapp Source og deretter side-menyknappen som tilsvarer den valgte C-kanalH1.
  2. Stilling og feste den med optiske monterings innlegg fotodioden i fokalplanet til en luftmikroskopobjektiv (10X) eller i strålebanen til mikroskopet etter fjerning av målet. Merk: Hvis det er nødvendig, fjerne kondensatoren og dens bærer.
  3. Definere Ti i kanalverktøyet (Acquisition Parameter verktøyet gruppe),: safir laser bølgelengde på 830 nm ved lav effekt (dvs. mindre enn 1% av full effekt). I Acquisition Mode verktøy, redusere skanneområdet til ett poeng for å belyse fotodiode med den minste stråle. Slå på laserskanning ved å klikke på Kontinuerlig knappen.
  4. Trykk AUTOSET på oscilloskop frontpanelet og manuelt flytte plasseringen av fotodioden for å få de pulstog på skjermen. Trykk RUN / STOP-knappen for å fryse skjermbildet.
    1. Hvis du vil lagre en kopi av oscilloskop skjermen, sette inn en 3,5tommers diskett i diskettstasjonen eller koble GPIB porten på bakpanelet til en datamaskin. Deretter trykker SHIFT papirkopi MENU, trykk FORMAT (hoved) for å velge TIFF image format og angi i Port menyen utgangskanalen. Trykk papirkopi-knappen for å spille inn oscilloskop visning av puls tog av Ti: safir laser.
  5. Slå av Ti: safir laserskanning ved å klikke på Stopp-knappen. Ved å klikke Kanaler verktøy definere OPO signal på 1107 nm og lavt strømforbruk. Slå på OPO laserskanning og registrere puls tog av OPO laser på oscilloskop. Slå av OPO laserskanning.
  6. Sammenlign temporal forskyvning mellom Ti: safir og OPO signaler.
    MERK: temporal skift t skift gir lengden av forsinkelseslinjen L DelayLine som må gjennomføres etter følgende ligning: L = c delayLine5; t skift der c er lysets hastighet.
  7. Velg ett av laserlinjer.
    MERK: I dette arbeidet Ti: ble safir laserlinje valgt fordi ledig plass i nærheten av denne laserlinje. I tillegg gir dette valget for å oppnå den re-justering av laserlinjen med en synlig laserlys.
  8. Åpne laserlinjen ved å fjerne beskyttelsesrørene i posisjonen hvor forsinkelseslinjen vil bli gjennomført.
    Forsiktig! Bruk egnede vernebriller og fjerne kjede armbånd eller se fra håndledd.
  9. Velge en bølgelengde i det synlige området for å være i stand til enkelt å observere laserstrålen (700 nm for eksempel, ved lav effekt i kanal verktøyet ifølge programvare). Slå på laserskanning.
  10. Plasser og satt med optiske monterings innlegg to iris membraner langs den åpne laserlinjen. Posisjon en iris ved utkjørselen av forsinkelseslinjen og sett de andre iris ved inngangen til periskop.
    MERK: periscope kontrollene ved to motoriserte speil styrt av programvaren vinkelen på inngangen av laserstrålen inn i skanne hodet av laser scanning mikroskop.
  11. Reduser blenderen blenderåpning og justere blender stillinger for å passe laserstrålen banen. Fest dem på den optiske bordet. Justere den vertikale posisjonen til en tredje mobilirisblender, for å kontrollere høyden av laserstrålen, mens suksessivt å plassere de fire speil av forsinkelseslinjen.
    MERK: Disse iris membraner vil tjene som kontroll for re-alignment prosedyren ved å vise banen til følge.
  12. Plasser speilet M1 er montert på en kompakt kinematisk speilfestet ved inngangen til forsinkelseslinjen (som vist i figur 1) og justere dets posisjon og orientering for å opprettholde bjelken høyde med bruk av den mobile blenderen. Sted speil M2 og M3 (også montert på kompakt kinematiske speilstøttene) ved 90 ° inn på oversettelsestrinnet som vil bli plassert ved midcoUrse. Plassere dem slik at de passer forsinkelseslinjelengde som tidligere beregnet.
  13. Juster retningen M2 og M3 med bruk av den mobile blenderen. Satt M4 (også festet på en kompakt mount) ved utgangen av forsinkelseslinjen (like før iris I 1 som vist i figur 1) og forsiktig justere dets posisjon og vinkel for å passe til laserstrålens bane gjennom de to faste iris membraner.
  14. Plasser laseren visning kort ved utgangen av mikroskopet objektiv og sjekk laserstrålen profil ved å klikke på kontinuerlig for å slå på laserskanning. Observere en jevn lys disk. Hvis det er nødvendig, lett justere orienteringen av M4.
  15. Stilling igjen hurtig fotodioden under laserstrålen i prøven fokusplanet til mikroskopet. Observere tidsmessige skift mellom Ti: safir laserstrålen og OPO strålen på oscilloskop.
    Merk: Hvis det er nødvendig, endre forsinkelsen linjelengden ved å flytte hele systemet M2, M3 montert påoversettelse scenen (uten å endre oversettelsen scenen tuning) for å synkronisere begge pulser. Endringer i noen få centimeter kan være nødvendig.

4. Spatial Overlapping av Beams

Merk: For å fremstille en CARS signal, blir romlig overlapping av de to laserstråler som kreves. Den alternative belysning av begge bjelker på samme kulene farget hele med to forskjellige fluorescerende fargestoffer kan anvendes for å indikere den romlige forskyvning. Finjusteringer av speilet posisjoner kan da redusere skift.

  1. Bruk forhåndsmontert fluorescerende mikrosfærer. Eller montere mikrosfærer i suspensjon på rene objektglass som beskrevet nedenfor:
    1. Før prøvetaking, til mix (på en cortex mikser eller ved sonicating) perler løsningen være sikker på at perlene er jevnt suspendert.
    2. Anvende 5 ul av perlesuspensjon til overflaten av et lysbilde og spres med pipettespissen. Vent til dråpe tørke og deretter bruke 5 mL av mounting medium, slik som glyserol, vann eller neddykking olje over den tørre prøve av perler. Dekk prøven med et dekkglass og forsegle dekkglass med hurtigtørkende lim eller smeltet parafin.
  2. Plasser fluorescerende polystyrenkuler fast på et objektglass under 20X vann objektiv. Legg noen dråper vann for å fordype målet.
  3. For å oppnå fokus på perlene, åpne kategorien Finn i programvaren for å bytte fra laserskanning modus til direkte observasjon av prøven med øyet, ved å trykke på Online-knappen. Åpne Ocular verktøy for å velge ad hoc filter og slå på halogenlampen ved å klikke på ikoner.
  4. fjerne manuelt dichroic speil på sideport glideren i uendelig plass og bruke fokus stasjonen på mikroskop for å fokusere prøven planet ved å observere perlene med okulars. Bytt dichroic speil.
  5. påKategorien finne, bytte til laserskanning modus ved å trykke på Offline-knappen. Gå til kategorien Acquisition å definere parametere for skanning: velg rammestørrelsen til 512 piksler, en skannehastighet på 9, en gjennomsnittsberegning av en, litt dybde på 8 bit og øke skanneområdet til det maksimale.
  6. I Kanaler verktøyet på fanen Acquisition, legge til et spor (spor 1) hvis det ikke allerede opprettet. Velg bølgelengde på 830 nm og lavt strømforbruk for Ti. Safir laserstråle Kryss fargen til grønt i Spor en boks fra kanalvinduet og i PMT3 eller pMT4 boksen fra lysbanen vinduet.
  7. I Kanaler verktøyet på fanen Acquisition, legge til en andre Track (Spor 2). Velg bølgelengde på 1107 nm og lavt strømforbruk for OPO laserstrålen. Kryss av farge til rødt i Spor 2 boksen fra Channels vinduet og i PMT3 boksen fra
  8. Juster gevinst på begge spor til 600. Deretter sekvensielt gjelder skanningen av de to stråler på prøven ved å klikke på kontinuerlig.
  9. Observer bildet i skjermområdet inn i 2D-visning. I Skjerm Vis Option regulatoren justere skjermen intensitet.
    Merk: Hvis det er nødvendig, flytt litt fokus stasjonen for å finne fokus planet av perlene. Juster Crop og zoome bildet i en enkelt perle eller i en gruppe tilstøtende perler.
  10. Bruk periskop kontrolleren til å overlappe bjelkene i xy-planet. I programvaren, åpner Oppretthold kategorien. Klikk på Systemvalg og vise verktøyvinduet Motorisert Periscope. Bruk grove og finjusteringer av periskop speil av Ti: safir laserstråle for å synkronisere på plass begge bildene.
  11. For periskop manipulasjon, bruker de første justerings barer for vertikal og second en for horisontale bevegelser av laserstrålen. Flytt strålen med inngangs speil til bildet er litt synlig, og deretter kompensere for laser intensitet med utgang speil av periskop ved å klikke på "input" og "output".
  12. For å overlapper vertikalt bjelkene, i Oppretthold fliken, åpner Collimator verktøyet og justere verdien av brennvidden av Ti: safir laserstråle.
  13. Flytt forsiktig målet vertikal posisjon for å sjekke forskjellen i fokus på begge bildene. Eller, ta en z-stack av prøven ved åpningen i kategorien Acquisition Z-Stack verktøyet og velge de forskjellige parametre (utvalg, antall skiver). Trykk Ortho i bildeskjermområdet for å se veibanen i aksialt tverrsnitt. Maksimer z-overlapping ved å gjøre det samme prosedyre flere ganger.

5. Endelige justeringer og Coherent Anti-Stokes Raman-spredning (CARS) Signal Observasjon fra Olive Oil Droplets

  1. Sett en dråpe olivenolje på en glassplate og dekke det med et glass dekkglass. Legg noen dråper vann for å dyppe en 20X nedsenking i vann objektiv. Fokus ved kanten av dekkglass ved hjelp av okularene (som forklart tidligere i 4.2).
  2. I Kanaler verktøyet på fanen Acquisition, velger i Spor 1 bølgelengde på 830 nm for Ti: safir laserstrålen og ved 1107 nm for OPO. Kryss begge laserne i Spor 1 for å få en samtidig skanning av både lasere. Sett krefter i lav verdi for en start.
  3. I lysbanen vinduet velger PMT1. Slå på laserskanning ved å klikke på Kontinuerlig knappen. Bevege seg noe i fokus for å levere laserlyset inn i olje tynt lag.
  4. Hvis det er nødvendig, øker den optiske effekt av begge lasere. Justere skjermen intensiteten i Skjerm Vis Option kontrollblokk. Beveg oversettelse trinn i forsinkelseslinjen inntil signalet ikke kan sigdelig forbedret.
  5. Etter den fine justeringer er ferdig, sjekk om det er virkelig en CARS signal: Flytt litt oversettelsen scenen; intensiteten av signalet som skal bli svakere. Og / eller slå av en av laserstrålen, enten Ti: safir laser eller OPO. Igjen må det være en sterk forfall i intensitet i forhold til CARS signal.
  6. For å oppnå maksimal CARS signal, velger du alternativet på programvaren for å gi en verdi av gjennomsnittsintensiteten i hele bildet (i Histo visningen av kategorien skjermområde). Juster bølgelengde (noen få nm), og x, y, z posisjoner av fokus strålen for å maksimere den midlere intensitet verdi.

6. Inngjerding av lysbanen av forsinkelseslinjen

  1. Siden det endelige systemet er dedikert til ikke-fysikere, omslutter lysbanen til forsinkelseslinjen med rør eller et avlukke boks, for å unngå direkte adgang til skadelig ikke-synlig høy toppeffekt laserstråle. Vær nøye med å gi en tilgang til oversettelse scenenknotten.

7. Wavelength Tuning for CARS

  1. Bruk ligningen ligning 1 til melodi laser bølgelengder til ønsket Raman vibrasjon. Å reprodusere resultatene presentert i dette arbeidet for å bilde CARS signal fra CH obligasjoner med stretching vibrasjoner fra 3015 cm -1, velger λ Ti: sapphire = 830 nm og λ OPO = 1095 nm.
    MERK: Raman karakteristiske vibrasjonsfrekvenser observert i biologiske prøver, slik som vann, kan CH binding som befinner seg i Evans et al 13 eller i Ellis et al 29...
  2. Bruk ligningen ligning 2 for å bestemme den emisjonsbølgelengde på CARS signal. For CH bindingen avbildning av biler, velge et smalt bånd filter på 670 nm siden X CARS = 670 nm med laser bølgelengder presentert i 7.1.
    MERK: En mobiltelefon søknaden er available å beregne X CARS fra λ P og λ S-verdier (se henvisning 30).

8. Observasjon av CARS Signal og Stained Myelin fra isjiasnerven Cuts

Merk: Alle dyreforsøk ble gjennomført i henhold til institusjonelle bestemmelser.

  1. Forbered de aksiale og langsgående sciatic nerve kutt på et objektglass som presenteres i Ozcelik et al. 31.
  2. Klargjør fluoromyelin røde flekker løsning ved å fortynne stamløsning 300 ganger i PBS. Svømme nerve kutt med den fargeløsning i 20 min ved RT. Fjerner oppløsningen og vasker 3 ganger i 10 minutter med PBS.
  3. Plasser kutt under 20X nedsenking i vann objektiv. Plasser en dekkglass. Legg noen dråper PBS å fordype målet og justere fokus på målet å få et klart bilde av kuttene gjennom okularene (som tidligere beskrevet i 4.2).
    4. <li> I Spor 1, velg Ti: safir og OPO lasere og definere sine bølgelengder til 830 nm og 1095 nm, henholdsvis. I lysbanen vinduet velger PMT1 og grønn farge.
  4. I Spor 2, velg OPO laser bare (bølgelengde på 1095 nm). I lysbanen vinduet velger pMT4 og rød farge.
  5. For begge lasere, velg lavt strømforbruk og sette forsterkningen til 600 for en start. Slå på laserskanning og justere følgende parametere for å forbedre CARS og fluorescens signal kontraster: strømverdier, oversettelse scene knott (veldig lett), bølgelengder (noen nm), skjerm intensitet.
  6. For å ta opp siste bildene med høy oppløsning, velger i Acquisition Mode verktøy følgende parametre: rammestørrelse på 1024 piksler, skannehastighet på 7, gjennomsnittsberegning av 4. Klikk på Snap knappen for å spille inn et enkelt bilde. Lagre bildet i den proprietære skjemaved å ta opp et bilde og full overtagelse parametere.

9. Observasjon av biler og SHG Signaler fra isjiasnerven Cuts

  1. Forbered isjiasnerven som presenteres i Ozcelik et al. 31.
  2. Følg prosedyren som forklart i del 8 for å få et bilde gjennom okularene og for å velge CARS signal parameter (spor 1).
  3. I Spor 2, velg OPO laser bare (bølgelengde på 1095 nm). I lysbanen vinduet velger PMT3 og magenta farge.
  4. Følg prosedyren som forklart i del 8 for å slå på laserskanning og lagre bilder med høy oppløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pulstoget frekvensen av standard Ti: safir laser er typisk rundt 80 MHz. Den OPO har samme frekvens siden den er pumpet opp av Ti: safir laser. En rask oscilloskop på minst 200 MHz er derfor nødvendig. En rask fotodiode i området 600 til 1100 nm er også nødvendig. Den maksimale tidsmessige forskyvning oppstår når Ti: safir og OPO signaler blir forskjøvet på 1 / (2 x 80 x 10 6) = 6,2 nanosekunder. Den tilsvarer en maksimal strålebanen forskyvning av 1,9 m Figur 2 viser pulstoget registrert fra den OPO laserstrålen (A) og fra Ti:. Safir laserstrålen uten at forsinkelseslinjen (B) og med den justerte forsinkelseslinjen (C ). Pulstogene blir således omtrent synkronisert i tid med den gjennomførte forsinkelseslinjen som er vist på figur 2A og 2C.

pg "/>
Figur 2. laserpulstog opptak for den tidsmessige synkroniserings opptak av pulstog på mikroskop prøven planet med et 10X objektiv av OPO bjelken (A), Ti: safir. Laserstrålen uten (B) og med den forsinkelseslinje (C ). Den øverste kurven for hver graf tomter signalet direkte opptak fra BNC-kontakten på baksiden av Ti: safir laser (Sync ut kontakten.). Oscilloskop trigger justeres på dette signalet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den romlig overlapping av de to stråler kan oppnås ved visualisering av fluorescerende polystyrenkuler festet på toppen av et objektglass (figur 3A). Figur 3B viser et bilde av tre nærliggende perler gitt avOPO laser på 1107 nm (rød falske farger) og av Ti: safir laser på 830 nm (grønn falske farger). Den romlige forskyvning mellom de to laserstråler som er blitt kompensert følge fremgangsmåten ifølge den romlige synkroniserings tidligere beskrevet (figur 3C).

Figur 3
Figur 3. Romlig overlapping av strålene. General view of fluorescerende sfærer (A). Zoome på 3 tilstøtende sfærer. Belysningen av perler på 830 og 1107 nm viser en romlig forskyvning av vulsten bilder (fargefeil) (B). Etter x, y, z justeringer, blir perle bilder flettes (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Finalentrinn for å oppnå den nøyaktige tidsmessig justering for å aktivere CARS lett kan realiseres ved å avbilde olivenolje dråper (inneholdende tallrike CH bindinger 32) og ved å bevege svakt speilene til forsinkelseslinjen for å fullføre den synkroniseringen i tiden for både laserpulstogene. Figur 4 viser bilder av en olivenolje dråpe levert fra Ti: safir laser belysning bare (figur 4A) og fra OPO belysning eneste (figur 4B). Begge bjelker samtidig påført indusere en klar signalforbedring (figur 4C) ved 670 nm, som tilsvarer en CARS signal fra indre karbon-hydrogen (CH) strekker vibrasjon med en Raman vibrasjon bånd rundt 2800 - 3100 cm -1. CARS signal (C) forsvinner når man de to stråler er slått av. Siden olivenolje inneholder naturlige fluoroforer 33, særlig klorofyll-molekyler som avgir i området 650-670 nm, det svakt signal i (A) og (B) er en multiphoton fluorescens prosess. Intensiteten av disse signalene er flere størrelsesordener lavere enn det CARS signal. Derfor vil det ikke forstyrre målingen av CARS signal.

Figur 4
Figur 4. Endelige fin time justeringer for CARS signalisere utbruddet. Olivenolje dråper kan brukes til å stille inn tid begge bjelker ved å justere forsinkelsen linjelengde med lineær oversettelse scenen med mikrometer stasjonen. Dråper henhold til (A) 830 nm laserlys bare og under (B) 1107 nm laserlys viser bare et svakt signal. Under samtidig belysning (C), er tydelig signal forbedring observert, tilsvarende CARS signal. Skala barer er 100 mikrometer. Raman vibrasjon topp på 3,015 cm -1. Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.

Myelin skjede er en biologisk struktur produsert av spesifikke celler som brytes og kondensat sin plasmamembran rundt aksoner av nerveceller i sentrale og perifere nervesystemet 34. Denne kappe er sterkt anriket på forskjellige lipider. Vi brukte her myelin hylser av isjiasnerven med musen. Tverrgående og langsgående isjiasnerve tverrsnitt segmenter er farget for to-foton fluorescens avbildning av myelin ved 1095 nm, som vist i figur 5B og figur 5E, respektivt. En fluoromyelin rødt fargestoff, som har selektivitet for myelin ble anvendt 35. Disse prøvene har samtidig opplyst om 830 og 1095 nm, og bilene signalet ble observert (figur 5A og figur 5D). I figur 5A-C, sirklene tilsvarer myelin hylser rundt aksonene (tom plass iside ringene) i tverrgående kutt. Som vist på figur 5C og 5F, er de samme struktur fant mens overlappende biler og fluorescens bilder. Vi konkluderer med at tilsvarende nivå av detaljer kan fås med biler og derfor uten bruk av fluorescerende merking.

Figur 5
Figur 5. CARS og farget myelin avbildning av hoftenervene kutt. (A) Tverrgående og (D) langsgående kutt av etiketten frie biler avbildning av myelin hylser. (B) Transversal og (E) langsgående kutt av den samme prøven farget med fluoromyelin rødt fargestoff i henhold til to-foton fluorescens-belysning ved 1095 nm. (C) Transversal og (F) langsgående snitt overlapping av begge bildene. Skala barer er 10 mikrometer. Gjennomsnittlig optiske krefter var 5 mW ved 830 nm og 16mW ved 1095 nm for CARS signal. Gjennomsnittlig optisk effekt var 8 mW ved 1095 nm for to-foton fluorescens bildebehandling. Raman vibrasjon topp på 2,915 cm -1. CARS signal forsvinner ved å stoppe skanning av en laser eller ved å flytte oversettelse scenen ut av Raman resonans. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I tillegg til CARS avbildning, den tilgjengelige mikros systemet gjør det mulig å samtidig generere andre harmoniske fra kollagenfibre ved den ytre overflate av hoftenerver. Denne ekstra bildet krever bare bruk av en annen detektor for å ta opp et signal ved 550 nm (halvparten av bølgelengden av den OPO) siden et smalt båndpassfilter ved 670 nm er anvendt for signalet opptak CARS. Figur 6 viser et kontrastbilde av myelin hylser avbildet i falsk grønn farge (CARS signal påly i figur 6A) omgitt av kollagenfibre som er illustrert i falsk magenta farger (SHG bare i figur 6B). CARS signal ble oppnådd med gjennomsnittlig optiske krefter 4 mW ved 830 nm og 13 mW ved 1095 nm, mens det kreves 50 mW ved 1095 nm for å oppnå SHG signal. Derfor mye lavere optisk energi som kreves for å oppnå CARS signal i forhold til SHG eller THG (ikke vist) som signalene i våre biologiske prøver.

Figur 6
Figur 6. CARS og SHG avbildning av mus isjiasnerven. (A) CARS bildebehandling, (B) SHG bildebehandling og (C) samtidig visualisering av myelin med CARS imaging (i grønn falske farger) og av kollagen ved SHG imaging (i magenta) på mus hoftenervene. Gjennomsnittlig optiske krefter var 4 mW ved 830 nm og 13 mW ved 1095 nm for biler. Gjennomsnittlig optisk effekt var 50 mW ved 1095nm for SHG. Scale bar er 10 mikrometer. Raman vibrasjon topp på 2,915 cm -1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mest utfordrende delen av arbeidet er tidsmessig synkronisering av laserstråler. Det krever en rask fotodiode kombinert med en rask oscilloskop, men bare en grov overlappende i tid kan bli utført til å begynne med. Deretter en ytterligere justering av noen få cm kreves. Endelig mikrometer trekk ved en lineær oversettelse scenen lar utføre den endelige finjustering av forsinkelsen linjelengde for å utløse CARS signal. Dette signal opprettholdes i et smalt område på rundt 20 um, som observert ved å justere oversettelsestrinnet mikrometer stasjon. Den tilsvarer en maksimal forskyvning av bjelkene i omtrent halvparten av pulsvarigheten, dvs. 140 fsec. Den romlig overlapping av de to stråler som er nødvendig for det CARS-signalet er lik en normal strålejustering for en slik laser scanning mikroskop system.

Gjennomføringen av forsinkelseslinjen kan oppnås i noen uker ved biologer som har en grunnleggende bakgrunn i eksperimental optikk eller i samarbeid med fysikere. Spesielle hensyn må tas for valg av speilene for å minimere refleksjon tap. Hvis de fleste av materialene til å bygge forsinkelseslinjen er rimelig, er det oscilloskop som kreves ikke er en standard oscilloskop. Dermed, siden noen dager er nok til å fullføre det timelige synkroniseringsprosedyren, låne oscilloskop fra et fysisk laboratorium ser ut til å være det beste alternativet. Spatial overlapping kan være tidkrevende siden det krever tuning av flere speil og linser (som kan motoriserte avhengig av laser scanning system). Tidligere CARS lasersystem basert på to elektronisk synkronisert Ti: safir laser hadde et problem med langsiktige (titalls minutter til timer) temp puls overlappende. Dette problemet har blitt fullstendig løst med OPO pumpet med en unik laserkilde 20,21. Med et slikt lasersystem, og ved hjelp av fast klemt fast optikk, bjelker ingen temporal walk-off mellom pumpe og Stokes ble observert i løpetmåneders drift.

En vesentlig begrensning av CARS teknikk er at den CARS signal kan skje uten tilstedeværelse av resonans molekyler (fra løsningsmidlet eller sprederne) 11. Denne ikke-resonant bakgrunn kan begrense følsomheten. Måter å minimere denne bakgrunn omfatter konfigurasjonen for påvisning (forover eller bakover gjenkjenning), laser egenskaper (femtosecond eller picosecond), valg av løsningen som brukes til å dyppe den objektive eller bilde behandling. En bakover deteksjon gjør det mulig å minimere den ikke-resonant bakgrunn 11 som det ble anvendt i dette arbeid (figur 1). Femtosecond Ti: safir lasere gi høy peak intensitet svært ønskelig for ikke-lineære optiske prosesser. Imidlertid, i den spektrale domenet, idet bredden av de fleste Raman linjer er mindre enn den spektrale bredde av en femtosecond puls, mens den passer til den spektrale bredde av en picosecond puls. Derfor er bruken av picosecond laser øker forholdet of resonans signal til ikke-resonant bakgrunn. For CH bindinger i lipid, på grunn av den høye tettheten av obligasjonene, er den ikke-resonant bakgrunn ubetydelig for en femtosecond laser. For å redusere bakgrunns effekt, kan subtraksjon av et referansebilde føres under off-resonant også brukes (ikke gjort for dette arbeidet).

Til tross for utnyttelse av nær-infrarøde laserstråler slik dyp penetrasjon i vev (200 - 300 mikrometer), den praktiske inntrengningsdybden oppnådd i nerve bildebehandling var rundt 50 mikrometer med eksperimenter utført i dette arbeidet. Men denne parameteren er sterkt avhengig av den biologiske vevet avbildes og, fordi alle myelinerte fibre er justert og konsentreres i en liten plass, perifere nerver sannsynligvis ikke utgjør de beste prøver for å evaluere denne lett penetrasjon. I tillegg er noen sekunder som kreves for å ta opp bilder med høy oppløsning (1024 x 1024 piksler), noe som kan begrense visualisering av in vivo

CARS mikros tillater kjemisk spesifikk selektiv avbildning med en oppløsning nær diffraksjonsgrensen. Denne teknikken krever ingen merking, og ettersom Ti: safir laser er avstembar fra 700 til 1000 nm og den OPO laser fra 1100 til 1300 nm, den dekker hele spekteret område av molekylære vibrasjoner i biologiske systemer (fra 500 til 7000 cm -1). Det er således anvendelig og sterkt diskriminerende til DNA, proteiner, lipider, eller vann, mens den sterkere signal oppstår fra lipid CH stretching binding. Photodamage blir også redusert på grunn av det lave nivå av lasereffekt som brukes til å generere den CARS signal i forhold til den andre-harmonisk generering avbildning. Siden CARS bildebehandling kan realiseres med lav laser makt og uten invasive koder, er det derfor et verktøy av valget for in vivo studier.

Laser skanne mikroskoper with en femtosecond Ti: safir laser kilde kombinert med en OPO har blitt stor grad tilgjengelig for to-foton mikroskopi i mange biologiske laboratorier. Siden den romlige synkroniseringen allerede er implementert i disse systemene, den tidsmessige overlappende fremgangsmåten i de to stråler som er beskrevet i dette arbeid bringer en ytterligere teknikk for mikroskopi uten kostbart tilleggsutstyr. Dermed kan den modifiserte oppsett for samtidig avbildning av celler eller levende vev med andre eller tredje Harmonic generasjon (SHG, THG), to-foton fluorescens og biler. CARS teknikken har vist stort potensial for in vivo avbildning av levende dyr slik at studiet av dynamiske prosesser (uten flekker eller genetiske manipulasjoner). Lovende bruksområder er in vivo label-free non-invasiv lipid bildebehandling, brukes for eksempel for sanntids avbildning av nevronale myelin i levende spinal vev 36, for å studere lipid-relaterte sykdommer (fedme, demyeliniserende og cardiovascular sykdommer) 37, menneskelig hud penetrasjonsmekanismer 22 eller hudsykdommer 38. Vi tror at fremtidige forbedringer vil gjelde bruk av spesielle objektiv, for eksempel glise mikro mål eller miniatyr mål å øke penetrasjonen dybden av CARS signal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oscilloscope Tektronix TDS 520D 500 MHz 
Photodetector Thorlabs DET08C/M, T4290 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm
Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II Coherent
Optical parametric oscillator OPO Compact Family APE Berlin
Axio Examiner microscope LSM 7 MP Carl Zeiss
Motorized periscope Newport
Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 Carl Zeiss
Beam combiner Carl Zeiss
Acousto-optic modulator Carl Zeiss
OPO power attenuator Carl Zeiss
Photomultiplier tube Carl Zeiss
ZEN software Carl Zeiss
Bandpass filters Carl Zeiss LSM BiG 1935-176 400 - 480 nm; 500 - 550 nm; 465 - 610 nm
Dichroic mirror Carl Zeiss Cutoff wavelength 760 nm
Silver mirrors Newport 10D20ER.2  λ/10, 480 - 20,000 nm, Quantity 4
Single-axis translation stage with standard micrometer Thorlabs PT1/M Quantity 1
Aluminium breadboard Thorlabs MB1015/M  Quantity 1
Mirror mount Thorlabs KMSS/M  Quantity 4
Mirror holder for Ø1" Optics  Thorlabs MH25 Quantity 4
Iris diaphragms  Thorlabs ID8/M Quantity 3
Protective box Thorlabs TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S Quantity 1
Optical posts Thorlabs TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M Quantity 8 (lengths depending on the set-up)
661 - 690 nm bandpass filter Semrock 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter Quantity 1
Fluorescent beads ThermoFisher TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit
Laser viewing card Thorlabs IR laser viewing card
Laser safety glass Newport LV-F22.P5L07 
FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain  ThermoFisher F34652

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
  4. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
  5. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  6. Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
  7. Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
  8. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
  9. Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
  10. Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
  11. Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
  12. Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
  13. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
  14. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. New York. (1995).
  15. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
  16. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  17. Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
  18. Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
  19. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
  20. Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
  21. Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
  22. Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
  23. Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
  24. Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
  25. Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
  26. Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).
  27. Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
  28. Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
  29. Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
  30. A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from: http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator (2015).
  31. Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
  32. Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
  33. Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
  34. King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
  35. Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
  36. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
  37. Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
  38. Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).

Tags

Biofysikk cellebiologi sammenhengende anti-Stokes Raman spredning mikroskopi laser scanning mikroskop ikke-lineær avbildning in-vivo imaging lipid myelin
Implementering av en sammenhengende Anti-Stokes Raman Spredning (CARS) System på en Ti: Sapphire og OPO Laser Basert Standard Laser Scanning Microscope
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mytskaniuk, V., Bardin, F.,… More

Mytskaniuk, V., Bardin, F., Boukhaddaoui, H., Rigneault, H., Tricaud, N. Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope. J. Vis. Exp. (113), e54262, doi:10.3791/54262 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter