Summary
分子結合の固有振動に基づくコヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）顕微鏡検査は、ラベルフリー化学的選択のライブセルイメージングを可能にします。サファイアレーザとOPOレーザー：この作品は、フェムト秒チタンに基づく標準的な多光子レーザー走査顕微鏡上の相補的な顕微鏡技術の実装を提供します。
Abstract
フェムト秒チタンを組み合わせたレーザー走査型顕微鏡：サファイアレーザと光パラメトリック発振器（OPO）レーザーラインを複製するには、生物学者のために利用できるようになりました。これらのシステムは、主に、マルチチャンネル二光子蛍光顕微鏡用に設計されています。しかし、そのまま、このような第二高調波発生（SHG）や第3高調波発生（THG）などの補完的な非線形光学顕微鏡は、また、構造化分子または水性中型のラベルフリーイメージングを可能にする、このセットアップを行うことができます脂質インターフェース。これらの技術は、生体内の観察に適しているが、化学的特異性が限られています。化学的に選択的なイメージングは、ラマン散乱に基づく固有振動信号から得ることができます。共焦点ラマン顕微鏡は、3次元空間分解能を提供するが、それは、高平均パワーと長い取得時間を必要とします。これらの困難を克服するために、レーザー技術の最近の進歩は、develのを可能にしました特にコヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）での非線形光学振動顕微鏡の発、。 CARS顕微鏡は、したがって、化学的にマッピング（OH伸縮振動を介して）（CH伸縮振動を介して）、脂質、水、タンパク質やDNAによって、生物学的および生細胞イメージングのための強力なツールとして浮上しています。本研究では、標準的なOPO結合多光子レーザー走査顕微鏡にCARS技術の実装について述べます。これは、レーザビーム経路の一方の長さを調整することによって二つのレーザラインにおける時間同期に基づいています。我々は、既存の多光子システム上でこの技術のステップバイステップの実装を提示します。実験光学系における基本的な背景が有用であると提示システムは高価な補助的な装置を必要としません。我々はまた、げっ歯類の坐骨神経のミエリン鞘に取得したCARSイメージングを示しており、我々はこのイメージングは、標準トンのような他の非線形光学イメージングと同時に行うことができることを示していますWO-光子蛍光技術と第二高調波発生。
Introduction
光学顕微鏡は、細胞内の分解能で生物学的システムを生きているの動的プロセスの非破壊可視化のための主要な技術となっています。蛍光顕微鏡は、その高い特異性と感度1に、現在生きている細胞で使用される最も人気のある画像造影です。蛍光プローブの大きなパレットは（外因性染料、遺伝的にコードされたタンパク質、半導体ナノ粒子）を浮上しています。様々な試料照明蛍光ベースの技術は、3D画像化を実行し、2を光退色されるこの技術の主な欠点を減らすために（例えば、共焦点または二光子顕微鏡法のような）栄えています。分子種の大部分は本質的に蛍光性ではなく、したがって、これらのフルオロフォアは、人為的に撮像された試料に導入しなければならないので、他の制限は、フルオロフォア標識の要件を含みます。この人工的な操作は、小分子のために特に破壊的であるか、または鍋を誘導することができますentialフォト毒性。これらの理由は、生体内の観察のための蛍光顕微鏡ではないに適しています。したがって、蛍光分子を使用することなく、高感度かつ特異的な分子のコントラストを有する光学イメージング技術の使用は、生物医学科学の非常に望ましいです。
標識または染色することなく、いくつかの非線形光学イメージング技術は、第二高調波発生（SHG）3,4と第三高調波発生（THG）5を含む、浮上しています。 SHG顕微鏡は、微小管またはコラーゲン6などの超分子レベルでの画像構造的配置に使用されてきました。 THGは、水性媒体および脂質7との間のインタフェースとしての光不均質から生成されます。 THGは、画像ミエリン8,9に示されました。両方の技術は、二光子蛍光顕微鏡上で実施し、一つのレーザビームを必要とすることができます。しかし、それらは典型的には50（高出力レーザ強度を必要とします生活試料中の有害である、と明確にイメージの特定の生物学的構造をするために必要な化学的特異性を提供しないTHG 9用の1180 nm）を、50 mWの- SHG 10、25用の860 nmのmWの。
化学的に選択的なイメージングは、ラマン散乱に基づいて固有の分子振動信号から得ることができます。光のビームが問題当たると、光子は吸収され、原子または分子によって散乱させることができます。散乱光子のほとんどは、入射光子と同じエネルギー、 すなわち、周波数を、持っています。このプロセスは、レイリー散乱と呼ばれています。しかしながら、光子の少数は、ラマン散乱と呼ばれる非弾性散乱過程で、すなわち、入射光子の周波数とは異なる光周波数で散乱されます。エネルギー差は、分子構造や環境に応じて振動モードの励起に由来します。したがって、自発ラマン散乱プロブIDEの化学選択的イメージングは、異なる分子は、特定の振動周波数を持っています。しかしそれは、その微弱な信号の限られています。共焦点ラマン顕微鏡を開発し、3次元空間分解能を提供するが、それは、高平均パワーと長い取得時間11を必要とされています。これらの困難を克服するために、レーザー技術の最近の進歩は、特に、コヒーレントアンチストークスラマン散乱における非線形光学振動顕微鏡の上昇、（CARS）11,12,13可能にしています。
CARS三次の非線形光学過程です。周波数ωPでポンプビームからなる3つのレーザビームは、周波数ωSのストークスビームおよびプローブビームが（ほとんどの場合、ポンプある）試料に集束され、（周波数ωAS =において反ストークスビームを生成します2ωP - ωS）14。反ストークス信号を大幅に向上させることができる場合の周波数差（ - ωSωP）ポンプおよびストークスビーム間のラマン分子振動のΩのR =に同調されます。 CARS信号は、多光子相互作用に基づいています。したがって、自発ラマン散乱よりも強い大きさのコヒーレント信号の注文を生成します。
CARS顕微鏡法は、第一の実験ダンカンら 15によって示されました。ツンブッシュらは 、高開口数の対物レンズを有する2つの焦点を合わせ、近赤外フェムト秒レーザー光を用いたCARSの位相整合条件を可能にし、二光子非共鳴バックグラウンド16を回避することによって、その後の技術を向上させます。 CARS顕微鏡は、したがって、化学的に、このような生細胞中（OH伸縮振動を介して）（CH伸縮振動を介して）脂質17,18、水、タンパク質、DNA 19,20などの分子を検出することにより、生細胞や組織イメージングのための強力なツールとして浮上していますしかし、化学化合物を重水素化21医薬品及び化粧品用途22のための。
非線形顕微鏡の主な制限は、複雑さと光源のコストに由来します。 CARSシステムは、短いパルス持続時間を持つと時間的および空間的に同期したパルス列を持つ2つの波長可変レーザーを必要とします。初期のCARS顕微鏡は、二つの同期ピコ秒のTiに基づいていた：サファイアレーザー20。スーパコンティニューム光源23を生成するサファイアレーザー：CARSイメージングは、単一のフェムト秒チタンから入手しました。最近では、単一のフェムト秒Tiから成るレーザ光源：波長可変光パラメトリック発振器（OPO）をポンピングサファイアレーザーは、CARS顕微鏡検査のために使用されています。このセットアップは、本質的に時間的にポンプと完全分子の振動スペクトル24を覆うストークスビームの間の周波数の差でビームを同期することを可能にします。また、レーザ走査型顕微鏡ターンに基づきます主に次の2つの光子蛍光（TPF）のために使用されるキーfsレーザとOPOは、非物理学者のために利用できるようになりました。各非線形（NLO）イメージング・モダリティは、特定の構造または分子に敏感であるため、このようなセットアップの可能性が大きく、他の非線形光学イメージングを組み込むことによって補助投資を必要とせずに向上させることができます。マルチモーダルNLOイメージングは、したがって、複雑な生体試料25のためのNLO顕微鏡の可能性を大文字にします。これらの技術の結合は、脂質代謝、皮膚または癌の開発26、骨格筋の発達27、アテローム性動脈硬化病変28に、特に、多くの生物学的な質問の調査を可能にしました。また、CARSのレーザビーム走査の実装は、高速イメージング、 すなわち、 生体内で動的プロセスを研究するための魅力的なツールの能力を与えます。
この作業の目的は、トンを実装するための各ステップを示すことです標準的な多光子レーザー走査型顕微鏡で彼CARS技術。サファイアレーザーとチタン（Tiによってポンプ：サファイアレーザー）OPO：生物学者のためのソフトウェアによって運営顕微鏡は、フェムト秒チタンをベースにしています。積分は、時間的に二つのビームを同期させるために、レーザビーム経路の一方の長さを調整することにより行いました。我々は実験的な光学系における基本的な背景を必要とするこの技術のステップバイステップの実施を説明します。我々はまた、げっ歯類の坐骨神経のミエリン鞘に得られる撮像CARSを示しており、我々はこのイメージングは、標準的な二光子蛍光技術と第二高調波発生などの他の非線形光学イメージングと同時に行うことができる示します。
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Protocol
図1.一般的なセットアップの概略図これは、Tiが含まれています。サファイア（680 - 1080 nm）をOPO（1050 - 1300 nm）のレーザー、4ミラー（M 4 M 1）と遅延線、。高速オシロスコープ、フォトダイオードと2つの固定虹彩絞りI 1、I 2。ミラーM 2及びM 3は、マイクロメートルの分解能で遅延線の長さを変更することを可能にするリニア並進ステージ上に固定されています。 660 - 。685 nmのバンドパスフィルタは、CARSイメージングのために使用される光電子増倍管（PMT）の前方に配置されたこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
レーザーシステムの1.スタートアップ
- サファイア波長800 nmまで設定されているか、または定義：Tiをことを確認しますサファイア電源コントローラ：Tiの上にこの波長。サファイアレーザー：チタンをオンにスタンバイからオンに鍵を回します。
- OPOコントローラの背面にOPOレーザーをオンにするとTi開き：チタン上のサファイアシャッター：サファイア電源コントローラを。
- OPOをポンプアップするタブレットコンピュータのスイッチをオンにします。タブレット上OPO接続とリモート接続のアイコンをクリックしてください。ウォームアップのために40分 - 30のを待ちます。
- 顕微鏡のコンピュータに切り替えて、「顕微鏡コンポーネント」のスイッチをオンにします。ダブルデスクトップ上のアイコンをクリックしてソフトウェアを起動します。
- ソフトウェアの取得]タブに、ソフトウェアの両方からレーザーを動作させるためにセットアップマネージャでレーザーツールを開きます。チタンを選択： オンサファイアレーザとOPOレーザーで 。光レーザパワーの値（800 nmで3700ミリワットの典型的な値と700 mWの千nmで）を確認してください。
- ビーム経路とレーザーを設定するには、セットアップマネージャツール群の光パスツールを開いて、 最初の光電子増倍管 （PMT）をボックスをチェックします。
- チタン確認するには：目的の出力でサファイアレーザースポットを、 取得パラメータツールグループ内のチャンネルツールを開きます。チタンを選択：低い値（約1％）で、サファイアのパワーを、0にゲイン（何の画像がこの段階では必要ありません）を低減し、顕微鏡の対物レンズを介してレーザビームを起動するためにスキャン手順を開始するために、 継続的なボタンをクリックしてください。空気顕微鏡対物レンズ（10X）の出力でIRレーザー視聴カードを配置することによって直接観察することによって赤い斑点の存在を確認してください。
- [停止]ボタンをクリックすることでサファイアレーザー：OPOレーザースポットを確認するには、チタンのスキャンを停止します。 Channelsウィンドウに低い値でOPOパワーを選択し、[C]をクリックしますontinuousボタン。
2.顕微鏡の設定
- 手動で非デスキャン検出（NDD）モードでのPMTにアップサンプルから760 nmの光を送出する目的ノーズピース上記の無限空間内のサイドポートスライダの760 nmのカットオフ波長とダイクロイックミラーを配置します。
- 唯一の車がこの仕事で提示結果を再現するために670 nmで信号記録するPMT1の前にNDDリフレクターキューブで685 nmの - 660での狭帯域通過フィルタを設定します。
- 500からミエリンの蛍光観察用PMT3の前にNDDリフレクターキューブで550 nmの範囲の狭帯域フィルタを配置します。 565からのSHGの観察のためPMT4の前面に反射キューブで610 nmの範囲の狭帯域フィルタを配置します。
- 、 アドホックバンドパスフィルタを用いて検出器上のソフトウェアで信号の記録を選択し、セットアップマネージャのメニューでは、 光パスツールを開くには買収タブインチ目的のPMT（チェックボックス）を有効化してこのチャンネルの色を選択します。この作業では、緑色はSHGのための蛍光およびマゼンタ用の赤CARS、のために選択しました。
3.時間同期
注：2つのレーザービームは、同一のTi起源：サファイアレーザーが、OPOビームは、それらが顕微鏡に達したときに二つのビームが時間的に同期していないので、それが発生したときに遅延されます。ここでの目標は、顕微鏡に到達するまでの時間で再同期させるために、2つのビームの一方を遅延させることです。
- BNCケーブルで電気BNCのレーザ出力（シンク。アウト）に、オシロスコープの入力チャンネルCH1を接続します。入力チャンネルオシロスコープのCH2は、フォトダイオードに接続し、トリガーチャンネルとしてCH1チャンネルを選択するトリガーメニューを押して、メインメニューボタン出所した後、C選択したチャンネルに対応し、サイドメニューボタンH1。
- 位置と目的を除去した後に、光の取り付けポストで空気顕微鏡対物レンズ（10倍）、または顕微鏡のビーム経路内の焦点面でのフォトダイオードを修正します。注意：必要に応じて、凝縮器及びそのキャリアを取り外します。
- チャンネルツール （ 取得パラメータツール群 ）では、Tiの定義：低電力で830 nmでサファイアレーザー波長（ すなわち、全電力の1％未満）。 取得モードツールでは、最も小さいビームでフォトダイオードを照明するために、1つのポイントにスキャン領域を減らします。 連続ボタンをクリックして、レーザースキャンに切り替えます。
- プレスAUTOSETオシロスコープのフロント・パネルに、手動で画面上のパルス列を取得するために、フォトダイオードの位置を移動させます。表示を凍結するプレスRUN / STOPボタンを押します。
- オシロスコープのディスプレイのコピーを保存するには、3.5を挿入フロッピーディスクドライブにフロッピーディスクをインチやコンピュータに背面パネルのGPIBポートを接続します。そして、TIFF画像形式を選択して、ポートメニューで出力チャネルを指定するには、SHIFTのHARDCOPYメニュー 、プレスFORMAT（メイン）を押します。サファイアレーザー：チタンのパルス列のオシロスコープの表示を記録するプレスHARDCOPYボタンを押します。
- [停止]ボタンをクリックすることで、スキャンサファイアレーザー：チタンのスイッチをオフにします。 チャンネルツールをクリックすることで、1107 nmおよび低電力でOPO信号を定義します。 OPOレーザースキャンに切り替えて、オシロスコープ上のOPOレーザーのパルス列を記録します。 OPOレーザースキャンをオフにします。
- サファイアとOPO信号：Tiの間の時間的なずれを比較してください。
注：L 遅延線 = C：時間的シフトT シフトは以下の式実装する必要があり、遅延線L 遅延線の長さを与えます5; cは光の速度であり、Tがシフトします。 - レーザーラインのいずれかを選択します。
注：この作業では、チタン：空き領域がこのレーザーラインの近くに利用可能であったため、サファイアレーザーラインが選ばれました。また、この選択は、可視レーザ光とレーザーラインの再整列を達成することができます。 - 遅延線が実装される位置に保護チューブを除去することにより、レーザーラインを開きます。
注意！適切な安全ゴーグルを着用し、チェーンブレスレットを削除したり、手首から時計。 - 簡単に（ソフトウェアのチャンネルツールで低電力で、例えば700ナノメートル）のレーザ光 を観察できるようにするために、可視範囲内の波長を選択します。レーザースキャンに切り替えます。
- プレイス、光学マウントポストにオープンレーザ線に沿って2つの虹彩絞りを設定します。位置1遅延線の出口で虹彩とは潜望鏡の入り口に他の絞りを配置します。
注：PEソフトウェアによるレーザ走査顕微鏡の走査ヘッドにレーザビームの入射角をパイロット2電動ミラーによってriscopeコントロール。 - 絞り開口を減少させ、レーザビーム経路に適合するように絞り位置を調整します。光学テーブル上に固定してください。順次遅延線の4つのミラーを位置決めしながら、レーザビームの高さを確認するために、第3の移動虹彩絞りの垂直位置を調整します。
注：これらの虹彩絞りは、以下のようにパスを示すことによって再アライメント手順のためのコントロールとして機能します。 - M1コンパクト動ミラーに取り付けられたミラーは、（ 図1に示すように）遅延線の入口にマウントし、その位置と、モバイル虹彩絞りを用いてビームの高さを維持するために、その向きを調整置きます。場所はmidcoに配置される並進ステージ上に90°でM2とM3は（もコンパクトキネマティックミラーマウントに取り付けられた）ミラーURSE。以前に計算した遅延線の長さに合うようにそれらを配置します。
- モバイル虹彩絞りを用いて、M2とM3の向きを調整します。 2つの固定された虹彩絞りを介してレーザビーム経路に適合するようにその位置や角度を調整慎重に（ 図1に示すようにわずか虹彩I 1前）及びM4を設定された遅延線の出口で（また、コンパクトなマウント上に固定されました）。
- 顕微鏡の対物レンズの出力でレーザ視聴カードを置き、レーザースキャンをオンにするために継続的にクリックすることにより、レーザービームプロファイルを確認してください。均一な明るいディスクを確認します。必要であれば、少しM4の向きを調整します。
- 再び位置顕微鏡の試料の焦点面におけるレーザ光の下で高速フォトダイオード。サファイアレーザービームとオシロスコープ上OPOビーム：Tiの間の時間的ずれを観察します。
注：必要に応じて、システム全体M2を移動させることにより遅延線の長さを変更し、M3は、上に搭載しました両方のパルスを同期させるための移動ステージ（移動ステージのチューニングを変更することなく）。数センチメートルの変更が必要とされ得ます。
梁の4空間的な重なり
注：CARS信号を生成するために、2つのレーザ光の空間的な重なりが必要です。二つの異なる蛍光色素で染色を通じて同じビーズ上に両ビームの交互の照明は、空間シフトを示すために使用することができます。ミラー位置の微調整は、その後のシフトを最小限に抑えることができます。
- あらかじめ実装されている蛍光マイクロスフェアを使用してください。以下に説明するように、またはきれいな顕微鏡スライド上の懸濁液中のマイクロスフェアをマウントします。
- サンプリングの前に、ビーズが均一に懸濁されていることを確認するために（皮質ミキサーや超音波処理によって）ビーズ溶液を混合。
- スライドの表面にビーズ懸濁液の5μLを適用し、ピペットチップで広がります。液滴が乾燥した後、マウントの5μLを適用するのを待ちこのようなビーズの乾燥試料を超えるグリセロール、水や液浸油として、メディアをる。カバーガラスでサンプルをカバーし、速乾性接着剤または溶融パラフィンでカバースリップをシール。
- 20X水目的の下に、顕微鏡スライド上に固定された蛍光ポリスチレンビーズを配置します。目的を浸すために数滴の水を追加します。
- オンラインのボタンを押すことにより、目でサンプルを直接観察にレーザ走査モードから切り替えるためにソフトウェアでタブを見つけて開き、ビーズに焦点を達成するために。 アドホックフィルタを選択し、 アイコンをクリックすることで、ハロゲンランプのスイッチをオンにする眼ツールを開きます。
- 手動で無限の空間にサイドポートスライダにダイクロイックミラーを削除して、接眼レンズとビーズを観察することにより、試料面を集中するために、顕微鏡のフォーカシング駆動を使用しています。ダイクロイックミラーを交換してください。
- の中にタブの位置を確認し 、 オフラインボタンを押して、レーザ走査モードに切り替えます。スキャンのパラメータを定義するために取得]タブに移動します：512ピクセル、9のスキャン速度、1の平均、8ビットのビット深度にフレームサイズを選択すると最大にスキャン領域を増やします。
- まだ作成されていない場合は取得]タブのチャンネルツールでは、トラック（トラック1）を追加します。 Tiのための830 nmおよび低電力で波長を選択：サファイアレーザービームをChannelsウィンドウからトラック1ボックスとPMT3または光路ウィンドウからPMT4ボックスに緑に色をダニ 。
- 取得タブのチャンネルツールでは、第2のトラック（トラック2）を追加します。 OPOレーザービームのための1107 nmおよび低電力で波長を選択します。 Channelsウィンドウからトラック2ボックスとからPMT3ボックスに赤に色をチェック
- 順次連続でクリックすることにより、試料上に二つのビームのスキャンを適用し、その後600に両方のトラックのゲインを調整します。
- 2Dビューに画面領域に画像を観察します。 ディスプレイの表示オプション制御ブロックでは、表示輝度を調整します。
注：必要に応じて、ビーズの焦点面を見つけるためにわずかにフォーカスドライブを移動します。クロップを調整し、単一のビーズに、または隣接するビーズのグループで画像をズームします。- xy平面にビームをオーバーラップするように潜望鏡コントローラを使用してください。ソフトウェアでは、 保守タブを開きます。 システムオプションをクリックして、 電動ペリスコープツールウィンドウを表示します。空間内の両方の画像を同期させるために、サファイアレーザービーム：チタンの潜望鏡ミラーの粗いおよび微調整を使用してください。
- 潜望鏡の操作のために、垂直方向とセコのための第1の調整バーを使用レーザ光の水平方向の動きのための1つのND。画像がわずかに表示されるまで入力ミラーでビームを移動し、「入力」と「出力」をクリックすることで、潜望鏡の出力ミラーとレーザ強度を補います。
- サファイアレーザービーム：垂直、 維持タブで、ビームをオーバーラップするコリメータツールを開き、Tiの焦点距離の値を調整するために。
- 静かに両方の画像に焦点の違いを確認することを目的と垂直位置を移動します。または、取得]タブZ-スタックツールの開口部により、サンプルのzスタックを取り、異なるパラメータ（範囲、スライス数）を選択します。軸方向断面にビームを参照するには、画像の画面領域のプレスオーソ。同じ手順を複数回実行して、zのオーバーラップを最大化します。
5.最終的な調整とコヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）オリーブオイル博士からの信号観測oplets
- ガラス板上にオリーブオイルの滴を入れて、ガラスカバースリップによってそれをカバー。 20X水浸対物レンズを浸漬する水の数滴を追加します。 （4.2で先に説明したように）接眼レンズを使用してカバースリップの端に焦点を当てています。
- サファイアレーザービームとOPO用の1107 nmで： 取得]タブのチャンネルツールでは、トラック1のTiのための830 nmの波長で選択しました。両方のレーザーの同時スキャンを取得するために、トラック1で両方のレーザをチェック。開始の低い値でパワーを設定します。
- ライトパス]ウィンドウで、PMT1を選択します。 連続ボタンをクリックして、レーザースキャンに切り替えます。オイルの薄い層にレーザ光を提供するために、わずかにフォーカスを移動します。
- 必要であれば、両方のレーザのパワーを増加させます。ディスプレイの表示オプション制御ブロックの表示輝度を調整します。信号がSIGになるまでゆっくりと遅延線の平行移動ステージを移動させますnificantly強化。
- ファインアライメントが完了したら、それは本当にCARS信号であるかどうかを確認します。少し移動ステージを移動します。信号の強度が弱くなっている必要があります。および/またはレーザビームの一方をオフに、いずれかのTi：サファイアレーザ、OPO。再びCARS信号に比べて強度の強い減衰が存在しなければなりません。
- （画面領域]タブのヒストビューで）画像全体の平均強度の値を提供するために、ソフトウェア上のオプションを選択し、最大CARS信号を達成するために。波長（数nm）を調整し、その後、フォーカスビームのX、Y、Z位置は平均強度値を最大化すること。
遅延線の光路の6エンクロージャ
- 最終的なシステムが非物理学者に専用されているので、有害な非可視高ピークパワーレーザービームへの直接アクセスを回避するために、チューブまたはエンクロージャボックス付き遅延線の光路を囲みます。並進ステージへのアクセスを提供するように注意してくださいつまみ。
CARS 7.波長チューニング
- 式を使用します
希望のラマン振動に同調するレーザー波長。画像CARSは、Tiλセレクト3015センチメートル-1の伸縮振動持つCH債券からの信号にこの仕事で提示結果を再現するには、 次のサファイア = 830 nmおよびλOPO = 1095 nmの。
注：。。水などの生体試料において観察ラマン特性振動周波数は、CH結合がEvans ら 13またはEllis ら 29に記載されています。 - 式を使用します
CARS信号の発光波長を決定します。 CARSによってCH結合イメージングでは、7.1で提示レーザー波長= 670nmのλCARS以来、670 nmで狭帯域フィルタを選択します。
注：携帯電話アプリケーションAVですからλCARSを計算するailable λP及びλS値（基準30を参照）。
希望のラマン振動に同調するレーザー波長。画像CARSは、Tiλセレクト3015センチメートル-1の伸縮振動持つCH債券からの信号にこの仕事で提示結果を再現するには、 次のサファイア = 830 nmおよびλOPO = 1095 nmの。 
CARS信号の発光波長を決定します。 CARSによってCH結合イメージングでは、7.1で提示レーザー波長= 670nmのλCARS以来、670 nmで狭帯域フィルタを選択します。 坐骨神経のカットからCARS信号とステンドミエリンの8観測
注：すべての動物実験は、機関の規制に従って行いました。
- Ozçelik ら 31に提示されるような顕微鏡スライド上の軸方向と縦方向の坐骨神経のカットを準備します。
- PBSに原液300倍に希釈することによりfluoromyelinレッド染色溶液を調製します。 RTで20分間染色液で神経カットをあふれさせます。溶液を除去し、PBSで10分間3回洗浄します。
- 20X水浸対物レンズの下にカットを配置します。カバーガラスを配置します。目的を浸すと、（以前は4.2で詳述）接眼レンズを通してカットの鮮明な画像を得ることが目的の焦点を調整するために、PBSの数滴を追加します。 <サファイアとOPOレーザーをそれぞれ、830 nmおよび1095 nmまで自分の波長を定義する：トラック1におけるLi>は、チタンを選択します。 ライトパス]ウィンドウでは、PMT1と緑の色を選択します。
- トラック2では、OPOレーザーのみ（1095 nmの波長）を選択します。 光路ウィンドウで、PMT4と赤の色を選択します。
- 両方のレーザは、低消費電力を選択し、開始のための600のゲインを設定します。レーザースキャンに切り替え、CARSを改善するには、次のパラメータを調整し、蛍光シグナルは対照的である：電力値、並進ステージノブ（非常にわずかに）、波長（数nm）、表示輝度を。
- 1024ピクセルのフレームサイズ、7のスキャン速度、単一の画像を記録するためのスナップボタンを4.の平均：高解像度で最終的な画像を記録するには、 アクイジションモードツールで次のパラメータを選択します。独自の形式で画像を保存します画像と完全な取得パラメータを記録します。
坐骨神経のカットからCARSとSHG信号の9観測
- Ozçelik らに提示された坐骨神経を準備します。31。
- 接眼レンズを介して画像を取得するとCARS信号パラメータ（トラック1）を選択する部分8で説明したように手順に従ってください。
- トラック2では、OPOレーザーのみ（1095 nmの波長）を選択します。 光路ウィンドウで、PMT3とマゼンタの色を選択します。
- レーザースキャンに切り替えて、高解像度の画像を保存する部分8で説明したように手順に従ってください。
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Representative Results
標準のTiパルス列の周波数：サファイアレーザーは、典型的には、約80メガヘルツです。サファイアレーザー：OPOそれは、Tiによって励起されるため、同じ周波数を有します。少なくとも200 MHzでの高速オシロスコープは、したがって、必要とされます。範囲600〜1100 nm単位での高速フォトダイオードも必要です。サファイアとOPO信号1 /（2×80×10 6）= 6.2ナノ秒でシフトしている：Tiを時最大時間的なずれが発生します。それ1.9メートル、最大光路シフトに対応する。図2は、OPOレーザービーム（A）から、およびTiから記録パルス列を示す：サファイアレーザー光遅延線（B）を含まない、調整遅延線（Cと）。 図2Aおよび図2Cに示すように、パルス列は、このように略実装遅延線と時間的に同期されます。
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時間同期のための 図2 のレーザパルス列録音記録パルス列のOPOビーム（A）の10倍の対物レンズを有する顕微鏡試料面ではTi：（B）なしのサファイアレーザービームと遅延線と（C ）。各グラフの上の曲線は、直接のTiの背面にあるBNCコネクタから記録された信号をプロット：サファイアレーザー（シンク出力コネクタ。）。オシロスコープのトリガは、この信号に調整されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
二つのビームの空間的な重なりは、顕微鏡スライド（ 図3A）の上に固定された蛍光ポリスチレンビーズを可視化することによって得ることができる。 図3Bは、によって与えられた近傍3ビーズの画像を示しますTIが1107 nmの（赤偽色）と、OPOレーザー：830 nmのサファイアレーザー（緑偽色）。両方のレーザビーム間の空間的シフトは、前述の空間的同期（ 図3C）の手順に従って補償されています。
ビームの 図3. 空間的重なり。蛍光マイクロスフェア（A）の一般的な見解。 3隣接するマイクロスフェアにズームします。ビーズ画像の空間シフト（偽色）（B）を示しているnmの830と1107でのビーズの照明。 X、Y、Zの調整の後、ビーズの画像は（C）マージされます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
最終CARSを活性化するための正確な時間的な調整を達成するための工程が容易に（多数のCH結合32を含む） をオリーブオイル滴を撮像して、両方のレーザパルス列の時間での同期を完了するために、遅延線のわずかにミラーを移動させることにより実現することができる。 図4サファイアレーザー照射のみ（ 図4A）及びOPO照明のみ（ 図4B）から：TIから配信オリーブオイル滴の画像を示しています。 3100センチメートル-1 -同時に適用両方のビームは、CARSは2800周りのラマン振動範囲で伸縮振動固有炭素-水素（CH）からの信号に対応する670 nmの、で明確なシグナル増強（ 図4C）を誘発します。 1つのビームがスイッチオフされたときにCARS信号（C）が消えます。オリーブオイルは、範囲内の650発光特定のクロロフィル分子の自然蛍光団33、含まれているので- 670 nmでの、（A）及び（B）に弱い信号MULありますtiphoton蛍光プロセス。これらの信号の強度は、CARS信号よりも数桁低いです。したがって、CARS信号の測定を混乱しません。
CARS図4.最終的な微一時的な調整が発生を知らせる。オリーブオイル滴がマイクロメータードライブを搭載したリニア移動ステージで遅延線の長さを調整することにより、時間的に調整するために、両方のビームを使用することができます。 （A）830 nmのレーザー光のみと下の下の小滴は、（B）1107 nmのレーザー光が弱いシグナルを示します。同時照明（C）の下、クリア信号強調は、CARS信号に対応し、観察されます。スケールバーは100μmです。 3015センチメートルでのラマン振動ピーク-1。 彼女をクリックしてくださいeは、この図の拡大版を表示します。
ミエリン鞘は、中枢神経系および末梢神経系34のニューロンの軸索の周りに彼らの形質膜を凝縮ラップし、特定の細胞により産生される生物学的構造です。このシースは、非常に異なる脂質に富んでいます。ここでは、マウスの坐骨神経のミエリン鞘を使用しました。それぞれ、 図5Bおよび図5Eに示すように、横方向及び縦方向の坐骨神経断面セグメントは1,095 nmでミエリンの二光子蛍光イメージングのために染色されています。ミエリンに対する選択性を有するfluoromyelin赤色染料は、35を使用しました。これらのサンプルは、同時に830でと1095 nmで照らされており、CARS信号が（ 図5Aおよび図5D）が観察されました。 図5A-Cでは、円は、（軸索の周囲のミエリン鞘に空きスペースに対応します横方向のカットで）リングサイド。 図5C及び図5Fに示されるようにCARSと蛍光画像を重ねながら、同様の構造が発見されました。我々は、詳細の同様のレベルは、車で、したがって蛍光標識を使用せずに得ることができると結論します。
図5. CARSと坐骨神経のカットの染色ミエリンイメージング。（A）トランスバーサル及び（D）ミエリン鞘のラベルフリーCARSイメージングの長手方向のカット。 （B）トランスバーサル及び（E）1,095 nmの二光子蛍光照明下fluoromyelin赤色染料で染色同じ試料の長手方向切断。 （C）トランスバーサルと両方の画像の（F）縦カットオーバーラップ。スケールバーは10μmです。平均光パワーは830 nmで5mWとしたと16CARS信号のための1095 nmのmWの。平均光パワーは、二光子蛍光イメージングのための1,095 nmで8ミリワットでした。 2915センチメートルでのラマン振動ピーク-1。 CARS信号は、一つのレーザのスキャンを停止することにより、またはラマン共振のうち、並進ステージを移動することによって消滅する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
さらに、CARSイメージングに、利用可能な顕微鏡システムは、同時に坐骨神経の外表面にコラーゲン繊維から第二高調波を生成することができます。この付加的な画像は、6図 。CARS信号を記録するために使用される670 nmの狭帯域バンドパスフィルタから550ナノメートル（OPOの半波長）の信号を記録するために異なる検出器の使用を必要とコントラスト画像を示しています偽緑色で描か髄鞘の（CARSは、上の信号図6AのLY）偽マゼンタ色のみ、図6Bの（SHG）に示されているコラーゲン繊維に囲まれています。それはSHG信号を得るために、1095 nmで50 mWのを必要としたCARS信号は、1095 nmで830 nmおよび13ミリワットで4ミリワットの平均光パワーで達成されました。したがって、はるかに低い光エネルギーは、CARSを得るために必要とされるSHGやTHG（図示せず）我々の生物学的試料中のシグナルと比較して信号。
図6. CARSとマウス坐骨神経のSHGイメージング。（A）CARSイメージング、（B）SHGイメージングおよび（緑偽色で）撮影するCARSによってミエリンの（C）の同時可視化と（マゼンタ）SHGイメージングによるコラーゲンのマウス坐骨神経に。平均光パワーは830 nmで4ミリワットとCARSのための1095 nmで13 mWのでした。平均光パワーは1095で50 mWのでしたSHGのためのNM。スケールバーは10μmです。 2915センチメートルでのラマン振動ピーク-1。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
仕事の最も困難な部分は、レーザビームの時間的同期です。これは、高速オシロスコープと組み合わせた高速フォトダイオードを必要としますが、時間の唯一のラフな重なりが最初に行うことができます。その後、数cmのさらなる調整が必要です。最後に、リニア並進ステージによってマイクロメートル移動するCARS信号をトリガするために、遅延線の長さの最終的な微調整を行うことができます。並進ステージマイクロメーター駆動を調整することによって観察されるように、この信号は、約20マイクロメートルの狭い範囲内に維持されます。これは、パルス持続時間の約半分、 すなわち、140フェムト秒のビームのピークシフトに対応します。 CARS信号のために必要とされる二つのビームの空間的な重なりは、レーザ走査型顕微鏡システムの通常のビーム位置合わせと同様です。
遅延線の実装は、実験における基本的なバックグラウンドを持つ生物学者によって数週間で達成することができますアル光学系や物理学者とのコラボレーションインチ特別なケアは、反射損失を最小化するために、ミラーの選択のために取らなければなりません。ディレイラインを構築するための材料の大部分が手頃な価格であれば、必要とされるオシロスコープは、標準的なオシロスコープではありません。数日は、下剤の研究室からオシロスコープを借りて、時間的な同期手順を完了するのに十分であるため、このように、最良の選択肢であるように思われます。それは、（レーザ走査システムに応じて電動できる）複数のミラー及びレンズの調整を要求するため、空間的重複は時間がかかる可能性があります。以前CARSレーザーシステムは、2つの電子的に同期したTiに基づいて：サファイアレーザーは、長期（数分から数時間の数十）一時的パルスの重なりの問題がありました。この問題は、完全にユニークなレーザー光源20,21でポンプOPOで解決されています。このようなレーザシステムでは、しっかりと締め光学系を使用して、ポンプおよびストークスの間には時間的なウォークオフはオーバー認められなかった梁操作の数ヶ月。
CARS技術の主な制限は、CARS信号は11（溶媒または散乱体からの）共振分子の存在なしに起こり得ることです。この非共鳴バックグラウンドは、感度を制限することができます。このような背景を最小化する方法は、検出の設定（前方または後方検出）、レーザ特性（フェムト秒またはピコ秒）を含む、ソリューションの選択は、目的や画像処理を浸すために使用されます。後方検出は、それが（ 図1）本研究で使用したように、非共鳴バックグラウンド11を最小化することができます。フェムト秒Ti：サファイアレーザーは、非線形光学プロセスのために非常に望ましい高いピーク強度を提供します。それはピコ秒パルスのスペクトル幅に合う一方しかし、スペクトル領域において、ほとんどのラマン線の幅は、フェムト秒パルスのスペクトル幅よりも小さいです。したがって、ピコ秒レーザの使用は、比Oを増加させます非共鳴背景にF共振信号。なぜなら社債の高密度の脂質中のCH債券については、非共鳴バックグラウンドは、フェムト秒レーザのためのごくわずかです。背景の影響を低減するために、オフ共鳴の下で記録された参照画像の減算は、（この仕事のために行われていない）を適用することができます。
組織の深部に浸透できるように、近赤外レーザビームの利用にもかかわらず（200から300ミクロン）、神経イメージングで得られた実用的な侵入深さがこの作品で行われた実験で約50ミクロンでした。すべての有髄線維が整列し、小さなスペースに集中しているので、しかし、このパラメータは、撮像された生体組織の大きく依存していると、末梢神経は、おそらく、この光の浸透を評価するための最良のサンプルを構成するものではありません。また、数秒は、インビボの可視化を制限することができ、高解像度の画像（1024×1024画素）、記録するために必要とされます
CARS顕微鏡は、回折限界に近い解像度と化学的に特定の選択的なイメージングを可能にします。 500 7000センチメートルから（サファイアレーザー1100から1300 nmの700〜1000 nmおよびOPOレーザーに調整可能である、それは生物学的システムで分子振動のスペクトル全体の領域を覆う：この手法は、任意のラベル付けを必要とせず、Tiがあるため-1）。強いシグナルは、結合伸縮脂質CHから生じつつ、それは、DNA、タンパク質、脂質、または水に適用すると高度に弁別します。光損傷はまた、第二高調波発生イメージングに比べCARS信号を生成するために使用されるレーザパワーの低いレベルに低減されます。 CARSイメージングは低いレーザパワーでかつ侵襲的なタグなしで実現することができるので、従って、 インビボ研究のために最適なツールです。
レーザ走査顕微鏡ウィスコンシンフェムト秒番目のTi：OPOと組み合わせサファイアレーザー光源は、多くの生物学的研究室で2光子顕微鏡のために主に利用できるようになりました。空間的な同期はすでにこれらのシステムに実装されているため、この作業で説明する2つのビームの時間的な重なり手順は、高価な追加の装置なしで顕微鏡の追加の技術をもたらします。したがって、修正されたセットアップは、細胞の同時イメージング又は第二又は第三高調波発生（SHG、THG）、二光子蛍光及びCARSで生体組織を可能にします。 CARS技術は、（汚れや遺伝子操作なし）力学過程の研究を可能にする生きた動物のin vivoイメージングのための大きな可能性を実証してきました。有望なアプリケーションは、脂質関連疾患を研究するためのライブの脊髄組織36における神経ミエリンのリアルタイムイメージングのためのインスタンスに使用される生体内のラベルフリーの非侵襲的な脂質イメージング、（肥満、脱髄およびcardiov に含めますascular疾患）37、ヒトの皮膚浸透機構22または皮膚障害38。私たちは、将来の改善は、CARS信号の侵入深さを向上させるために、このようなGRINマイクロ目標やミニチュア目的として特別な対物レンズの使用に関係すると確信しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400 - 480 nm; 500 - 550 nm; 465 - 610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480 - 20,000 nm, Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661 - 690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
References
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