Abstract
Sekundær vækst stilk i træer og tilhørende træ dannelse er betydelige både biologiske og kommercielle perspektiver. Men relativt lidt er kendt om den molekylære kontrol, der styrer deres udvikling. Dette er til dels på grund af fysiske, ressource- og tidsbegrænsninger ofte forbundet med studiet af sekundære vækstprocesser. En række in vitro-teknikker er blevet anvendt involverer enten plantedel eller hele planten systemet i både woody og ikke-træagtige plantearter. Men spørgsmål om deres anvendelighed for studiet af sekundære vækst stilk processer, den vrangvillighed af visse arter og arbejdskraft intensitet er ofte uoverkommelige for medium til høje gennemløb applikationer. Også, når man ser på sekundær stængel udvikling og træ dannelse de specifikke træk, der undersøges måske kun bliver målbar sent i et træ livscyklus efter flere års vækst. Ved at tage disse udfordringer alternativ in vivo protocols er blevet udviklet, opkaldt induceret Somatic Sector Analysis, som indebærer skabelse af transgene væv sektorer somatiske direkte i plantens sekundære stilk. Formålet med denne protokol er at give en effektiv, let og relativt hurtigt middel til at skabe transgene sekundær plantevæv for gen og promotor funktionel karakterisering, der kan udnyttes i en række træarter. Resultater præsenteres her viser, at der kan skabes transgene stamceller sektorer sekundære i alle live væv og celletyper i sekundær stængler af forskellige træarter, og at træ morfologiske træk samt promotor ekspressionsmønstre i sekundær stængler let kan vurderes lette medium til høj throughput funktionel karakterisering.
Introduction
Tree stængler omfatte en betydelig mængde af planeter biomasse og er af enorm biologisk, kulturel og kommerciel betydning. Sekundær stængler skabe levested ved at give ressourcer og husly for mange andre livsformer. De leverer mange andre tjenester til økosystemerne, de bebor og fungerer som en vedvarende ressource til produktion af tømmer, papirmasse og papir og andre træ og ikke-træprodukter. Sekundær udvikling stilk og mere specifikt træ formation er underlagt komplekse molekylære system, der regulerer udviklingen af specifikke celletyper, den biokemiske sammensætning af deres cellevægge, og hvordan de er indrettet til at danne væv og organer. Dissekere den molekylære basis for sekundær stængel udvikling og dannelse træ er beskæmmet af mange faktorer, herunder variabilitet af træ og stamceller egenskaber inden for og mellem stængler, lange generation gange, out-crossing parring systemer, høj heterozygositet, høj genetisk belastning, sæsonmæssige hviletilstand, lang modenkarakteregenskab etablering perioder og den blotte fysiske størrelse af modne træer. Som et resultat, forståelse af sekundær udvikling stamceller i forhold til den detaljerede viden om de fleste andre aspekter af den molekylære kontrol af plantens udvikling, er stadig i sin vorden.
En række in vitro teknikker er blevet anvendt til at undersøge og forstå sekundær stængel udvikling, især træ og sekundære cellevæg formation. Disse protokoller indebærer brug af hele planten eller plantedel systemer, hvor enten transgene planter er skabt eller specifikke sekundære celler eller væv transformeres til studiet af specifikke aspekter af træ og / eller sekundær stængel udvikling 1. Transgene planter kan inddrives indlæg genetisk transformation fra en bred vifte af plantevæv og celletyper, men det går langsomt, især når man analyserer træ fiber træk på grund af lange regenerering og dæmme modning gange (i størrelsesordenen år), høj teknisk og arbejdskraft demands, lille produktion af kandidatgener samt vanskeligheder med at udbrede nogle woody plantearter. Lignende teknikker er blevet udviklet i ikke-woody model system som Arabidopsis, der med succes overvinde nogle af disse begrænsninger, men ikke alle sekundære stamceller celletyper en gave i disse stængler og træk relateret til sæsonudsving eller levetid ikke kan studeres i sådanne arter 2. Alternativt plantedel, såsom Pinu s radiata calluskulturer 3 reducere de tilknyttede tidsrammer. Disse metoder er dog begrænset til studiet af en individuel celletype og lider lignende begrænsninger som nævnt for in vitro-forsøg. Ligeledes har apikale stamceller kulturer 4 involverer hele stamceller eksplantaterne vist lovende, men endnu ikke er blevet anvendt til studiet af specifikke gener eller promotorer af interesse. For nylig er en alternativ protokol involverer behårede rod kulturer blevet udviklet til eukalyptus og har været med succesanvendt 5, men denne metode kræver stadig in vitro dyrkning, involverer sekundære rødder i stedet for stilke og til dato det er begrænset til en enkelt træart.
Induceret somatisk sektoranalyse (ISSA), som beskrevet her, blev udviklet for at overvinde nogle af disse problemer giver en medium til high throughput funktionelle screeningsværktøj til gener og initiativtagere med formodede roller i træ dannelse og sekundær stamme væv udvikling. ISSA er en in vivo transformation og screening system, som blev udviklet for at reducere den tid, det tager at fremstille transgene celler og væv i en intakt sekundært stamceller mens overvinde arbejdskraft, tekniske og gennemløb begrænsninger rutinemæssigt anvendes in vitro-metoder. De her beskrevne protokoller mulighed for samtidig etablering af hundredvis af uafhængigt transformerede væv sektorer og celler i den afledte stammer inden for en kort periode, i træarter og væv af interesse uden genetic og / eller miljømæssige variation inden for forholdsvis korte tidsrammer og lave lønomkostninger. ISSA in vivo teknikker blev først beskrevet for sekundær stilk 6 og knop 7 væv og er siden blevet forfinet i sekundær stængel væv gennem studier af gener og / eller promotorer involveret i cambial differentiering og omfatter: tubulin (TUB) 8, fasciclin-lignende arabinogalactan ( FLA) 9, cellulose syntase (CESA) 10, sekundær cellevæg-associeret nac domæne (SND2) 11, ARBORKNOX (ark1) 12 og virkelig interessant nyt gen (RING) H2 protein 13. Disse undersøgelser blev gennemført i sekundær stængler af poppel og eucalypt planter og forudsat indsigt i cellemorfologi, cellevæggen kemi og genekspression.
De her beskrevne protokoller er beregnet til at samle erfaringen ennd viden gennem udvikling og anvendelse af ISSA fra en række af offentliggjorte og ikke-offentliggjorte studier i det seneste årti. De fokuserer på in vivo transformation af sekundære stamceller væv 6 og koncentrere sig om undersøgelser af Populus alba 'pyramidalis' klon, Eucalyptus globulus samt 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis kloner. Dette dokument tager forskerne gennem protokollen fra dyrkning af planter og bakterier, transformation af stamceller væv, vækst og høst af væv, identifikation af de transgene celler og væv, forberedelse til fænotypiske vurderinger og metoder til indsamling og analyse af data. Mens teknikker med succes har været anvendt til at måle cellevæg monosaccharid sammensætning også 9,11, på grund af pladsbegrænsninger, dette dokument koncentrerer sig om teknikker, der anvendes til måling af celler og væv morfologi og forståelse genekspression mønstre i sekundær stems kun. Følgelig protokollen som skitseret er velegnet til dem, der ønsker at få yderligere indsigt i den rolle og / eller ekspression af gener forbundet med sekundær stilke med en lav pris, teknisk let, og middel til høj throughput metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af plantemateriale
- Forud for eksperimenter, rejser nye planter af de foretrukne træarter fra frø eller skæring og vokse træ / s, indtil diameteren af stilken i området er beregnet til eksperimenter er ca. 1 cm i diameter.
Bemærk: Den nødvendige kan variere på grund plante vækstrater derfor tillade mellem tre til ni måneder for dette trin gang.
2. Binary Vector Creation
- Udføre arbejde fra dette afsnit til afsnit 7 i et laboratorium eller drivhus, hvor Agrobacterium tumefaciens kan håndteres, og at egnede personlige værnemidler ordineret til laboratoriet bruges.
- Forbered en binær vektor indeholdende enten et gen af interesse knockdown eller overekspression kassette og en β-glucuronidase (GUS) reportergenet kassette eller en promotor af interesse fusioneret til et GUS-gen afhængig af hvilken type undersøgelse.
Bemærk: Der er en række af binære vektor backbones der kan fremskaffede kommercielt eller via forskningsnetværk samt talrige teknikker til rådighed til at indsætte gener og promotorer af interesse i binære vektorer. I forbindelse med denne protokol er op til forsøgslederen at gøre beslutningen om, hvordan man skaber en binær vektor. - Omdan binær vektor i en afvæbnet stamme af A. tumefaciens ved hjælp af elektroporation eller varmechok 14 og lagre passende indtil det skal bruges til eksperimenter.
- Gentag trin 2.2 for ethvert positivt og / eller negative kontroller.
Bemærk: Negative kontroller bør omfatte en binær vektor indeholdende ingen genet af interesse til et gen af interesse undersøgelse og en promotorfri GUS for en promotor af interesse undersøgelse. Positiv kontrol for en promotor af interesse undersøgelse bør omfatte en blomkålsmosaikvirus 35S-promotor (CaMV35S) fusioneret til et GUS reporter.
3. Fremstilling af A. tumefaciens til podning
- Mindst en uge før experimentation, tage en lille mængde (ca. 1 ul) af A. tumefaciens forberedt under trin 2.2 og 2.3 og spredes tyndt på separate LB medium med agar 14 plader indeholdende passende antibiotika til bakteriel udvælgelse. Vokse ved 28 ° C i en inkubator at danne små kolonier og derefter opbevares ved 4 ° C indtil brug.
- 48 timer før eksperimenteren, overføre en koloni af A. tumefaciens fra hver plade i separate 50 ml skruelåg rør indeholdende 5 ml forvarmet (28 ° C) LB-medium 14 indeholdende passende antibiotika til bakteriel udvælgelse og omrør ved 200 rpm på en rysteinkubator i ca. 48 timer ved 28 ° C, indtil blanding er meget uklar.
- Mellem 4-6 timer før podning af anlægget stængler (afsnit 4) tilsættes 1 ml af LB / A. tumefaciens blandingen i en frisk 50 ml skruelåg rør indeholdende 19 ml (1:20 fortynding) af frisk varm (28 ° C) LB-medium med passende antibiotika tilbakteriel markering. Hvis optiske densitet (OD) ved 600 nm (OD 600, som målt ved spektroskopi) er over 0,1, fortyndes yderligere med varm LB indtil dette er opnået.
- Placer fortyndet LB / A. tumefaciens blandingen tilbage på rysteinkubator og ryst under de samme betingelser (200 rpm, 28 ° C), indtil OD600 er mellem 0,4-0,6 og fjerne.
- Centrifuge LB / A. tumefaciens blandingen i 15 minutter ved 1.000 xg og 4 ° C.
- Dekanteres væsken og straks resuspender A. tumefaciens pellet i 1 ml afkølet MS-medier 15, overførsel til 2 ml mikrorør og gemme på is, indtil de skal podning (afsnit 4). Denne opløsning blev betegnet som Podning Media.
4. Podning af Plant Stem med A. tumefaciens
- Start eksperimenter i slutningen af foråret eller først på sommeren ved hjælp af planter, der er oprettet i afsnit 1, der har en aktiv og hurtigt voksende kambium. En god diagnostisk for enaktiv og hurtigt voksende cambium er, at phloem let kan skrælles af veddet.
- Find en klar lige stykke stængel nær bunden af anlægget og fjern eventuelle blade og grene.
- Ved hjælp af en skarp skalpel (fortrinsvis No. 11) eller barberblad, oprette en 1 cm 2 'cambial vinduet' på en klar stykke stængel ved at indføre to lodrette parallelle snit gennem Phloem på 20 mm i længden og en 5 mm fra hinanden derefter en vandret snit, der forbinder de to lodrette snit ved deres basale ende.
- Skræl phloem strimmel skabt af snittet opad udsætte udvikle veddet væv og tilsæt tilstrækkeligt Podning Media fra trin 3.6 at væde overfladen af den eksponerede udvikle veddet anvendelse af en pipette (typisk 5-10 pi). Umiddelbart genindsætte den Phloem strimmel.
- Bind den Phloem strimmel til stilken tæt med Parafilm.
- Gentag trin 4,2-4,5 for yderligere cambial vinduer for gen (er) eller promotor (er) af interesse at skabe enNY New cambial vinduer mindst 1 cm over eller under andre cambial vinduer og i en 90 ° offset.
- Komplet trin 4.2 til 4.5 for de positive og negative kontrol vektorer (trin 2.4) sikrer, at hver vektor føjes til den samme stamme af hver plante, der anvendes i forsøget.
- Overvåg vækst stamceller diameter periodisk og høst for GUS assay (afsnit 5), når radial vækst på mindst 5 mm er blevet observeret i stængler.
Bemærk: Mængden af radial vækst brug for, er afhængig af mængden af væv kræves for downstream analyse.
5. Høst for GUS Histologisk analyse
- Excise den "cambial vinduet 'fra stammen fjerne enhver væv ikke en del af ny vækst inden for cambial vinduet.
- For undersøgelser vedrørende modne xylem og Phloem celle / vævs morfologi, skræl Phloem fra veddet.
- Til undersøgelser hvor cambial zone skal forblive intakt eller promotor- ekspressionsmønstre skal vurdereed, slice den cambial vindue på tværs ved hjælp af et barberblad eller en anden skarp klinge til skiver på mellem 0,5 og 1 mm i tykkelse.
- Placer forarbejdede cambial vindue væv i 14 ml rundbundede rør og skyl to gange i 0,1 M phosphatpuffer ved pH 7 14. Sikre, at vævet er fuldstændig neddykket, forbliver i opløsning i mindst fem minutter, og al overskydende opløsning fjernes ved slutningen af den anden skylning.
- Der tilsættes 5 ml GUS-reagens (0,5 mm x-gluc (5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsyre), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 r / r, 0,5 mM kalium ferricyanid (III), 0,05 mM kaliumferrocyanid (II), fyldt op til slutvolumen med 0,1 mM phosphatbuffer pH 7; jf. Hawkins et al 16) til hvert rør. Hvis væv ikke er helt under vand, tilføje ekstra GUS reagens.
- Inkuber rørene i 10 minutter ved 55 ° C i mørke.
- Inkuber rør til en yderligere 12-16 timer på en rysteinkubator ved 37 ° C i mørkeunder forsigtig omrøring (mellem 30 og 60 rpm) for at muliggøre blanding.
- Ved fjernelse fra rysteinkubator tilfældigt kontrollere pH af GUS reagens i en lille delmængde af rør under anvendelse af lakmuspapir med et pH-område 0-7.
- Hvis nogen af rørene har en pH under 6 derefter mærke dem. Fortsæt med at kontrollere den resterende del af rørene for at bekræfte pH og mærke hvis pH er 6 eller derunder.
Bemærk: Prøver med en pH under 6 kan ikke være egnet til analyse. Disse prøver skal udelukkes fra yderligere analyse.
- Hvis nogen af rørene har en pH under 6 derefter mærke dem. Fortsæt med at kontrollere den resterende del af rørene for at bekræfte pH og mærke hvis pH er 6 eller derunder.
- Dekanteres GUS reagens og erstatte med tilstrækkelig 70% ethanol til dækning væv.
- Opbevares ved 4 ° C indtil brug.
6. Identifikation af transgene Tissue
- Ved hjælp af pincet, tage alle de cambial vindue væv fra et rør og sted i små bakke eller petriskål at give mulighed for mikroskopisk visualisering.
- Ved hjælp af en dissektionsmikroskop mellem 1X og 4X forstørrelse, identificere og tælle de antal celler eller vævat have en lys blå farvning. Blå farvede celler eller væv omtales som en sektor fra dette punkt og fremefter. Tally dem på følgende måder.
- For prøver, hvor Phloem er fjernet (trin 5.1.1), tælle antallet af sektorer i cambial væv findes på overfladen af den udviklende veddet (cambial sektor, figur 1a).
- For prøver, der er blevet skåret i skiver (trin 5.1.2), tælle antallet sektorer findes i forskellige celle eller vævstyper (figur 1b, 1c, 1d). Sektorer kan findes i følgende typer væv: den periderm (periderm sektor, figur 1e), phloem (Phloem sektor, figur 1f), cambial væv (Cambial sektor, figur 1g, 1h, 1I), sår parenkym (Wound Parenkym Sector, Figur 1j) og i tyloses (Tylose sektor, figur 1k).
- Under mikroskopisk etVURDERING sikre, at begge sider af en disk er blevet set, og at sektorer, der opstår på tværs af to skiver er matchet, så tal ikke overvurderes.
- Placer kun vævet indeholdende sektorer tilbage ind i røret indeholdende 70% ethanol og opbevares indtil brug.
- Gentag trin 6.1 til 6.3 omhandlede for yderligere cambial vinduer, herunder positive og / eller negative kontrol.
- Beregn den gennemsnitlige transformationseffektivitet for hver sektor type for hvert gen eller promotor af interesse og kontrollerne separat ved at dividere det samlede antal sektorer med det samlede antal på 1 cm 2 cambial vinduer til at udlede et gennemsnitligt antal Transformation Begivenheder pr cm 2 i vækstlaget inokuleret (ATScm -2).
- Fortsæt til trin 7.2 og 8 for analyse af promotor-ekspressionsmønstre og trin 7.1, 7.2 eller 7.3 for teknikker til at vurdere celler og væv morfologi i cambial væv.
7. Analyse afCelle og Tissue Morfologi i Cambial Tissue
Bemærk: Nedenfor er et udvalg af teknikker, der har været anvendt med succes til analyse af ISSA afledte prøver.
- Analyse af veddet celle område, lumen område, celle vægtykkelse og cellevæg område ved hjælp Scanning Electron Microscopy (SEM).
Bemærk: Denne protokol kræver minimal prøveforberedelse og giver mulighed for relativ høj overførselshastighed på sektoranalyse vedrørende de morfologiske træk skitseret.- Fra dette trin og frem skal du sikre kittel, øjenbeskyttelse og anvendes handsker, når woody væv håndteres og behandles.
- Identificer en cambial sektor til analyse og foretage et snit ca. 0,5 mm til hver side af det ved hjælp af en enkelt kant barberblad til at oprette en disk (figur 2a).
- Skær overskydende xylem væv forlader ca. 1 mm af xylem væv til den tangentielle side af sektoren (figur 2b).
- Forsigtigly skæres tværs gennem midten af den sektor, der anvender en frisk dobbelt barberblad (figur 2c).
- Foretag yderligere to lavvandede radiale snit på den tværgående plan hver side af sektoren til at afgrænse den transgene væv (figur 2d). Som GUS-farvning ikke vil trænge dybt ind i vævet følge med de radiale filer af celler til hver side af farvede væv findes på cambial overflade.
- Vedhæft forberedt cambial sektor står op til scenen af en SEM pin stub montere bruge SEM ledende tape (Figur 2e) og holde i ekssikkator indtil brug for SEM visualisering.
- Gentag trin 7.1.2 til 7.1.6 for yderligere sektorer, herunder dem fra den negative kontrol.
- Ved hjælp af en SEM i en lavt vakuum tilstand (energi 5 kV, spot 3,0 nm), visualisere og tage billeder af celler / væv i sektoren samt celler / væv direkte tilstødende sektoren (figur 2f). Mængden af forstørrelseer afhængig af de funktioner af interesse. For xylemfibre, 2,000X er egnet (Figur 2g).
- Når en cambial sektor er blevet visualiseret og fotografier taget ved en passende forstørrelse, måle veddet celle / væv morfologiske træk af interesse ved hjælp af billede måling software.
- Til statistisk analyse, foretage flere parvise analyser ved hjælp parrede t-tests for at sammenligne forskellen mellem morfologiske målt i den transgene sektor og den tilstødende ikke-transgene kontrol celler / væv (målt inden for 0,5 mm fra sektoren kant) for hver sektor til at bestemme en p -værdi.
- Gentag trin 7.1.10 for den negative kontrol.
- I tilfælde, hvor den positive kontrol viser en lav p-værdi (α <0,05) beregnes differensen mellem de transgene og tilstødende ikke-transgene celler / væv til et morfologisk træk. Brug denne "forskel værdi« i en uparret t-test til at sammenligne effekten af genet af interesse med negative kontrol for at bestemme en p-værdi.
- Histokemisk analyse af cambial celle / væv morfologi eller promotor ekspressionsmønstre i stamceller / væv ved hjælp af lysmikroskopi.
Bemærk: Mens mere tidskrævende, denne metode giver mulighed for flere analysemuligheder, herunder aspekter af cambial dynamik, f.eks cambial bredde samt promotor ekspressionsmønstre. Hertil kommer, at hvis ikke få adgang til et SEM, denne protokol kan bruges som et alternativ til trin 7.1.- Punktafgiftsområdet af interesse ved anvendelse barberblad og nogle omkringliggende væv som små blokke (ikke større end 1 mm 3) og anbringes direkte i 1-3 ml 100% ethanol i en prøve hætteglas med skruelåg i mindst 2 dage ved 4 ° C på et rysteapparat. Forbered lille blok på en måde, som vil muliggøre overfladen af interesse, der skal tilgås af en mikrotom.
- Gentag for yderligere sektorer, herunder dem fra den negative kontrol.
- Fjern væske og erstatte med 25% ethanol: 75% LR hvid blanding i 2 dage opretholdelse betingelser.
- Gentag trin 7.2.3 med 50% ethanol: 50% LR hvid, 25% ethanol: 75% LR hvid og derefter endelig to gange med 100% LR hvid.
- Placer lille blok i Integrering Mold med overfladen af interesse tilpasset korte ende og forsigtigt dække med frisk LR hvid og polymerisere ifølge producentens anvisninger.
- Skær 5 um snit fra overfladen af renter på en roterende mikrotom og montere på en glasplade. Brug Safranin O (0,01%) farvning til visualisering cellevæggen og / eller andre funktioner.
- Tilføj montering medier, placere et dækglas og lad at sætte natten over.
- Se under et lysmikroskop mellem 100X og 600X forstørrelse og capture image.
- Capture morfologiske træk fra billeder ved hjælp af billede måling software.
- For statistisk analyse af kvantitative morfologiske træk, i forlængelse af trin 7.1.10.
- For kvalitativ analyse af morfologiske træk,sammenligne og beskrive mønstre observeret for genet eller promotoren af interesse og det negative og / eller positive kontrol.
- Analyse af Microfibril Angle (MFA) i opblødt fibre Brug af lysmikroskopi.
- Excise transgene xylem væv direkte fra en sektor samt fra ikke-transgene væv støder op til det (inden for 0,5 mm, figur 2h) og anbringes i separate 1,5 ml rør. Gentag for yderligere sektorer, herunder dem fra den negative kontrol.
- Komplet trin 7.3.3 til 7.3.5 i et stinkskab.
- Tilsættes 250 pi hydrogenperoxid og 250 pi iseddikesyre til hvert rør.
- Placer røret i varmeblok ved 90 ° C i 2 timer i stinkskab.
- Fjerne væv fra tuber og omhyggeligt skylning med destilleret vand mindst to gange.
- Ved hjælp af en vandopløselig monterings medier, mount væv på et objektglas og drille hinanden med skarpe pincet før påføring af dækglas.
- Udsigtunder et lysmikroskop og tage billeder af de enkelte fibre ved forstørrelse på mere end 400 gange.
- Til bestemmelse microfibril vinkel af fibre, måle vinklen mellem pit åbninger og / eller cellevæg Rillerne og den lange akse af fiberen (figur 2i) under anvendelse billede måling software.
- For statistisk analyse, forlængelse af trin 7.1.10.
8. Analyse af Promoter Expression Patterns
- Analyse af Promoter Expression Opskrifter i Sekundære Stem Væv.
- Tally frekvensen af hver sektor type til promotoren af interesse samt de positive og negative kontroller som nævnt i trin 6.2.2.
- Sammenligne hyppigheden af de forskellige typer sektor for promotoren af interesse med den positive kontrol ved hjælp af Chi-square test for at etablere p-værdier. kan foretages yderligere analyse af celle / vævsspecificitet hjælp trin 7.2 efter behov.
- Hvis mere end en promotoraf interesse undersøges derefter gentage denne analyse gør sammenligning mellem alle initiativtagere af interesse og den positive kontrol.
- Hvis der observeres sektorer eller blå farvning i den negative kontrol og derefter tilføje dette til analyse eller opgive alt efter omfang, eller hvis der er mistanke om endogene farvning (se Diskussion).
- Analyse af Promoter Expression Mønstre Under Cambial Derivative udvikling og differentiering.
- Brug af et dissektionsmikroskop, visualisere alle cambial sektorer (fig 1g, 1 h, 1i) identificeret i trin 6.2 og bestemmelse af tilstedeværelsen / fraværet af blåfarvning i tre væv typer afledt fra kambium; den phloem (P), udvikling xylem (X1) eller udvikles xylem væv (X2) (se figur 3a).
- Pr trin 8.1.2, sammenligne hyppigheden af tilstedeværelse / fravær af GUS-farvning i P, X1 og X2 regioner af promotoren fra intpåløbne med den positive kontrol ved hjælp af Chi-square test for at etablere p-værdier. kan foretages yderligere analyse af celle / vævsspecificitet hjælp trin 7.2 efter behov.
- Se trin 8.1.2.1 og 8.1.2.2 for yderligere overvejelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af denne protokol alle live sekundære stamcellelinjer og vævstyper er blevet vist at være modtagelige for A. tumefaciens transformationer og er blevet defineret i typer sektor baseret på celletype oprindeligt forvandlet og det efterfølgende udviklingsmæssige vækstmønster. Sektor typer omfatter periderm, Phloem, cambial, sår parenkym og tylose (figur 1b, 1c, 1d) og kan findes i konsistente steder beskriver i resten af dette stykke. En periderm sektor består af en gruppe af transformerede celler udelukkende findes i periderm og aldrig strækker sig ind i phloem (figur 1e). En Phloem sektor kan findes på forskellige steder mellem den igangsættende lag og periderm dog aldrig strækker sig ind disse omgivende væv (Figur 1f). En cambial sektor består af transformerede xylem / cambium / Phloem væv hidrørende fra transformation af cambial indledende og kan forekomme i tre forskellige mønstre: i) "fuld" cambial sektor, transformerede xylem / cambial / Phloem celler strækker sig fra grænsen af såret parenkym væv gennem veddet og cambial zone til den Phloem væv, der indeholder både ray og tenformede celler eller ray elementer kun (figur 1g), ii) "tabt indledende 'cambial sektor, en variant af den fulde cambial sektor, hvor en indledende er gået tabt fra den igangsættende lag forlader spejlet xylem og Phloem sektorer, og en ikke-transformeret igangsættende lag (figur 1h), og iii) »xylem kun» cambial sektor, transformeret xylem væv strækker sig fra grænsen af såret parenkym væv til variable længder i det nydannede xylogenic væv, men aldrig nå det igangsættende lag (Figur 1i). Et sår parenkym sektor indeholder forvandlet sår parenchymceller findes som enten en enkelt celle eller grupper af celler, ofte i radial files, placeret mellem eksisterende træ og nydannede xylem væv (Figur 1j). En tylose Sektor bestående af transformerede fartøj tyloses inden den allerede eksisterende træ (figur 1k).
Repræsentative transformation effektivitet data for både gen og promotor seværdighed undersøgelser samt deres positive kontroller fremgår af tabel 1 og tabel 2. Data er blevet trukket fra to store forsøg, der gennemføres på tværs af samme tidsperiode (dec-april) i de samme genotyper af eucalypt og poppel på tværs af to på hinanden følgende år, der involverer en række træ dannelse gener og initiativtagere af interesse. Fokus på positive kontroller fra promotoren af interesse undersøgelser (tabel 2), de mest modtagelige vævstype til A. tumefaciens T-DNA overførslen er cambial væv med ca. 60% og 40% af de sektorer, der er identificeret i eukalyptus og poppel henholdsvisvære cambial sektorer. I eukalyptus, er den næste mest udbredte Sektor viklet parenchym ved 35%, medens de andre typer sektor alle havde ATScm -2 værdier under 5%. I popler, er den næste mest udbredte Sektor viklet parenchym til 20% efterfulgt af phloem til 15%, mens resten af de typer sektor blev fundet ved en frekvens på under 5%. En højere sandsynlighed for at finde en sektor i et cambial vindue samt større antal cambial sektorer, er typiske hvis metoden med Phloem skræl protokollen (tabel 1, trin 5.2.1) skyldes muligheden for farvning og muligheden for at visualisere den hele området af kambium.
Under udviklingen af disse protokoller en række variable blev undersøgt som en del af protokol optimering forsøg. Disse omfattede bakterielle koncentration i Podning Media, medietype anvendt i Podning Media, tilsætning af acetosyringon til Podning Media, væv alder og A. tumefaciens-stammen samt tidspunktet for inokulation og genotype. Cambial sektor ATScm -2 data fra disse undersøgelser er vist i tabel 3 og tabel 4. De fleste af variabler undersøgt, når ændret, føre til ændringer i cambial ATScm -2 i begge arter og indgår især øge koncentrationen af bakterier i Podning medier, brug af MS i podningen medier og valg af A. tumefaciens-stammen. Hertil kommer, tidspunkt for podning og træ genotype viste signifikante forskelle i eukalyptus med vaccinationer i forsommeren viser højere ATScm -2 mens eucalypt kloner SG21 og SG44 viste højere cambial ATScm -2, 41,6 og 40,4, sammenlignet med andre på tværs af alle måneder tilsammen.
Gennemsnitlig størrelse cambial sektor varierer og er afhængig af mængden af dets tangentiale og radiale vækst i en cambial vindue. I en substikprøve på 53 sektorer i poppel, der dyrkes i ca. 4 måneder, den tangentielle bredde sektorer på cambium varierede mellem 0,09 og 0,58 mm med et gennemsnit på 0,27 mm, mens radial vækst i hele cambial vinduer varierede fra 0,7 til 2,2 mm med et gennemsnit på 1,35 mm. Når de kombineres, er disse tilvejebragt mellem 0,063 mm2 og 1,276 mm 2 af transgene væv til analyse. I en anden delprøve af 188 sektorer i de samme arter, hvor mellem 1,5-4 mm radial vækst i cambial vinduet blev observeret mere end ca. 5 måneder er den gennemsnitlige sektor masse var 72 mg (tabel 5).
Mængden af transgene væv skabt har vist sig at give tilstrækkelige celler og / eller væv til at foretage morfologiske målinger samt for studiet af promotoraktivitet. For eksempel indflydelsen af tre Eucalyptus grandis flas på en række xylem fiber morfologiske træk 9 var ex bundsgående i eucalypt kloner og afslørede mulige roller for EgrFLA2 i MFA beslutsomhed og EgrFLA1 i cellestørrelse bestemmelse (tabel 6). Desuden mønstre af ekspression af Eucalyptus grandis CESA genpromotor i udviklingslandene veddet (X1), udviklet xylem (X2) og phloem (P) Væv 10 identificerede signifikant forskellige ekspressionsmønstre mellem EgrCESA1, 2, 3, og EgrCESA4, 5, 7 i eucalypt stængler. I denne analyse EgrCESA1, 2, 3, viste sig at være primært udtrykkes i udviklingen af veddet væv mens EgrCESA4, 5, blev 7 vist at blive udtrykt i både udviklingslande xylem og Phloem væv (figur 3b, tabel 7). Alle EgrCESA promotorer viste signifikant forskellige ekspressionsmønstre til den positive kontrol (CaMV35S promotor) (tabel 7).
4553 / 54553fig1.jpg "/>
Figur 1:. Transgene sektorer typer (a) Cambial sektorer kiggede på overfladen af den eksponerede veddet efter forarbejdning ved hjælp af Phloem skræl protokollen (trin 5.2.1). Diske viser en række typer sektor på tværgående overflade i poppel (b) og eucalypt (c) stængler efter forarbejdning ved hjælp af tværgående snit protokollen (trin 5.2.2). (D) Skematisk diagram af den række af typer sektor findes i plantestilke. Eksempler på periderm sektor (e), Phloem sektor (f), "fuld" cambial sektor (g), 'tabt indledende' cambial sektor (h), "veddet kun" cambial sektor (i), sår parenkym sektor (j) og tylose sektor (k) i poppel. Sorte pile angiver, hvor mindre størrelse sektor er placeret. Alle skala barer = 1 mm.Iles / ftp_upload / 54.553 / 54553fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Udarbejdelse af cambial sektorer for morfologisk analyse ved hjælp SEM og lysmikroskopi (a) Excision af disk med sektor. (B) Disc trimmet til fjernelse af overskydende væv. Skære igennem tværgående overflade af den transgene sektor (c). (D) Indføring af to radiale udskæringer til at hjælpe lokalisere den transgene væv under SEM. (E) Tissue monteret på et SEM pin hjælp ledende tape. (F) Afbildning af regionen transgene og ikke-transgene væv, som skal afbildes til analyse. (G) Typisk billede af veddet fiber og ray celler taget med 2,000X forstørrelse. (h (I) udblødt fiber set under lysmikroskopi afbilder vinkel miner og / eller cellevæg Rillerne og på den lange akse af cellen. Sort pil angiver pit åbning. Scale barer = AF, h = 1 mm, g, i = 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Analyse og resultater af gen-promotor ekspressionsmønstre af cambial derivater (a) skildring af P (phloem), X1 (udvikle veddet) og X2 (udviklet xylem) regioner.. (B) Resultater indikerer andel af P, X1 og X2 farvning i cambial sektorer fra et forsøg med en række CESA Eucalyptus Grandis omdannet til stængler af eucalypt hybrider. Data, der stammer fra Creux et al. 10. n = antal sektorer vurderes. Scale bar = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| træarter | vektor typen | Antal gener af interesse anvendt | Samlet antal vinduer skabt | Samlet antal vinduer, hvor en sektor blev identificeret (%) | Cambial ATScm -2 cambial (i vinduer, hvor en sektor blev identificeret) |
| Eucalyptus globulus x camaldulensis hybrider (i alt tre kloner) | Positiv kontrol (Gener af interesse) | 1 (kun GUS) | 96 | 97% | 45,1 (1,5) |
| Gener af interesse | 20 | 630 | 92% | 46,1 (2,2) | |
| Populus alba 'pyramidalis' | Positiv kontrol (Gener af interesse) | 1 (kun GUS) | 110 | 74% | 10,8 (1,5) |
| Gener af interesse | 20 | 700 | 81% | 14,6 (0,8) |
Tabel 1:. Typisk cambial ATScm -2 for den positive kontrol og gener af interesse Tallene er hentet fra undersøgelser foretaget i løbet af to år i træk i den samme eucalypt og poppel kloner ved hjælp af en række gener og Phloem skræl høst protokol (trin 5.2. 1). Standardfejlværdier i parentes. </ P>
| træarter | vektor typen | Antal promotor / gener | Samlet antal vinduer skabt | Samlet antal vinduer, hvor en sektor blev identificeret (%) | ATScm -2 alle sektorer | ATScm -2 periderm | ATScm -2 Phloem | ATScm -2 cambial | ATScm -2 Wound Parenkym | ATScm -2 Tylose |
| Eucalyptus globulus x camal- dulensis hybrider (i alt tre kloner) | positiv kontrol | <td> 1 (GUS kun)118 | 63% | 25,74 (2,35) | 0,24 (0,07) | 0,89 (0,19) | 15,7 (1,71) | 8,84 (1,4) | 0,07 (0,03) | |
| Initiativtagere Interessante | 28 | 1050 | 31% | 14,67 (1,77) | 0,02 (0,01) | 0,05 (0,01) | 13.79 (1.75) | 0,78 (0,21) | 0,03 (0,01) | |
| Populus alba 'pyramidalis' | positiv kontrol | 1 (kun GUS) | 110 | 54% | 12,37 (1,77) | 0,22 (0,07) | 1,85 (0,29) | 5,07 (0,6) | 2,78 (0,75) | 0,29 (0,53) |
| Initiativtagere Interessante | 28 | 990 | 26% | 8,28 (1,18) | 0,16 (0,04) | 0,9 (0,09) | 6,67 (1,16) | 0,27 (0,07) | 0,28 (0,11) |
Tabel 2:. Typisk sektor ATScm -2 for den positive kontrol og initiativtagere af interesse Tallene er hentet fra undersøgelser foretaget i løbet af to år i træk i den samme eucalypt og poppel kloner ved hjælp af en vifte af promoter sekvenser og skiven høst protokollen (trin 5.2. 2). ATScm -2 værdier blev afledt fra vinduer, hvor en sektor kun blev identificeret. Standardfejlværdier i parentes. Klik her for at se en større version af denne tabel.
| Arter | Forsøg | Behandling Beskrivelse | Antal vinduer i behandling | |
| eucalyptus globulus | Koncentration af A. tumefaciens i Podning Media | Resuspenderet i 25 ml MS | 10 | 1,4 (0,62) |
| Resuspenderet i 5 ml MS | 10 | 1,6 (0,72) | ||
| Resuspenderet i 1 ml MS (kontrol) | 10 | 2,4 (1,16) | ||
| Medietype i Podning Media | LB | 10 | 0,4 (0,22) | |
| MS (kontrol) | 10 | 2,4 (1,16) | ||
| Tilsætning af acetosyringon til Podning Media | med acetosyringon | 11 | 0,9 (0,37) | |
| Uden acetosyringon (kontrol) | 11 | 0,6 (0,64) | ||
| Alder stamceller væv inokuleres | 6 måneder (control) | 11 | 1,1 (0,66) | |
| 18 måneder | 11 | 1,8 (0,95) | ||
| A. tumefaciens stamme | AGL1 (kontrol) | 18 | 0 (0) | |
| C58 | 18 | 0,1 (0,1) | ||
| LBA4404 | 18 | 0,6 (0,4) | ||
| Populus alba 'pyramidalis' | Koncentration af A. tumefaciens i medier | Resuspenderet i 25 ml MS | 10 | 2,2 (0,55) |
| Resuspenderet i 5 ml MS | 10 | 2,7 (0,63) | ||
| Resuspenderet i 1 ml MS (kontrol) | 10 | 5,1 (1,58) | ||
| Medietype anvendes til stamceller podning | LB | 10 | 2,8 (0,71) | |
| MS (kontrol) | 10 | 5,1 (1,58) | ||
| Tilsætning af acetosyringon til Podning Media | med acetosyringon | 11 | 0,3 (0,14) | |
| Uden acetosyringon (kontrol) | 11 | 0,5 (0,25) | ||
| Alder stamceller væv inokuleres | 6 måneder (kontrol) | 11 | 1,5 (0,33) | |
| 18 måneder | 11 | 1,5 (0,63) | ||
| A. tumefaciens stamme | AGL1 (kontrol) | 20 | 8,1 (2) | |
| C58 | 20 | 12,5 (2) | ||
| LBA4404 | 20 | 11,1 (2) |
Tabel 3: Cambial ATScm -2 værdier for en række variabler undersøgt som led i protokol optimering stier. Variabler blev undersøgt i en poppel klon og en række Eucalyptus globulus individer på tværs af en række år med cambial ATScm -2 data præsenteret. Cambial windows blev høstet ved anvendelse af disken høst protokollen (trin 5.2.2). Standardfejlværdier i parentes.
| Eucalyptus globulus x camaldulensis klon-id | Antal cambial vinduer for hver måned | Cambial ATScm -2 Late Spring (november) Podning | Cambial ATScm -2 Tidlig sommer (december) Podning | Cambial ATScm -2 Mid Summer (Januar) Podning | Cambial ATScm -2 Late Summer (februar) Podning | Cambial ATScm -2 Tidlig efterår (marts)podning | Cambial ATScm -2 alle måneder kombineret |
| SG5 | 10 | 15,7 (7,8) | 50,7 (13,7) | 10,5 (5,1) | 30.7 (4.4) | 16.8 (6.3) | 24,9 (4,3) |
| SG6 | 10 | 6.1 (3.1) | 38,5 (15,1) | 4,5 (1,7) | 14.5 (3.3) | 27,6 (8,4) | 18,3 (4) |
| SG13 | 10 | 28,4 (6,7) | 41,8 (9,1) | 16.1 (7) | 29,3 (5,2) | 19,8 (4,3) | 27,1 (3,1) |
| SG18 | 10 | 6,7 (2,9) | 18,3 (6,7) | 17,4 (3,4) | 19.2 (6.1) | 18,1 (6,3) | 15,5 (2,4) |
| SG21 | 10 | 38,7 (14,3) | 77 (17,5) | 23,9 (5,7) | 27,5 (6,9) | 40,7 (13,5) | 41,6 (6) |
| SG35 | 10 | 23.5 (10.2) | 42,8 (12,2) | 7,6 (2,5) | 17,6 (4,3) | 31,3 (4,6) | 24,6 (3,8) |
| SG37 | 10 | 19.7 (8) | 55,2 (14,5) | 7,4 (1,8) | 35 (10,4) | 15,9 (4,5) | 26,6 (3,8) |
| SG39 | 10 | 12,5 (2,4) | 23,6 (6,3) | 6,9 (3) | 26,3 (8,1) | 7,3 (2,3) | 15,5 (2,6) |
| SG40 | 10 | 24.8 (11) | 24,5 (6,8) | 14 (5,6) | 35,6 (6,1) | 19.9 (4.2) | 23,8 (3,2) |
| SG44 | 10 | 22,3 (3,4) | 63 (29,3) | 9,8 (2,6) | 52,5 (10,3) | 54,3 (15) | 40,4 (7,4) |
| SG46 | 10 | 15.3 (5.2) d> | 63,9 (20,1) | 23,6 (4) | 22,5 (4,8) | 17,4 (4,9) | 28,5 (5,1) |
| Månedlig Cambial ATScm -2 | 19,9 (5) | 45,3 (9,1) | 12,6 (2,8) | 27,8 (4,5) | 24 (5,1) |
Tabel 4:. Indflydelse af genotype og tidspunkt for podning på cambial ATScm -2 i eucalypt kloner ti vinduer blev indført hver måned i løbet af vækstsæsonen til 10 forskellige Eucalyptus globulus x camaldulensis kloner, som alle blev høstet i maj. Månedlig data præsenteres for hver genotype med en samlet gennemsnitlig månedlig og genotypisk ATScm -2 præsenteres også. Cambial windows blev høstet under anvendelse af Phloem skræl høst protokol (trin 5.2.1). Standardfejlværdier i parentes.es / ftp_upload / 54.553 / 54553tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af denne tabel.
| Plant Number | Antal cambial sektorer udskåret | Samlet masse af alle sektorer (pg) | Gennemsnitlige masse af sektorer (ug) |
| 1 | 11 | 750 | 68 |
| 2 | 19 | 1460 | 77 |
| 3 | 21 | 160 | 8 |
| 4 | 26 | 4.460 | 172 |
| 5 | 15 | 1320 | 88 |
| 6 | 22 | 2490 | 113 |
| 7 | 19 | 1720 | 91 |
| 8 | 30 | 830 | 28 |
| 9 | 25 | 360 | 14 |
| Total | 188 | 13.550 | 72 |
Tabel 5:. Typisk masse af en cambial sektor 45 vinduer på tværs af ni planter blev undersøgt i poppel til at bestemme den gennemsnitlige masse for en sektor og høstet ved hjælp af disken høst protokollen (trin 5.2.2). Planter blev dyrket i 5 måneder og den radiale vækst på tværs af en cambial vindue var mellem 1-4 mm.
| Morph- giske træk | GUS kun (positiv kontrol) | Ikke-transgen væv (GUS kun) | P-værdi | Gen en (FLA1) | Ikke-transgene væv (FLA1) | P-værdi | Gen 2 (FLA2) | Ikke-transgene væv (FLA2) | P-værdi | Gen 3 (FLA3) | Ikke-transgene væv (FLA3) | P-værdi |
| Gennemsnitlig Cell Vægtykkelse (um) * | 1,81 (0,1) | 1,65 (0,1) | 0,2692 | 1,47 (0,14) | 1,55 (0,12) | 0,6403 | 1,65 (0,13) | 1,78 (0,13) | 0,4839 | 1,59 (0,12) | 1,63 (0,11) | 0,8254 |
| Gennemsnitlig Cell Wall Area (um 2) * | 69.1 (4.74) | 60,7 (2,03) | 0,1229 | 64.1 (15.68) | 59,9 (9,79) | 0,5004 | 61,6 (3,4) | 65 (3,96) | 0,5182 | 61,9 (3,56) | 61,5 (3,16) | 0,9438 |
| Gennemsnitlig Cell Area (um 2) * | 115,9 (11.01) | 99,9 (5,1) | 0,2041 | 124,4 (6,1) | 108 (4,36) | 0,0445 | 110,8 (8,45) | 111,3 (9,06) | 0,9671 | 108,5 (4,43) | 103 (3,07) | 0,3204 |
| Gennemsnitlig Lumen Area (um 2) * | 46,9 (7,55) | 39,2 (4,89) | 0,407 | 60,2 (5,28) | 48,1 (4,46) | 0,0991 | 49,2 (7,56) | 46,3 (7,5) | 0,7882 | 46,6 (3,31) | 41,5 (3,9) | 0,3264 |
| Gennemsnit Microfibril Angle (O) # | 24,3 (0,75) | 24,2 (0,45) | 0,8648 | 22,3 (0,82) | 22,7 (0,7) | 0,5664 | 23,7 (0,55) | 26,6 (0,5) | 0,0001 | 26 (0,88) | 27,2 (0,72) | 0,0903 |
Tabel 6:. ISSA Fiber morfologi målinger stammer fra genet af interesse undersøgelse Sammenligning af fiber cellevæg, cellestørrelse og MFA målinger fra transgene fibre kommer fra Eucalyptus globulus x camaldulensis kloner stængler transformeret med Eucalyptus grandis Flas (EgrFLA1, 2, 3) og positiv kontrol (GUS), hvis de hosliggende ikke-transgene kontrol fibre. Data, der stammer fra MacMillan et al. 9. * Angiver forsøg involverede måling af 10 fibre i 10 sektor (total på 100 fibre). # Indikerer forsøg involverede måling af 5 fibre i 20 sektorer (i alt 100 fibre). α <0,05 vist med fed skrift. Klik her for at se en større version af denne tabel.
| EgCESA1 | EgCESA2 | EgCESA3 | EgCESA4 | EgCESA5 | EgCESA7 | GUS kun (positiv kontrol) | |
| EgrCESA1 | 0,708 | 2,839 | 8,856 | 9,976 | 9.18 | 29,165 | |
| EgrCESA2 | 1.11 | 12,008 | 11,363 | 30,234 | |||
| EgrCESA3 | 15,151 | 16,123 | 15,488 | 37,791 | |||
| EgrCESA4 | 4,852 | 0,108 | 46,858 | ||||
| EgrCESA5 | 3,275 | 11,278 | |||||
| EgrCESA7 | 36,082 | ||||||
| GUS kun (positiv kontrol) |
Tabel 7: Chi 2 værdier afledt sammenligning af promotor ekspressionsmønstre i cambial derivater Chi 2 analyse sammenligning af tilstedeværelse / fravær af GUS-farvning i P, X1 og X2 region cambial derivater. mellem seks Eucalyptus grandis CESA genpromotorer sekvenser (EgrCESA 1, 2, 3, 4, 5, 7) og positiv kontrol (GUS kun). Data, der stammer fra Creux et al. 10. α <0,05 er vist i understregning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ISSA-protokollen er en forholdsvis enkel og effektiv metode til at skabe transgene stamceller væv i træarter i løbet af et par måneder til analyse af gener og promotorer af interesse involveret i træ og dæmme formation. Lille indsats, ud over at holde planter i live, er forpligtet til at vokse transgene stamceller væv efter podning, som står i kontrast til in vitro-metoder, hvor omfattende dyrkning er nødvendige for at opretholde væv eller planter, hvor træ produktion kan tage op til år at påbegynde eller hvor en sand sekundær stængel er ikke oprettet en. ISSA har også vist sig at være anvendelig til en bred vifte af træarter, herunder arter i slægten Populus, Eucalyptus og Pinus 6 samt Acacia og Corymbia (data ikke vist), hvor meget lidt, om nogen, optimering er påkrævet for at udlede transgene væv. Ved hjælp af denne metode, er det derfor muligt at undersøge en række of gener eller initiativtagere af interesse i de fleste arter af interesse. Endvidere kan den protokol kan bruges alene eller sammen med mere udbredte i vitro-teknikker, hvor flere gener kan undersøges ved hjælp af ISSA i første omgang for at identificere potentielle kandidater til at tage frem til mere involveret in vitro-metoder.
De beskrevne eksempler viser, at der kan skabes tilstrækkelige sektorer til at foretage efterfølgende analyse fra kun et lille antal af transgene cambial vinduer. Med ATScm -2 værdier på 46,1 i eucalypt og 14.6 i poppel kun en eller to cambial vinduer ville være tilstrækkelig til at undersøge et enkelt træk, som det er muligt at tilføje mange vinduer til en enkelt plante stilk eller replikere på en lang række planter. I praksis er det dog ikke alle cambial vinduer fører til skabelsen af en cambial sektor, der kan udnyttes (se tabel 1, tabel 2) som størrelsen af sektorer kan variere, er de generelt småog i tilfælde, kan være placeret i umiddelbar nærhed af hinanden begrænser deres anvendelse til nedstrøms analyse. Endvidere kan genet af interesse påvirke cellelevedygtigheden 12 eller andre aspekter af celleudvikling potentielt resulterer i fuldstændigt fravær af transgene sektorer for et specifikt gen af interesse. Det er derfor tilrådeligt at altid tilstræbe et større antal vinduer, end der kan være behov for analyse. Lignende forsigtighed bør anvendes ved brug af ISSA for promoter undersøgelser betydelig variabilitet kan forventes med lidt / svag eller ingen udtryk observeret i nogle tilfælde (tabel 2). Men et mindre antal sektorer, så lidt som 6, har vist, at held anvendes til analyse 10. Disse resultater viser, at ganske beskedne forsøg med kun et lille antal vinduer kan føre til betydelige indsigt i genfunktioner og promotoraktivitet.
Fra en analyse perspektiv, den tætte nærhed af transgenic og ikke-transgene væv giver et kraftfuldt værktøj til at identificere små, men meningsfulde forskelle i træk mellem gener af interesse. Celler og væv stikprøven direkte op til hinanden, er af samme genotypiske baggrund og har været påvirket af de samme miljøforhold reduktion af antallet af uafhængige variable og forenkle den statistiske analyse, der kræves. Fra en sampling perspektiv, power analyse på ISSA afledte data fra flere eksperimenter (fx tabel 6), har vist, at et mindre antal målinger pr sektor, f.eks celle vægtykkelse på 3-5 celler pr sektor, og måling af et større antal sektorer, f.eks 20-25 sektorer for et gen af interesse, tilvejebringer en mere effektiv og statistisk robust prøvetagningsstrategien. Hver sektor repræsenterer en uafhængig transformationsbegivenhed eller "line" af celler med den statistiske analyse foretaget bestemmelse af gennemsnitlige effekt af flere transformationsbegivenhederinvolverer genet af interesse. Ligeledes evnen til at omdanne alle stamceller væv giver en mulighed for at studere udtryk for initiativtagere til interesser på tværs af hele stilken og mere specifikt under kambium differentiering. ISSA protokoller, der er beskrevet her, giver en pålidelig og valideret rørledning fra skabelsen af transgene væv igennem til høst af prøver, indsamling og analyse af data for væv og celler morfologi og for promotor ekspressionsmønstre.
I de fleste tilfælde sektorer er resultatet af omdannelsen af en enkelt celle, som gennem celledeling kan have givet anledning til en række afledte celler og væv. For eksempel opstår en cambial sektor fra transformation af en enkelt celle, at Post sår opsving bliver en cambial indledende som igen deler periclinally og anticlinally at skabe en sektor, der strækker sig hele vejen fra den oprindelige sår i Phloem. I disse tilfælde blev den transformerede indledende opretholdesinden for cambium indtil tidspunktet for høst og en "fuld" variant overholdes, dog, hvis det indledende tabes fra cambial lag under radial vækst og erstattet af en ikke-transformeret nabocelle gennem 'celle-invasion ", så en' mistet indledende »variant vil være resultatet. For at sikre korrekt klassifikation af typer sektor og til at hjælpe med fortolkningen af resultater anbefales det kraftigt, at kendskab til anatomiske træk af sekundære stilk udvikling og sår svar være forudsætninger for analyse af ISSA resultater. Desuden er regelmæssig afprøvning af pH af GUS reagens tilrådes (se trin 5.6). En lav pH (fx under 6) kan føre til aktivering af endogene p-glucuronidaser (GUS) i anlægget stamceller, der kan dække det sande omfang af en sektor eller føre til identifikationen af falske positiver. Hvor dette er mistanke, anbefales det, at disse prøver udelukkes fra yderligere analyse. Protokollen GUS reagenspålideligt anvendt i undersøgelserne, der er beskrevet her, for at afhjælpe potentielle problemer med endogen GUS aktivitet blev tilpasset fra Hawkins et al. (2002) 16 og udnytter yderligere vigtige skridt, herunder to skylninger med fosfatbuffer i ligevægt prøver til pH 7, og varmebehandling ved 55 o C i 10 minutter for at destabilisere endogen GUS-aktivitet 17,18. GUS reagens permeabilitet er også begrænset og er ansvarlig for færre sektorer identificeres ved hjælp af den tværgående disc protokol i forhold til den Phloem peel-protokollen.
Alle arter prøvelicens har vist sig at være modtagelige for transformation af cambial væv. Er imidlertid konstateret betydelige forskelle i ATScm -2 både mellem og inden for slægt og art. Tilsvarende stamme af A. tumefaciens og tid / sæson af podning kan påvirke ATScm -2. Det foreslås, at virksomheden nogle indledende test af disse variabler i species og genotyper, der undersøges før skala vedtagelsen af protokollen større. Teoretisk er der ingen grænse for alder og størrelse af stilke, som ISSA kunne anvendes, så længe der er en aktivt voksende kambium. for at lette efterfølgende behandling af transgene væv sektorer Det anbefales dog, inokulerende stængler på ca. 1 cm i diameter.
ISSA er ikke uden begrænsninger. Den relativt lille størrelse af transgene væv sektorer øjeblikket begrænser downstream fænotypebestemmelse metoder og følgelig kun et begrænset antal af sådanne fremgangsmåder er blevet rutinemæssigt anvendt til dato. Disse fremgangsmåder er hovedsagelig fokuseret på morfologisk karakterisering som beskrevet ovenfor såvel som semi kvantitativt skøn af monosaccharider sammensætning i den sekundære cellevæg som bemærket i indledningen 9,11. Med fremkomsten og videreudvikling af nye teknologier til skala analyse af biologiske materialer fint der er yderligere potentiale for at udvikle yderligere fænotypebestemmelserørledninger til ISSA sektorer, for eksempel i cellevæg analyse af sammensætningen. Det er stadig svært, men at udføre kvantitative, sektor for sektor, Ribonucleinsyre (RNA) baseret genekspression og protein undersøgelser og / eller identificere og udbrede ISSA afledte transgene celler gennem in vitro dyrkning for yderligere analyse på grund den destruktive karakter af GUS assay . Nogle fluorescerende reportergener og væv udskrivning er blevet trialed at kvantificere RNA fra de enkelte sektorer, men til dato disse tilgange ikke har været brugt med held til mellemstore og high throughput screening i drift. Endvidere kunne transgene teknikker ikke prøvelicens til dato såsom RNAi komplicere analyse, hvor GUS-ekspression og nedregulering af target-genet kan ikke co-lokalisere.
Mens der er nogle nuværende begrænsninger, indarbejdelse af nye og kommende teknologier og analysemetoder der sandsynligvis vil overvinde disse begrænsninger, yderligere at styrke den rolle, ISSA ensa medium til high throughput protokol til at dissekere den komplekse molekylære natur cambial differentiering, træ udvikling og dæmme formation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no. 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide(III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| ImageJ imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
