Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים

Published: October 5, 2016 doi: 10.3791/54553
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3,4, 1
1School of Ecosystem and Forest Sciences, Faculty of Science, The University of Melbourne, 2Victorian AgriBiosciences Centre, La Trobe University R&D Park, 3College of Biological Sciences, Department of Plant Biology, University of California, Davis, 4Department of Genetics, Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

Abstract

צמיחה של גבעול משני עצי היווצרות העץ הקשורים הן משמעותיות הוא מנקודות מבט ביולוגי ומסחרי. עם זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על השליטה המולקולרית שולטת התפתחותם. מדובר בין שאר בשל פיסיים, משאבים ומגבלות זמן קשורים לעתים קרובות עם בחקר תהליכי גדילה משניים. מספר טכניקות במבחנה שימשו מעורבים או חלק הצמח או מערכת הצמח כולו בשני וודי מיני צמחים שאינם מעוצים. עם זאת, שאלות על תחולתן לחקר תהליכי צמיחה של גבעול משני, הסרבנות של מינים מסוימים עוצמת עבודה הן לעתים קרובות מונעת על מדיום ליישומי תפוקה גבוהים. כמו כן, כאשר מסתכלים היווצרות פיתוח ועץ גזע משתי התכונות הספציפיות תחת החקירה עלולות רק להיות מדידות מאוחר מחזור החיים של עץ לאחר מספר שנים של צמיחה. בהתמודדות אלטרנטיבת האתגרים הללו in vivo protocols פותחו, בשם מושרה ניתוח מגזר סומטיים, אשר יש בהם משום יצירת סקטורים רקמות סומטיות מהונדס ישירות בגזע המשני של הצמח. מטרת פרוטוקול זה היא לספק אמצעי יעיל, קל ומהיר יחסית כדי ליצור רקמות צמח משני מהונדסות עבור גן ואפיון פונקציונלי אמרגן שניתן לנצלם במגוון של מיני עצים. התוצאות המוצגות כאן עולה כי המגזרים גזע משני מהונדס יכול להיווצר בכל רקמות חיות סוגי תאים משני גבעולי מגוון של מיני עצים וכי תכונות מורפולוגיות עץ כמו גם דפוסי ביטוי האמרגן ב משנית נובעת ניתן להעריך בקלות להקל בינוני עד גבוה אפיון פונקציונלי תפוקה.

Introduction

עץ נובע מהווה כמות משמעותית של ביומסה הכוכבית הלכת הם בעלי חשיבות ומסחרית ביולוגית, תרבותיות עצומה. משני נובע ליצור בית גידול על ידי מתן משאבים ומחסה למצוא צורות חיים רבות אחרות. הם מספקים שירותים רבים אחרים אל המערכות האקולוגיות הם מאכלסים ולפעול כמשאב מתחדש לייצור עץ, עיסת נייר ועץ אחרים מוצרים שאינם עץ. פיתוח גזע משני ובאופן ספציפי היווצרות עץ נשלט על ידי מערכת מולקולרית מורכבת המווסתת את הפיתוח של סוגי תאים מסוימים, את ההרכב הביוכימי של קירות התא שלהם וכיצד הם מסודרים ליצירת רקמות ואיברים. לנתח את הבסיס המולקולרי של פיתוח גזע משתי היווצרות עץ נאלץ להתמודד על ידי גורמים רבים, כוללים ההשתנות של מאפייני עץ גזע בתוך ובין נובעת, משך דור ארוך, מערכות הזדווגות מחוץ למעבר, הטרוזיגוטיות גבוהה, עומס גנטי גבוה, תרדמת עונתית, ארוך בּוֹגֵרתקופות הקמת תכונה ואת הגודל הפיזי העצום של עצים בוגרים. כתוצאה מכך, הבנה של יחסי פיתוח גזע משניים הידע המפורט של רוב ההיבטים האחרים של הבקרה המולקולרית של התפתחות צמח, הוא עדיין בחיתוליו.

מספר טכניקות במבחנה שמשו ללמוד ולהבין פיתוח גזע משני, בעץ מסוים היווצרות דופן תא משנית. פרוטוקולים אלה כרוכים בשימוש צמח כולו או מערכות חלק צמח, שם גם צמחיים מהונדסים נוצרים או תאים משני ספציפיים או רקמות הופכים לחקר היבטים הספציפיים של עץ ו / או פיתוח גזע מהשני 1. ניתן לשחזר צמחים טרנסגניים פוסט שינוי גנטי ממגוון רחב של רקמות צמח סוגי תאים, עם זאת, ההתקדמות היא איטית, במיוחד בעת ניתוח תכונות סיביות עץ בשל התחדשות ארוכה נובעים פעמי התבגרות (לפי סדר שנים), גבוה טכנית deman העבודהds, תפוקה נמוכה של גנים מועמדים כמו גם קשיים הפצת כמה מיני צמחים עציים. טכניקות דומות פותחו במערכת מודל שאינו עצית, כגון ארבידופסיס כי בהצלחה להתגבר על כמה מגבלות אלה, אך לא כל סוגי תאי גזע משני מתנה אלה גבעולים תכונות הקשורות עונתי או אריכות ימים לא ניתן ללמוד מינים כגון 2. לחלופין, מערכות חלק הצמח, כגון תרבויות יבלת radiata s pinu 3 לצמצם את לוחות הזמנים הכרוכים בכך. שיטות אלה עם זאת מוגבלים המחקר של סוג תאים בודדים סובלים אילוצים דומים כאמור לניסויים במבחנה. בדומה לכך, תרבויות גזע פסגה 4 מעורבי explants כל הגבעול הראו הבטחה אבל עדיין לא יושמו לחקר גנים ספציפיים או מקדמים של עניין. לאחרונה, פרוטוקול חלופי מעורבים תרבויות שורש שעיר פותחה עבור האקליפטוסים והוא מיושם בהצלחה5 מיושם, עם זאת, שיטה זו עדיין דורשת בטיפוח במבחנה, כרוך שורשים משניים ולא גבעולים עד היום הוא מוגבל מין עץ בודד.

ניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA), כפי שמתואר כאן, פותח כדי להתגבר על כמה בעיות אלה מתן מדיום לכלי הקרנה פונקציונלית קצב העברת נתונים גבוהים עבור גנים ומקדמים עם תפקידים חשודים במבנה עץ התפתחות רקמת גזע משני. ISSA היא מערכת טרנספורמציה והקרנת vivo שבו פותחה כדי לצמצם את הזמן שנדרש כדי לייצר תאים מהונדסים ורקמות בתוך גזע משני שלמים תוך ההתגברות על עבודה, מגבלות טכניות ותפוקה של בשימוש שיגרתי בשיטות במבחנה. הפרוטוקולים המתוארים כאן לאפשר את הקמתה סימולטני של מאה מגזרי רקמות שינו באופן עצמאי תאים משני נובע בתוך פרק הזמן קצר, ב מיני עצים ורקמות של עניין ללא genetic ו / או סביבתי וריאציה בתוך מסגרות זמן קצרות יחסית ועלות עבודה נמוכה. טכניקות vivo ב ISSA תוארו לראשונה עבור רקמות משני גזע 6 ו ניצן 7 ויש לי מאז שוכללה ברקמת גזע משני באמצעות מחקרים של גנים ו / או מקדמי המעורבים בידול cambial וכוללים: טובולין (גיגית) 8, arabinogalactan דמוי fasciclin ( FLA) 9, synthase תאית (CESA) 10, תחום NAC הקשורים דופן התא המשני (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 ובאמת גן חדש מעניין (RING) H2 חלבון 13. מחקרים אלה נערכו משני גבעולי צמחי צפצפת eucalypt ותובנות הניתנים לתוך מורפולוגיה תא, כימית דופן תא ביטוי גנים.

הפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו להפגיש את חווייתידע nd שנרכש באמצעות הפיתוח והיישום של ISSA מתוך מגוון רחב של מחקרים שפורסמו וכן פורסמו בעשור האחרון. הם מתמקדים טרנספורמציה in vivo של רקמות גזע משני 6 ולהתרכז מחקרים שכללו שיבוט 'pyramidalis' Populus alba, אקליפטוס Globulus וכן 11 שיבוטים אקליפטוס Globulus x camaldulensis. מסמך זה לוקח חוקרים באמצעות הפרוטוקול מן גידול צמחים וחיידקים, טרנספורמציה של רקמות גזע, צמיחת קציר של רקמות, זיהוי תאים מהונדסים ורקמות, הכנה והערכות פנוטיפי ושיטות לאיסוף והניתוח של נתונים. בעוד טכניקות יושמו בהצלחה למדוד רכב monosaccharide דופן תא גם 9,11, בשל מגבלות מקום, מסמך זה מתרכז בטכניקות המשמשות למדידת תא ומורפולוגיה רקמות בהבנת דפוסי ביטוי גנים משני stEMS בלבד. לפיכך, הפרוטוקול כפי שמתואר מתאים לאלו המעוניינים לקבל תובנה מעמיקות יותר לתוך התפקיד ו / או הביטוי של גנים הקשורים משני גבעולים באמצעות עלות נמוכה, מבחינה טכנית קלה, בינונית עד שיטת העברת נתונים גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חומר צמחי

  1. לפני ניסויים, להעלות שתילים חדשים של מיני עצים המועדף מזרע או חיתוך ולגדול עץ / ים עד קוטר של גזע באזור המיועד לניסויים הוא כ 1 ס"מ קוטר.
    הערה: משך הזמן הנדרש עשויים להשתנות עקב שיעורי גידול צמחים ולכן מאפשרים בין שלושה עד תשעה חודשים של שלב זה.

2. בינארי וקטור בריא

  1. לנהל עבודה סעיף זה לסעיף 7 במעבדה או חממה שבה tumefaciens Agrobacterium ניתן לטפל וכי ציוד מגן אישי מתאים שנקבע במעבדה משמש.
  2. הכין וקטור בינארי המכיל גם גן של מציאת ריבית או קלטת ביטוי יתר וקלטת גן כתב β-glucuronidase (גאס) או אמרגן של העניין התמזג גן גאס בהתאם לסוג של מחקר.
    הערה: ישנם מספר BAC וקטור בינאריkbones כי ניתן מקורות מסחריים או דרך רשתות מחקר וכן טכניקות רבות הזמינות להכניס גנים ומקדמי עניין לתוך וקטורים בינאריים. בהקשר של פרוטוקול זה תלוי אך ורק את הנסיין לקבל את ההחלטה על איך ליצור וקטור בינארי.
  3. Transform וקטור בינארי לתוך זן מנשקו של א tumefaciens באמצעות הלם electroporation או חום 14 ולאחסן כראוי עד הצורך לניסויים.
  4. חזור על שלב 2.2 עבור כל חיובי ו / או שולט שלילי.
    הערה: בקרות שליליות צריכות לכלול וקטור בינארי המכיל לא גן של עניין עבור גן לימוד זיקה בם גאס promoterless עבור אמרגן של מחקר עניין. בקרה חיובית עבור אמרגן של מחקר ריבית צריכה לכלול אמרגן 35s וירוס כרובית פסיפס (CaMV35s) התמזג עיתונאי גאס.

3. הכנת א tumefaciens עבור חיסון

  1. לפחות שבוע לפני experimentation, לקחת כמות קטנה (כ 1 μl) של א tumefaciens מוכן במהלך שלב 2.2 ו -2.3 ולהפיץ דק על מצע נפרד LB עם אגרתי 14 צלחות המכילות אנטיביוטיקה מתאימה לבחירת חיידקים. לגדול ב 28 ° C באינקובטור ליצור מושבות קטנות ולאחר מכן לאחסן ב 4 ° C עד הצורך.
  2. 48 שעות לפני ניסויים, להעביר מושבה אחד א tumefaciens מכל הצלחת לתוך 50 מ"ל נפרד בורג צינורות העליון המכיל 5 מ"ל של טרום התחמם (28 ° C) התקשורת LB 14 המכיל אנטיביוטיקה מתאימה הבחירה חיידקים להתסיס ב 200 סל"ד על חממה שייקר במשך כ -48 שעות ב -28 מעלות צלזיוס עד תערובת מאוד מעונן.
  3. בין 4-6 שעות לפני חיסון גבעולי צמחים (סעיף 4) להוסיף 1 מ"ל של א LB / tumefaciens תערובת לתוך 50 מ"ל טריים לדפוק צינור עליון המכיל 19 מיליליטר (01:20 דילול) של חם הטרי (28 מעלות צלזיוס) LB תקשורת עם אנטיביוטיקה מתאימהמבחר חיידקים. אם צפיפות אופטית (OD) ב 600 ננומטר (OD 600, כפי שהיא נמדדת על ידי ספקטרוסקופיה) היא מעל 0.1, לדלל עוד יותר עם חמי LB ועד להשגתו.
  4. מניחים מדולל LB / א tumefaciens תערובת בחזרה על החממה שייקר ולנער באותם התנאים (200 סל"ד, 28 ° C) עד OD 600 היא בין 0.4-0.6 ולהסיר.
  5. צנטריפוגה LB / א tumefaciens התערובת במשך 15 דקות XG ב 1000 ו 4 ° C.
  6. למזוג נוזל ומיד resuspend א tumefaciens גלולה לתוך 1 מ"ל של מקורר התקשורת MS 15, להעביר 2 מ"ל microtube ולאחסן על הקרח עד נדרש חיסון (סעיף 4). פתרון זה נקרא הרכבת מדיה.

הרכבת חיסון 4. של צמח גזע עם א tumefaciens

  1. התחל ניסויים במהלך סוף האביב או בתחילת הקיץ באמצעות צמחים נוצרו בסעיף 1 כי יש cambium פעיל מצמיחה מהירה. אבחון טוב עבורcambium גדל פעיל ומהיר הוא כי השיפה ניתן קלופים בקלות מן העצה.
  2. מצא קטע ישר ברור של גזע ליד הבסיס של הצמח ולהסיר עלים וענפים.
  3. באמצעות אזמל חד (רצוי מס '11) או סכין גילוח, ליצור "חלון cambial' 1 סנטימטר 2 ב קטע ברור של גזע על ידי החדרת שני חתך מקביל אנכי דרך השיפה של 20 מ"מ אורך ו מ"מ אחד 5 מזה אז חתך אופקי המחבר את שני חתכים אנכיים בקצה הבסיסי שלהם.
  4. מקלף את רצועת השיפה נוצרה על ידי החתך כלפי מעלה חשיפת רקמת העצה לפתח ולהוסיף מדיה חיסון מספיק משלב 3.6 להרטיב את פני השטח של עצת הפיתוח נחשף בעזרת פיפטה (בדרך כלל 5-10 μl). מיד והכנס מחדש את רצועת השיפה.
  5. לחייב את רצועת השיפה לגבעול באופן הדוק עם Parafilm.
  6. חזור על שלבי 4.2 כדי 4.5 כל חלונות cambial נוספים עבור הגן (ים) או אמרגן (ים) של עניין יצירהניו cambial חלונות לפחות 1 ס"מ מעל או מתחת לחלונות cambial אחרים בכל 90 ° לקזז.
  7. צעדים שלמים 4.2 ל 4.5 וקטורי השליטה חיובית ושלילית (שלב 2.4) להבטיח כי כל וקטור מתווסף אותו השורש של כל צמח השתמש בניסוי.
  8. צג צמיחה קוטר גזע מעת לעת הקציר עבור assay גאס (סעיף 5) כאשר הצמיחה רדיאלי של 5 מ"מ לפחות נצפתה הגבעולים.
    הערה: כמות צמיחה רדיאלי שצריך זה תלוי בכמות של רקמת הנדרש לניתוח במורד הזרם.

קציר 5. עבור גאס היסטולוגית Assay

  1. ובלו 'חלון cambial' מן הגבעול הסרת כל רקמה לא חלק הצמיחה חדשה בתוך חלון cambial.
    1. עבור מחקרים הנוגעים להבשיל עצה ומורפולוגיה תא / רקמות השיפה, לקלף את השיפה מן העצה.
    2. עבור מחקרים שבהם אזור cambial נדרש להישאר דפוסי ביטוי שלם או האמרגן יש להעריךed, פורסים את חלון cambial רוחבי באמצעות סכין גילוח או סכין חדה אחרת לתוך דיסקים של בין 0.5 ו 1 מ"מ עובי.
  2. מניח רקמות חלון cambial מעובדות 14 מיליליטר עגול צינורות תחתונים ולשטוף פעמי חיץ פוספט 0.1 M ב- pH 7 14. ודא כי הרקמה היא שקועה לחלוטין, נשאר בתמיסה במשך חמש דקות לפחות וכל הפתרון העודף מוסר בסוף השטיפה השנייה.
  3. הוסף 5 מ"ל של ריאגנט גאס (0.5 מ"מ X-gluc (חומצה 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-D-glucuronic), 10 mM EDTA, 0.5% Triton X-100 V / V, 0.5 מ"מ אשלגן ferricyanide (III), 0.05 פרוציאני אשלגן מ"מ (II), עשה עד נפח סופי עם 0.1 מ"מ פוספט חיץ pH 7;. לראות הוקינס ואח 16) על צינור אחד. אם הרקמה אינה שקועה לחלוטין, להוסיף מגיב גאס נוסף.
  4. דגירה צינורות במשך 10 דקות ב 55 ° C בחושך.
  5. דגירה צינורות עבור שעות 12-16 נוסף על חממה שייקר ב 37 ° C בחושךבאמצעות תסיסה עדינה (בין 30 ל 60 סל"ד), כדי לאפשר ערבוב.
  6. לאחר ההסרה מן החממה שייקר אקראי לבדוק את ה- pH של מגיב גאס בתוך קבוצה קטנה של צינורות באמצעות נייר לקמוס עם מגוון pH 0-7.
    1. אם כל אחד הצינורות יש pH מתחת ל -6 ואז לתייג אותם. המשך לבדוק את שאר הצינורות כדי לאשר את ה- pH ואת התווית אם pH הוא 6 או מתחת.
      הערה: דוגמאות עם pH מתחת ל -6 ואינן מתאימות לניתוח. יש דוגמאות אלה להיכלל לניתוח נוסף.
  7. למזוג גאס מגיב ולהחליף עם אתנול 70% מספיק כדי לכסות רקמות.
  8. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.

זיהוי 6. של רקמות מהונדסות

  1. בעזרת מלקחיים, להוציא את כל רקמת חלון cambial משפופרת ומניחה מגש קטן או צלחת פטרי כדי לאפשר להדמיה מיקרוסקופית.
  2. באמצעות מיקרוסקופ לנתח בין 1X והגדלה 4X, לזהות לספור את מספר תאים או רקמותקבצים שיש להם כתמים כחולים בהירים. תאים או רקמה צבעוניים הכחולים מכונים כמגזר מנקודה זו ואילך. טלי אותם בדרכים הבאות.
    1. לקבלת דוגמיות שבו השיפה הוסר (שלב 5.1.1), לספור את מספר סקטורים ברקמת cambial נמצא על פני השטח של העצה מתפתחות (המגזר cambial, איור 1 א).
    2. לקבלת דוגמיות כי קוצצו לתוך דיסקים (שלב 5.1.2), לספור את המגזרים מספר נמצא סוגי תאים או רקמות שונות (1b, 1c, 1D). מגזרים ניתן למצוא סוגי רקמות הבאים: periderm (המגזר periderm, איור 1e), השיפה (המגזר השיפה, איור 1F), רקמות cambial (המגזר Cambial, איור 1G, 1h, ט 1), parenchyma הפצע (פצע מגזר parenchyma, 1J איור) וב tyloses (המגזר Tylose, איור 1k).
      1. במהלך מיקרוסקופיssessment להבטיח ששני הצדדים של דיסק נצפו וכי מגזרים המתרחשים על פני שני דיסקים מותאמים כך מספרים אינם להפריז.
  3. המקום היחיד המגזרים המכיל רקמות בחזרה לתוך שפופרת המכילה 70% אתנול ו החנות עד הצורך.
  4. חזור על שלב 6.1 כדי 6.3 של חלונות cambial נוספת כולל השליטה החיובית ו / או שלילית.
  5. חשב את יעילות השינוי הממוצע עבור כל סוג במגזר עבור כל גן או האמרגן של עניין והבקרות בנפרד על ידי חלוקת סך של המגזרים במספר הכולל של חלונות cambial 1 ס"מ 2 לגזור מספר ממוצע של אירועים טרנספורמציה לס"מ 2 של cambium מחוסן (ATScm -2).
  6. עבור לשלב 7.2 ו -8 עבור ניתוח דפוסי ביטוי אמרגן צעד 7.1, 7.2 או 7.3 עבור טכניקות להעריך תא ומורפולוגיה רקמות ברקמת cambial.

7. ניתוח שלמורפולוגיה תאים ורקמות רקמות Cambial

הערה: להלן מבחר של טכניקות אשר שימשו בהצלחה לניתוח של ISSA נגזר דגימות.

  1. ניתוח של שטח תא עצה, אזור לומן, עובי דופן תא ואזור דופן תא באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM).
    הערה: פרוטוקול זה דורש הכנת מדגם מינימאלית ומאפשר העברת נתונים גבוהות יחסי של ניתוח מגזר הנוגע תכונות המורפולוגיות התוו.
    1. משלב זה ואילך בבקשה להבטיח מעבדה מעיילת, הגנה וחקר עיני כפפות משמשות בכל פעם רקמות וודי מטופל ומטופל.
    2. זהה את מגזר cambial לניתוח ולעשות חתך כ 0.5 מ"מ מכל צד של אותו באמצעות סכין גילוח קצה יחיד ליצור (איור 2 א) דיסק.
    3. חתוך את רקמת עצה עודפת עוזב כ 1 מ"מ של רקמת עצה לצד המשיק של הסקטור (איור 2b).
    4. זָהִירly לחתוך רוחבי דרך המרכז במגזר באמצעות סכין גילוח כפול קצה טרי (איור 2 ג).
    5. לעשות שני חתכים רדיאליים רדוד נוספים על המטוס הרוחבי משני צדי מגזר לתחום הרקמה המהונדסת (איור 2). כפי מכתים גאס לא תחדור עמוק לתוך הרקמה לבצע יחד את הקבצים רדיאלי של תאים משני צדי רקמה צבעונית נמצאים על פני שטח cambial.
    6. צרף הפנים cambial במגזר מוכן עד שלב של בדל סיכה SEM הר באמצעות קלטת מוליך SEM (איור 2E) ולשמור על ייבוש עד הצורך להדמיה SEM.
    7. חזור על שלבי 7.1.2 עד 7.1.6 עבור סקטורים נוספים לרבות אלה מהשליטה השלילית.
    8. באמצעות SEM במצב ואקום נמוך (kV אנרגיה 5, במקום 3.0 ננומטר), לחזות לצלם תמונות של תאים / רקמות בתוך המגזר וכן רקמת תאים / ישירות בסמוך במגזר (איור 2F). כמות ההגדלהתלוי בתכונות של עניין. לסיבי עצה, 2,000X מתאימה (2G איור).
    9. פעם במגזר cambial כבר דמיין ותצלומים שצולמו הגדלה מתאימה, למדוד עצת תא / רקמות תכונות מורפולוגיות של עניין באמצעות תוכנה למדידת תמונה.
    10. לניתוח סטטיסטי, מתחייב pairwise מספר ניתוחים באמצעות מבחני t מזווגים להשוות את ההבדל בין מורפולוגיים נמדדו במגזר המהונדס ותאי שליטה הלא המהונדס הסמוכים / הרקמות (נמדדו בתוך 0.5 מ"מ מקצה מגזר) לכל מגזר לקבוע p -ערך.
    11. חזור על שלב 7.1.10 עבור הביקורת השלילית.
      1. במקרים בם השליטה החיובית מראה p-value נמוך (α <0.05), לחשב את ההבדל בין מהונדס ותאים הלא מהונדס סמוך / רקמות אחראיות לתכונה מורפולוגיים. השתמש ב 'ערך ההבדל "זה מבחן t-מזווג כדי להשוות את האפקט של הגן של עניין עם negative הבקרה כדי לקבוע א-ערך p.
  2. ניתוח histochemical של תא cambial / מורפולוגיה רקמות או ביטוי אמרגן דפוסים ברקמות גזע תאים / באמצעות מיקרוסקופ אור.
    הערה: בעוד זמן רב יותר, שיטה זו מאפשרת אפשרויות ניתוח נוספות, כולל היבטים של דינמיקת cambial, למשל, רוחב cambial כמו גם דפוסי ביטוי אמרגן. בנוסף, אם אין אפשרות לגשת SEM, פרוטוקול זה יכול לשמש כחלופה עבור צעד 7.1.
    1. במגזר ובלו של עניין באמצעות סכין גילוח וכמה רקמה שמסביב כמו קוביות קטנות (לא יותר מ 1 מ"מ 3) ומניחים ישירות 1-3 מיליליטר של 100% אתנול בבקבוקון מדגם עם כובע בורג עבור 2 ימים לפחות ב 4 ° C על שייקר. הכן את הבלוק הקטן באופן שיאפשר את פני השטח של עניין ונגיש באמצעות microtome.
    2. חזור על פעולה עבור כל מגזרים נוספים כולל אלה מהשליטה השלילית.
    3. הסר נוזלי ולהחליף עם 25% אתנול: 75% תערובת לבנה LR עבור 2 ימי שמירה על תנאים.
    4. חזור על שלב 7.2.3 עם 50% אתנול: לבן 50% LR, 25% אתנול: 75% LR לבן ולבסוף פעמיים עם לבן 100% LR.
    5. מקם את הבלוק קטן Embedding עובש עם פני השטח של עניין מיושר הקצר ומכסים בזהירות עם לבן טרי LR לפלמר לפי הוראות היצרן.
    6. חותכים 5 מיקרומטר חלקים ממשטח ריבית על microtome סיבובית ו הר בשקופית זכוכית. השתמש Safranin O (0.01%) מכתים לדמיין דופן התא ו / או תכונות אחרות.
    7. הוסף מדיה הרכבה, במקום להחליק לכסות ולאפשר להגדיר לילה.
    8. צפה תחת מיקרוסקופ אור בין הגדלה 100X ו 600X ו לכידת תמונה.
    9. לכידת תכונות מורפולוגיות מן התמונות באמצעות תוכנת מדידת תמונה.
      1. לניתוח סטטיסטי של תכונות מורפולוגיות כמוני, בצע על משלב 7.1.10.
      2. לניתוח איכותי של תכונות מורפולוגיות,להשוות לתאר דפוסים שנצפו עבור הגן או האמרגן של ריבית שלילית ו / או בקרה חיובית.
  3. ניתוח של מיקרופיברילות זווית (MFA) בסיבים macerated באמצעות מיקרוסקופ אור.
    1. מהונדס והבלו רקמת העצה ישירות מתוך מגזר וכן מרקמות הלא מהונדס הסמוכים לו (בתוך 0.5 מ"מ, איור 2H) ומניחים צינורות 1.5 מ"ל נפרד. חזור על פעולה עבור כל מגזרים נוספים כולל אלה מהשליטה השלילית.
    2. פעולות מלאות 7.3.3 כדי 7.3.5 במנדף.
    3. הוסף 250 μl של מי חמצן ו -250 μl של חומצה אצטית קרחונית על צינור אחד.
    4. מניח צינורית הגוש חום 90 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ב במנדף.
    5. הסרה של רקמה משפופרות ובזהירות לשטוף עם מים מזוקקים לפחות פעמיים.
    6. באמצעות תקשורת הרכבה מסיסה במים, הר רקמות בשקופית זכוכית ניסיתי להפריד עם מלקחיים חדים לפני ההדבקה להחליק את מכסה.
    7. נוףתחת מיקרוסקופ תמונות ולכידות לאור סיבים בודדים בהגדלה גדולה יותר 400X.
    8. כדי לקבוע זווית מיקרופיברילות של סיבים, למדוד את הזווית בין הפתחים הבורים ו / או פסי קיר תא לבין ציר הזמן של הסיבים (האיור 2i) באמצעות תוכנת מדידת תמונה.
    9. לניתוח סטטיסטי, בצע על משלב 7.1.10.

8. ניתוח של יזם דפוסי הביטוי

  1. ניתוח של דפוסי ביטוי יזם ברקמות גזע משתיים.
    1. טלי שכיחותה של כל סוג במגזר עבור האמרגן של עניין, כמו גם בקרות חיוביות ושליליות כאמור בשלב 6.2.2.
    2. השווה את התדירות של סוגים במגזר השונים עבור האמרגן של עניין עם השליטה החיובית באמצעות בדיקות צ'י מרובעות להקים-ערכי p. ניתוח נוסף של סגוליות תא / רקמות יכול להתבצע באמצעות צעד 7.2 כנדרש.
      1. אם יותר אמרגן אחדעניין נחקרת מכן חזור השוואת עשיית ניתוח זה בין כל היזמים של ריבית השליטה החיובית.
      2. אם סקטורים או כתמים כחולים הם נצפו בבקרה שלילית ואז להוסיף את זה בניתוח או לנטוש תלוי במידה או אם מכתים אנדוגני חשוד (ראה דיון).
  2. ניתוח של דפוסי ביטוי יזם במהלך פיתוח נגזרי Cambial והבחנה.
    1. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לחזות את כל המגזרים cambial (איור 1g, 1h, 1i) שזוהה בשלב 6.2 ולקבוע את נוכחות / היעדרות של כתמים כחולים בסוגים שלוש רקמות נגזר cambium; השיפה (P), פיתוח עצה (X1) או רקמות עצה מפותחות (X2) (ראה איור 3 א).
    2. כמו לכל צעד 8.1.2, להשוות את התדירות של נוכחות / היעדרות של מכתים גאס ב P, אזורי X1 ו- X2 של אמרגן של interest עם השליטה החיובית באמצעות בדיקות צ'י מרובעות להקים-ערכי p. ניתוח נוסף של סגוליות תא / רקמות יכול להתבצע באמצעות צעד 7.2 כנדרש.
      1. עיין בשלבים 8.1.2.1 ו 8.1.2.2 עבור שיקולים נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שימוש בפרוטוקול זה כל סוגי תאים ורקמות גזע משני חיים הוכחו להיות רגישים א tumefaciens טרנספורמציות הוגדרו לתוך סוגים במגזר בהתאם לסוג תא טרנספורמציה בתחילה וזה דפוס הצמיחה התפתחותי שלאחר מכן. סוגי מגזר כוללים periderm, השיפה, cambial, פצע parenchyma ו tylose (1b, 1c, 1D) וניתן למצוא במקומות עקביים לתאר ביתר פסק זו. מגזר periderm מורכב מקבוצה של תאים טרנספורמציה נמצא באופן בלעדי periderm ולעולם הארכת לתוך (1e איור) השיפה. ניתן למצוא במגזר השיפה במקומות שונים בין השכבה והיזומה ואת periderm, לעומת זאת, מעולם לא ומפעפע רקמות הסובבות אלה (1F איור). מגזר cambial מורכב רקמות עצה / cambium / השיפה טרנספורמציה נגזרו טראןsformation של הראשוני cambial ויכול להתרחש בשלושה דפוסים ברורים: i) "מלאה" במגזר cambial, / עצת טרנספורמציה תאי cambial / השיפה המשתרעים מן הגבול של רקמת parenchyma הפצע דרך אזור העצה ו cambial לרקמת השיפה המכיל את שני קרנות תאי כישורים או אלמנטי ray בלבד (1G איור), ii) במגזר cambial 'ראשוני אבוד ", גרסה של מגזר cambial המלא שבו ראשוני אבדה מהשכבה והיזומה עוזב עצת שיקוף ומגזרים השיפה ואת שכבה ויזומה untransformed (איור 1h), ו- III) "העצה היחידה 'במגזר cambial, רקמת העצה טרנספורמציה המשתרע מן הגבול של הרקמה parenchyma הפצע מאמצים משתנה לתוך הרקמה xylogenic שהוקמה זה עתה אך לעולם אינו משיג את השכבה ויזום (1i איור). מגזר parenchyma הפצע מכיל טרנספורמציה תאי parenchyma פצע נמצאים כמו גם תא יחיד או קבוצות של תאים, לעתים קרובות fil רדיאליes, הממוקם בין העץ קיים ורקמות עצה שהוקמו זה עתה (1J איור). סקטור tylose המורכב tyloses כלי טרנספורמציה נמצא בתוך העץ קיים מראש (איור 1k).

נתונים יעילי שינוי נציג לשני גני אמרגן של מחקרי עניין, כמו גם הבקרות החיוביות שלהם מוצגים בלוח 1 ולוח 2. נתונים הוסתו משני מחקרים גדולים שנערכו ברחבי באותו הפרק הזמן (דצמבר באפר) ב גנוטיפים אותו של eucalypt וצפצף על פני שנים רצופות מעורבת מספר גני היווצרות עץ היזמים של עניין. התמקדות בקרות חיוביות מן האמרגן של מחקרי עניין (טבלה 2), סוג הרקמה הרגיש ביותר א tumefaciens T-DNA העברת רקמות cambial עם כ -60% ו -40% של המגזרים המזוהים אקליפטוסים ואת הצפצפה בהתאמהלהיות מגזרי cambial. בשנת אקליפטוסים, סוג הסקטור הבא הנפוץ ביותר הוא פצע parenchyma ב -35% ואילו סוגי המגזר האחרים כל היו ערכים -2 ATScm מתחת ל -5%. בשנת צפצפות, סוג הסקטור הבא הנפוץ ביותר הוא פצע parenchyma ב 20% ואחריו השיפה ב -15% בעוד שאר סוגי במגזר נמצאו בתדר מתחת ל -5%. סבירות גבוהה יותר של מציאה במגזר בחלון cambial וכן מספר גדול יותר של מגזרי cambial החשים הזדהות טיפוסית שבו פרוטוקול קליפת השיפה משמש (טבלה 1, צעד 5.2.1) בשל היכולת מכתימה והאפשרות לדמיין את האזור כולו של cambium.

במהלך הפיתוח של הפרוטוקולים הללו מספר משתנה נחקר במסגרת ניסויים אופטימיזציה בפרוטוקול. ריכוז חיידקים אלה כלל ב הרכבת מדיה, סוג המדיה המשמש הרכבת מדיה, תוספת של acetosyringone חיסון מדיה, גיל רקמות ו- A. tumefaciens זן כמו גם זמן של חיסון גנוטיפ. במגזר Cambial ATScm -2 נתונים מניסויים אלה מוצגים בלוח 3 ולוח 4. רוב משתנה שנחקרו, וכאשר היא משתנית, להביא לשינויי cambial ATScm -2 בשני המינים כלל בעיקר להעלאת ריכוז חיידקי ההרכבה מדיה, שימוש MS בתקשורת הרכבת חיסון בחירה של א tumefaciens זן. בנוסף, זמן של גנוטיפ חיסון והעץ הראה הבדלים משמעותיים אקליפטוסים עם חיסונים בתחילת קיץ מראה גבוה ATScm -2 תוך SG21 שיבוטי eucalypt ו SG44 הראו cambial הגבוה ATScm -2, 41.6 ו 40.4, בהתאמה בהשוואה לאחרים בכל החודשים יחד.

גודל סקטור cambial ממוצע משתנה והוא תלוי בכמות של הצמיחה משיקה רדיאלי שלה בחלון cambial. בתת אחדמדגם של 53 מגזרים צפצפה, גדל במשך כ -4 חודשים, רוחב משיק סקטורים בבית cambium נע בין 0.09 ו 0.58 מ"מ עם ממוצע של 0.27 מ"מ בעוד שהצמיחה רדיאלי על פני חלונות cambial נע בין 0.7 כדי 2.2 מ"מ עם ממוצע של 1.35 מ"מ. כאשר משלב אותם, שנקבע בין 0.063 מ"מ 2 ו 1.276 מ"מ 2 של רקמות מהונדסות לניתוח. בשנת subsample אחר של 188 ענפים מאותו המין, שם בין 1.5-4 מ"מ של צמיחה רדיאלי על פני חלון cambial נצפה על פני כ -5 חודשים, המסה במגזר הממוצעת הייתה 72 מיקרוגרם (לוח 5).

כמות הרקמה מהונדסת נוצרה הוכחה לספק מספיק תאים ו / או רקמות לבצע מדידות מורפולוגיים, כמו גם לחקר הפעילות הפרומוטר. לדוגמא, את ההשפעה של אקליפטוס שלושה grandis flas על מספר תכונות מורפולוגיה סיבי עצה 9 לשעבר היה plored שיבוטי eucalypt וגילו תפקידים אפשריים עבור EgrFLA2 בקביעתה משרד חוץ EgrFLA1 בקביעת גודל תא (לוח 6). בנוסף, דפוסי ביטוי של אקליפטוס grandis אמרגן גן CESA ב העצה מתפתח (X1), עצה מפותחת (X2) ואת השיפה (P) רקמות 10 דפוסי ביטוי שונים מזוהים באופן משמעותי בין EgrCESA1, 2, 3, ו EgrCESA4, 5, 7 ב eucalypt הגבעולים. בניתוח זה, EgrCESA1, 2, 3 הוצגו להתבטא בעיקר בפיתוח רקמות העצה תוך EgrCESA4, 5, 7 הוצגו להתבטא בשני העצה בפיתוח רקמות השיפה (איור 3B, לוח 7). כל יזמי EgrCESA הראו דפוסי ביטוי שונים משמעותי הבקרה החיובית (אמרגן CAMV35S) (לוח 7).

4553 / 54553fig1.jpg "/>
איור 1:. סוגי מגזרים טרנסגניים (א) מגזרי Cambial כפי שנצפה על פני השטח של העצה שנחשפה לאחר העיבוד באמצעות פרוטוקול קליפת השיפה (שלב 5.2.1). דיסקים מראה מגוון של סוגי המגזר על משטח רוחבי של ב (ב) צפצפה eucalypt (ג) נובעת לאחר עיבוד באמצעות פרוטוקול קיצוץ רוחבי (שלב 5.2.2). (ד) תרשים סכמטי של מגוון סוגי מגזר נמצא מפעל נובע. דוגמאות של המגזר periderm (ה), המגזר השיפה (ו), "מלא" המגזר cambial (ז), "איבד הראשונית של המגזר cambial (ח)," העצה היחידה 'במגזר cambial (i), המגזר parenchyma הפצע (י) ו במגזר tylose (k) ב צפצפה. חיצים שחורים לציין היכן במגזר בגודל קטן ממוקמים. כל הברים בקנה המידה = 1 מ"מ.Iles / ftp_upload / 54,553 / 54553fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. הכנת המגזרים cambial לניתוח מורפולוגי באמצעות SEM ו מיקרוסקופ אור (א) כריתה של המגזר המכיל דיסק. (ב) דיסק גזוז להסרת רקמה עודפת. חיתוך באמצעות משטח רוחבי של המגזר המהונדס (ג). (ד) מבוא של שני חתכים רדיאליים לסייע באיתור הרקמה המהונדסת תחת SEM. (ה) רקמות רכובות על פיני SEM באמצעות קלטת מוליך. (ו) תיאור של האזור של מהונדס ורקמות הלא מהונדסות שאמורות להיות צלם לניתוח. (ז) תמונה אופיינית של תאי סיבי עצה וריי שנתפסו בהגדלת 2,000X. (h (I) סיבי macerated שנצפו תחת מיקרוסקופ אור המתארת את הזווית של הבורות ו / או פסי דופן תא לציר הארוך של התא. חץ שחור מציין צמצם בור. ברי סולם = af, h = 1 מ"מ, g, i = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ניתוח תוצאות של דפוסי ביטוי גני האמרגן נגזר cambial (א) תיאור של P (השיפה), X1 (העצה מתפתחת) ו X2 אזורים (עצה מפותחת).. (ב) תוצאות מציין שיעור P, X1 והכתים X2 במגזרי cambial מניסוי המעורב במגוון של CESA מאקליפטוס Grandis להפוך גבעולי כלאי eucalypt. נתונים שמקורו מן קורה et al. 10. n = מספר ענפים שהוערכו. סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מיני עצים סוג וקטור מספר הגנים של עניין בשימוש סה"כ חלונות נוצר סה"כ חלונות שבו סקטור זוהה (%) Cambial ATScm -2 cambial (בחלונות במקומות שבהם סקטור זוהה)
אקליפטוס Globulus x כלאי camaldulensis (בסך הכל שלושה שיבוטים) בקרה חיובית (גנים של עניין) 1 (גאס בלבד) 96 97% 45.1 (1.5)
גנים של עניין 20 630 92% 46.1 (2.2)
Populus alba 'pyramidalis' בקרה חיובית (גנים של עניין) 1 (גאס בלבד) 110 74% 10.8 (1.5)
גנים של עניין 20 700 81% 14.6 (0.8)

טבלת 1:. אופייני cambial ATScm -2 עבור הבקרה החיוביות גני העניין דמויים כבר שמקורו מן המחקרים שנעשו במשך שנים רצופות באותו eucalypt ומשכפל צפצפה באמצעות מגוון של גנים ואת פרוטוקול קצירת קליפת השיפה (שלב 5.2. 1). ערכי סטיית התקן בסוגריים. </ P>

<td> 1 (גאס בלבד)
מיני עצים סוג וקטור המספר / גני אמרגן סה"כ חלונות נוצר סה"כ חלונות שבו סקטור זוהה (%) ATScm -2 בכל המגזרים ATScm -2 periderm ATScm -2 השיפה Cambial -2 ATScm ATScm -2 Wound parenchyma ATScm -2 Tylose
אקליפטוס Globulus x camal-
כלאי dulensis (בסך הכל שלושה שיבוטים) 		בקרה חיובית 118 63% 25.74 (2.35) 0.24 (0.07) 0.89 (0.19) 15.7 (1.71) 8.84 (1.4) 0.07 (0.03)
יזמים של ריבית 28 1050 31% 14.67 (1.77) 0.02 (0.01) 0.05 (0.01) 13.79 (1.75) 0.78 (0.21) 0.03 (0.01)
Populus alba 'pyramidalis' בקרה חיובית 1 (גאס בלבד) 110 54% 12.37 (1.77) 0.22 (0.07) 1.85 (0.29) 5.07 (0.6) 2.78 (0.75) 0.29 (0.53)
יזמים של ריבית 28 990 26% 8.28 (1.18) 0.16 (0.04) 0.9 (0.09) 6.67 (1.16) 0.27 (0.07) 0.28 (0.11)

טבלה 2:. ATScm במגזר אופייני -2 עבור השליטה החיובית ומקדמי עניין דמויים כבר שמקורו מן המחקרים שנעשו במשך שנים רצופות באותו eucalypt ומשכפל צפצפה באמצעות מגוון של רצפי אמרגן ופרוטוקול קציר דיסק (שלב 5.2. 2). ערכי -2 ATScm נגזרו חלונות שבו סקטור זוהה בלבד. ערכי סטיית התקן בסוגריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

מִין מִשׁפָּט תיאור טיפול מספר חלונות בטיפול -2
Globulus אקליפטוס ריכוז של א tumefaciens ב מדיה הרכבה Resuspended ב- MS 25 מ"ל 10 1.4 (0.62)
Resuspended ב- MS 5 מ"ל 10 1.6 (0.72)
Resuspended ב 1 מ"ל MS (שליטה) 10 2.4 (1.16)
סוג מדיה מדיה הרכבה LB 10 0.4 (0.22)
MS (שליטה) 10 2.4 (1.16)
תוספת של acetosyringone מדיה הרכבה עם acetosyringone 11 0.9 (0.37)
ללא acetosyringone (שליטה) 11 0.6 (0.64)
גיל של רקמת גזע מחוסן 6 חודשים (control) 11 1.1 (0.66)
18 חודשים 11 1.8 (0.95)
א tumefaciens זן AGL1 (שליטה) 18 0 (0)
C58 18 0.1 (0.1)
LBA4404 18 0.6 (0.4)
Populus alba 'pyramidalis' ריכוז של א tumefaciens בתקשורת Resuspended ב- MS 25 מ"ל 10 2.2 (0.55)
Resuspended ב- MS 5 מ"ל 10 2.7 (0.63)
Resuspended ב 1 מ"ל MS (שליטה) 10 5.1 (1.58)
סוג מדיה המשמש חיסון גזע LB 10 2.8 (0.71)
MS (שליטה) 10 5.1 (1.58)
תוספת של acetosyringone מדיה הרכבה עם acetosyringone 11 0.3 (0.14)
ללא acetosyringone (שליטה) 11 0.5 (0.25)
גיל של רקמת גזע מחוסן 6 חודשים (שליטה) 11 1.5 (0.33)
18 חודשים 11 1.5 (0.63)
א tumefaciens זן AGL1 (שליטה) 20 8.1 (2)
C58 20 12.5 (2)
LBA4404 20 11.1 (2)

טבלה 3: Cambial ATScm -2 ערכים עבור מגוון של משתנים שנחקרו במסגרת מסלולי אופטימיזציה פרוטוקול. משתנים נחקרו שיבוט צפצפה ומגוון של אנשי Globulus אקליפטוס על פני מספר שנים עם cambial ATScm -2 בנתונים המוצגים. חלונות Cambial נבצרו באמצעות פרוטוקול קצירת דיסק (שלב 5.2.2). ערכי סטיית התקן בסוגריים.

מזהה אקליפטוס Globulus x שיבוט camaldulensis מספר חלונות cambial עבור כל חודש בסוף האביב -2 Cambial ATScm (נובמבר) הרכבה הרכבת חיסון הקיץ מוקדם -2 Cambial ATScm (דצמבר) בקיץ שבאמצע -2 Cambial ATScm (ינואר) הרכבה לחופש הגדול -2 Cambial ATScm (פברואר) הרכבה בתחילת הסתיו -2 Cambial ATScm (מרץ)הַרכָּבָה Cambial ATScm -2 כל החודשים בשילוב
SG5 10 15.7 (7.8) 50.7 (13.7) 10.5 (5.1) 30.7 (4.4) 16.8 (6.3) 24.9 (4.3)
SG6 10 6.1 (3.1) 38.5 (15.1) 4.5 (1.7) 14.5 (3.3) 27.6 (8.4) 18.3 (4)
SG13 10 28.4 (6.7) 41.8 (9.1) 16.1 (7) 29.3 (5.2) 19.8 (4.3) 27.1 (3.1)
SG18 10 6.7 (2.9) 18.3 (6.7) 17.4 (3.4) 19.2 (6.1) 18.1 (6.3) 15.5 (2.4)
SG21 10 38.7 (14.3) 77 (17.5) 23.9 (5.7) 27.5 (6.9) 40.7 (13.5) 41.6 (6)
SG35 10 23.5 (10.2) 42.8 (12.2) 7.6 (2.5) 17.6 (4.3) 31.3 (4.6) 24.6 (3.8)
SG37 10 19.7 (8) 55.2 (14.5) 7.4 (1.8) 35 (10.4) 15.9 (4.5) 26.6 (3.8)
SG39 10 12.5 (2.4) 23.6 (6.3) 6.9 (3) 26.3 (8.1) 7.3 (2.3) 15.5 (2.6)
SG40 10 24.8 (11) 24.5 (6.8) 14 (5.6) 35.6 (6.1) 19.9 (4.2) 23.8 (3.2)
SG44 10 22.3 (3.4) 63 (29.3) 9.8 (2.6) 52.5 (10.3) 54.3 (15) 40.4 (7.4)
SG46 10 15.3 (5.2) ד> 63.9 (20.1) 23.6 (4) 22.5 (4.8) 17.4 (4.9) 28.5 (5.1)
Cambial חודשי ATScm -2 19.9 (5) 45.3 (9.1) 12.6 (2.8) 27.8 (4.5) 24 (5.1)

לוח 4:. השפעת גנוטיפ והשעה של חיסון על ATScm cambial -2 שיבוטים eucalypt עשר חלונות הוכנסו בכל חודש במהלך העונה הגוברת 10 שיבוטים שונים אקליפטוס Globulus x camaldulensis שהיו כל שנקטפו מאי. נתונים חודשיים מוצג עבור כל גנוטיפ עם ATScm חודשי גנוטיפ הממוצע הכולל -2 מוצגים גם. חלונות Cambial נבצרו באמצעות פרוטוקול קצירת קליפת השיפה (שלב 5.2.1). ערכי סטיית התקן בסוגריים.es / ftp_upload / 54,553 / 54553tbl4large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

מספר צמח מספר מגזרי cambial ניכר המסה הכוללת של כל המגזרים (מיקרוגרם) המסה הממוצעת של המגזרים (מיקרוגרם)
1 11 750 68
2 19 1,460 77
3 21 160 8
4 26 4,460 172
5 15 1,320 88
6 22 2,490 113
7 19 1,720 91
8 30 830 28
9 25 360 14
סה"כ 188 13,550 72

לוח 5:. המוני אופייני של מגזר cambial 45 חלונות פני תשעה צמחים נחקרו צפצפה כדי לקבוע את המסה הממוצעת של מגזר וקוצר באמצעות פרוטוקול קצירת דיסק (שלב 5.2.2). הצמחים גדלו במשך 5 חודשים ואת הצמיחה רדיאלי על פני חלון cambial הייתה בין 1-4 מ"מ.

Morph-
תכונת ological 		גאס בלבד (בקרה חיובית) ללא מהונדס רקמות (גאס בלבד) P-value הגן של עניין 1 (FLA1) ללא מהונדס רקמות (FLA1) P-value הגן של עניין 2 (FLA2) ללא מהונדס רקמות (FLA2) P-value הגן של עניין 3 (FLA3) ללא מהונדס רקמות (FLA3) P-value
סלולארי ממוצע עובי דופן (מיקרומטר) * 1.81 (0.1) 1.65 (0.1) .2692 1.47 (0.14) 1.55 (0.12) .6403 1.65 (0.13) 1.78 (0.13) .4839 1.59 (0.12) 1.63 (0.11) .8254
סלולרי ממוצע פינת קיר (מיקרומטר 2) * 69.1 (4.74) 60.7 (2.03) .1229 64.1 (15.68) 59.9 (9.79) .5004 61.6 (3.4) 65 (3.96) .5182 61.9 (3.56) 61.5 (3.16) .9438
שטח התא ממוצע (מיקרומטר 2) * 115.9 (11.01) 99.9 (5.1) .2041 124.4 (6.1) 108 (4.36) .0445 110.8 (8.45) 111.3 (9.06) .9671 108.5 (4.43) 103 (3.07) .3204
פינת לומן ממוצעת (מיקרומטר 2) * 46.9 (7.55) 39.2 (4.89) .407 60.2 (5.28) 48.1 (4.46) .0991 49.2 (7.56) 46.3 (7.5) .7882 46.6 (3.31) 41.5 (3.9) .3264
# ממוצע מיקרופיברילות זווית (O) 24.3 (0.75) 24.2 (0.45) -0.8648 22.3 (0.82) 22.7 (0.7) .5664 23.7 (0.55) 26.6 (0.5) 0.0001 26 (0.88) 27.2 (0.72) .0903

לוח 6:. מדידות מורפולוגיה סיבי ISSA נגזר גן של מחקר עניין השוואת דופן תא סיבים, גודל תא ומדידות MFA שנלקחו סיבים מהונדסים שמקורו מן האקליפטוס Globulus x camaldulensis שיבוטי גבעולים הפכה עם אקליפטוס grandis flas (EgrFLA1, 2, 3) ו בקרה חיובית (גאס בלבד) עם הסיבים מלאים המהונדסים הלא הצמודים. נתונים שמקורו מן מקמילן ואח '. 9. * מציין בניסוי זה השתתף במדידת 10 סיבים 10 מגזר (טוטאל של 100 סיבים). # מציין במשפט מעורב מדידת 5 הסיבים 20 המגזרים (כולל של 100 סיבים). <α 0.05 מודגשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

ד> 11.05
EgCESA1 EgCESA2 EgCESA3 EgCESA4 EgCESA5 EgCESA7 גאס בלבד (בקרה חיובית)
EgrCESA1 .708 2.839 8.856 9.976 9.18 29.165
EgrCESA2 1.11 12.008 11.363 30.234
EgrCESA3 15.151 16.123 15.488 37.791
EgrCESA4 4.852 .108 46.858
EgrCESA5 3.275 11.278
EgrCESA7 36.082
גאס בלבד (בקרה חיובית)

p-together.within-page = "1"> לוח 7: צ'י 2 ערכים הנגזרים השוואה של דפוסי ביטוי האמרגן בנגזרים cambial ניתוח צ'י 2 השוואת נוכחות / היעדרות של מכתים גאס ב P, X1 והאזור X2 נגזרים cambial. בין שישה אקליפטוס grandis רצפי יזמי גן CESA (EgrCESA 1, 2, 3, 4, 5, 7) ובקרה חיובית (גאס בלבד). נתונים שמקורו מן קורה et al. 10. α <0.05 שמוצג תחתון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול ISSA הוא שיטה פשוטה יחסית ויעילה ליצירת רקמות גזע מהונדסת מיני עצים במרחב של כמה חודשים לניתוח של גנים ומקדמים של האינטרס הכרוך עץ גזע היווצרות. מעט מאמץ, מעבר שמירת צמחים בחיים, נדרש לגדל רקמות גזע מהונדסות הבאות חיסון אשר עומד בניגוד לשיטות במבחנה שבה culturing הנרחב נדרש לשמור רקמות או צמחים, שבו ייצור עץ עשוי להימשך עד שנה כדי להתחיל או שם אמיתי גזע משני אינה נוצרת 1. ISSA גם הוכח לחול על מגוון רחב של מיני עצים, כולל מינים של הסוג של Populus, אקליפטוס Pinus 6 וכן אקשיה Corymbia (מידע לא מוצג) שם מעט מאוד, אם בכלל, אופטימיזציה נדרש לגזור רקמות מהונדסות. באמצעות שיטה זו, ולכן ניתן לחקור מספר oגנים או מקדמי f עניין ברוב המינים של עניין. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש בפני עצמו או בשילוב עם שימוש נרחב יותר בטכניקות במבחנה שב מספר רב של גנים יכולים להיחקר באמצעות ISSA בערכאה הראשונה לזהות מועמדים פוטנציאליים לקחת קדימה ליותר מעורב שיטות במבחנה.

הדוגמא המתוארת מראה כי מגזרים מספיק ניתן ליצור לבצע ניתוח במורד זרם ממספר קטן בלבד של חלונות cambial המהונדסת. עם ערכי -2 ATScm של 46.1 ב eucalypt ו 14.6 ב צפצפה רק אחד או שני חלונות cambial יהיו מספיק כדי לחקור תכונה אחת כפי שהוא ניתן להוסיף חלונות רבים על גבעול בודד או לשכפל על צמחים רבים. בפועל, עם זאת, לא כל חלונות cambial להוביל ליצירה של מגזר cambial שניתן לנצלם (ראו טבלה 1, טבלה 2) כמו הגודל של מגזרים יכול להשתנות, הם בדרך כלל קטניםובמקרים יכול להיות ממוקם בסמיכות זה לזה להגביל את השימוש שלהם לניתוח במורד הזרם. בנוסף, הגן של עניין עשוי להשפיע על כדאיויות תא 12 או היבטים אחרים של התפתחות תא וכתוצאה מכך לגרום העדר המוחלט של מגזרים מהונדסים עבור גן מסוים של עניין. לכן מומלץ תמיד לשאוף למספר גדול יותר של חלונות מאשר כי עשוי להידרש לניתוח. זהירות דומה צריכה להיות מיושמת כאשר באמצעות ISSA ללימודי אמרגן כפי שניתן לצפות שונה משמעותי עם ביטוי קטן / חלש או לא נצפה במקרים מסוימים (טבלה 2). עם זאת, מספר קטן יותר של מגזרים, קטן כמו 6, הוכח לשמש בהצלחת ניתוח 10. תוצאות אלו מראות כי די ניסויים צנועים היה מעורבים מספר קטן בלבד של חלונות יכולים להוביל לתובנה משמעותיות לתוך תפקוד גן ופעילות אמרגן.

מנקודת מבט ניתוח, בסמיכות של transgenic ורקמות הלא מהונדס מספק כלי רב עוצמה כדי לזהות הבדלים קטנים אך משמעותיים בתכונותיו בין הגנים של עניין. תאים ורקמות שנדגמו סמוכים ישירות זה לזה הם מאותו רקע גנוטיפ ו הושפעו באותם תנאים סביבתיים צמצום מספר משתנים בלתי תלויים ופישוט הניתוח הסטטיסטי הנדרש. מנקודת מבט דגימה, ניתוח כוח על ISSA נגזר נתונים מניסויים מרובים (למשל, לוח 6), הראה כי מספר קטן יותר של מדידות לכל מגזר, למשל, דופן תא עובי של 3-5 תאים לכל מגזר, ומדידת מספר גדול יותר מגזרים, למשל, 20-25 מגזרים עבור גן של עניין, מספקים אסטרטגית דגימה יעילה ויציבה יותר מבחינה סטטיסטית. כל מגזר מייצג אירוע טרנספורמציה עצמאי או 'קו' של תאים עם הניתוח הסטטיסטי התחייב בקביעת ההשפעה הממוצעת של אירועי טרנספורמציה מרוביםלערב את הגן של עניין. לא פחות, את היכולת להפוך את כל רקמות הגזע מספקת הזדמנות ללמוד את הביטוי של מקדמי אינטרסים פני כל הגבעול ובאופן ספציפי במהלך התמיינות cambium. פרוטוקולי ISSA המתואר כאן לספק צינור אמין ומאומת מבריאת הרקמות מהונדסות ועד הקציר של דגימות, איסוף וניתוח של נתונים עבור רקמות מורפולוגיה תאים עבור דפוסי ביטוי אמרגן.

ברוב המקרים, מגזרים הם התוצאה של טרנספורמציה של תא בודד, אשר באמצעות חלוקת תא עשוי עורר מספר תאים ורקמות נגזרים. לדוגמא, מגזר cambial נובע טרנספורמציה של תא בודד שפוסט פצע ההתאוששות הופכת ראשונית cambial אשר בתורו מחלק periclinally ו anticlinally ליצור במגזר המתמשכת לאורך כל הדרך מן הפצע המקורי לתוך השיפה. במקרים אלה, נתוני הפתיחה טרנספורמציה נשמרהבתוך cambium עד למועד קטיף וחלופה "מלאה" הוא ציין, עם זאת, שם ראשוני זה הולך לאיבוד משכבת ​​cambial במהלך צמיחה רדיאלי ובמקומו בתא שכן טרנספורמציה הלא דרך 'תא-פלישה, אז' גרסה ראשונית 'איבד תהיה התוצאה. על מנת להבטיח סיווג נכון של סוגים במגזר ולסייע עם הפרשנות של תוצאות הוא מומלץ בחום היכרות שעם תכונות אנטומיות של תגובות פצע ופיתוח גזע משני להיות תנאים מוקדמים עבור הניתוח של תוצאות ISSA. כמו כן, בדיקה רגילה של pH של מגיב גאס מומלץ (ראה שלב 5.6). PH נמוך (למשל, מתחת ל -6) יכול להוביל הפעלה של אנדוגני β-glucuronidases (גאס) ב גבעול אשר יכול להסוות את ההיקף האמיתי של מגזר או להביא לזיהויו של תוצאות חיוביות שגויות. איפה זה חשוד, מומלץ כי דגימות אלה ייכללו ניתוח נוסף. פרוטוקול מגיב גאסבאופן מהימן שיושמו המחקרים המפורטים כאן כדי להקל על בעיות פוטנציאליות עם פעילות גאס אנדוגני הותאמה מתוך הוקינס et al. (2002) 16 ו מנצלים שלבים עיקריים נוספים, כולל שתי שטיפות עם חיץ פוספט לאזן דגימות pH7, טיפול בחום ב 55 C o במשך 10 דקות כדי לערער פעילות גאס אנדוגני 17,18. חדירות מגיבים גאס הן גם מוגבלות, והוא אחראי על מגזרים פחות להיות מזוהה באמצעות פרוטוקול הדיסק הרוחבי לעומת פרוטוקול קליפת השיפה.

כל המינים trialed הראו להיות רגישים טרנספורמציה של רקמות cambial. עם זאת, הבדלים משמעותיים ATScm -2 הוא בין ובתוך סוג והמינים נצפו. באופן דומה הזן של א tumefaciens ושעה / עונה של חיסון יכולים להשפיע ATScm -2. הוא הציע כי התחייבות כמה בדיקות ראשוניות של משתנים אלה ספציפיתes ו גנוטיפים תחת חקירה לפני אימוץ בקנה מידה גדול יותר של הפרוטוקול. תיאורטית אין הגבלה על הגיל או הגודל של הגבעולים שאליו ISSA יכול להיות מיושם כל עוד קיים cambium ומתרחב. עם זאת, על מנת להקל על עיבוד במורד הזרם של מגזרים רקמות מהונדס מומלץ inoculating גבעולי כ -1 ס"מ קוטר.

ISSA אינו נטול מגבלות. גדליו הקטנים יחסית של מגזרי רקמות מהונדסים היום מגבילים שיטות phenotyping במורד וכתוצאה מכך רק מספר מצומצם של שיטות כאלה שמש באופן שגרתי עד כה. שיטות אלה הם התמקדו בעיקר אפיון מורפולוגי כפי שתוארו לעיל, כמו גם הערכה כמותית למחצה של רכב מונוסכרידים בקיר התא המשני כאמור בהקדמה 9,11. עם כניסתו ועידון של טכנולוגיות חדשות עבור ניתוח בקנה מידה נאה של חומרים ביולוגיים קיים פוטנציאל להמשיך לפתח phenotyping נוסףצינורות עבור מגזרי ISSA, למשל בניתוח הלחנת דופן תא. זה עדיין קשה, עם זאת, כדי לבצע כמוני, מגזר לפי מגזר, חומצה ריבונוקלאית (RNA) ביטוי גנים מבוסס ומחקרי חלבון ו / או לזהות ולהרבות ISSA שמקורם בתאים מהונדסים דרך culturing במבחנה לניתוח נוסף עקב הטבע ההרסני של assay גאס . גנים מסוימים כתבו ניאון והדפסת רקמות כבר trialed לכמת RNA ממגזרי פרט אך עד כה גישות אלו לא שמשו בהצלחה בינונית עד הקרנת תפוקה גבוהה בפעולה שיגרתית. יתר על כן, טכניקות מהונדסות לא trialed עד כה כגון RNAi יכולות לסבך ניתוח שבו ביטוי גאס ולמטה ויסות של גן המטרה לא יכולים לשתף בתרגום.

אמנם יש כמה מגבלות נוכחיות, שילוב של טכנולוגיות חדשות המתעוררות ושיטות אנליטיות צפויות להתגבר על המגבלות האלה, עוד שיפור התפקיד של ISSAsa בינוני עד פרוטוקול העברת נתונים גבוה עבור לנתח הטבע המולקולרי המורכב של בידול cambial, פיתוח עץ גזע היווצרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plants NA NA Please consult local nursery suppliers for plants as needed
Agrobacterium strain NA NA There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region.
Binary vector (gene and promoter) NA NA We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community.
LB media Sigma L3022 The same product could be sourced from another company
LB media with agar Sigma L2897 A like product could be sourced from another company
Antibiotics Sigma NA The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a  range of companies
50 ml Screw top tubes Fisher Scientific 14-432-22 The same product could be sourced from another company
2 ml Microtube Watson Bio Lab 132-620C The same product could be sourced from another company
MS Media Sigma M9274 The same product could be sourced from another company
Scalpel blade no. 11 Sigma S2771 The same product could be sourced from another company
Parafilm "M" Bemis PM996 This is the best product to use to bind the cambial window post creation 
14 ml round bottom tubes Thermo Scientific 150268 The same product could be sourced from another company
EDTA Sigma E6758 The same product could be sourced from another company
Triton Sigma X100 The same product could be sourced from another company
X-Gluc X-GLUC direct You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html
Potassium Ferricyanide(III) Sigma 244023 The same product could be sourced from another company
Potassium Ferrocyanide(II) Sigma P9387 The same product could be sourced from another company
Litmus paper Sigma WHA10360300 The same product could be sourced from another company
Single edge razor blade ProSciTech L055 The same product could be sourced from another company
Double edge razor blade ProSciTech L056 The same product could be sourced from another company
SEM Pin Stub ProSciTech GTP16111 The same product could be sourced from another company
Sample vial with screw cap ProSciTech L6204 The same product could be sourced from another company
Ethanol sigma E7023 The same product could be sourced from another company
LR white ProSciTech C025 The same product could be sourced from another company
Embedding Mould ProSciTech RL090 We recommend this variety, however there are plenty of options available
Water Soulable mounting media ProSciTech IA019 One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored.
Hydrogen peroxide Sigma 216763 A like product could be sourced from another company
Glacial acetic acid Sigma A9967 A like product could be sourced from another company
Safranin O ProSciTech C138 A like product could be sourced from another company
Quanta Environmental Scanning Electron Microscope FEI This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised
ImageJ imaging software can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
  2. Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
  3. Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
  4. Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
  5. Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
  6. Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
  7. Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
  8. Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
  9. MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
  10. Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
  11. Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
  12. Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
  13. Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
  14. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  16. Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
  17. Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
  18. Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).

Tags

גנטיקה גיליון 116 גיבוש עץ Xylogenesis גזע משניים צמח ניתוח מגזר סומטיים מושרה מהונדס אפיון פונקציונלי ג'ין דפוסי ביטוי היזם eucalypt צפצפה, ביולוגית צמח
השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Spokevicius, A., Taylor, L., Melder, … More

Spokevicius, A., Taylor, L., Melder, E., Van Beveren, K., Tibbits, J., Creux, N., Bossinger, G. The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development. J. Vis. Exp. (116), e54553, doi:10.3791/54553 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter