Abstract
樹木における二次茎の成長と関連した木部形成は、生物学的および商業的な観点の両方から重要です。しかし、比較的少ないが、その開発を支配する分子制御について知られています。これは、多くの場合、二次成長過程の研究に関連する物理、リソースと時間制限による部分です。 in vitroでの多くの技術は、植物の一部または木質及び非木質植物種の両方でプラント全体のシステムのいずれかを含む使用されています。しかし、二次茎成長プロセスの研究のための彼らの適用性についての質問には、特定の種や労働強度の反抗は、高スループットのアプリケーションへの媒体のため、多くの場合、法外です。二ステム開発や木材形成を見たときにも、調査中の特定の形質のみが成長の数年後に後半ツリーのライフサイクルにおける測定可能になるかもしれません。 生体内の P で 、これらの課題の代替に対処するにはrotocolsは、直接、植物の二次茎トランスジェニック体細胞組織セクターの創出を伴う誘発性体細胞セクター分析、命名、開発されてきました。このプロトコルの目的は、樹種の範囲内で利用することができる遺伝子及びプロモーター機能的特徴付けのために、トランスジェニック植物の二次組織を作成するための、効率的で、簡単で、比較的迅速な手段を提供することです。ここに示された結果は、トランスジェニック二ステム部門は二次ですべてのライブの組織および細胞型で作成することができることを示して容易に高い中〜容易に評価することができる樹種の多様性の茎およびセカンダリでその木材の形態学的特性だけでなく、プロモーターの発現パターンは茎スループット機能的特徴。
Introduction
ツリーは、惑星のバイオマスのかなりの量を含み、巨大な、生物学、文化、商業的に重要である茎。セカンダリが他の多くの生命体のためのリソースや避難所を提供することにより、生息地を作成茎。彼らは、彼らが生息し、木材、紙パルプ及びその他の木材や非木材製品の生産のための再生可能な資源としての役割を果たす生態系に他の多くのサービスを提供します。二次茎の発達、より具体的に木材形成は、特定の細胞型の発達を調節する複雑な分子系によって支配される、生化学それらの細胞壁の組成および方法は、それらが組織および器官を形成するように配置されています。二ステム開発と木部形成の分子基盤を解剖することは内と茎の間、長い世代時間、アウト交差配偶システム、高ヘテロ接合性、高い遺伝的負荷、季節の休眠、長い木材や茎の特性のばらつきを含む多くの要因によって混乱されます成熟しました形質設立期間と成木の薄手の物理的な大きさ。その結果、植物の発達の分子制御のほとんどの他の態様の詳細な知識に二ステム開発の相対的な理解は、まだ始まったばかりです。
インビトロでの多くの技術は、特定の木材及び二次細胞壁形成、二次茎の発達を研究し、理解するために使用されています。これらのプロトコルは、トランスジェニック植物のいずれかが作成されるか、特定の二次細胞または組織は、木材及び/又は二次茎の発達1の特定の側面の研究のために形質転換された植物全体または植物の部分システムの使用を含みます。トランスジェニック植物は、植物組織および細胞型の様々なからポスト形質転換を回収することができるが、進行が遅く、特に、長い再生に木質繊維特性を分析し、（年のオーダーで）熟成時間をステムと、高い技術と労働デーマンdsは、候補遺伝子だけでなく、いくつかの木本植物種を伝播するの難しさの低いスループット。同様の技術は、正常にこれらの制限の一部を克服するシロイヌナズナなどの非木質モデルシステムが開発されているが、これらの中には存在しないすべての二次の幹細胞型は、茎および季節性または寿命に関連する特性は、種2で検討することができません。あるいは、このようなPINUのラジアータのカルス培養3などの植物部分のシステムは、関連する時間枠を減らします。これらの方法は、しかし、個々の細胞型の研究に限定し、in vitroの実験のために述べたように同様の制約を受けるています。同様に、全体の茎外植片を含む頂端幹培養液4が有望であることが示されたが、まだ特定の遺伝子または関心のプロモーターの研究のために適用されていません。より最近では、毛状根培養を伴う代替のプロトコルは、ユーカリのために開発されており、正常でした5を適用し、しかし、この方法はまだ、 試験管内の培養に必要とする二次根を伴うのではなく茎や日付には、単一の樹種に限定されています。
ここに記載されるように誘導された体細胞セクター分析（ISSA）は、木材形成および二次茎組織発達における疑わしい役割を有する遺伝子およびプロモーターのためのハイスループット機能スクリーニングツールの媒体を提供するこれらの問題のいくつかを克服するために開発されました。 ISSA労働を克服しながら、完全な二幹トランスジェニック細胞および組織を産生するのにかかる時間を短縮するために開発されたインビボでの形質転換およびスクリーニングシステムであり、日常の技術的およびスループット限界は、 インビトロの方法で使用されます。二次はグラムなしの樹種や目的の組織では、短時間で茎にここで説明するプロトコルは、独立して形質転換組織の部門や細胞の数百の同時作成を可能に比較的短い時間枠と低人件費内eneticおよび/または環境変動。 ISSA のインビボ技術は、第一及び形成層の分化に関与する遺伝子および/またはプロモーターの研究によって二次茎組織で洗練されて以来、二ステム6と芽7組織について説明したとしていたが含まれます： チューブリン （TUB）8、 ファスシクリンのようなアラビノガラクタンを （ FLA）9、 セルロース合成酵素 （CESA）10、 二次細胞壁関連NACドメイン （SND 2）11、ARBORKNOX（ARK1）12と本当に面白い新しい遺伝子 （RING）H2タンパク質13。これらの研究は、ポプラおよびユーカリ植物の茎二次で実施し、細胞形態、細胞壁の化学的性質と遺伝子発現への洞察を提供しました。
ここで説明するプロトコルは、経験aを一緒に持って来るように意図されていますND知識は、過去10年間で出版され、未発表の研究の範囲からISSAの開発と応用を通して得られました。彼らは、二次茎組織6のin vivoでの変換に焦点を当て、 ギンドロ「錐」クローン、 ユーカリグロだけでなく、11 ユーカリグロのxカマルドレンシスクローンを含む研究に専念します。この文書は、組織の植物や細菌、幹組織の変革、成長と収穫の栽培からプロトコルを介して研究者を取り、トランスジェニック細胞および組織の識別、表現型の評価およびデータの収集と分析のための方法のための準備。技術が正常にスペースの制約、また9,11を細胞壁単糖組成を測定するために適用されているが、この文書は、細胞及び組織形態学を測定し、二番目の遺伝子発現パターンを理解するために使用される技術に集中しますEMSのみ。したがって、概説されたプロトコルは、ロールおよび/または二次的に連結された遺伝子の発現へのさらなる洞察を得るためにお探しの方に適した低コスト、技術的に容易で、かつハイスループット方法に培地を用いて茎。
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Protocol
植物材料の調製
- 実験前に、種子または切断から優先樹種の新しい苗木を高め、実験のために意図された領域中の幹の直径は直径約1cmになるまでツリー/秒を育てます。
注：必要な時間は、このステップのために3ヶ月から9ヶ月の間に許可し、したがってによる植物の成長率に変更になる場合があります。
2.バイナリーベクターの作成
- アグロバクテリウム・ツメファシエンスを取り扱うことができ、実験室のために処方、その適切な個人保護具を使用する実験室や温室内でのセクション7にこのセクションから作業を行っています。
- 関心のノックダウンまたは過剰発現カセットの遺伝子およびβグルクロニダーゼ（GUS）レポーター遺伝子カセットや研究の種類に応じて、GUS遺伝子に融合した関心のプロモーターのいずれかを含むバイナリーベクターを準備します。
注：バイナリーベクターBACの数があります。商業や研究ネットワークだけでなく、バイナリーベクターに目的の遺伝子およびプロモーターを挿入するために利用可能な多数の技術を通じて調達することができkbones。このプロトコルの文脈ではバイナリーベクターを作成する方法についての決定を行うための実験者に任されています。 - A.の武装解除株にバイナリーベクターをトランスフォームエレクトロポレーションまたは熱ショック14を使用し、実験に必要とされるまで適切に保管しツメファシエンス 。
- 任意の正および/または陰性対照のための手順を繰り返し2.2。
注：陰性対照は、関心の研究と関心の研究のプロモーターのためのプロモーターをGUS遺伝子のために関心のない遺伝子を含まないバイナリーベクターを含むべきです。関心の研究のプロモーターの陽性対照は、GUSレポーターに融合されたカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（CaMV35Sプロモーター）を含むべきです。
A.の調製接種のためのツメファシエンス
- EXPERに少なくとも週前imentation、Aの少量（約1μl）を取りますツメファシエンスは、ステップ2.2と2.3の間に製造し、細菌の選択のための適切な抗生物質を含む寒天14プレートを用いて別々のLB培地上に薄く広げました。小さなコロニーを形成した後、4℃で保存するためにインキュベーター中28℃で増殖 必要になるまでCを°。
- 48時間実験前に、Aの1つのコロニーを転送独立した50ミリリットルに各プレートからツメファシエンスは、予め温めた（28℃）のLB培地14細菌の選択のための適切な抗生物質を含有するまで28℃で約48時間振とう培養器で200rpmで攪拌の5ミリリットルを含むトップチューブをねじ混合物は非常に濁っています。
- 4-6時間は、植物の接種の前に茎の間（セクション4）LB / Aの1ミリリットルを追加します新鮮な50ミリリットルにツメファシエンス混合物のための適切な抗生物質を含む新鮮な暖かい（28°C）のLB培地19ミリリットル（1：20希釈）を含むトップチューブをスクリュー細菌の選択。 600nmの（分光法によって測定されるようにOD 600）での光学密度（OD）が0.1以上である場合、これが達成されるまで、暖かいLBでさらに希釈します。
- 希釈したLB / Aを配置しますバックシェーカーインキュベーターにツメファシエンス混合し、OD 600が 0.4〜0.6と削除の間になるまで同じ条件（200 rpmで、28°C）の下に振ります。
- 遠心分離機LB / A.千×gで4℃で15分間、混合物をツメファシエンス 。
- 液体デカントし、すぐにAを再懸濁ツメファシエンスペレットの1mlをMS培地15を冷却に、2ミリリットルマイクロチューブに移し、接種（セクション4）のために必要になるまで氷上で保存します。この溶液を接種メディアと呼ばれています。
工場の4接種A.と茎ツメファシエンス
- アクティブと急速に成長形成層を持つセクション1で作成した植物を使用して、晩春か初夏の間に実験を開始します。以下のための良い診断アクティブと急速に成長して形成層は、師部が簡単に木部から剥離することができるということです。
- 植物の根元に近い幹の明確な直線部分を見つけ、任意の葉や枝を削除します。
- その後、鋭いメス（好ましくは11号）やカミソリの刃を使用して、長さが20ミリメートルの師部を介して2つの垂直の平行切開を導入することにより、ステムの明確なセクションが1cm 2 '形成層ウィンドウ」を作成し、1 5ミリメートル離れてその基端に2つの垂直カットを接続する水平カット。
- ピール切開によって作成された師部ストリップは、上向きに開発木部組織を露出し、ピペット（通常5〜10μl）を用いて露光、現像木部の表面を濡らすためにステップ3.6から十分な接種のメディアを追加します。すぐに師部ストリップを挿入します。
- パラフィルムでしっかりとステムに師部ストリップをバインドします。
- 繰り返しは関心が作成の遺伝子（複数可）またはプロモーター（複数可）のための追加の形成層の窓のための4.5に4.2ステップ1cm以上の上または下に他の形成層の窓やオフセット90°nyの新しい形成層の窓。
- 各ベクターは、実験に用いた各植物の同じ茎に付加されることを確実に完全ステップ陽性および陰性対照ベクター（ステップ2.4）4.5へ4.2。
- GUSアッセイのための幹直径定期的成長と収穫少なくとも5ミリメートルの半径方向の成長が茎で観察されている（第5節）を監視。
注：必要なラジアル成長量は、下流の分析に必要な組織の量に依存します。
GUS組織学的アッセイ5.収穫
- 物品税の任意の組織ではない形成層ウィンドウ内の新たな成長の一部を除去し、ステムから「形成層ウィンドウ」。
- 木部と師部細胞/組織形態を成熟に関する研究のために、木部からの師部の皮をむきます。
- 形成層帯が無傷またはプロモーターの発現パターンが残るために必要な研究のために評価されますedは、横方向に厚さが0.5〜1mmのディスクにカミソリの刃または他の鋭い刃を使用して形成層ウィンドウをスライス。
- 。組織が完全に水没されていることを確認し、少なくとも5分間、溶液中に残留し、すべての余分な溶液がの終わりに除去される14ミリリットル丸底試験管内で処理形成層窓組織を配置し、pHが7〜14で、0.1 Mリン酸緩衝液中で2回すすぎ第二のリンス。
- GUS試薬（0.5mMのX-Glucを（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-グルクロン酸）の5 mlを加え、10mMのEDTA、0.5％トリトンX-100 V / V、0.5 mMのカリウム。参照ホーキンスら 16）を各チューブに、フェリシアン化物（III）は、0.05ミリモルのフェロシアン化カリウム（II）、0.1 mMリン酸緩衝液pH 7で最終体積にしました。組織が完全に浸漬されていない場合は、追加のGUS試薬を加えます。
- 暗所で55℃で10分間チューブをインキュベートします。
- 暗所で37℃でシェーカーインキュベーターでさらに12-16時間チューブをインキュベート（回転数30〜60）を穏やかな攪拌を使用して混合を可能にします。
- シェーカーインキュベーターから取り出した後、ランダムにpH範囲0-7でリトマス紙を使用して、チューブの小さなサブセットでGUS試薬のpHを確認してください。
- チューブのいずれかが6未満のpHを持っている場合は、それらにラベルを付けます。 pHが6以下であれば、pHおよびラベルを確認するために、チューブの残りの部分をチェックし続けます。
注：6以下のpHを有するサンプルは、分析に適していないかもしれません。これらのサンプルは、さらなる分析から除外しなければなりません。
- チューブのいずれかが6未満のpHを持っている場合は、それらにラベルを付けます。 pHが6以下であれば、pHおよびラベルを確認するために、チューブの残りの部分をチェックし続けます。
- GUS試薬をデカントし、組織をカバーするのに十分な70％エタノールと交換してください。
- 4℃で保存必要になるまで。
トランスジェニック組織の6同定
- 鉗子を使用して、顕微鏡可視化を可能にするために、小さなトレイまたはペトリ皿内のすべての形成層窓管からの組織と場所を取ります。
- 1X及び4X倍率間の解剖顕微鏡を用いて、細胞または組織の数を特定し、集計それは明るいブルー染色を持っています。青色に染色された細胞または組織を、以降この点から、セクタと呼ばれます。次の方法でそれらをタリー。
- 師部は（ステップ5.1.1）削除されたサンプルについては、開発木部（形成層部門、 図1a）の表面に見られる形成層組織内のセクタの数を数えます。
- ディスク（ステップ5.1.2）にカットされた試料については、別の細胞または組織型（ 図1b、1C、1D）に投票された数のセクタをカウントします。セクターは、以下の組織タイプで見つけることができます：周皮（周皮部門、 図1eの ）、師部（師部部門、 図1F）、形成層組織を（形成層部門、 図1グラム 、1時間 、1I）、創傷実質（創傷柔セクター、 図1J）およびチロース中（チロース部門、 図1K）。
- 顕微鏡Aの間にディスクの両側が視聴されていることと、番号が過大評価されないように、2枚のディスク全体に発生したセクタが一致していることを確認してくださいssessment。
- 必要になるまで70％エタノールとストアを含むチューブに戻すだけの組織を含むセクタを配置します。
- 陽性および/または陰性対照を含む任意の追加の形成層の窓6.3を繰り返し手順6.1。
- 形成層の1cm 2当たりの形質転換事象の平均数を導出するために1cm 2の形成層の窓の総数でセクタの合計数を割ることによって個別の遺伝子または目的のプロモーターおよびコントロールの各セクタタイプについての平均変換効率を算出し接種（ATScm -2）。
- 形成層組織中の細胞や組織形態を評価するための技術のための7.2と8プロモーターの発現パターンとステップ7.1の分析のために、7.2または7.3に進みます。
7.分析形成層組織中の細胞や組織形態
注：以下にISSAの分析のために首尾よく使用されてきた技術の選択は、サンプルに由来します。
- 走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて、木部細胞面積、内腔面積、セル壁の厚さとセル壁面積の分析。
注：このプロトコルは、最小限のサンプル調製を必要とし、概説形態学的形質に関連するセクター分析の比較的高いスループットを可能にします。- 以降、このステップから、木質組織が処理され、処置されているときはいつでも白衣、目の保護と手袋が使用されていることを確認してください。
- 分析のための形成層のセクターを特定し、切開ディスク（ 図2a）を作成するために、単一のエッジかみそりの刃を使用して、その両側に約0.5ミリメートルを作ります。
- セクターの接線方向側に木部組織の約1ミリメートルを残して過剰木部組織を切り落とす（ 図2b）。
- 注意深いですlyが新鮮なダブルエッジのカミソリの刃（ 図2c）を使用して、部門の中心を通って横方向に切断しました。
- トランスジェニック組織（ 図2d）を画定する部門の横断面両側に二つの追加の浅い放射状切開を行います。 GUS染色は組織に深く浸透しないように形成層表面で見つかった染色された組織のいずれかの側に細胞の半径ファイルに沿います。
- SEMピンスタブの段階まで準備し形成層のセクターの顔を添付すると、SEM導電性テープ（ 図2E）を使用してマウントし、SEMの可視化のために必要になるまでデシケーター中に保管してください。
- 繰り返しは、陰性対照からのものを含む任意の追加セクタのために7.1.6に7.1.2を繰り返します。
- 低真空モードでのSEM（エネルギーが5kV、3.0 nmのスポット）を使用して、部門（ 図2F）を可視化し、セクター内の細胞/組織だけでなく、細胞/組織直接隣接の写真を撮ります。倍率の量関心のある特徴に依存しています。木部繊維の場合、2,000Xは、適切な（ 図2グラム ）です。
- 形成層セクタが可視化し、写真が適切な倍率で撮影された後、画像計測ソフトウェアを使用して、関心の木部細胞/組織の形態学的特性を測定します。
- 統計分析のために、複数のペアワイズを行うPを決定するために、各セクタのためのトランスジェニックセクターで測定形態素との差（セクタエッジ0.5 mm以内に測定）は、隣接する非トランスジェニック対照細胞/組織を比較する対応のあるt検定を用いて分析し-値。
- ネガティブコントロールのための手順を繰り返し7.1.10。
- ポジティブコントロールは低いp値（α<0.05）を示している例では、形態学的形質についてトランスジェニックおよび隣接する非トランスジェニック細胞/組織との間の差を計算します。 negatで目的の遺伝子の効果を比較するために、対応のないt検定では、この「差分値」を使用しますp値を決定するための制御をアイブ。
- 光学顕微鏡を用いて、幹細胞/組織中の形成層の細胞/組織形態又はプロモーターの発現パターンの組織化学的分析。
注：より多くの時間がかかりますが、この方法は、形成層の力学、 例えば、形成層の幅だけでなく、プロモーターの発現パターンの態様を含むより多くの分析オプションを可能にします。また、SEMにアクセスすることができない場合、この手順は、ステップ7.1のための代替として使用することができます。- 小さなブロックとしてカミソリの刃といくつかの周囲の組織を用いて目的の物品税部門（大きくない3ミリメートル 1以上）と4℃で少なくとも2日間、スクリューキャップ付きサンプルバイアル中の100％エタノール1-3ミリリットル中に直接置きますシェーカー上。ミクロトームがアクセスする関心の表面を可能にするような方法で小さなブロックを準備します。
- 陰性対照からのものを含む任意の追加セクタのために繰り返します。
- 液体を削除し、2と交換5％エタノール：条件を維持する2日間75％のLR白の混合物。
- 50％LR白、25％エタノール：75％のLRは白そして最後に二回100％のLR白と50％エタノールで繰り返し手順7.2.3。
- 短い方の端に合わせ関心の表面と金型の埋め込みに小さなブロックを置き、慎重に新鮮なLRの白でカバーし、製造業者の指示に従って重合します。
- 回転式ミクロトーム上で関心の表面から5μm切片をカットし、スライドガラス上にマウントします。細胞壁および/または他の特徴を視覚化するためにサフラニンO（0.01％）染色を使用してください。
- 、取り付けメディアを追加カバースリップを置き、一晩設定することができます。
- 100Xおよび600X倍率とキャプチャ画像との間の光顕微鏡下で見ます。
- 画像計測ソフトウェアを使用して画像から形態学的特徴をキャプチャします。
- 定量的形態学的形質の統計分析のために、ステップ7.1.10からに従ってください。
- 形態学的形質の定性分析のために、比較して、目的の遺伝子またはプロモーターと負および/または正の対照について観察されたパターンを記述します。
- 光学顕微鏡を用いて浸軟ファイバのミクロフィブリル角度（MFA）の分析。
- 部門からだけでなく、それに隣接する非トランスジェニック組織から直接消費税トランスジェニック木部組織の別々の1.5ミリリットルチューブ内及び場所（0.5ミリメートル、 図2H以内）。陰性対照からのものを含む任意の追加セクタのために繰り返します。
- 完全な手順は、ドラフト内で7.3.5に7.3.3。
- 各チューブに過酸化水素250μlの氷酢酸250μlのを追加します。
- ヒュームフード中で2時間、90℃のヒートブロックにチューブを置きます。
- チューブから組織を取り出して、慎重に少なくとも2回、蒸留水ですすいでください。
- 水溶性封入剤を使用して、スライドガラス上の組織をマウントし、カバースリップを固定する前に鋭いピンセットで離れていじめます。
- ビュー光学顕微鏡下で400倍よりも大きな倍率で個々の繊維の画像を取り込みます。
- 繊維のミクロフィブリル角度を決定するために、ピットの開口部および/または細胞壁条痕や画像計測ソフトウェアを用いた繊維（ 図2I）の長軸との間の角度を測定します。
- 統計分析のために、ステップ7.1.10からに従ってください。
8.分析プロモーターの発現パターン
- 二次茎組織におけるプロモーター発現パターンの解析。
- ステップ6.2.2で述べたように、関心のプロモーター、ならびに陽性および陰性対照のため、各セクター型の頻度をタリー。
- p値を確立するためにカイ二乗検定を使用してポジティブコントロールと利益のプロモーターのための異なるセクタタイプの頻度を比較してください。細胞/組織特異性のさらなる分析は、必要に応じてステップ7.2を用いて行うことができます。
- 複数のプロモーターの場合関心のその後関心のあるすべてのプロモーターおよび陽性対照との間に、この分析を作るの比較を繰り返し検討されています。
- セクタまたは青色の染色が陰性対照で観察されている場合は、分析にこれを追加したり、程度に応じて、または内因性の染色が疑われる場合（ 説明を参照）放棄。
- 形成層派生開発と分化中のプロモーターの発現パターンの解析。
- 解剖顕微鏡を使用して、ステップ6.2で識別されたすべての形成層のセクタ（図1グラム 、1時間 、1I）を可視化し、形成層由来3の組織型におけるブルー染色の存在/不在を決定。師部（P）は、木部（X1）または開発木部組織（X2）を開発する（ 図3a参照します ）。
- ステップ8.1.2あたりのように、int型のプロモーターのP、X1とX2の領域でGUS染色の存在/不在の頻度を比較しますp値を確立するためにカイ二乗検定を使用してポジティブコントロールとerest。細胞/組織特異性のさらなる分析は、必要に応じてステップ7.2を用いて行うことができます。
- 追加の考慮事項については、ステップ8.1.2.1と8.1.2.2を参照してください。
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Representative Results
このプロトコルを使用してすべてのライブ二幹細胞及び組織型は、Aに対して感受性であることが示されています変換ツメファシエンスと最初に形質転換された細胞の種類に基づいて、セクタの種類と、それ以降の発育成長パターンに定義されています。セクターの種類は周皮、師部、形成層、創傷実質およびチロース（ 図1b、1C、1D） が含まれ 、一貫性の場所にあります。この段落の残りの部分で説明します。周皮部門は周皮でのみ発見、決して師部（ 図1eの ）内に延びる形質転換された細胞のグループで構成されます。師部部門は、これらの周囲の組織（ 図1F）内に延びることはありません、しかし、開始層と周皮との間に様々な場所で見つけることができます。形成層のセクターはTRANから派生形質転換された木部/形成層/篩部組織から構成されています形成層の初期のsformationと3種類のパターンで発生する可能性があります：ⅰ）「フル」形成層部門、線の両方を含む師部組織への木部や形成層ゾーンを通って創傷柔組織の境界から延びる変換された木部/形成層/師部細胞と紡錘状細胞または線要素のみ（ 図1グラム ）、ⅱ）「失われた初期の「形成層部門、初期はミラー木部と師部のセクターと非形質転換開始層を残す開始層から失われた完全な形成層のセクターのバリアント（ 図1H）、及びiii）「木部だけ「形成層部門、変換された木部組織新たに形成されたxylogenic組織の中に変数の長さに巻かれた柔組織の境界から延びるが、開始層（ 図1I）に到達することはありません。創傷実質セクターは、多くの場合、半径フィルで、細胞の個々の細胞またはグループとして発見形質転換された創傷柔細胞が含まれていますエス、既存の木と新たに形成された木部組織（ 図1J）の間に位置します。既存の木の中に見つかった形質転換された血管チロースで構成されるチロースセクター（ 図1K）。
遺伝子およびプロモーター関心の研究並びにそれらのポジティブコントロールの両方のための代表的な形質転換効率のデータを表1及び表2に示す。データは、同一の遺伝子型で同期間（12年04月）にわたって行わ二つの大きな臨床試験から引き出されています木部形成遺伝子と関心の多くのプロモーターを含む2年連続全体のユーカリやポプラの。 Aに関心の研究（ 表2）、最も影響を受けやすい組織型のプロモーターから陽性対照を中心にT-DNAの転送がそれぞれ約60％とユーカリやポプラで識別されたセクタの40％と形成層組織であるツメファシエンス形成層のセクターです。他のセクターの種類すべてが5％未満にATScm -2の値を有していたユーカリでは、次の最も豊富なセクター型は35％で実質に巻かれています。セクタータイプの残りは5％以下の頻度で発見された一方でポプラでは、次の最も豊富なセクター型は15％で、師部、続いて20％で実質に巻かれています。師部ピールプロトコルは（ 表1、ステップ5.2.1）による染色のための能力と視覚化する可能性に使用される場合に形成層のウィンドウにセクターを見つけるだけでなく、識別された形成層のセクターのより多くの数のより高い可能性が典型的です形成層の全領域。
これらのプロトコルの開発中に変数の数は、プロトコルの最適化試験の一環として調査しました。これらには、細菌接種メディア内の濃度、接種メディアで使用されるメディアの種類、接種メディアにアセトシリンゴンのほか、組織の年齢およびA。ツメファシエンス株だけでなく、接種および遺伝子型の時間。形成層セクタATScm -2これらの試験からのデータが変更された場合、変数の大部分は調査した。 表3及び表4に示す形成層ATScmに変化をもたらす-2両方の種に接種中の細菌の濃度を増加させること、特に含まれていますメディア、接種メディアでのMSの使用とAの選択ツメファシエンス株 。また、接種および木の遺伝子型の時間を一緒にすべての月全体で他の人にユーカリクローンSG21とSG44はATScm -2、41.6および40.4より高い形成層を示した高いATScm -2、それぞれ比較を示す初夏に接種とユーカリで有意差が認められました。
平均形成層のセクタサイズが変化し、形成層のウィンドウで、その接線方向及び半径方向の成長量に依存しています。一つのサブで約4ヶ月間成長ポプラで53部門、のサンプルは、形成層におけるセクタの接線幅は0.09と0.27ミリメートルの平均で0.58ミリメートルの間で変化させながら、1.35の平均で0.7〜2.2ミリメートルの範囲であった形成層の窓を横切って放射状成長ミリメートル。組み合わせると、これらは0.063ミリメートル2および分析のためのトランスジェニック組織の1.276ミリメートル2との間に設けられました。形成層のウィンドウ全体のラジアル成長1.5~4ミリメートルであるが、約5ヶ月間の観察された同じ種で188セクタの別のサブサンプルでは、平均的なセクターの質量は72μgの（ 表5）でした。
作成されたトランスジェニック組織の量は、形態学的測定を行うだけでなく、プロモーター活性の研究のためにするのに十分な細胞および/または組織を提供することが示されています。たとえば、3 ユーカリの影響は木部繊維の形態学的形質9だった元の数にのFLAグランディスユーカリクローンでploredとセルサイズの決意（ 表6）にMFAの決意とEgrFLA1にEgrFLA2のための可能な役割を明らかにしました。また、 ユーカリの発現パターンは、現像木部（X1）でCESA遺伝子プロモーター、開発木部（X2）と師部（P）をグランディス EgrCESA1、2、3、及びEgrCESA4、5、7と10同定有意に異なる発現パターンを組織しますユーカリに茎。 3は、主EgrCESA4、5ながら木部組織の開発に発現することが示された。この分析では、EgrCESA1、2は 、7は、現像木部と師部組織（ 図3B、 表7）の両方で発現されることが示されました。すべてEgrCESAプロモーターは、陽性対照（たCaMV35Sプロモーター）（ 表7）に有意に異なる発現パターンを示しました。
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図1： トランスジェニックセクタータイプ （a）は、師部ピールプロトコル（ステップ5.2.1）を使用して処理した後、露出した木部の表面に見られるように形成層のセクター。ポプラでの横断面上のセクタの種類の範囲を示すディスク（b）およびユーカリ（c）は 、横方向の切断プロトコル（ステップ5.2.2）を使用して処理した後に生じます。植物に見出される（D）セクタタイプの範囲の概略図で生じます。周皮部門（E）の例として、師部セクター（f）は 、「フル」形成層部門（ グラム ）、「失われた初期の「形成層部門（H）、「木部のみ」形成層のセクター（I）、創傷実質部門（j）およびポプラにおけるチロースセクター（K）。小さいサイズのセクタが配置されている場所黒い矢印が示しています。すべてのスケールバー= 1ミリメートル。ジル/ ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：SEMと光学顕微鏡を用いて形態素解析のための形成層セクターの調製 （a）のディスクを含むセクターの切除。 （b）のディスクは、過剰な組織を除去するためにトリミング。トランスジェニックセクターの（c）の横断面を切断。支援するために、2つのラジアルカットの（d）のご紹介 SEMの下でトランスジェニック組織を見つけるインチ導電性テープを使用して、SEMピンに搭載された（e）の組織。 （f）を分析のために画像化されるべきであるトランスジェニックおよび非トランスジェニック組織の領域の描写。 （ グラム ）2,000X倍率で撮影し木部繊維および線細胞の典型的なイメージ。 （H （I）ピットおよび/または細胞壁縞の角度を示す光学顕微鏡下で細胞の長軸に見浸軟繊維。黒い矢印は、ピットの開口部を示しています。スケールバー= afが、H = 1ミリメートルは、gは、私が20μmを=。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 分析と形成層誘導体の遺伝子プロモーターの発現パターンの結果 P（師部）、X1（現像木部）とX2（開発木部）領域の（a）の描写。 （b）の結果は、CESAの範囲を含む試験から形成層部門のP、X1とX2染色の割合を示しますユーカリ由来のプロモーターは、形質転換グランディス 。 Creux ら 10から供給されたデータ。 n =評価のセクタ数。スケールバー= 0.5ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 樹種 | ベクトル型 | 関心対象の遺伝子の数を使用します | 作成されたウィンドウの総数 | セクターが同定されたウィンドウの合計数（％） | 形成層ATScm -2形成層（セクタが同定されたウィンドウで） |
| グロブルスユーカリののxカマルドレンシスハイブリッド（3クローンの合計） | 陽性コントロール（目的の遺伝子） | 1（GUSのみ） | 96 | 97％ | 45.1（1.5） |
| 目的の遺伝子 | 20 | 630 | 92％ | 46.1（2.2） | |
| ギンドロ「錐」 | 陽性コントロール（目的の遺伝子） | 1（GUSのみ） | 110 | 74％ | 10.8（1.5） |
| 目的の遺伝子 | 20 | 700 | 81％ | 14.6（0.8） |
表1：代表的な形成層ATScm -2 陽性コントロールと目的の遺伝子の数値は、遺伝子の範囲と師部の剥離収穫プロトコル（ステップ5.2を使用して、同じユーカリやポプラのクローンで2年連続かけて行われた研究から供給されています。 1）。括弧内の標準的なエラー値。</ P>
| 樹種 | ベクトル型 | プロモーター/遺伝子の数 | 作成されたウィンドウの総数 | セクターが同定されたウィンドウの合計数（％） | ATScm -2すべてのセクター | ATScm -2周皮 | ATScm -2師部 | ATScm -2形成層 | ATScm -2創傷柔 | ATScm -2チロース |
| グロブルスユーカリのx camal- dulensisハイブリッド（3クローンの合計） | 陽性対照 | <TD> 1（GUSのみ）118 | 63％ | 25.74（2.35） | 0.24（0.07） | 0.89（0.19） | 15.7（1.71） | 8.84（1.4） | 0.07（0.03） | |
| 興味のプロモーター | 28 | 1050 | 31％ | 14.67（1.77） | 0.02（0.01） | 0.05（0.01） | 13.79（1.75） | 0.78（0.21） | 0.03（0.01） | |
| ギンドロ「錐」 | 陽性対照 | 1（GUSのみ） | 110 | 54％ | 12.37（1.77） | 0.22（0.07） | 1.85（0.29） | 5.07（0.6） | 2.78（0.75） | 0.29（0.53） |
| 興味のプロモーター | 28 | 990 | 26％ | 8.28（1.18） | 0.16（0.04） | 0.9（0.09） | 6.67（1.16） | 0.27（0.07） | 0.28（0.11） |
表2：典型的なセクターATScm -2 陽性対照と関心のプロモーターの数値は、プロモーター配列およびディスクの収穫プロトコル（ステップ5.2の範囲を使用して、同じユーカリやポプラのクローンで2年連続かけて行われた研究から供給されています。 2）。 ATScm -2の値は、セクタがのみ確認された窓から誘導されました。括弧内の標準的なエラー値。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 種 | トライアル | 治療の説明 | 治療中のウィンドウの数 | |
| ユーカリグロ | 接種メディアでのA. tumefaciensの濃度 | 25ミリリットルのMSに再懸濁 | 10 | 1.4（0.62） |
| 5mLのMSに再懸濁 | 10 | 1.6（0.72） | ||
| 1ミリリットルのMS（コントロール）に再懸濁 | 10 | 2.4（1.16） | ||
| 接種メディアでのメディアの種類 | ポンド | 10 | 0.4（0.22） | |
| MS（コントロール） | 10 | 2.4（1.16） | ||
| 接種メディアへのアセトシリンゴンの追加 | アセトシリンゴンと | 11 | 0.9（0.37） | |
| アセトシリンゴン（コントロール）なし | 11 | 0.6（0.64） | ||
| 接種した幹組織の時代 | 6ヶ月（制御リットル） | 11 | 1.1（0.66） | |
| 18ヶ月 | 11 | 1.8（0.95） | ||
| A.ツメファシエンス株 | AGL1（コントロール） | 18 | 0（0） | |
| C58 | 18 | 0.1（0.1） | ||
| LBA4404 | 18 | 0.6（0.4） | ||
| ギンドロ「錐」 | メディアでのA. tumefaciensの濃度 | 25ミリリットルのMSに再懸濁 | 10 | 2.2（0.55） |
| 5mLのMSに再懸濁 | 10 | 2.7（0.63） | ||
| 1ミリリットルのMS（コントロール）に再懸濁 | 10 | 5.1（1.58） | ||
| メディアタイプは、幹接種のために使用さ | ポンド | 10 | 2.8（0.71） | |
| MS（コントロール） | 10 | 5.1（1.58） | ||
| 接種メディアへのアセトシリンゴンの追加 | アセトシリンゴンと | 11 | 0.3（0.14） | |
| アセトシリンゴン（コントロール）なし | 11 | 0.5（0.25） | ||
| 接種した幹組織の時代 | 6ヶ月（コントロール） | 11 | 1.5（0.33） | |
| 18ヶ月 | 11 | 1.5（0.63） | ||
| A.ツメファシエンス株 | AGL1（コントロール） | 20 | 8.1（2） | |
| C58 | 20 | 12.5（2） | ||
| LBA4404 | 20 | 11.1（2） |
表3：形成層ATScm -2 プロトコル最適化トレイルの一部として検討変数の範囲の値。変数はポプラクローンと提示形成層ATScm -2データと年数全体のユーカリグロ個体の範囲で検討しました。形成層の窓は、ディスクの収穫プロトコル（ステップ5.2.2）を使用して回収しました。括弧内の標準的なエラー値。
| グロブルスユーカリの X カマルドレンシスのクローンID | 各月の形成層ウィンドウの数 | 形成層ATScm -2下旬春（11月）接種 | 形成層ATScm -2初夏（12月）接種 | 形成層ATScm -2ミッドサマー（1月）接種 | 形成層ATScm -2晩夏（2月）接種 | 形成層ATScm -2初秋（月）接種 | 形成層ATScm -2組み合わせたすべての月 |
| SG5 | 10 | 15.7（7.8） | 50.7（13.7） | 10.5（5.1） | 30.7（4.4） | 16.8（6.3） | 24.9（4.3） |
| SG6 | 10 | 6.1（3.1） | 38.5（15.1） | 4.5（1.7） | 14.5（3.3） | 27.6（8.4） | 18.3（4） |
| SG13 | 10 | 28.4（6.7） | 41.8（9.1） | 16.1（7） | 29.3（5.2） | 19.8（4.3） | 27.1（3.1） |
| SG18 | 10 | 6.7（2.9） | 18.3（6.7） | 17.4（3.4） | 19.2（6.1） | 18.1（6.3） | 15.5（2.4） |
| SG21 | 10 | 38.7（14.3） | 77（17.5） | 23.9（5.7） | 27.5（6.9） | 40.7（13.5） | 41.6（6） |
| SG35 | 10 | 23.5（10.2） | 42.8（12.2） | 7.6（2.5） | 17.6（4.3） | 31.3（4.6） | 24.6（3.8） |
| SG37 | 10 | 19.7（8） | 55.2（14.5） | 7.4（1.8） | 35（10.4） | 15.9（4.5） | 26.6（3.8） |
| SG39 | 10 | 12.5（2.4） | 23.6（6.3） | 6.9（3） | 26.3（8.1） | 7.3（2.3） | 15.5（2.6） |
| SG40 | 10 | 24.8（11） | 24.5（6.8） | 14（5.6） | 35.6（6.1） | 19.9（4.2） | 23.8（3.2） |
| SG44 | 10 | 22.3（3.4） | 63（29.3） | 9.8（2.6） | 52.5（10.3） | 54.3（15） | 40.4（7.4） |
| SG46 | 10 | 15.3（5.2） D> | 63.9（20.1） | 23.6（4） | 22.5（4.8） | 17.4（4.9） | 28.5（5.1） |
| 月刊形成層ATScm -2 | 19.9（5） | 45.3（9.1） | 12.6（2.8） | 27.8（4.5） | 24（5.1） |
表4：形成層ATScm上接種の遺伝子型と時間の影響 -2 ユーカリクローン内の 10個の窓はすべての月に収穫した10種類のユーカリグロののxカマルドレンシスクローンに生育期間にわたって毎月導入されました。月次データは全体の月平均および遺伝子型ATScm -2も提示で各遺伝子型のために提示されています。形成層の窓は、師部の剥離収穫プロトコル（ステップ5.2.1）を使用して回収しました。括弧内の標準的なエラー値。エス/ ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 植物番号 | 切除された形成層のセクタ数 | すべてのセクターの総質量（μgの） | セクターの平均質量（μgの） |
| 1 | 11 | 750 | 68 |
| 2 | 19 | 1460 | 77 |
| 3 | 21 | 160 | 8 |
| 4 | 26 | 4460 | 172 |
| 5 | 15 | 1320 | 88 |
| 6 | 22 | 2490 | 113 |
| 7 | 19 | 1720 | 91 |
| 8 | 30 | 830 | 28 |
| 9 | 25 | 360 | 14 |
| 合計 | 188 | 13550 | 72 |
表5：形成層セクターの典型的な質量 9工場全体で45の窓は、セクターの平均質量を決定するために、ポプラで調査し、ディスクの収穫プロトコル（ステップ5.2.2）を使用して回収しました。植物は、5ヶ月間培養し、形成層のウィンドウ全体の径方向の成長は、1〜4ミリメートルでした。
| morpho-の異形 学的特性 | GUSのみ（ポジティブコントロール） | 非トランスジェニック組織（GUSのみ） | P値 | インタレスト1の遺伝子（FLA1） | 非トランスジェニック組織（FLA1） | P値 | インタレスト2の遺伝子（FLA2） | 非トランスジェニック組織（FLA2） | P値 | インタレスト3の遺伝子（FLA3） | 非トランスジェニック組織（FLA3） | P値 |
| 平均細胞壁厚み（μm）* | 1.81（0.1） | 1.65（0.1） | 0.2692 | 1.47（0.14） | 1.55（0.12） | 0.6403 | 1.65（0.13） | 1.78（0.13） | 0.4839 | 1.59（0.12） | 1.63（0.11） | 0.8254 |
| 平均細胞壁面積（μm2で）* | 69。1（4.74） | 60.7（2.03） | 0.1229 | 64.1（15.68） | 59.9（9.79） | 0.5004 | 61.6（3.4） | 65（3.96） | 0.5182 | 61.9（3.56） | 61.5（3.16） | 0.9438 |
| 平均セル面積（μm2で）* | 115.9（11.01） | 99.9（5.1） | 0.2041 | 124.4（6.1） | 108（4.36） | 0.0445 | 110.8（8.45） | 111.3（9.06） | 0.9671 | 108.5（4.43） | 103（3.07） | 0.3204 |
| 平均ルーメンエリア（μmの2）* | 46.9（7.55） | 39.2（4.89） | 0.407 | 60.2（5.28） | 48.1（4.46） | 0.0991 | 49.2（7.56） | 46.3（7.5） | 0.7882 | 46.6（3.31） | 41.5（3.9） | 0.3264 |
| 平均ミクロフィブリル角度（O）＃ | 24.3（0.75） | 24.2（0.45） | 0.8648 | 22.3（0.82） | 22.7（0.7） | 0.5664 | 23.7（0.55） | 26.6（0.5） | 0.0001 | 26（0.88） | 27.2（0.72） | 0.0903 |
表6：ISSA繊維形態の測定は、対象の試験の遺伝子に由来する繊維細胞壁、細胞の大きさとグロブルスユーカリ第Xカマルドレンシスクローンから供給ジェニック繊維から採取MFA測定値の比較は、 ユーカリで形質転換された茎のFLA（EgrFLA1、2、3）とは、 グランディス隣接する非トランスジェニック対照繊維とポジティブコントロール（のみGUS）。マクミランら 9から供給されたデータ。 * TOT（裁判は10部門で10の繊維の測定を関与を示します100繊維のアル）。 ＃は、試験は20セクタ（100繊維の合計）で5繊維の測定を関与を示しています。 α<0.05太字で示す。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| EgCESA1 | EgCESA2 | EgCESA3 | EgCESA4 | EgCESA5 | EgCESA7 | GUSのみ（ポジティブコントロール） | |
| EgrCESA1 | 0.708 | 2.839 | 8.856 | 9.976 | 9.18 | 29.165 | |
| EgrCESA2 | 1.11 | 12.008 | 11.363 | 30.234 | |||
| EgrCESA3 | 15.151 | 16.123 | 15.488 | 37.791 | |||
| EgrCESA4 | 4.852 | 0.108 | 46.858 | ||||
| EgrCESA5 | 3.275 | 11.278 | |||||
| EgrCESA7 | 36.082 | ||||||
| GUSのみ（ポジティブコントロール） |
表7：ホーチミン 形成層誘導体中のプロモーターの発現パターンの比較から導き出さ 2 値形成層誘導体のP、X1とX2の領域でのGUS染色の存在/不在を比較するカイ2分析。 6 ユーカリ間CESA遺伝子プロモーター配列（EgrCESA 1、2、3、4、5、7）および陽性対照（のみGUS）をグランディス 。 Creux ら 10から供給されたデータ。 α<0.05を下線で示します。
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Discussion
ISSAプロトコルは、木材に関わる目的の遺伝子およびプロモーターの分析のため、数ヶ月の空間における樹種におけるトランスジェニック幹組織を作成するための比較的単純かつ効率的な方法であり、形成を生じます。少しの努力は、生きている植物を保つことを超えて、大規模な培養は、組織または植物を維持するために必要とされる木材生産を開始する年まで取ることができる場所や、真のin vitroの方法とは対照的に立っているトランスジェニック幹組織次の接種を成長させるために必要とされます二ステムは1を作成されません。 ISSAもあれば、最適化が必要であり、ここで、非常に少ない（データは示していない） ポプラ 、 ユーカリおよびマツ 6の属だけでなく、 アカシアとCorymbiaで種を含む樹種の広い範囲に適用可能であることが示されていますトランスジェニック組織を導き出します。この方法を使用して、数値Oを調査することが可能ですF遺伝子または関心のほとんどの種への関心のプロモーター。さらに、プロトコルは、より広く、複数の遺伝子が、インビトロの方法でより複雑に前方に取る可能性のある候補を識別するために、まず第一にISSAを用いて調べることができるインビトロ技術に使用されると、それ自体で、または組み合わせて使用することができます。
記載の実施例は、十分なセクタが、トランスジェニック形成層の窓の少数の下流に分析を行うために作成することができることを示しています。 ATScmで-2ポプラ1つまたは2つだけ形成層ウィンドウでユーカリで46.1と14.6の値は、単一の植物の茎に多数のウィンドウを追加したり、多数の植物で複製することが可能であるように、単一の形質を調査するのに十分であろう。しかしながら、実際には、すべての形成層ウィンドウセクタのサイズを変えることができるように、それらは、一般的に小さい（ 表1、 表2参照）を利用することができる形成層セクタの生成につながりませんそしてケースの下流の分析のためのそれらの使用を制限し、互いに近接して配置することができます。また、目的の遺伝子は、細胞生存率12または潜在的に関心のある特定の遺伝子についてトランスジェニックセクタの完全な非存在下で得られた細胞発達の他の側面に影響を与えることができます。常に分析のために必要となる可能性があるよりも、窓の大きい数を目指すことをお勧めです。かなりのばらつきがある場合（ 表2）で観察された/少し弱いかまたは全く発現に期待することができるようなプロモーターの研究のためのISSAを使用した場合、同様の注意が適用されるべきです。しかし、セクタ数が少ない、6のように少ないが、うまく分析10のために使用されることが示されています。これらの結果は、ウィンドウの少数を含む非常にささやかな実験は、遺伝子機能及びプロモーター活性に重要な洞察をもたらすことができることを示しています。
トランスジーンの分析の観点から、近接ICおよび非トランスジェニック組織は、目的の遺伝子間の形質の小さいが、意味の違いを識別するための強力なツールを提供します。互いに直接隣接してサンプリングした細胞及び組織は、同じ遺伝子型のバックグラウンドであり、独立変数の数を減らし、必要な統計分析を単純化する同じ環境条件によって影響されています。サンプリングの観点から、ISSAの電力解析は、複数の実験（ 例えば、 表6）のデータの由来、その小さなセクタあたりの測定回数、 例えば、セクタ当たり3~5の細胞の細胞壁の厚さ、及び多数の測定を示していますセクタ、 例えば、目的の遺伝子のための20から25のセクターは、より効率的かつ統計的に堅牢なサンプリング戦略を提供します。各セクタは独立した形質転換事象または複数の形質転換事象の平均効果を決定着手統計解析を用いた細胞の「行」を表し、目的の遺伝子を含みます。同様に、すべての幹の組織を変革する能力は、形成層の分化の間に、より具体的に全体の茎と全体の利益のプロモーターの発現を研究する機会を提供します。ここで説明ISSAプロトコルは、組織や細胞形態およびプロモーターの発現パターンのためのデータのサンプル、収集と分析の収穫に至るまで、トランスジェニック組織の作成から、信頼性および検証パイプラインを提供します。
ほとんどの場合、セクタは、細胞分裂を介して誘導体の細胞および組織の数に上昇を与えていることができる単セルの形質転換の結果です。例えば、形成層のセクターは、創傷回復が順番に師部に元の創傷からのすべての方法を拡張する部門を作成するpericlinallyとanticlinally分割形成層の初期になる投稿単一細胞の形質転換から生じます。これらのケースでは、変換された初期には維持されました形成層内の収穫の時間と 'フル'バリアント 'は、その後、この初期ラジアル成長中に形成層の層から失われ、「細胞浸潤'を介して、非形質転換隣接セルによって置き換えられている場合、しかし、観察されるまで失われた初期の「変異体は、結果になります。オーダーセクタータイプの正確な分類を確保するため、結果の解釈を支援するために、強く、二次ステム開発の解剖学的特徴と習熟し、創傷応答がISSA結果の分析のための前提条件にすることをお勧めします。また、GUSの試薬のpHの定期的なテストは（ステップ5.6参照）をお勧めします。低pH（ 例えば、6以下）部門の真の範囲をマスクまたは偽陽性の同定につながることができ、植物の茎中の内因性βグルクロニダーゼ（GUS）の活性化につながることができます。これが疑われる場合、これらのサンプルはさらなる分析から除外することをお勧めします。 GUS試薬プロトコル確実に16（2002）。内在性のGUS活性の潜在的な問題は、ホーキンスらから適応させた緩和するためにここで概説研究に適用され、55で2 pH7にサンプルを平衡化するために、リン酸緩衝液でリンスし、熱処理などの追加の重要なステップを利用O℃で10分間、内因性のGUS活性17,18を不安定にします。 GUS試薬透過性も限られており、師部剥離プロトコルに比べて横ディスクプロトコルを用いて同定される少数のセクタを担当します。
試用すべての種は、形成層組織の形質転換に感受性であることが示されています。しかし、ATScmに有意差-2の間の属および種内の両方が観察されています。 A.の同様の歪みツメファシエンスと時間/接種のシーズンはATScmに影響を与えることができ-2。特異で、これらの変数のいくつかの予備試験を行っていることが示唆されていますプロトコルの大規模導入に先立って調査中のESおよび遺伝子型。理論的にはどのISSAは限り活発に増殖して形成層があるとして適用することができるために茎の年齢やサイズに制限はありません。しかし、トランスジェニック組織セクターの下流の処理を容易にするために、それが推奨され接種は、約1cmの直径の茎。
ISSAはその限界がないわけではありません。トランスジェニック組織セクターの比較的小さいサイズは、現在、下流の表現型の方法を制限し、その結果、そのような方法の限定された数は、日常的に今日まで用いられてきました。導入9,11に記載されているように、これらのメソッドの主な目的は、上記で概説したように形態学的特徴に焦点を当てただけでなく、二次細胞壁における単糖組成物の半定量的推定されています。生物学的材料の微細な規模解析のための新技術の出現と洗練された追加の表現型を開発するための更なる可能性がありますISSAのセクターのためのパイプライン、細胞壁組成分析で、例えば。それは、セクターによって定量的、部門を実行するために、しかし、依然として困難であるリボ核酸（RNA）ベースの遺伝子発現やタンパク質の研究および/またはISSAを特定し、伝播GUSアッセイの破壊的な性質による追加的な分析のためのin vitroでの培養を通してトランスジェニック細胞を導出。いくつかの蛍光レポーター遺伝子および組織の印刷は、個々のセクタからのRNAを定量するために試用されているが、今日まで、これらのアプローチは、正常通常運転中の高スループットスクリーニングに媒体として使用されていません。さらに、RNAiのような日に試用ないトランスジェニック技術は、GUS発現および標的遺伝子のダウンレギュレーションは、共局在をしないことがあり、分析を複雑にする可能性があります。
いくつかの現在の制限がありますが、新興技術や分析方法の組み込みは、さらにISSA Aの役割を高め、これらの制限を克服する可能性があります形成層分化の複雑な分子の性質を解剖するための高スループットのプロトコルへのsa媒体、木材の開発および形成を生じます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no. 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide(III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| ImageJ imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
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