Abstract
Sekundær stilk vekst i trær og tilhørende tre dannelse er betydelig både fra biologiske og kommersielle perspektiver. Men relativt lite er kjent om den molekylære kontroll som styrer deres utvikling. Dette er delvis på grunn av fysisk, ressurs og tid begrensninger ofte forbundet med studiet av sekundære vekstprosesser. Et antall in vitro-teknikker har blitt anvendt og som involverer enten plante del eller hele anlegget system i både treaktig og ikke-treaktige plantearter. Imidlertid spørsmål om deres anvendbarhet for studiet av sekundære stammen vekstprosesser, recalcitrance av visse arter og arbeidskraft intensitet er ofte prohibitive for middels til høy gjennomstrømning. Også når vi ser på videregående stammen utvikling og tre formasjon de spesifikke egenskaper under etterforskning kan bare bli målbar sent i et tre livssyklus etter flere år med vekst. I møte disse utfordringene alternativ in vivo protocols har blitt utviklet, kalt Induced Somatic Sector Analysis, som innebærer etablering av transgene somatiske vev sektorer direkte i anlegget sekundære stammen. Målet med denne protokollen er å gi en effektiv, enkel og relativt rask måte å lage transgene sekundære plantevevet for gen og formidler funksjonell karakterisering som kan benyttes i en rekke treslag. Resultatene som presenteres her viser at transgene sekundære stilk sektorer kan opprettes i alle levende vev og celletyper i videregående stammer fra en rekke treslag og at tre morfologiske trekk samt promoter uttrykk mønstre i videregående stammer lett kan vurderes å legge til rette medium til høy gjennomstrømming funksjonell karakterisering.
Introduction
Tre stammer utgjør en betydelig del av planeter biomasse og er av enorm biologiske, kulturelle og kommersielle betydning. Sekundær stammer skape habitat ved å gi ressurser og ly for mange andre livsformer. De leverer mange andre tjenester til de økosystemene de lever og virker som en fornybar ressurs for produksjon av tømmer, cellulose og papir og andre treprodukter og ikke-treprodukter. Sekundær stilk utvikling og nærmere bestemt tre dannelse er styrt av komplekse molekyl system som regulerer utvikling av spesifikke celletyper, den biokjemiske sammensetningen av deres cellevegger, og hvor de er anordnet for å danne vev og organer. Dissekere molekylære grunnlaget for sekundær stilk utvikling og tre dannelse er forvirret av mange faktorer, inkludert variasjonen av tre og stilk eiendommer i og mellom stammer, lange generasjonstid, out-krysset parbindingssystem høy heterozygositet, høy genetisk belastning, sesong dormancy, lang modenegenskap etablering perioder og selve fysiske størrelsen på trær. Som et resultat, forståelse av sekundær stammen utvikling i forhold til den inngående kunnskap om de fleste andre aspekter av den molekylære kontroll av planteutvikling, er fremdeles i sin barndom.
Et antall in vitro-teknikker er blitt brukt til å studere og forstå sekundære stammen utvikling, spesielt tre og sekundærcelleveggen formasjonen. Disse protokoller involverer bruk av hele planten eller plantedeler systemer, hvor enten transgene planter som er skapt eller bestemte sekundære celler eller vev blir transformert for studier av spesifikke aspekter av tre og / eller sekundære stilk utvikling 1. Transgene planter kan gjenopprettes stolpe genetisk transformasjon fra et bredt utvalg av plantemateriale og celletyper, er imidlertid fremgang langsom, spesielt ved analyse av tre fiber egenskaper på grunn av lang regenerering og stammen modningstider (av størrelsesorden på flere år), høy teknisk og arbeidskraft demands, lav gjennomstrømning av kandidatgener, så vel som vanskeligheter med å spre noen treaktig plantearter. Lignende teknikker er blitt utviklet i ikke-treaktig modellsystem slik som Arabidopsis som på en vellykket overvinne noen av disse begrensningene, men ikke alle sekundære stilk celletyper en til stede i disse stengler og egenskaper relatert til sesongvariasjoner eller levetid kan ikke bli studert i slike arter 2. Alternativt, plante del systemer, for eksempel Pinu s radiata callus kulturer 3 redusere de tilhørende tidsrammer. Disse fremgangsmåter er imidlertid begrenset til studiet av en individuell celle type og lider lignende begrensninger som nevnt for in vitro eksperimenter. Tilsvarende har apikale stilk kulturer 4 innebærer hele stilk explants vist lovende, men som ennå ikke har blitt anvendt for å studere spesifikke gener eller arrangører av interesse. Mer nylig har en alternativ protokoll som involverer hårete bakenfor kulturer blitt utviklet for eucalypts og har vært vellykketanvendt 5 imidlertid fremdeles krever denne metode in vitro dyrking, omfatter sekundære røtter i stedet for stengler, og hittil er det begrenset til en enkelt treslag.
Indusert somatisk sektor analyse (ISSA), som beskrevet her, ble utviklet for å overvinne noen av disse problemene ved å gi en middels til høy gjennomstrømming funksjonelle screeningverktøy for gener og arrangører med mistanke roller i tre dannelse og utvikling sekundær stilk vev. Issa er en in vivo transformasjon og screening system som ble utviklet for å redusere den tid det tar å fremstille transgene celler og vev i et intakt sekundærspindelen mens overvinne arbeidskraft, tekniske og throughput begrensningene som rutinemessig anvendes in vitro metoder. Protokollene er beskrevet her tillate samtidig etableringen av hundrevis av uavhengig forvandlet vev sektorer og celler i videregående stammer innenfor en kort tidsperiode, i treslag og vev av interesse uten genetic og / eller miljøvariasjon innenfor relativt korte tidsrammer og lave arbeidskraftkostnader. Issa in vivo teknikker ble først beskrevet for sekundær stilk 6 og knopp 7 vev og har siden blitt videreutviklet i videregående stammen vev gjennom studier av gener og / eller arrangører involvert i cambial differensiering og inkluderer: tubulin (TUB) 8, fasciclin lignende arabinogalaktan ( FLA) 9, cellulose syntase (CESA) 10, sekundær cellevegg-forbundet NAC domene (SND2) 11, ARBORKNOX (ark1) 12 og virkelig interessant nytt gen (RING) H2 protein 13. Disse studiene ble gjennomført i videregående stammer av poppel og eucalypt planter og gitt innsikt i celle morfologi, celleveggen kjemi og genuttrykk.
Protokollene er beskrevet her er ment å bringe sammen opplevelsennd kunnskap gjennom utvikling og anvendelse av ISSA fra en rekke publiserte og upubliserte studier løpet av det siste tiåret. De fokuserer på in vivo transformasjon av sekundære stamceller 6 og konsentrere seg om studier av Populus alba 'pyramid' klone, Eucalyptus globulus samt 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis kloner. Dette dokumentet tar forskerne gjennom protokollen fra dyrking av planter og bakterier, transformasjon av stamceller, vekst og innhøsting av vev, identifisering av transgene celler og vev, forberedelse for fenotypiske vurderinger og metoder for innsamling og analyse av data. Mens teknikker har med hell blitt brukt til å måle celleveggen monosakkarid sammensetningen også 9,11, på grunn av plassbegrensninger, konsentrerer dette dokumentet på teknikker som brukes for å måle celle og vev morfologi og forstå genutrykksmønster i videregående stEMS bare. Følgelig protokollen som skissert er egnet til de som ønsker å få ytterligere innsikt i hvilken rolle og / eller uttrykket av gener knyttet til videregående stilkene ved hjelp av en lav pris, teknisk lett, og middels til høy gjennomstrømning metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av plantemateriale
- Før eksperimentering, heve nye frøplanter av de foretrukne treslag fra frø eller skjæring og vokse tre / s inntil diameteren av stammen i området beregnet for eksperimentering er omtrent 1 cm i diameter.
Merk: Den tiden som trengs kan variere på grunn av plantevekstrater derfor tillate mellom tre og ni måneder for dette trinnet.
2. Binary Vector Creation
- Gjennomføre arbeidet fra denne delen av § 7 i et laboratorium eller drivhus hvor Agrobacterium tumefaciens kan håndteres og at nødvendig verneutstyr foreskrevet for laboratoriet er brukt.
- Fremstille en binær vektor inneholdende enten et gen av interesse knockdown eller overekspresjon kassett og en β-glukuronidase (GUS) reporter gene kassett eller en promoter av interesse fusjonert til en GUS-genet avhengig av typen av studien.
Merk: Det er en rekke av binære vektor backbones som kan være hentet kommersielt eller gjennom forskernettverk samt en rekke teknikker for å sette inn gener og arrangører av interesse til binære vektorer. I sammenheng med denne protokollen er opp til eksperimentator å ta beslutningen om hvordan du oppretter en binær vektor. - Transform binær vektor inn i en avvæpnet stamme av A. tumefaciens ved hjelp av elektroporering eller varmesjokk 14 og lagre hensiktsmessig inntil nødvendig for eksperimentering.
- Gjenta trinn 2.2 for alle positive og / eller negative kontroller.
Merk: Negative kontroller bør omfatte en binær vektor som ikke inneholder genet av interesse for et gen av interesse studie og en promoterless GUS for en formidler av interesse studien. Positiv kontroll for en formidler av interesse studien bør inkludere en Blomkål Mosaic Virus 35s promoter (CaMV35s) smeltet til en GUS reporter.
3. Fremstilling av A. tumefaciens for Inoculation
- Minst en uke før experimentation, ta en liten mengde (ca. 1 ul) av A. tumefaciens fremstilt under trinn 2,2 og 2,3 og spredd tynt på separate LB-medium med 14 agar plater inneholdende egnede antibiotika for bakteriell valg. Grow ved 28 ° C i en inkubator for å danne små kolonier og deretter lagre ved 4 ° C inntil nødvendig.
- 48 timer før eksperimentering, overføre en koloni av A. tumefaciens fra hver plate i separate 50 ml skrukork-rør inneholdende 5 ml forvarmet (28 ° C) LB-media 14 inneholdende egnede antibiotika for bakteriell utvalg og agitere ved 200 rpm på en risteinkubator i omtrent 48 timer ved 28 ° C inntil blandingen er svært uklar.
- Mellom 4-6 timer før inokulering av anlegget stammer (seksjon 4) tilsett 1 ml LB / A. tumefaciens blandingen til en frisk 50 ml skrukork inneholdende 19 ml (1:20 fortynning) av frisk varm (28 ° C) LB-medium med egnede antibiotika forbakteriell utvalg. Hvis optisk tetthet (OD) ved 600 nm (OD 600, målt ved spektroskopi) er over 0,1, fortynnes ytterligere med varm LB inntil dette er oppnådd.
- Plasser utvannet LB / A. tumefaciens blandingen tilbake for rysteinkubator og riste under de samme betingelser (200 opm, 28 ° C) inntil OD600 er mellom 0,4-0,6 og fjerne.
- Sentrifuger LB / A. tumefaciens blandingen i 15 minutter ved 1000 xg og 4 ° C.
- Dekanter væske og umiddelbart suspendere A. tumefaciens pellet i 1 ml avkjølt MS media 15, overføring til 2 ml mikrorør og lagre på is inntil nødvendig for vaksinasjon (§ 4). Denne løsning refereres til som Inokulering Media.
4. Inokulering av Plant Stem med A. tumefaciens
- Begynn eksperimentering i løpet av våren eller tidlig sommer å bruke planter som er opprettet i § 1 som har en aktiv og raskt voksende cambium. En god diagnostisk for enaktiv og raskt voksende cambium er at barken lett kan skrelles fra Margen.
- Finne en klar rett seksjon av stammen nær bunnen av anlegget og fjerne eventuelle blader og grener.
- Ved hjelp av en skarp skalpell (fortrinnsvis No. 11) eller barberblad, skape en 1 cm 2 'cambial vindu "i en klar del av spindelen ved å innføre to vertikale parallelle innsnitt gjennom barken på 20 mm i lengde og en 5 mm fra hverandre så en horisontalt kutt som forbinder de to vertikale kutt på sitt basal slutten.
- Skrell barken stripe skapt av snittet oppover utsette utvikle Xylem vev og legge tilstrekkelig Inoculation Media fra trinn 3,6 til våte overflaten av eksponert utvikle Margen ved hjelp av en pipette (vanligvis 5-10 mL). Umiddelbart sett inn barken stripe.
- Bind barken stripe til stammen tett med Parafilm.
- Gjenta trinn 4.2 til 4.5 for eventuelle ytterligere cambial vinduer for genet (er) eller promoter (e) av interesse å skape enNY New cambial vinduer minst 1 cm over eller under andre cambial vinduer og i 90 ° offset.
- Fullfør trinn 4.2 til 4.5 for de positive og negative kontroll vektorer (trinn 2.4) som sikrer at hver vektor blir tilsatt til den samme stammen av hver plante benyttet i forsøket.
- Overvåk vekst stammen diameter periodisk og høst for GUS analysen (kapittel 5) når radial vekst på minst 5 mm har blitt observert i stengler.
Merk: Mengden av radielle vekst er nødvendig er avhengig av mengden av vev som er nødvendig for genetisk analyse.
5. Høsting for GUS Histologisk analyse
- Vesenet den "cambial vinduet" fra stammen fjerne alle vev ikke er en del av ny vekst innen cambial vinduet.
- For studier knyttet til modne xylem og morfologi barken celle / vev, skrelle barken fra Margen.
- For studier hvor cambial sonen er nødvendig for å forbli intakt eller promoter uttrykk mønstre som skal vurdereed, skjære cambial vinduet tvers bruker et barberblad eller en annen skarp kniv til skiver på mellom 0,5 og 1 mm i tykkelse.
- Plasser bearbeidet cambial vindus vev i 14 ml rundbunnede rør og skylles to ganger i 0,1 M fosfatbuffer ved pH 7 14. Påse at vevet er helt under vann, forblir i oppløsning i minst fem minutter, og alt overskudd av oppløsning fjernet ved slutten av den andre skylling.
- Tilsett 5 ml av GUS-reagens (0,5 mM X-Gluc (5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-glukuronsyre), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 volum / volum, 0,5 mM kalium ferricyanid (III), 0.05 mM kaliumferrocyanid (II), fylt opp til sluttvolum med 0,1 mM fosfatbuffer pH 7, jf. Hawkins et al 16) til hvert rør. Dersom vevet ikke er helt under vann, legge til ekstra GUS reagens.
- Inkuber rørene i 10 minutter ved 55 ° C i mørket.
- Inkuber rør for et ytterligere 12-16 timer på en rysteinkubator ved 37 ° C i mørkeved bruk av forsiktig omrøring (mellom 30 og 60 rpm) for å tillate blanding.
- Ved fjerning fra rysteinkubator tilfeldig kontrollerer pH-verdien av GUS-reagens i en liten undergruppe av rør ved hjelp av lakmuspapir med et pH-område 0-7.
- Hvis noen av rørene har en pH-verdi under 6 og deretter merke dem. Fortsett å kontrollere resten av rørene for å bekrefte pH og merke hvis pH er 6 eller lavere.
Merk: Prøver med en pH under 6 kan ikke være egnet for analyse. Disse prøvene må bli ekskludert fra videre analyse.
- Hvis noen av rørene har en pH-verdi under 6 og deretter merke dem. Fortsett å kontrollere resten av rørene for å bekrefte pH og merke hvis pH er 6 eller lavere.
- Dekanter GUS reagent og erstatte med tilstrekkelig 70% etanol for å dekke vev.
- Oppbevar ved 4 ° C inntil nødvendig.
6. Identifisering av transgene Tissue
- Bruk pinsett, ta ut alle cambial vinduet vev fra et rør og legg i liten skuff eller petriskål for å tillate mikroskopisk visualisering.
- Ved hjelp av et mikroskop dissekere mellom 1 og 4X forstørrelse, identifisere og telle antallet celler eller vevsom har en lys blå flekker. Blå fargede celler eller vev er referert til som en sektor fra dette punkt og fremover. Tally dem på følgende måter.
- For prøver der barken er fjernet (trinn 5.1.1), telle antall sektorer i cambial vev funnet på overflaten av utviklings xylem (cambial sektor, Figur 1a).
- For prøver som har blitt kuttet i skiver (trinn 5.1.2), telle antall sektorer som finnes i de ulike celle eller vevstyper (Figur 1b, 1c, 1d). Sektorer kan finnes i følgende vevstyper: den periderm (Periderm sektor, figur 1e), barken (barken sektor, Figur 1f), cambial vev (sektoren cambial, figur 1g, 1h, 1i), sår parenchyma (Wound Parenchyma Sector, Figur 1j) og i tyloses (sektoren Tylose, figur 1k).
- Under mikroskopisk enssessment sikre at begge sider av en plate har blitt vist, og at sektorer som oppstår over to plater er tilpasset slik at tallene ikke er overvurdert.
- Plasser bare vev som inneholder sektorer tilbake inn i røret som inneholder 70% etanol og lagre inntil nødvendig.
- Gjenta trinn 6.1 til 6.3 for eventuelle ytterligere cambial vinduer, inkludert de positive og / eller negative kontroller.
- Beregne gjennomsnittlig transformasjon effektivitet for hver sektor type for hvert gen eller formidler av interesse og kontrollene separat ved å dele totalt antall sektorer av det totale antall 1 cm 2 cambial vinduer for å utlede et gjennomsnittlig antall Transformation Aktiviteter per cm 2 av Cambium vaksinert (ATScm -2).
- Gå videre til trinn 7,2 og 8 for analyse av promoter uttrykk mønstre og trinn 7.1, 7.2 eller 7.3 for teknikker for å vurdere celler og vev morfologi i cambial vev.
7. Analyse avCeller og vev morfologi i cambial Tissue
Merk: Her er et utvalg av teknikker som har vært brukt med hell for analyse av ISSA avledet prøver.
- Analyse av Margen celle område, lumen område, celleveggtykkelse og cellevegg-området ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM).
Merk: Denne protokollen krever minimal prøveopparbeidelse og åpner for relativt høy gjennomstrømning av sektoranalyse knyttet til de morfologiske trekk skissert.- Fra dette trinnet og fremover må du sørge for laboratoriefrakk, vernebriller og hansker brukes når woody vev blir håndtert og behandlet.
- Identifisere en cambial sektor for analyse og lage et snitt ca 0,5 mm på hver side av det ved hjelp av en enkel kant barberblad for å lage en plate (figur 2a).
- Skjær av overflødig Margen vev forlater ca 1 mm av Xylem vev til tangent side av sektoren (figur 2b).
- Forsiktigly kuttet på tvers gjennom midten av sektoren ved hjelp av en ny dobbel kant barberblad (figur 2c).
- Lag to ekstra grunne radielle snitt på tverrplanet hver side av sektoren for å avgrense den transgene vev (figur 2d). Som GUS farging ikke vil trenge dypt inn i vevet følge langs de radiale filer av cellene på hver side av farget vev finnes på cambial overflaten.
- Fest forberedt cambial sektor forsiden opp til scenen av en SEM pin spire montere ved hjelp av SEM ledende tape (figur 2e) og hold i eksikator inntil nødvendig for SEM visualisering.
- Gjenta trinn 7.1.2 til 7.1.6 for ytterligere sektorer, inkludert de fra den negative kontrollen.
- Ved hjelp av en SEM i en lav vakuummodus (energi 5 kV, spot 3,0 nm), visualisere og ta bilder av celler / vev innenfor sektoren, samt celler / vev direkte tilstøtende den sektor (figur 2f). Mengden av forstørrelseer avhengig av funksjoner av interesse. For Xylem fiber, er 2,000X egnet (figur 2g).
- Når en cambial sektor har blitt visualisert og fotografier tatt ved en passende forstørrelse, måle Margen celle / vev morfologiske trekk av interesse å bruke bilde måling programvare.
- For statistisk analyse, gjennomføre flere parvise analyser med parvise t-tester for å sammenligne forskjellen mellom morfologisk målt i transgene sektoren og tilstøtende ikke-transgen kontroll celler / vev (målt innenfor 0,5 mm fra sektoren kant) for hver sektor for å finne en p -verdi.
- Gjenta trinn 7.1.10 for den negative kontrollen.
- I de tilfeller hvor den positive kontrollen viser en lav p-verdi (α <0,05), beregning av differansen mellom den transgene og ikke-transgene tilstøtende celler / vev for en morfologisk egenskap. Bruk denne 'forskjellsverdi "i en uparet t-test for å sammenligne effekten av genet av interesse med negative kontroll for å fastslå en p-verdi.
- Histokjemisk analyse av cambial celle / vev morfologi eller promoter uttrykk mønstre i stamceller / vev ved hjelp av lysmikroskopi.
Merk: Mens mer tidkrevende, gir denne metoden for flere analysemuligheter, inkludert aspekter av cambial dynamikk, f.eks cambial bredde samt promoter uttrykk mønstre. I tillegg, hvis ikke får tilgang et SEM, denne protokollen kan brukes som et alternativ for trinn 7.1.- Vesenet sektor av interesse å bruke barberblad og noen omkringliggende vev som små blokker (ikke større enn 1 mm 3) og plasser direkte i 1-3 ml 100% etanol i et prøveglass med skrukork i minst 2 dager ved 4 ° C på en ristemaskin. Forbered liten blokk på en måte som vil gi rom for overflaten av interesse å få tilgang til en mikrotom.
- Gjenta for eventuelle andre sektorer, inkludert de fra den negative kontrollen.
- Fjern væske og erstatte med 25% etanol: 75% LR hvite blanding i 2 dager opprettholde betingelser.
- Gjenta trinn 7.2.3 med 50% etanol: 50% LR hvite, 25% etanol: 75% LR hvit og til slutt to ganger med 100% LR hvit.
- Plasser liten blokk i å bygge Mold med overflaten av interesse justert til korte enden og nøye dekke med frisk LR hvite og polymerisere i henhold til produsentens instruksjoner.
- Skjær 5 um seksjoner fra overflaten av interesse på en roterende mikrotom og montere på en glass-slide. Bruk safranin O (0,01%) farging for å visualisere celleveggen og / eller andre funksjoner.
- Legg monterings media, plassere en dekkglass og la til å sette over natten.
- Vis under et lysmikroskop mellom 100X og 600X forstørrelse og ta bilde.
- Capture morfologiske trekk fra bilder ved hjelp av bilde måling programvare.
- For statistisk analyse av kvantitative morfologiske trekk, følger på fra trinn 7.1.10.
- For kvalitativ analyse av morfologiske trekk,sammenligne og beskrive mønstre observert for genet eller promotoren av interesse og den negative og / eller positive kontroll.
- Analyse av Microfibril Angle (UD) i oppbløtt Fibers Bruke lysmikroskopi.
- Forbrukertransgent vev Margen direkte fra en sektor, så vel som fra ikke-transgene vev tilstøtende til den (innen 0,5 mm, fig 2h) og plasser i separate 1,5 ml rør. Gjenta for eventuelle andre sektorer, inkludert de fra den negative kontrollen.
- Fullfør trinn 7.3.3 til 7.3.5 i et avtrekksskap.
- Tilsett 250 ul av hydrogenperoksid og 250 ul iseddik til hvert rør.
- Plasser røret i varmeblokk ved 90 ° C i 2 timer i avtrekkshette.
- Fjerne vev fra rør og forsiktig skylling med destillert vann i det minste to ganger.
- Ved hjelp av en vannløselig montering media, montere vev på en glassplate og erte hverandre med skarpe tang før påføring av dekkglass.
- Utsiktetter et lysmikroskop og ta bilder av individuelle fibrene ved forstørrelse større enn 400X.
- For å bestemme microfibril vinkel av fibre, måle vinkelen mellom gropen åpninger og / eller cellevegg striper og den lange aksen til fiberen (figur 2i) ved hjelp bilde måling programvare.
- For statistisk analyse, følger på fra trinn 7.1.10.
8. Analyse av Arrangøren uttrykk mønstre
- Analyse av Arrangøren Expression Mønstre i videregående stamceller.
- Telleapparat frekvensen av hver sektor type for arrangøren av interesse samt de positive og negative kontroller som nevnt i punkt 6.2.2.
- Sammenligne frekvensen av de forskjellige typer sektor for promotoren av interesse med den positive kontroll ved hjelp av Chi-kvadrat tester for å etablere p-verdier. Videre analyse av celle / vev-spesifisitet kan foretas ved hjelp av trinnet 7,2 etter behov.
- Hvis mer enn én promoterav interesse blir etterforsket deretter gjenta denne analysen gjør sammenligning mellom alle arrangører av interesse og positiv kontroll.
- Hvis sektorer eller blå flekker er observert i den negative kontrollen deretter legge dette til analyse eller forlate avhengig av omfang, eller hvis det er mistanke om endogen flekker (se diskusjon).
- Analyse av Arrangøren uttrykk mønstre Under cambial Derivative Utvikling og differensiering.
- Ved hjelp av en dissekere mikroskop, visualisere alle cambial sektorer (figur 1g, 1h, 1i) identifiserte i trinn 6,2 og fastslå tilstedeværelse / fravær av blå flekker i tre vev typer avledet fra cambium; barken (P), utvikle xylem (X1) eller utviklet Xylem vev (X2) (se figur 3a).
- Som per trinn 8.1.2, sammenligne frekvensen av nærvær / fravær av GUS flekker i P, X1 og X2 regioner av arrangøren av interest med den positive kontrollen ved hjelp av Chi-kvadrat tester for å etablere p-verdier. Videre analyse av celle / vev-spesifisitet kan foretas ved hjelp av trinnet 7,2 etter behov.
- Se trinn 8.1.2.1 og 8.1.2.2 for flere hensyn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen alle levende sekundære stamcelle og vevstyper har vist seg å være utsatt for A. tumefaciens transformasjoner og er definert i sektortyper basert på celletype i utgangspunktet forvandlet og det påfølgende utviklingsvekstmønster. Sektor typer inkluderer periderm, barken, cambial, sår parenchyma og tylose (Figur 1b, 1c, 1d), og kan bli funnet i samsvar steder beskrive i resten av dette avsnittet. En periderm sektor består av en gruppe av transformerte celler funnet utelukkende i periderm og aldri strekker seg inn i barken (figur 1E). En barken sektor kan bli funnet på forskjellige steder mellom initierende laget og periderm imidlertid aldri strekker seg inn i disse omkringliggende vev (Figur 1f). En cambial sektor består av transform xylem / Cambium / barken vev avledet fra transformation av cambial innledende og kan forekomme i tre forskjellige mønstre: i) 'fullstendig' cambial sektor, transformerte Margen / cambial / barken celler som strekker seg fra grensen av såret parenchyma vevet gjennom Margen og cambial sonen til barken vev som inneholder både stråle og fusiform celler eller ray elementer bare (figur 1G), ii) "tapte første 'cambial sektor, en variant av den fulle cambial sektor der en innledende har gått tapt fra initierende lag forlater speilet Margen og barken sektorer og et utransformert initierende lag (Figur 1h), og iii) "Margen bare 'cambial sektor, transformert Margen vev som strekker seg fra grensen av såret parenchyma vev til variable lengder inn i den nylig dannede xylogenic vev, men aldri å nå den initierende lag (figur 1i). Et sår parenchyma sektor inneholder forvandlet sår parenchyma celler som finnes enten som en enkelt celle eller grupper av celler, ofte i radial files, som ligger mellom den eksisterende tre og nydannede Xylem vev (figur 1j). En tylose sektor består av transformerte skips tyloses innenfor pre-eksisterende tre (figur 1k).
Representative transformasjon effektivitetsdata for både gen og formidler av rente studier samt deres positive kontroller er presentert i tabell 1 og tabell 2. Data har blitt trukket fra to store studier gjennomført over samme tidsperiode (des-april) i de samme genotypene av eucalypt og poppel over to år på rad som involverer en rekke av tre formasjons gener og arrangører av interesse. Med fokus på positive kontroller fra arrangøren av rente studier (tabell 2), mest utsatt vevstype til A. tumefaciens T-DNA overføring er cambial vev med ca 60% og 40% av de sektorene som er identifisert i eucalypts og poppel henholdsvisvære cambial sektorer. I eucalypts, er den nest mest tallrike sektor typen sår parenkymet på 35%, mens de andre sektortyper alle hadde ATScm -2 verdier under 5%. I popler, er den nest mest tallrike sektor typen sår parenkymet på 20%, etterfulgt av barken på 15%, mens resten av sektortyper ble funnet på en frekvens under 5%. En høyere sannsynligheten for å finne en sektor i en cambial vindu, så vel som et større antall cambial sektorer som er identifisert er typisk hvor barken skallet protokollen blir brukt (tabell 1, trinn 5.2.1) på grunn av evnen til beising og muligheten for å visualisere hele området av cambium.
Under utviklingen av disse protokollene et antall variabler ble undersøkt som en del av protokollen optimaliseringsforsøk. Disse inkluderte bakteriekonsentrasjon i Inoculation Media, medietype som brukes i Inoculation Media, tillegg av Acetosyringone til Inoculation Media, vev alder og A. tumefaciens stamme samt tidspunkt for vaksinasjon og genotype. Cambial sektor ATScm -2 data fra disse forsøkene er presentert i tabell 3 og tabell 4. Hoveddelen av variabler undersøkt, da endret føre til endringer i cambial ATScm -2 i begge arter og inkludert spesielt å øke konsentrasjonen av bakterier i Inoculation Media, bruk av MS i Inoculation Media og valg av A. tumefaciens stamme. I tillegg, tidspunkt for vaksinasjon og tre genotype viste signifikante forskjeller i eucalypts med vaksiner på forsommeren viser høyere ATScm -2 mens eucalypt kloner SG21 og SG44 viste høyere cambial ATScm -2, 41,6 og 40,4, henholdsvis i forhold til andre på tvers av alle måneder til sammen.
Gjennomsnitt cambial sektorstørrelse varierer og er avhengig av mengden av sin tangential og radial vekst i et cambial vindu. I en subPrøven av 53 sektorer i poppel, dyrket i omtrent fire måneder, den tangentiale bredde av sektorer ved kambiumet varierte mellom 0,09 og 0,58 mm med et gjennomsnitt på 0,27 mm, mens radial vekst på tvers cambial vinduer varierte 0,7 til 2,2 mm med et gjennomsnitt på 1,35 mm. Når kombinert, disse anordnet mellom 0,063 mm og 1,276 mm 2 2 av transgent vev for analyse. I en annen subsample av 188 sektorer i den samme art, hvor mellom 1,5-4 mm i radial vekst over cambial vinduet ble observert mer enn omtrent 5 måneder, den gjennomsnittlige sektor massen var 72 pg (tabell 5).
Mengden av transgent vev laget har vist seg å gi tilstrekkelig celler og / eller vev til å gjennomføre morfologiske målinger så vel som for studiet av promoter-aktivitet. For eksempel, påvirkning av tre Eucalyptus grandis flas på en rekke Margen fiber morfologiske trekk 9 var ex plored i eucalypt kloner og avslørte mulige roller for EgrFLA2 i UD besluttsomhet og EgrFLA1 i cellestørrelse bestemmelse (Tabell 6). I tillegg mønstre av ekspresjon av Eucalyptus grandis CESA genpromoteren i den tredje Margen (X1), utviklet Margen (X2) og barken (P) vev 10 identifiserte signifikant forskjellige uttrykk mønstre mellom EgrCESA1, 2, 3, og EgrCESA4, 5, 7 i eucalypt stengler. I denne analysen EgrCESA1, 2, 3 ble vist å være primært uttrykkes på å utvikle Margen vev mens EgrCESA4, 5, 7 ble vist å være uttrykt i både utvikling Margen og barken vev (figur 3b, tabell 7). Alle EgrCESA arrangører viste signifikant forskjellige uttrykk mønstre til den positive kontrollen (CAMV35S promoter) (tabell 7).
4553 / 54553fig1.jpg "/>
Fig. 1: Transgene sektorer typer (a) cambial sektorer som så på overflaten av den blottlagte Margen etter behandling ved hjelp av barken skall-protokollen (trinn 5.2.1). Plater som viser en rekke sektortyper på tverrgående overflate i poppel (b) og eukalyptus (c) stengler etter behandling ved hjelp av den tversgående snitt protokollen (trinn 5.2.2). (D) Skjematisk fremstilling av utvalget av sektortyper som finnes i plantestammene. Eksempler på periderm sektor (e), barken sektor (f), "full" cambial sektor (g), "tapte første 'cambial sektor (h),' Margen bare" cambial sektor (i), sår parenchyma sektor (j) og tylose sektor (k) i poppel. Svarte piler indikerer hvor mindre størrelse sektor er plassert. Alle skala barer = 1 mm.iles / ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Utarbeidelse av cambial sektorer for morfologisk analyse ved hjelp av SEM og lysmikroskopi (a) Eksisjon av plate som inneholder sektor. (B) Disc trimmet for å fjerne overflødig vev. Å skjære gjennom tverrgående overflate av transgene sektor (c). (D) Innføring av to radiale kutt for å hjelpe i å finne den transgene vevet under SEM. (E) Tissue montert på en SEM pinne ved hjelp av ledende tape. (F) Visning av regionen av transgene og ikke-transgene vev som skal avbildes for analyse. (G) Typisk bilde av xylem fiber og ray celler tatt med 2,000X forstørrelse. (h (I) oppmalte fibre sees under lysmikroskopi som viser vinkelen på groper og / eller cellevegg furer og til lengdeaksen for cellen. Svarte pilen indikerer pit blenderåpning. Skala barer = af, h = 1 mm, g, i = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Analyse og resultater av genet promoter uttrykk mønstre av cambial derivater (a) Visning av P (barken), X1 (utvikle xylem) og X2 (utviklet Xylem) regioner.. (B) Resultater indikerer andel av P, X1 og X2 flekker i cambial sektorer fra en studie med et utvalg av CESA Eucalyptus Grandis forvandlet til stammer av eucalypt hybrider. Data hentet fra Creux et al. 10. n = antall sektorer vurderes. Scale bar = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| treslag | Vector typen | Antall gener av interesse brukt | Totalt antall vinduer opprettet | Totalt antall vinduer der en sektor ble identifisert (%) | Cambial ATScm -2 cambial (i vinduer hvor en sektor ble identifisert) |
| Eucalyptus globulus x camaldulensis hybrider (totalt tre kloner) | Positiv kontroll (Gener av interesse) | 1 (kun GUS) | 96 | 97% | 45,1 (1,5) |
| Gener av interesse | 20 | 630 | 92% | 46,1 (2,2) | |
| Populus alba 'pyramid' | Positive Control (Gener av interesse) | 1 (kun GUS) | 110 | 74% | 10,8 (1,5) |
| Gener av interesse | 20 | 700 | 81% | 14,6 (0,8) |
Tabell 1:. Typisk cambial ATScm -2 for den positive kontrollen og gener av interesse Tallene er hentet fra studier gjennomført over to år på rad i samme eucalypt og poppel kloner ved hjelp av en rekke gener og barken skallet høsting protokollen (trinn 5.2. 1). Vanlige feilmeldinger i parentes. </ P>
| treslag | Vector typen | Antall promoter / gener | Totalt antall vinduer opprettet | Totalt antall vinduer der en sektor ble identifisert (%) | ATScm -2 alle sektorer | ATScm -2 Periderm | ATScm -2 barken | ATScm -2 cambial | ATScm -2 Wound Parenchyma | ATScm -2 Tylose |
| Eucalyptus globulus x camal- dulensis hybrider (totalt tre kloner) | positiv kontroll | <td> 1 (GUS only)118 | 63% | 25,74 (2,35) | 0.24 (0.07) | 0,89 (0,19) | 15.7 (1.71) | 8,84 (1,4) | 0,07 (0,03) | |
| Arrangører av interesse | 28 | 1050 | 31% | 14.67 (1.77) | 0,02 (0,01) | 0.05 (0.01) | 13.79 (1.75) | 0,78 (0,21) | 0,03 (0,01) | |
| Populus alba 'pyramid' | positiv kontroll | 1 (kun GUS) | 110 | 54% | 12.37 (1.77) | 0.22 (0.07) | 1,85 (0,29) | 5,07 (0,6) | 2.78 (0.75) | 0,29 (0,53) |
| Arrangører av interesse | 28 | 990 | 26% | 8.28 (1.18) | 0,16 (0,04) | 0,9 (0,09) | 6.67 (1.16) | 0.27 (0.07) | 0,28 (0,11) |
Tabell 2:. Typisk ATScm sektor -2 for den positive kontrollen og arrangører av interesse Tallene er hentet fra studier gjennomført over to år på rad i samme eucalypt og poppel kloner ved hjelp av en rekke promotersekvenser og platen høsting protokollen (trinn 5.2. 2). ATScm -2 verdier ble avledet fra vinduer hvor en sektor ble bare identifisert. Standard feilverdier i parentes. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
| Arter | Prøve | behandling Beskrivelse | Antall vinduer i behandling | |
| eucalyptus globulus | Konsentrasjon av A. tumefaciens i Inoculation Media | Resuspendert i 25 ml MS | 10 | 1.4 (0.62) |
| Resuspendert i 5 ml MS | 10 | 1,6 (0,72) | ||
| Resuspendert i 1 ml MS (kontroll) | 10 | 2.4 (1.16) | ||
| Media skriver i Inoculation Media | LB | 10 | 0,4 (0,22) | |
| MS (kontroll) | 10 | 2.4 (1.16) | ||
| Tilsetting av Acetosyringone til Inoculation Media | med Acetosyringone | 11 | 0,9 (0,37) | |
| Uten Acetosyringone (kontroll) | 11 | 0.6 (0.64) | ||
| Age of stammen vev vaksinert | 6 måneder (control) | 11 | 1,1 (0,66) | |
| 18 måneder | 11 | 1.8 (0.95) | ||
| A. tumefaciens stamme | AGL1 (kontroll) | 18 | 0 (0) | |
| C58 | 18 | 0,1 (0,1) | ||
| LBA4404 | 18 | 0,6 (0,4) | ||
| Populus alba 'pyramid' | Konsentrasjon av A. tumefaciens i media | Resuspendert i 25 ml MS | 10 | 2.2 (0.55) |
| Resuspendert i 5 ml MS | 10 | 2.7 (0.63) | ||
| Resuspendert i 1 ml MS (kontroll) | 10 | 5.1 (1.58) | ||
| Media type som brukes for stammen vaksinasjon | LB | 10 | 2.8 (0.71) | |
| MS (kontroll) | 10 | 5.1 (1.58) | ||
| Tilsetting av Acetosyringone til Inoculation Media | med Acetosyringone | 11 | 0,3 (0,14) | |
| Uten Acetosyringone (kontroll) | 11 | 0,5 (0,25) | ||
| Age of stammen vev vaksinert | 6 måneder (kontroll) | 11 | 1.5 (0.33) | |
| 18 måneder | 11 | 1.5 (0.63) | ||
| A. tumefaciens stamme | AGL1 (kontroll) | 20 | 8,1 (2) | |
| C58 | 20 | 12,5 (2) | ||
| LBA4404 | 20 | 11,1 (2) |
Tabell 3: cambial ATScm -2 verdier for en rekke variabler undersøkt som en del av protokoll optimalisering stier. Variabler ble undersøkt i en poppel klone og et utvalg av Eucalyptus globulus individer over en rekke år med cambial ATScm -2 data presentert. Cambial vinduer ble høstet ved hjelp av platen høsting protokollen (trinn 5.2.2). Standard feilverdier i parentes.
| Eucalyptus globulus x camaldulensis klone ID | Antall cambial vinduer for hver måned | Cambial ATScm -2 Late Spring (November) Inoculation | Cambial ATScm -2 Tidlig på sommeren (desember) Inoculation | Cambial ATScm -2 Midt Sommer (januar) Inoculation | Cambial ATScm -2 Late Summer (februar) Inoculation | Cambial ATScm -2 Tidlig høst (mars)inoculation | Cambial ATScm -2 alle måneder kombinert |
| SG5 | 10 | 15,7 (7,8) | 50,7 (13,7) | 10,5 (5,1) | 30,7 (4,4) | 16.8 (6.3) | 24,9 (4,3) |
| SG6 | 10 | 6,1 (3,1) | 38,5 (15,1) | 4,5 (1,7) | 14,5 (3,3) | 27,6 (8,4) | 18,3 (4) |
| SG13 | 10 | 28,4 (6,7) | 41.8 (9.1) | 16,1 (7) | 29,3 (5,2) | 19,8 (4,3) | 27,1 (3,1) |
| SG18 | 10 | 6,7 (2,9) | 18,3 (6,7) | 17,4 (3,4) | 19,2 (6,1) | 18,1 (6,3) | 15,5 (2,4) |
| SG21 | 10 | 38,7 (14,3) | 77 (17,5) | 23.9 (5.7) | 27,5 (6,9) | 40,7 (13,5) | 41,6 (6) |
| SG35 | 10 | 23,5 (10,2) | 42,8 (12,2) | 7,6 (2,5) | 17,6 (4,3) | 31,3 (4,6) | 24,6 (3,8) |
| SG37 | 10 | 19,7 (8) | 55,2 (14,5) | 7,4 (1,8) | 35 (10,4) | 15.9 (4.5) | 26,6 (3,8) |
| SG39 | 10 | 12,5 (2,4) | 23,6 (6,3) | 6,9 (3) | 26,3 (8,1) | 7,3 (2,3) | 15,5 (2,6) |
| SG40 | 10 | 24,8 (11) | 24,5 (6,8) | 14 (5,6) | 35,6 (6,1) | 19,9 (4,2) | 23,8 (3,2) |
| SG44 | 10 | 22,3 (3,4) | 63 (29,3) | 9,8 (2,6) | 52,5 (10,3) | 54,3 (15) | 40,4 (7,4) |
| SG46 | 10 | 15.3 (5.2) d> | 63,9 (20,1) | 23,6 (4) | 22,5 (4,8) | 17,4 (4,9) | 28,5 (5,1) |
| Månedlig cambial ATScm -2 | 19.9 (5) | 45,3 (9,1) | 12,6 (2,8) | 27,8 (4,5) | 24 (5,1) |
Tabell 4:. Påvirkning av genotype og tidspunkt for vaksinasjon på cambial ATScm -2 i eucalypt kloner ti vinduer ble introdusert hver måned over vekstsesongen til 10 forskjellige Eucalyptus globulus x camaldulensis kloner som alle var høstet i mai. Månedlig data blir presentert for hver genotype med en samlet gjennomsnittlig månedlig og genotypisk ATScm -2 presenteres også. Cambial vinduer ble høstet ved hjelp av barken peel høsting protokollen (trinn 5.2.1). Standard feilverdier i parentes.es / ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
| Plant Number | Antall cambial sektorer Bolts | Totale massen av alle sektorer (mikrogram) | Gjennomsnittlig masse av sektorer (mikrogram) |
| 1 | 11 | 750 | 68 |
| 2 | 19 | 1460 | 77 |
| 3 | 21 | 160 | 8 |
| 4 | 26 | 4460 | 172 |
| 5 | 15 | 1320 | 88 |
| 6 | 22 | 2490 | 113 |
| 7 | 19 | 1720 | 91 |
| 8 | 30 | 830 | 28 |
| 9 | 25 | 360 | 14 |
| Total | 188 | 13550 | 72 |
Tabell 5:. Typisk massen av en cambial sektor 45 vinduer over ni planter ble undersøkt i poppel for å bestemme den gjennomsnittlige massen av en sektor og høstes ved hjelp av platen høsting protokollen (trinn 5.2.2). Plantene ble dyrket i 5 måneder og radial vekst over en cambial vindu var mellom 1-4 mm.
| morfolino ological egenskap | GUS bare (positiv kontroll) | Ikke-transgene vev (GUS only) | P-verdi | Gene av interesse 1 (FLA1) | Ikke-transgene vev (FLA1) | P-verdi | Gene Interesse 2 (FLA2) | Ikke-transgene vev (FLA2) | P-verdi | Gene Interesse 3 (FLA3) | Ikke-transgene vev (FLA3) | P-verdi |
| Gjennomsnittlig Cell Wall Tykkelse (mm) * | 1,81 (0,1) | 1,65 (0,1) | 0,2692 | 1,47 (0,14) | 1,55 (0,12) | 0,6403 | 1,65 (0,13) | 1,78 (0,13) | 0,4839 | 1,59 (0,12) | 1,63 (0,11) | 0,8254 |
| Gjennomsnittlig Cell Wall Area (mikrometer 2) * | 69.1 (4.74) | 60.7 (2.03) | 0,1229 | 64.1 (15.68) | 59.9 (9.79) | 0,5004 | 61,6 (3,4) | 65 (3,96) | 0,5182 | 61,9 (3,56) | 61.5 (3.16) | 0,9438 |
| Gjennomsnittlig Cell Area (mikrometer 2) * | 115,9 (11.01) | 99,9 (5,1) | 0,2041 | 124,4 (6,1) | 108 (4,36) | 0,0445 | 110,8 (8.45) | 111,3 (9.06) | 0,9671 | 108,5 (4,43) | 103 (3,07) | 0,3204 |
| Gjennomsnittlig Lumen Area (mikrometer 2) * | 46.9 (7.55) | 39.2 (4.89) | 0,407 | 60.2 (5.28) | 48.1 (4.46) | 0,0991 | 49.2 (7.56) | 46,3 (7,5) | 0,7882 | 46.6 (3.31) | 41,5 (3,9) | 0,3264 |
| Gjennomsnittlig Microfibril Angle (O) # | 24.3 (0.75) | 24.2 (0.45) | 0,8648 | 22.3 (0.82) | 22,7 (0,7) | 0,5664 | 23.7 (0.55) | 26,6 (0,5) | 0,0001 | 26 (0,88) | 27.2 (0.72) | 0,0903 |
Tabell 6:. ISSA Fiber morfologi målinger stammer fra genet av interesse studie Sammenligning av fiber cellevegg, cellestørrelse og MFA målinger fra transgene fibre hentet fra Eucalyptus globulus x camaldulensis kloner stammer transformert med Eucalyptus grandis FLAS (EgrFLA1, 2, 3) og positiv kontroll (GUS only) med de tilstøtende ikke-transgene kontrollfibre. Data hentet fra MacMillan et al. 9. * Angir prøve involverte måling av 10 fibre i 10 sektor (total på 100 fiber). # Indikerer prøve involverte måling av 5 fibre i 20 sektorer (totalt 100 fibre). α <0.05 vist i fet skrift. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
| EgCESA1 | EgCESA2 | EgCESA3 | EgCESA4 | EgCESA5 | EgCESA7 | GUS bare (positiv kontroll) | |
| EgrCESA1 | 0,708 | 2,839 | 8,856 | 9,976 | 9.18 | 29,165 | |
| EgrCESA2 | 1.11 | 12,008 | 11,363 | 30,234 | |||
| EgrCESA3 | 15,151 | 16,123 | 15,488 | 37,791 | |||
| EgrCESA4 | 4,852 | 0,108 | 46,858 | ||||
| EgrCESA5 | 3,275 | 11,278 | |||||
| EgrCESA7 | 36,082 | ||||||
| GUS bare (positiv kontroll) |
Tabell 7: Chi 2 verdier avledet fra sammenligning av promoteren ekspresjonsmønstre i cambial derivater Chi to analyse som sammenligner tilstedeværelse / fravær av GUS farging i P, X1 og X2 region av cambial derivater. mellom seks Eucalyptus grandis CESA genesekvenser promotere (EgrCESA 1, 2, 3, 4, 5, 7) og positiv kontroll (kun GUS). Data hentet fra Creux et al. 10. α <0.05 vist på understreking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ISSA-protokollen er en relativt enkel og effektiv metode for etablering av transgene stamceller i treslag i løpet av noen få måneder for analyse av gener og arrangører av interesse involvert i tre og stem formasjon. Liten innsats, utover å holde plantene i live, er nødvendig for å vokse transgen stammen vev etter vaksinasjonen som står i kontrast til in vitro metoder hvor omfattende dyrking er nødvendig for å opprettholde vev eller planter, hvor tre produksjon kan ta opp til år for å starte eller hvor en sann sekundær stammen ikke er opprettet en. Issa har også vist seg å være anvendbar på et bredt spekter av treslag, inkludert arter i slekten av Populus, eukalyptus og Pinus 6 samt Acacia og Corymbia (data ikke vist), der det er svært lite, om noen, optimalisering er nødvendig for å utlede transgene vev. Ved hjelp av denne metoden, er det derfor mulig å etterforske en rekke of gener eller arrangører av interesse for de fleste arter av interesse. Videre kan protokollen kan brukes alene eller i forbindelse med mer utbredt in vitro teknikk der flere gener kan bli undersøkt ved hjelp Issa i første rekke for å identifisere potensielle kandidater til å ta frem til mer involvert in vitro metoder.
De beskrevne eksempler viser at tilstrekkelig sektorer kan bli opprettet for å foreta analysen nedstrøms fra bare et lite antall av transgene cambial vinduer. Med ATScm -2 verdier av 46,1 i eucalypt og 14,6 i poppel bare én eller to cambial vinduer ville være tilstrekkelig til å undersøke en enkelt egenskap som det er mulig å legge til mange vinduer til en enkelt plante stilk eller kopiere på en rekke planter. I praksis vil imidlertid ikke alle cambial vinduer fører til opprettelsen av en cambial sektor som kan anvendes (se tabell 1, tabell 2) som størrelsen av sektorene kan variere, er de vanligvis småog i tilfeller kan være plassert i umiddelbar nærhet til hverandre for å begrense deres anvendelse for genetisk analyse. I tillegg kan genet av interesse påvirke cellenes levedyktighet 12 eller andre aspekter ved celle utvikling som resulterer i potensielt fullstendig fravær av transgene sektorer for et bestemt gen av interesse. Det er derfor lurt å alltid satse på et større antall vinduer enn kan være nødvendig for analyse. Ligner forsiktighet bør brukes når du bruker ISSA for promoter studier som betydelig variasjon kan forventes med lite / svak eller ingen uttrykk observert i noen tilfeller (tabell 2). Imidlertid er en mindre antall sektorer, så lite som 6, har vist seg å være vellykket anvendt for analyse 10. Disse resultater viser at ganske beskjedne forsøk med bare et lite antall av vinduer kan føre til betydelige innsikt i genfunksjon og promoter-aktivitet.
Fra en analyse perspektiv, nærhet av transgenic og ikke-transgene vev gir et kraftig verktøy for å identifisere små, men betydningsfulle forskjeller i egenskaper mellom gener av interesse. Celler og vev samplet direkte ved siden av hverandre, er av samme genotypiske bakgrunn og har blitt påvirket av de samme miljøforhold redusere antall uavhengige variabler og forenkle den statistiske analysen er nødvendig. Fra en samplings perspektiv, kraft analyse på Issa avledet data fra flere eksperimenter (f.eks, tabell 6), har vist at et mindre antall målinger pr sektor, for eksempel celleveggtykkelse på 3-5 celler pr sektor, og måling av et større antall sektorer, for eksempel 20-25 sektorer for et gen av interesse, gir en mer effektiv og robust statistisk prøvetakingsstrategi. Hver sektor representerer en selvstendig transformasjon hendelse eller "linje" av celler med den statistiske analysen foretatt bestemme den gjennomsnittlige effekten av flere transformerings hendelsersom omfatter genet av interesse. Like, evnen til å forvandle alle stamceller gir en mulighet til å studere uttrykket av arrangører steder over hele stammen og mer spesifikt under cambium differensiering. Issa protokollen beskrevet her gi en pålitelig og validert rørledning fra etableringen av transgene vev gjennom til høsting av prøvene, innsamling og analyse av data for vev og celle morfologi og for arrangøren uttrykk mønstre.
I de fleste tilfeller sektorer er et resultat av transformasjonen av en enkelt celle, som gjennom celledeling kan ha gitt opphav til en rekke avledede celler og vev. For eksempel oppstår en cambial sektoren fra transformasjonen av en enkelt celle som selv legge viklet utvinningen blir en cambial innledende som igjen skiller periclinally og anticlinally for å skape en sektor som strekker seg hele veien fra den opprinnelige såret inn i barken. I disse tilfellene ble den transformerte startopprettholdesinnenfor cambium før høstens tid og en "full" variant er observert, men der denne første er tapt fra cambial laget under radial vekst og erstattet av en ikke-transformert nabocellen gjennom "celle-invasjon", og deretter en " tapte første 'variant vil bli resultatet. For å sikre korrekt klassifisering av sektortyper og for å hjelpe med tolkningen av resultatene anbefales det sterkt at kjent med anatomiske trekk av sekundære stammen utvikling og sår svarene være forutsetninger for analysen av Issa resultater. Dessuten er regelmessig testing av pH til GUS-reagens rådet (se trinn 5.6). En lav pH-verdi (f.eks, under 6) kan føre til aktivering av endogene P-glucuronidases (GUS) i plantestammen, som kan maskere det virkelige omfanget av en sektor eller føre til identifisering av falske positiver. Der dette er mistenkt, er det anbefalt at disse prøvene bli utelukket fra videre analyse. GUS reagent protokollenpålitelig anvendt i studiene som er skissert her for å lindre potensielle problemer med endogen GUS aktivitet ble tilpasset fra Hawkins et al. (2002) 16, og benytter flere viktige skritt inkludert to skyllinger med fosfatbuffer for å stabilisere prøvene til pH7, og varmebehandling ved 55 o C i 10 minutter for å destabilisere endogen GUS aktivitet 17,18. GUS reagent permeabilitet er også begrenset, og er ansvarlig for færre sektorer blir identifisert ved hjelp av tverrgående plate protokollen i forhold til barken peel-protokollen.
Alle arter praksis har vist seg å være mottagelige for transformasjon av cambial vev. Imidlertid har betydelige forskjeller i ATScm -2 både mellom og innen slekten og arten er observert. Tilsvar belastningen av A. tumefaciens og tid / sesongen av vaksinasjon kan påvirke ATScm -2. Det foreslås at foretaket noen foreløpige tester av disse variablene i spesies og genotyper under etterforskning før større skala adopsjon av protokollen. Teoretisk er det ingen grense for alder eller størrelse på stengler som ISSA kan brukes så lenge det er et aktivt voksende cambium. Imidlertid, for å lette nedstrøms prosessering av transgene vev sektorer er det anbefalt å inokulere stammer fra omtrent 1 cm diameter.
ISSA er ikke uten sine begrensninger. Den relativt lille størrelsen av transgene vev sektorer begrenser tiden nedstrøms fenotyping metoder og følgelig bare et begrenset antall av slike metoder har vært rutinemessig benyttet til dags dato. Disse metodene er i hovedsak fokusert på morfologisk karakterisering, som beskrevet ovenfor, så vel som halv kvantitativt estimat av monosakkarider preparat i sekundærcelleveggen slik det fremgår av innledningen 9,11. Med bruk og foredling av nye teknologier for fin skala analyse av biologisk materiale det er ytterligere potensial for å utvikle flere fenotypingrørledninger for Issa sektorer, for eksempel i celleveggen sammensetningsanalyse. Det er fortsatt vanskelig, men å utføre kvantitativ, sektor for sektor, ribonukleinsyre (RNA) basert genuttrykk og proteinstudier og / eller identifisere og spre ISSA avledet transgene celler gjennom in vitro dyrkning for ytterligere analyse på grunn av den destruktive natur GUS analysen . Noen fluorescerende reporter gener og trykking vev har vært trialed å kvantifisere RNA fra enkelte sektorer, men til dags dato disse tilnærmingene har ikke blitt brukt for middels til høy gjennomstrømming screening i rutinedrift. Videre kan transgene teknikker ikke praksis hittil som RNAi komplisere analyse hvor GUS-ekspresjon og nedregulering av mål-genet ikke kan ko-lokalisere.
Mens det er noen dagens begrensninger, innlemmelse av nye og kommende teknologier og analytiske metoder er sannsynlig å overvinne disse begrensningene, som har styrket rolle ISSA ensa middels til høy gjennomstrømming protokoll for å dissekere den komplekse molekylære natur cambial differensiering, tre utvikling og demme formasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no. 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide(III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| ImageJ imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
