使用市售试剂盒检测水中内分泌活性 体外 转录激活生物测定

摘要

一种用于检测水样（包括处理后的废水中和地表受纳水）有机提取物内分泌活性的方案，已通过商业可得的分裂阻滞法（“冻融”法）进行改良。 体外 转录激活生物测定

摘要

体外 转录激活生物测定法已显示出作为水质监测工具的潜力，但其推广和广泛应用在一定程度上受到缺乏标准化方法以及可靠、用户友好型技术难以获取的限制。本研究采用市售的分裂阻滞细胞系，对环境质量专业人员关注的水样中化学物质的内分泌活性进行定量筛查。通过基于细胞的荧光共振能量转移（FRET）检测方法，建立了一种包含全面质量保证/质量控制（QA/QC）检查的单一标准化方案，用于检测雌激素受体和糖皮质激素受体活性（分别为ER和GR）。对来自美国加利福尼亚州（USA）淡水系统的经处理的城市废水排放水和地表水样品，采用固相萃取法进行提取，并利用该标准化方案分析其内分泌活性。针对终点特异性参比化学物质的背景值和剂量-反应曲线均符合可靠测量所必需的QA/QC标准。地表水样品的生物测定筛查反应大多未检出。相比之下，二级处理厂的排放水样品表现出最高的可测活性，GR的生物测定当量浓度（BEQs）最高达392 ng地塞米松/L，ER则为17 ng 17β-雌二醇/L。三级处理出水样品的生物测定反应低于二级处理出水，表明经过高级处理后，内分泌活性化学物质的残留水平较低。该方案表明，利用市售分裂阻滞细胞"试剂盒"的体外转录激活生物测定法可被适用于水中内分泌活性的筛查。

引言

当前的水质监测依赖于准确且精确地测量化学污染物的存在情况，以此作为野生动物和人类暴露风险的替代指标。然而，这种逐项化学物质监测与评估的范式已无法跟上我们所面临的不断变化的化学物质环境。随着对合成与天然化学物质的归趋及其效应的深入了解，我们持续寻求能够反映预期生物学影响的检测工具，同时这些工具还需不受化学物质生产、使用及环境输入变化的干扰。此类工具对于判断未知或新型化学物质以及转化产物是否值得关注尤为重要。此外，水体中复杂的化学物质混合物难以通过单一化学物质监测加以充分评估。因此，我们面临更新现有监测工具箱的挑战，以更有效地应对受污水处理厂出水及城市/雨水径流排放影响的地表水中的上述问题。

近年来，生物分析技术作为水质评估的筛查工具展现出良好的应用前景。特别是 体外 通过已知特定作用机制对化学物质产生响应的生物测定法^1,2 对环境监测领域具有重要意义³. 许多研究已采用 体外 用于定量饮用水、地表水和废水中内分泌活性的生物测定法^{4 -6}此外，许多生物测定方法针对分子起始事件（例如， 受体激活）这一过程可能通过不良结局通路分析与有害效应相关联^7,8.

水质评估中生物筛查技术的发展相对迅速，已有数百种不同的 体外 已评估其效用的生物测定终点^9,10....

方案

1. 采集和处理水样（改编自 Escher 等⁹）

1. 取一个洁净的1 L棕色玻璃瓶，其中含有1 g叠氮化钠和50 mg抗坏血酸，加入待测水样至满瓶。将样品在4 °C下保存，并在72小时内完成处理。
   注意：叠氮化钠具有高毒性，必须小心操作。使用防护装备（眼部/面部、手套、防护服），并在通风良好的通风橱内称量。切勿使用金属药匙进行称量。
2. 将样品以5–10 ml/min的流速依次通过1.6 µM玻璃纤维滤膜和预处理过的固相萃取（SPE）小柱。调节真空泵的压力以控制流速。
3. 用真空干燥小柱15分钟。
4. 先用10 ml甲醇洗脱小柱，再用10 mL丙酮:己烷（1:1, v/v）洗脱。
5. 在高纯度氮气的温和气流下将洗脱液浓缩至约1 ml。加入500 µl二甲基亚砜（DMSO）进行溶剂交换，并将提取物再次蒸发浓缩至500 µl。
6. 将提取物转移至棕色玻璃自动进样瓶中，在-20 °C下保存。

2. 准备检测特异性参考化学品和水提取物的稀释液

1. 为标准曲线制备9个稀释度。
   1. 用100% DMSO配制检测特异性参考化学品的储备液。ER检测的最终浓度必须为2 µM 17β-雌二醇，GR检测为100 µM 地塞米松。将储备液储存于-20 °C。

结果

本研究选取了4个24小时混合污水样品（经处理的城市污水出水）、6个来自南加州淡水系统的地表水瞬时样品，以及1个由超纯水组成的现场空白样，以说明本实验方案。4个出水样品中，有3个来自采用常规活性污泥法的污水处理厂（“二级出水”），另1个来自在生物处理后增设砂滤/碳滤的高级污水处理厂（“三级出水”）。地表水样品采集自代表不同土地利用类型的流域（开放区域、农业区和城市区）。

水提取物的不同稀释度均未表现出明显的细胞毒性，与DMSO对照组相比，细胞死亡率均低于20%。表1）。无细胞（仅培养基）背景信号较低，仅细胞组与细胞加DMSO组的响应比较表明，溶剂对荧光测量无显著影响。测定所用校准曲线的参数，包括斜率和log EC₅₀，在可接受的历史数值范围内（表1）表明校准曲线在时间上的良好重现性。ER 检测中可接受的校准曲线示例如下所示： 图2选.......

讨论

环境雌激素（如17β-雌二醇（E2））的强效性已有充分记录，因此有必要在ng/L浓度水平对这类化学物质进行筛查^23,24。本研究中，废水排放物的雌激素受体反应（BEQ范围：2.3至17 ng E2/L）略高于澳大利亚污水处理厂二级出水所报道的水平²⁰，而地表水的BEQ值（<0.5至4 ng E2/L）则处于其他国家报道的地表水和雨水径流的范围之内（<1至11 ng E2/L）¹⁶。尽管地表水样品中测得的雌激素受体活性水平较低，该检测方法仍可作为水质评估的一个相关筛查终点。双酚A和烷基酚类表面活性剂等雌激素常在水生环境中被检出，但使用传统分析化学方法对其进行定量往往较为困难。ER细胞检测法还可用于当前及新注册农药的筛查，Kojima等人²⁵的研究已证明了这一点。

在本研究分析的全部4个出水样品中，GR活性均比ER活性高出一个数量级（表 2）。这一趋势与既往关于废水排放的研究结果一致¹⁴，且本文报道的GR-BEQs范围略高，但与.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GeneBLAzer ER alpha DA 检测试剂盒	ThermoFisher	K1393	试剂盒包含 ER 分裂阻滞 (DA) 细胞和 LiveBLAzer FRET 加载试剂盒。
GeneBLAzer GR DA 检测试剂盒	ThermoFisher	K1391	试剂盒包含 GR 分裂阻滞 (DA) 细胞和 LiveBLAzer FRET 加载试剂盒。
PrestoBlue 细胞活力检测试剂	ThermoFisher	A-13261
台盼蓝，PBS 中 0.4%	Sigma-Aldrich	T8154	ThermoFisher 亦有供应
Corning 96 孔黑色壁透明底板	Corning	3603	独立包装，无菌，带盖
Whatman 玻璃纤维滤膜，GF/A，1.6 µM	Sigma-Aldrich	WHA1820025
微孔板铝封膜	E&K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc 柱，200 mg 吸附剂	Waters	WAT106202
17β 雌二醇	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
抗坏血酸	Fisher Scientific	A61-100	Sigma-Aldrich 亦有供应
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	分子生物学级
溶剂（丙酮、己烷、甲醇）	Fisher Scientific		高效液相色谱级
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002	该化学品具有高毒性，必须谨慎操作。使用防护服，并在通风橱内称量。EMD Millipore 亦有供应。
自动细胞计数器或血细胞计数板	多种*		供应商包括 Bio-Rad、Fisher Scientific、Sigma-Aldrich 和 ThermoFisher。
II 级生物安全柜	多种*
CO2 培养箱	多种*
低温冷冻柜	多种*		建议使用液氮储存杜瓦瓶。
荧光酶标仪	多种*		仪器必须具备底部读数功能。
* 无推荐来源，该设备的选择取决于预算、使用频率和实验室空间。