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जल का उपयोग करने में अंतःस्रावी गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध Published: December 4, 2016 doi: 10.3791/54725
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Southern California Coastal Water Research Project Authority, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida

Abstract

इन विट्रो transactivation bioassays में पानी की गुणवत्ता की निगरानी के औजार के रूप में वादा दिखाया है, लेकिन उनकी गोद लेने और बड़े पैमाने पर आवेदन मानकीकृत तरीके और मजबूत, उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रौद्योगिकी की उपलब्धता की कमी के कारण आंशिक रूप से बाधा कर दिया गया है। इस अध्ययन में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, विभाजन गिरफ्तार सेल लाइनों मात्रात्मक पर्यावरण की गुणवत्ता पेशेवरों के लिए ब्याज की पानी के नमूने में मौजूद रसायनों के अंत: स्रावी गतिविधि के लिए स्क्रीन करने के लिए कार्यरत थे। एक एकल, मानकीकृत प्रोटोकॉल है कि व्यापक गुणवत्ता आश्वासन / गुणवत्ता नियंत्रण शामिल (क्यूए / क्यूसी) चेक (ईआर और जीआर क्रमशः) एस्ट्रोजेन और glucocorticoid रिसेप्टर गतिविधि के लिए विकसित किया गया था एक सेल आधारित प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) परख का उपयोग। कैलिफोर्निया (यूएसए) में इलाज नगरपालिका अपशिष्ट जल प्रवाह और सिस्टम मीठे पानी से सतह के पानी के नमूने, ठोस चरण निकासी का उपयोग कर निकाला और मानकीकृत आद्य का उपयोग कर अंत: स्रावी गतिविधि के लिए विश्लेषण किया गयाकर्नल। पृष्ठभूमि और समापन बिंदु विशेष संदर्भ रसायनों के लिए खुराक प्रतिक्रिया क्यूए / क्यूसी दिशा निर्देशों विश्वसनीय माप के लिए आवश्यक समझा मुलाकात की। सतह के पानी के नमूने के लिए bioassay स्क्रीनिंग प्रतिक्रिया काफी हद तक पता लगाने योग्य नहीं था। इसके विपरीत, माध्यमिक उपचार संयंत्रों से प्रवाह के नमूने 392 एनजी dexamethasone / जीआर के लिए और ईआर के लिए एल 17 एनजी 17β-estradiol / एल अप करने के लिए अनुमानित bioassay बराबर सांद्रता (BEQs) के साथ, उच्चतम औसत दर्जे गतिविधि थी। एक तृतीयक प्रवाह नमूना के लिए bioassay प्रतिक्रिया माध्यमिक अपशिष्ट के लिए मापा तुलना में कम था, उन्नत उपचार के बाद अंत: स्रावी सक्रिय रसायन की एक निचली अवशिष्ट का संकेत है। इस प्रोटोकॉल से पता चला है कि इन विट्रो transactivation bioassays कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपयोग में, विभाजन गिरफ्तार सेल "" किट, पानी में अंत: स्रावी गतिविधि के लिए स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

मौजूदा पानी की गुणवत्ता की निगरानी सही और ठीक वन्य जीवन और मनुष्य के लिए जोखिम के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में रासायनिक contaminants की घटना के उपाय करने की क्षमता पर predicated है। हालांकि, इस रसायन-से-रासायनिक निगरानी और मूल्यांकन के प्रतिमान कभी बदलते रासायनिक ब्रह्मांड है कि हम सामना के साथ तालमेल नहीं रख सकते हैं। हम भाग्य और सिंथेटिक और प्राकृतिक रसायनों के प्रभाव के बारे में अधिक जानने के रूप में, हम माप उपकरण की उम्मीद पता है कि जैविक प्रभावों के लिए खोज करने के लिए जारी है, और है कि एक ही समय में रासायनिक उत्पादन, उपयोग और पर्यावरण इनपुट में परिवर्तन करने के लिए प्रतिरक्षा हैं। इस तरह के उपकरणों को समझने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक अज्ञात या नए रसायन, और परिवर्तन के उत्पादों, हमारे ध्यान देने लायक है कि क्या कर रहे हैं। इसके अलावा, पानी में मौजूद रसायनों के जटिल मिश्रण खराब व्यक्ति रासायनिक निगरानी से संबोधित कर रहे हैं। इस प्रकार, हम सतह के पानी Tha में इन मुद्दों को बेहतर पता करने के लिए मौजूदा निगरानी उपकरण बॉक्स के आधुनिकीकरण की चुनौती का सामनाटी में इलाज अपशिष्ट जल प्रवाह और शहरी / तूफानी जल अपवाह की मुक्ति प्राप्त करते हैं।

हाल के वर्षों में, रसायन तकनीक के पानी की गुणवत्ता के आकलन के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में वादा दिखाया है। विशेष रूप से, in'vitro bioassays कि ज्ञात के माध्यम से अभिनय रसायन का जवाब में कार्रवाई 1,2 के विशेष मोड पर्यावरण निगरानी समुदाय से 3 बहुत रुचि के हैं। कई जांच पीने, सतह और अपशिष्ट जल 4 -6 के अंत: स्रावी गतिविधि यों तो इन विट्रो bioassays में कार्यरत है। इसके अलावा, bioassays के एक नंबर आणविक की शुरुआत की घटनाओं (जैसे, रिसेप्टर सक्रियण) जो संभावित प्रतिकूल परिणाम मार्ग के माध्यम से हानिकारक प्रभाव से जोड़ा जा सकता का विश्लेषण करती 7.8 लक्ष्य।

पानी की गुणवत्ता के आकलन के लिए bioscreening के विकास अपेक्षाकृत तेजी से किया गया है, इन विट्रो bioassay समापन में विभिन्न के सैकड़ों के साथ के लिए मूल्यांकन किया गया हो रही उनकीउपयोगिता 9,10। वर्तमान में, केवल bioassays के एक मुट्ठी अच्छा माप परिशुद्धता (प्रयोगशालाओं के भीतर) प्राप्त करने के लिए, जबकि पानी गुणों 5,6 के बीच अंतर करने की क्षमता का प्रदर्शन दिखाया गया है। विशेष रूप से इलाज किया अपशिष्ट जल प्रवाह के लिए, एस्ट्रोजेन और glucocorticoid स्टेरॉयड की घटना को सफलतापूर्वक किया गया है विट्रो transactivation assays 11,12 में उपयोग करने के लिए जिम्मेदार है। हालांकि, आज तक का सबसे अध्ययनों से कार्यरत है bioassays जिसका सेल लाइनों मालिकाना (और इस प्रकार व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं) कर रहे हैं, निरंतर देखभाल और हेरफेर, या दोनों की आवश्यकता होती है। नतीजतन, क्षमता जल संसाधन समुदाय रुकावट बनी हुई है को यह स्क्रीनिंग तकनीक हस्तांतरण करने के लिए प्रोटोकॉल का मानकीकरण करने, इंटर-प्रयोगशाला अंशांकन व्यायाम प्रदर्शन, और अंततः।

इन विट्रो bioassays अमेरिका ToxCast कार्यक्रम के माध्यम से संचालित की कम से कम एक आपूर्तिकर्ता "फ्रीज पिघलना और व्यावसायिक तौर पर उपयोग करने के लिए आसान में उपलब्ध 13 है4; प्रारूपों। ये विभाजन गिरफ्तार सेल "किट" उपचार 14 के विभिन्न स्तरों का प्रतिनिधित्व पानी से निकाला रसायनों की गतिविधि को मापने में मजबूत होना दिखाया गया है। हालांकि विक्रेता प्रोटोकॉल अलग-अलग रसायनों या मिश्रण के bioactivity स्क्रीन करने के लिए उपलब्ध हैं, उनमें से कुछ संशोधन की आवश्यकता से पहले वे पानी के नमूने के लिए लागू किया जा सकता है। इलाज किया अपशिष्ट जल प्रवाह 15, तूफानी जल अपवाह 16, पानी प्राप्त 17,18 और अधिक हाल ही में साफ पानी 19,20 कि पानी की गुणवत्ता समुदाय के हित के लिए जलीय मीडिया के प्रमुख उदाहरण हैं।

इस अध्ययन में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध का उपयोग कर पानी के नमूनों में अंत: स्रावी गतिविधि को मापने के लिए एक एकल, मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, विभाजन गिरफ्तार विट्रो transactivation bioassays में। हम पृष्ठभूमि, खुराक responsivity और tw के लिए प्रतिक्रिया की repeatability की एक व्यापक मूल्यांकन के माध्यम से प्रोटोकॉल की मजबूती का प्रदर्शनविशेष रुचि एस्ट्रोजेन रिसेप्टर और Glucocorticoid transactivation (ईआर और जीआर, क्रमशः) के ओ समापन। प्रोटोकॉल कैलिफोर्निया में सिस्टम मीठे पानी से इलाज अपशिष्ट जल प्रवाह और सतह के पानी के नमूने स्क्रीन करने के लिए लागू किया गया था।

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Protocol

1. लीजिए और प्रक्रिया जल नमूना (Escher एट अल से संशोधित। 9)

  1. एक स्वच्छ 1 एल एम्बर कांच हित के पानी के नमूने के साथ शीर्ष पर 1 ग्राम सोडियम azide और 50 मिलीग्राम एस्कॉर्बिक एसिड युक्त बोतल भरें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूना और 72 घंटा के भीतर प्रक्रिया।
    नोट: सोडियम azide बेहद जहरीला है और सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए। सुरक्षात्मक गियर (आंख / चेहरे, दस्ताने, कपड़े) का प्रयोग करें और एक ठीक से काम धूआं हुड में तौलना। वजन के लिए एक धातु रंग का प्रयोग न करें।
  2. उसके बाद 5-10 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर एक preconditioned ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) कारतूस के माध्यम से एक 1.6 माइक्रोन के ग्लास फाइबर फिल्टर के माध्यम से और नमूना गुजरती हैं। वैक्यूम पंप के दबाव प्रवाह की दर को नियंत्रित करने के लिए समायोजित करें।
  3. वैक्यूम 15 मिनट के लिए कारतूस सूखी।
  4. मेथनॉल के 10 मिलीलीटर, एसीटोन के 10 एमएल के द्वारा पीछा के साथ कारतूस Elute: हेक्सेन (1: 1, वी / वी)।
  5. उच्च शुद्धता नाइट्रोजन की एक सौम्य धारा के तहत ~ 1 मिलीलीटर eluate ध्यान लगाओ। विलायकडाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 500 μl जोड़ने और निकालने के 500 μl करने के लिए नीचे वाष्पन द्वारा विनिमय।
  6. एक एम्बर गिलास autosampler शीशी निकालने स्थानांतरण। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. परख विशेष संदर्भ रासायनिक और पानी निकालने की dilutions तैयार

  1. अंशांकन वक्र के लिए 9 dilutions तैयार करें।
    1. 100% DMSO में परख विशिष्ट संदर्भ रसायन के एक शेयर समाधान करें। अंतिम एकाग्रता ईआर परख के लिए 2 माइक्रोन 17β-estradiol, और जीआर परख के लिए 100 माइक्रोन के dexamethasone होना चाहिए। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर।
    2. एक बाँझ ट्यूब में परख माध्यम के 285 μl को उचित संदर्भ रासायनिक शेयर के 15 μl जोड़ें (ट्यूब # 1)। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा नमूना मिक्स।
    3. 8 अतिरिक्त ट्यूब (नलियों # 2-9) में परख माध्यम में 5% DMSO के एक समाधान के 200 μl जोड़ें।
    4. टब के माध्यम से ट्यूब # 2 के लिए # 1 ट्यूब से एक 100 μl विभाज्य स्थानांतरणई # 9 3 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रदर्शन करने के लिए। प्रत्येक पतला नमूना एक विभाज्य ले रही है और अगले ट्यूब में जोड़ने से पहले एक विंदुक के साथ अच्छी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए।
  2. परख माध्यम के 190 μl में DMSO के 10 μl मिश्रण से एक विलायक नियंत्रण नमूना तैयार करें।
  3. प्रत्येक पानी निकालने के लिए चार dilutions तैयार करें।
    1. पहला ट्यूब, परख माध्यम के 95 μL में पानी निकालने के 5 μL जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। तीन अन्य नलियों में परख माध्यम में 5% DMSO के 50 μl जोड़ें।
    2. अगले करने के लिए एक ट्यूब से समाधान के 50 μl के हस्तांतरण से एक 2 गुना कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना।

3. झल्लाहट Bioassay आचरण करने के लिए सेल निलंबन तैयार

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार परख विशिष्ट मध्यम तैयार। परख माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और उपयोग करने से पहले एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम।
  2. क्रायोजेनिक मुक्त के बाहर ईआर या जीआर विभाजन गिरफ्तार कोशिकाओं की एक शीशी ले लोZer और कोशिकाओं कोमल आंदोलन के साथ 2 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी रखकर जल्दी से पिघलना। 70% इथेनॉल के साथ शीशी शुद्ध करना और एक द्वितीय श्रेणी के जैविक सुरक्षा कैबिनेट में जगह है।
  3. शीशी सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर खोलें और परख के माध्यम के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को हस्तांतरण।
  4. 5 मिनट के लिए 200 x जी पर अपकेंद्रित्र।
  5. एक बाँझ कांच pipet का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला Aspirate और परख माध्यम की 6 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend।
  6. एक महत्वपूर्ण दाग समाधान के 5 μl के साथ सेल निलंबन के 5 μl मिलाएं और एक मतगणना कक्ष में एक विभाज्य जोड़ें।
  7. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना और सेल निलंबन में जीवित कोशिकाओं के घनत्व का अनुमान है। यदि आवश्यक हो तो परख माध्यम की मिलीलीटर प्रति 550,000 जीवित कोशिकाओं के अंतिम घनत्व प्राप्त करने के लिए पतला।

4. एक 96 अच्छी तरह से काले वॉल साफ-नीचे की थाली में प्लेट कोशिकाओं और पतला पानी निकालने जोड़े

  1. एक थाली बनाएंलेआउट है कि एक 9 सूत्री परख विशिष्ट अंशांकन वक्र, क्यूए / QC नमूने और प्रत्येक पानी निकालने के लिए कई dilutions भी शामिल है। एक 96 अच्छी तरह से थाली लेआउट का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है।
  2. दोहराने सेल मुक्त नियंत्रण कुओं को परख माध्यम के 90 μl जोड़ें।
  3. एक बाँझ pipetting जलाशय में सेल निलंबन डालो और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग अन्य कुओं के लिए सेल निलंबन के 90 μl जोड़ें।
  4. उचित कुओं के लिए चरण 2 के दौरान तैयार पतला नमूने के 10 μl जोड़ें। अच्छी तरह से प्रति DMSO के अंतिम एकाग्रता 0.5% अधिकतम होना चाहिए।
  5. एक ढक्कन के साथ कवर प्लेट और 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में जगह है।

आकृति 1
चित्रा 1:। एक 96 अच्छी तरह से थाली लेआउट का उदाहरण बहु अच्छी तरह से थाली एक परख विशिष्ट अंशांकन वक्र, 3 प्रकार के शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया हैक्यूए / क्यूसी नियंत्रण के और पानी निकालने के प्रति 4 dilutions (मीडिया ही है, DMSO में साफ माध्यम से कोशिकाओं और कोशिकाओं मध्यम नुकीला)। प्रत्येक नियंत्रण और पानी निकालने के कमजोर पड़ने तीन प्रतियों कुओं में विश्लेषण किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. लोड हो रहा है समाधान तैयार करने के लिए और अच्छी तरह से प्रत्येक जोड़े

  1. ऊष्मायन के बाद, प्लेट आरटी को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं। इस झल्लाहट bioassay के लिए, कदम 5.2 से 5.6 के माध्यम से प्रत्यक्ष प्रकाश के अभाव में आयोजित किया जाना चाहिए।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक 6x लोड हो रहा है समाधान तैयार है।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 6x लोड हो रहा है समाधान के 20 μl जोड़ें।
  4. पतला पानी निकालने की cytotoxicity मूल्यांकन करने के लिए एक अच्छी तरह से सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक के 10 μl जोड़ें।
  5. एल्यूमीनियम चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली सील।
  6. 2 घंटे के लिए आरटी पर अंधेरे में थाली सेते हैं।

6. उपाय cytotoxicity और अंत: स्रावी गतिविधि रिस्पांस

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन नीचे पढ़ने क्षमताओं के साथ microplate रीडर सेट करें।
  2. झल्लाहट transactivation bioassay के लिए, नीले रंग में प्रतिदीप्ति (409/460 एनएम, उत्तेजना (पूर्व) / उत्सर्जन (ईएम) तरंगदैर्ध्य) और हरी (409 पूर्व / 530 एम एनएम) चैनलों को मापने।
  3. cytotoxicity परख के लिए, 560 पूर्व / 590 एम एनएम पर प्रतिदीप्ति उपाय।

7. क्यूए / QC जाँच का आकलन डेटा की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए

  1. सेल मुक्त (मीडिया केवल) और कोशिकाओं केवल (स्वच्छ परख माध्यम में कोशिकाओं) नियंत्रण की औसत कच्चे प्रतिदीप्ति की तुलना करें। मीडिया से केवल पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम से कम 25% केवल कोशिकाओं-नियंत्रण की प्रतिक्रिया से कम होना चाहिए।
  2. कच्चे झल्लाहट डेटा की प्रक्रिया। दोनों 'ब्लू' और 'हरी' डेटासेट के लिए, अच्छी तरह से युक्त सभी सेल से सेल मुक्त नियंत्रण कुओं की औसत प्रतिदीप्ति घटाना। इसे परिकलित करेंप्रत्येक प्रयोगात्मक अच्छी तरह से करने के लिए नीले / हरी अनुपात।
  3. केवल कोशिकाओं और DMSO नियंत्रण के साथ कोशिकाओं के नीले / हरी अनुपात की तुलना करें। इन पर नियंत्रण के प्रतिदीप्ति मूल्यों 15% सापेक्ष मानक विचलन (आरएसडी) के भीतर होना चाहिए।
  4. नमूना एकाग्रता एक लॉग आणविक जन (लॉग एम) के रूप में व्यक्त के खिलाफ नीले / हरी अनुपात के रूप में परख विशिष्ट अंशांकन वक्र प्लॉट। ढलान, आर 2 की गणना करें और लॉग चुनाव आयोग 50 (50% प्रभाव एकाग्रता)। कैलिब्रेशन मानकों को 1 टेबल में सूचीबद्ध उम्मीद सीमा के भीतर होना चाहिए।
  5. सभी तीन प्रतियों कुओं के लिए आरएसडी की गणना। प्रतिकृति के बीच परिवर्तनशीलता 20% से कम होना चाहिए।
  6. cytotoxicity डेटा (560 पूर्व / 590 एम एनएम) के लिए, सभी सेल युक्त कुओं से सेल मुक्त नियंत्रण औसत (यानी मीडिया पृष्ठभूमि) घटाना।
  7. प्रत्येक नमूना के लिए औसत पृष्ठभूमि घटाया प्रतिदीप्ति की गणना। DMSO के नियंत्रण का एक प्रतिशत के रूप में जिसके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति डेटा प्लॉट। नमूना dilutions नहीं करना चाहिए20% से अधिक सेल मृत्यु दर केवल कोशिकाओं और DMSO के नियंत्रण की तुलना में दिखा रहे हैं।

8. डेटा विश्लेषण

  1. जांच (लोद) की परख सीमा न्यूनतम अंशांकन प्रतिक्रिया प्लस कि प्रतिक्रिया का मतलब की दो मानक विचलन के रूप में गणना।
  2. एक खुराक प्रतिक्रिया दिखा नमूने के लिए, चुनाव आयोग 50 निकाले जाते हैं   संदर्भ रसायन के 10 और 50% प्रभाव सांद्रता के बीच अंशांकन वक्र की एक रेखीय प्रतिगमन के ढलान का उपयोग कर पानी निकालने की।
  3. BEQ = संदर्भ रसायन के चुनाव आयोग 50 / EC पानी के नमूने की 50: Bioanalytical बराबर एकाग्रता (BEQ) सूत्र का उपयोग कर की गणना।

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन में, और इलाज नगरपालिका अपशिष्ट जल प्रवाह की 4x 24 घंटा समग्र नमूने, 6 हड़पने के दक्षिणी कैलिफोर्निया में सिस्टम मीठे पानी से सतह के पानी के नमूनों की एक क्षेत्र ultrapure पानी से मिलकर खाली इस प्रोटोकॉल वर्णन करने के लिए चयन किया गया था। 4 प्रवाह नमूने के 3 परंपरागत सक्रिय कीचड़ अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों ( "माध्यमिक प्रवाह"), और रेत / कार्बन निस्पंदन जोड़ा पद जैविक उपचार ( "तृतीयक प्रवाह") के साथ एक उन्नत अपशिष्ट उपचार संयंत्र से चौथे एक से थे। सतह के पानी के नमूनों अलग भूमि उपयोग (खुला, कृषि और शहरी) का प्रतिनिधित्व वाटरशेड से एकत्र किए गए थे।

पानी के अर्क के dilutions DMSO नियंत्रण (तालिका 1) की तुलना में कम से कम 20% सेल मनाया मृत्यु दर के साथ कोई स्पष्ट cytotoxicity दिखाया। सेल मुक्त (मीडिया केवल) पृष्ठभूमि कम था, और गकेवल कोशिकाओं और DMSO प्रतिक्रियाओं के साथ कोशिकाओं के बीच omparison संकेत दिया कि विलायक प्रतिदीप्ति पैमानों पर कोई प्रभाव पड़ा। परख विशिष्ट अंशांकन घटता के पैरामीटर्स, ढाल और लॉग चुनाव आयोग 50 सहित स्वीकार्य ऐतिहासिक मूल्यों (तालिका 1) समय के साथ अंशांकन घटता का एक अच्छा reproducibility के प्रदर्शन की सीमा के भीतर थे। के रूप में संदर्भ रसायन परख प्रतिक्रिया, इलाज अपशिष्ट जल और अन्य जांचकर्ताओं द्वारा ऐतिहासिक उपयोग में घटना की संभावना के बल पर आधारित था ईआर परख के लिए स्वीकार्य अंशांकन वक्र का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है। 17β-एस्ट्राडियोल और dexamethasone के चयन 20 22। तीन प्रतियों नमूनों के बीच जवाब में परिवर्तनशीलता कम से कम 20% आरएसडी था। इस प्रकार, सभी डेटा स्वीकार्य गुणवत्ता का होना समझा रहे थे, और बाद में अपशिष्ट जल और सतह के पानी के नमूनों में ईआर और जीआर bioactivity (में एनजी / एल BEQ रूप में व्यक्त) का अनुमान किया गया था।

(चित्रा 3) था। हालांकि, सतह के पानी के अर्क मजबूत ईआर या जीआर गतिविधि नहीं दिखा था। 10 के एक रेफरी के बावजूद, फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं अक्सर करने के लिए या लोद नीचे करीब थे। क्षेत्र को खाली लिए bioassay प्रतिक्रियाओं के अभाव की पुष्टि की है कि पता लगाने लोद ऊपर उल्लेख किया नमूना या प्रक्रियात्मक प्रयोगशाला कलाकृतियों का नतीजा नहीं थे।

ईआर और जीआर गतिविधियों 7 में पता चला रहे थे और 10 प्रतिनिधि के पानी के नमूनों में क्रमश: (तालिका 2) के 4, एनजी E2 / एल 17 के BEQs के उच्चतम साथ और 392 एनजी माध्यमिक अपशिष्ट में पाए डेक्स / एल। तृतीयक प्रवाह के नमूने में जीआर गतिविधि bioassay लोद नीचे था। इसी तरह, सबसे सतह के पानी के नमूनों लोद ऊपर कोई जीआर गतिविधि और माध्यमिक अपशिष्ट से ईआर गतिविधि के बहुत कम स्तर का प्रदर्शन किया।

चित्र 2
चित्रा 2:। ईआर परख खुराक प्रतिक्रिया वक्र के लिए अंशांकन वक्र के उदाहरण के लिए, मतलब प्रतिदीप्ति अनुपात (± SEM) के रूप में साजिश रची, sigmoidal और चुनाव आयोग 10 और चुनाव आयोग 50 मूल्यों का निर्धारण किया जाता है। वक्र के इस हिस्से को रेखीय प्रतिगमन का उपयोग फिट और एक bioassay बराबर एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3:। TheRrelative संवर्धन फैक्टर Bioassay समतुल्य सांद्रता के खिलाफ साजिश रची पानी के नमूनों की मतलब नीले / हरी प्रतिदीप्ति अनुपात (± SEM) (BEQ) नमूने जिसका कमजोर पड़ने श्रृंखला सीमा से ऊपर दो अंक की एक न्यूनतम के साथ एक एकाग्रता निर्भर प्रतिक्रिया दिखाने के लिए गणना कर रहे हैं पता लगाने (लोद) की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर) परख Glucocorticoid रिसेप्टर (जीआर) परख
अध्ययन के परिणाम स्वीकृति मानदंड अध्ययन के परिणाम स्वीकृति मानदंड
अंशांकन मानकों
लॉग इन करें मतलब EC50 (एम) -9.6 -10.1 को -9.1 -8.5 -9.0 -8.0 करने के लिए
ढलान मतलब 1.1 0.9 करने के लिए 1.5 2.0 1.8 करने के लिए 2.4
R2 0.99 > 0.95 0.99 > 0.95
क्यूए / क्यूसी नियंत्रण
मीडिया पृष्ठभूमि हाँ मीडिया केवल <सेल + मीडिया हाँ मीडिया केवल <सेल + मीडिया
Cytotoxicity (% मृत्यु) 0% <20% मृत्यु 0 5% करने के लिए <20% मृत्यु
नमूना परिशुद्धता (% आरएसडी) </ Td> 2 18% <20% 4 13% <20%

तालिका 1: के इलाज अपशिष्ट जल प्रवाह की Bioanalytical स्क्रीनिंग और सतह के पानी के नमूनों से क्यूए / क्यूसी परिणाम सारांश।

नमूना आईडी और विवरण ईआर BEQ (एनजी E2 / एल) जीआर BEQ (एनजी डेक्स / एल)
एक - पूर्ण माध्यमिक उपचार संयंत्र से अंतिम प्रवाह 6.4 248
बी - पूर्ण माध्यमिक उपचार संयंत्र से अंतिम प्रवाह 13 392
सी - पूर्ण माध्यमिक उपचार संयंत्र से अंतिम प्रवाह 17 236
डी - तृतीयक उपचार पी से अंतिम प्रवाहlant 2.3 <22
ई - कृषि क्षेत्र से सतह पानी <0.5 30
एफ - कृषि क्षेत्र से सतह पानी <0.5 <22
जी - शहरी क्षेत्र से सतह के पानी 4 <22
एच - शहरी क्षेत्र से सतह के पानी 0.9 <22
मैं - खुले मैदान से सतह के पानी 0.8 <22
जम्मू - खुले मैदान से सतह के पानी <0.5 <22
कश्मीर - क्षेत्र को खाली (ultrapure पानी) <0.5 <22

तालिका 2: एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर-BEQ) और glucocorticoid रिसेप्टर के लिए Bioassay समतुल्य सांद्रता (जीआर-BEQ) एसी। tivity कैलिफोर्निया (यूएसए) में एकत्र नमूनों में से तीन प्रकार के विश्लेषण कर रहे हैं: नगरपालिका अपशिष्ट जल प्रवाह (ई), सतही जल (ईजे), और क्षेत्र को खाली (कश्मीर)।

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Discussion

ऐसे 17β-estradiol (E2), एनजी / एल सांद्रता 23,24 पर इन रसायनों के लिए वारंट स्क्रीनिंग के रूप में पर्यावरण एस्ट्रोजेन, की अच्छी तरह से प्रलेखित शक्ति। इस अध्ययन में, अपशिष्ट जल अपशिष्ट के लिए ईआर प्रतिक्रिया (BEQ रेंज: 2.3 करने के लिए 17 एनजी E2 / एल) 4 के लिए किया गया ऑस्ट्रेलियाई WWTPs 20 से माध्यमिक प्रवाह के लिए सूचना दी तुलना में कुछ अधिक एनजी E2 / एल जबकि सतह के पानी के लिए (BEQs <0.5, ) रेंज 11 एनजी E2 / एल) 16 को सतह और तूफानी जल अन्यत्र (<1 के लिए सूचना के भीतर थे। ईआर गतिविधि के निम्न स्तर सतह के पानी के नमूनों में मापा जाता है के बावजूद, इस परख के पानी की गुणवत्ता के आकलन के लिए एक प्रासंगिक स्क्रीनिंग समापन बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है। ऐसे Bisphenol एक और alkylphenol surfactants के रूप में एस्ट्रोजेन अक्सर जलीय वातावरण में पता चला रहे हैं, लेकिन वे पारंपरिक विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान का उपयोग अंदाजा लगाना मुश्किल हो सकता है। ईआर-सेल assays भी, के रूप में कोजिमा एट अल द्वारा दिखाया वर्तमान में और हाल में पंजीकृत कीटनाशकों की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी साबित हो सकता है25।

जीआर गतिविधि सभी 4 प्रवाह इस अध्ययन (तालिका 2) में विश्लेषण के नमूनों में परिमाण के एक आदेश से ईआर गतिविधि पार हो गई। इस प्रवृत्ति अपशिष्ट जल प्रवाह 14 पर पिछले अध्ययनों के अनुरूप है, और जीआर-BEQs के लिए रेंज यहां बताया थोड़ा अधिक है, लेकिन एक ही इन विट्रो bioassay 12 का उपयोग अन्य माध्यमिक अपशिष्ट के लिए सूचना के बराबर है। एक अलग सेल bioassay का उपयोग करना, जापान में अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों से प्रवाह के लिए GR-BEQs के लिए सीमा कम (<3 करने के लिए 78 एनजी डेक्स / एल) वर्तमान अध्ययन 22 में माध्यमिक प्रवाह के लिए रिपोर्ट उन लोगों की तुलना में था। एकल सतह के पानी का नमूना है कि 30 एनजी डेक्स / एल (2 टेबल, नमूना ई) की एक अधिकतम जीआर प्रतिक्रिया पंजीकृत के अपवाद के साथ, शेष सतह के पानी के नमूनों में जीआर गतिविधि के लिए डच सतह के पानी से 21 कम गतिविधि के साथ सूचना अनुरूप था । हालांकि, पर्यावरण imजीआर सक्रिय रसायनों के लिए समझौता कम अच्छी तरह से ईआर के लिए ज्यादा सक्रिय रसायन 26 विशेषता है, उच्च आदेश प्रभाव एक चुनौती के लिए क्षमता का आकलन कर रही है।

पारंपरिक रासायनिक विश्लेषण, लिखित प्रोटोकॉल और एक प्रदर्शन के आधार क्यूए का उपयोग माप के सत्यापन के पालन के साथ के रूप / क्यूसी दृष्टिकोण डेटा की गुणवत्ता और मजबूती अधिकतम हो। हालांकि पानी की गुणवत्ता के आकलन के लिए अनुकूलित सेल bioassays के सत्यापन के विकसित और सुधार करने के लिए, क्यूए / QC मानकों को पहले Mehinto एट अल। 14 में उल्लिखित है और इस अध्ययन के लिए लागू की माप से पता चला है कि हमारे परिणाम prespecified दिशानिर्देश के मूल्यों के भीतर अच्छी तरह से थे जारी रहेगा (तालिका 1 )। इन bioassays के लिए अंशांकन वक्र मापदंडों के मानदंड है कि कोशिकाओं (जैसे, cytotoxicity) की व्यवहार्यता का आकलन के अलावा के साथ मुख्य अंतर का प्रतिनिधित्व करने वाले अन्य विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल औजार (जैसे, जीसी एमएस) के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के, दर्पण। एक और परिचालनएक उच्च throughput प्रारूप में कोशिकाओं का उपयोग संभव बनाया फर्क कई नमूना dilutions कि एकाग्रता निर्भर प्रतिक्रिया की उम्मीद जब bioactivity (चित्रा। 2) में मापा जाता है उदाहरण देकर स्पष्ट का समावेश है। नमूना माप, कम ईआर और तृतीयक प्रवाह (नमूना डी) तीन माध्यमिक प्रवाह नमूनों की तुलना के लिए जीआर प्रतिक्रियाओं की समीक्षा में (एसी) तालिका में हमारी bioassay स्क्रीनिंग परिणामों के सापेक्ष सटीकता के अतिरिक्त सबूत उपलब्ध कराता है 2। नियंत्रण के निगमन या संदर्भ के नमूने है कि ब्याज की मैट्रिक्स का प्रतिनिधित्व करते हैं, इस मामले के पानी में, आगे के भीतर और विशेष रूप से मापने संस्थाओं भर bioassay परिणामों की तुलना करने की क्षमता में वृद्धि होगी।

ईआर और जीआर transactivation सेल इस अध्ययन में उपयोग लाइनों की प्रतिक्रियाएं मजबूत एगोनिस्ट E2 और dexamethasone की गतिविधि के सापेक्ष व्यक्त कर रहे थे, क्रमशः। यह अनुमति देता है के लिए bioactivity का एक मात्रात्मक अनुमान व्यक्त कियाSA Bioassay बराबर एकाग्रता (BEQ)। यह आगे रसायनों की जांच है कि bioassay प्रतिक्रिया के लिए योगदान करते हैं, यानी अलग-अलग पारंपरिक विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान के माध्यम से निर्धारित एगोनिस्ट की सांद्रता के साथ BEQs के एक प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है। इस अवधारणा को प्रेरणा का एजेंट के रूप में भी प्रभाव निर्देशित विश्लेषण में जाना जाता है के नैदानिक ​​जांच के निर्देशन में bioscreening का जोड़ा उपयोगिता को रेखांकित करता है।

चूंकि एसपीई को नियमित दवाइयों और अन्य "उभरते contaminants" पानी से की एक विस्तृत श्रृंखला को अलग-थलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, हम एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 9, 20 है कि एक sorbent पानी में दोनों हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक रसायन पर कब्जा करने के लिए बनाया गया विशेष रुप से कार्यरत हैं। हालांकि हम इस तकनीक का उपयोग सभी बायोएक्टिव कार्बनिक यौगिकों की मात्रात्मक कब्जा मान, अतिरिक्त काम पूरी तरह से मानकीकरण और इस तरह के निष्कर्षण तरीकों के प्रदर्शन को मान्य करने की जरूरत है। सेल परख के प्रकार के इस अध्ययन में कार्यरत उपस्थित हो सकता हैएक और सीमा। ये assays contaminants और परमाणु रिसेप्टर्स के बीच बातचीत को मापने और इस तरह के रासायनिक झिल्ली रिसेप्टर के रूप में खाते अन्य संभावित बातचीत, में नहीं लेते। इस प्रकार, यह संभव है कि स्क्रीनिंग प्रतिक्रियाओं यहाँ मापा को कम करके आंका गया था। नमूना निकासी की तरह, वहाँ कोई मानकीकृत तरीके सेल परख डेटा का विश्लेषण करने के लिए और अलग अलग दृष्टिकोण अलग परिणाम का उत्पादन कर सकते हैं। रेखीय इस अध्ययन में इस्तेमाल अंशांकन वक्र के निचले आधे के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए मॉडल प्रतिगमन सभी सेल assays के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है, खासकर अगर मॉडलिंग की प्रतिक्रिया वर्तमान अध्ययन में निर्दिष्ट अपेक्षाकृत संकीर्ण सीमा से आगे बढ़ाया है। उपरोक्त मुद्दों में अतिरिक्त जांच किस हद तक इन उपकरणों का एक मजबूत निगरानी उपकरण के रूप में लागू किया जा सकता को समझने की जरूरत है।

जबकि नींव के ज्यादा ईआर और जीआर अंत: स्रावी सक्रिय रसायनों के लिए स्क्रीन के रूप में के लिए दिया जा रहा है, शोधकर्ताओं के दायरे का विस्तार कर रहेBioanalytical उपकरण कार्यों के अन्य प्रासंगिक मोड, जैसे, androgenicity, genotoxicity, न्यूरोटॉक्सिटी और immunotoxicity 9,27 शामिल करने के लिए। एक अधिक संपूर्ण उपकरण बॉक्स में जाना जाता है और / या अज्ञात रसायन है कि 28, अब और भविष्य में हो सकता है, विभिन्न जलीय वातावरण में 19 के परिवर्तन के उत्पादों सहित बायोएक्टिव रसायन, के लिए स्क्रीन करने की क्षमता में वृद्धि होगी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
GeneBLAzer ER alpha DA assay kit ThermoFisher K1393 Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
GeneBLAzer GR DA assay kit ThermoFisher K1391 Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
PrestoBlue cell viability reagent  ThermoFisher A-13261
Trypan blue, 0.4% in PBS Sigma-Aldrich  T8154 Also available at ThermoFisher
Corning 96-well black wall, clear-bottom plate Corning 3603 Individually wrapped, sterile with lid
Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM Sigma-Aldrich  WHA1820025
Microplate aluminum sealing film E&K Scientific T592100
Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent Waters WAT106202
17β Estradiol Sigma-Aldrich  E2758 CAS #50-28-2
Ascorbic acid Fisher Scientific A61-100 Also available at Sigma-Aldrich
Dexamethasone  Sigma-Aldrich  D4902 CAS #50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich  D8418 Molecular grade
Solvents (acetone, hexane, methanol) Fisher Scientific HPLC grade
Sodium azide Sigma-Aldrich  S2002 Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore.
Automated cell counter or hemocytometer Various* Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher.
Class II biological safety cabinet Various*
CO2 incubator Various*
Cryogenic freezer  Various* Liquid nitrogen storage dewar is recommended. 
Fluorescence microplate-reader Various*  The reader must have bottom read capabilities.
* No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space.

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 118 Bioanalytical स्क्रीनिंग इन विट्रो transactivation bioassay पानी की गुणवत्ता अंत: स्रावी सक्रिय रसायन विभाजन गिरफ्तार कोशिकाओं एस्ट्रोजन रिसेप्टर glucocorticoid रिसेप्टर
जल का उपयोग करने में अंतःस्रावी गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Transactivation bioassays
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Mehinto, A. C., Jayasinghe, B. S.,… More

Mehinto, A. C., Jayasinghe, B. S., Vandervort, D. R., Denslow, N. D., Maruya, K. A. Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays. J. Vis. Exp. (118), e54725, doi:10.3791/54725 (2016).

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