Abstract
ב bioassays transactivation במבחנה הראתה הבטחה ככלים לניטור איכות מים, אולם יישומם ואת היישום נרחב התעכב בין היתר בשל חוסר שיטות סטנדרטיות וזמינות של טכנולוגיה חזקה, ידידותי למשתמש. במחקר זה, זמין מסחרי, שורות תאים נעצר חלוקה הועסקו להקרין כמותית לפעילות האנדוקרינית של כימיקלים נוכחים דגימות מים המעניינות מקצוע איכות סביבה. פרוטוקול יחיד, סטנדרטי שכלל אבטחת איכות מקיפה / בקרת איכות (QA / QC) בדיקות פותחתה עבור פעילות קולטן אסטרוגן Glucocorticoid (ER ו GR, בהתאמה) באמצעות העברת אנרגית תהודת קרינה מבוססת תאים assay (סריג). דוגמאות של השפכים שפכים עירוניים מטופלים ומים עיליים ממערכות מים מתוקים בקליפורניה (ארה"ב), חולצו באמצעות מיצוי שלב מוצק ונותחו לפעילות האנדוקרינית באמצעות פרוטו סטנדרטיתcol. רקע מנה-תגובה עבור כימיקלי התייחסות ספציפי נקודות קצה עומדים בכללי QA / QC כנחוץ למדידה אמינה. תגובת הקרנת מבדק עבור דגימות מים עיליות הייתה במידה רבה לא ניתן לגילוי. לעומת זאת, דגימות שפכים ממפעלים טיפול שניוני היו הפעילות למדידה הגבוהה ביותר, עם ריכוזים המקבילה מבדק משוער (BEQs) עד 392 ng dexamethasone / L עבור GR ו -17 ng 17β-אסטרדיול / L עבור ER. תגובת המבדק למדגמת שליישונים בשפכים הייתה נמוכה מזה שנמדד לקולחים משניים, מה שמעיד על התחתונה שיורית של כימיקלים האנדוקרינית פעילים לאחר טיפול מתקדם. פרוטוקול זה הראה כי ב bioassays transactivation במבחנה לנצל זמינים מסחרית, תא נעצר חלוקה "ערכות", ניתן להתאים למסך פעילות אנדוקרינית במים.
Introduction
לניטור איכות מים הנוכחי מבוסס על היכולת בודדת ומדויק למדוד את המופע של מזהמים כימיים כמו פרוקסי לחשיפת חיות ובני האדם. עם זאת, ניטור הפרדיגמה הערכה כימי-ידי-זה כימי לא יכול לעמוד בקצב עם היקום הכימי המשתנה שאנו מתמודדים איתה. ככל שאנו לומדים יותר על הגורל ואת ההשפעות של כימיקלים סינטטיים וטבעיים, אנו ממשיכים לחפש כלי מדידה שכתובת צפויות השפעות ביולוגיות, וכי בעת ובעונה האחת חסינים לשינויי ייצור כימיקלים, שימוש קלט סביבתי. כלים כאלה הם רלוונטיים במיוחד להבנה אם כימיקלים ידועים או חדשים, ומוצרים טרנספורמציה, ראויים לתשומת לבנו. יתר על כן, תערובות מורכבות של כימיקלים הנמצאים במים מופנות כהלכה על ידי ניטור כימי יחיד. לפיכך, אנו עומדים בפני האתגר של מודרניזציה של ארגז כלי בקרה קיים לכתובת טובה יותר את הנושאים הללו tha מים עילייםt לקבל הזרמת השפכים קולחין נגר עירוני / stormwater.
בשנים האחרונות, טכניקות bioanalytical הראו הבטחה ככלי הקרנה להערכת איכות מים. בפרט, bioassays in'vitro המגיב כימיקלים מתנהגים באמצעות ידוע, מצבי פעולה ספציפיים 1,2 הם עניין רב לקהילת הניטור הסביבתי 3. מספר מחקרים מועסקים bioassays במבחנה לכמת את הפעילות האנדוקרינית של שתייה, משטח wastewaters 4 -6. יתר על כן, מספר bioassays למקד אירועים מולקולריים ייזום (למשל, הפעלת קולטן) אשר ניתן לקשר פוטנציאל להשפעות המזיקות באמצעות מסלול תוצאה שלילי מנתח 7,8.
האבולוציה של bioscreening להערכת איכות מים כבר יחסית מהירה, עם מאה שונים קצה מבדק במבחנה לאחר הוערכה עבור שלהםשירות 9,10. נכון לעכשיו, רק קומץ של מבדקים הוכח להשיג דיוק מדידה טוב (בתוך מעבדות) תוך הפגנת היכולת להבחין בין איכויות מי 5,6. לקבלת קולחים קולחים בפרט, את המופע של אסטרוגנים סטרואידים בסטרואידים כבר היוו בהצלחה באמצעות מבחני transactivation במבחנה 11,12. עם זאת, רוב המחקרים שנערכו עד כה, המועסקים bioassays שורות תאים אשר הנם רכוש (ובכך אינו זמין נרחב), דורשים טיפול מתמשך ומניפולציה, או שניהם. כתוצאה מכך, היכולת לבצע סטנדרטיזציה פרוטוקולים, לבצע תרגילי כיול הבינה-מעבדה, ובסופו של דבר להעביר טכנולוגית הקרנה זה למשאבי מי הקהילה נשארה הפריעה.
לפחות ספק אחד של מבדקים במבחנה בדקה באמצעות תכנית ToxCast ארה"ב זמין מסחרי 13 קל לשימוש "הקפאת הפשרה4; פורמטים. חטיבת-נעצר אלו תא "ערכות" הוכחו להיות חזקים מדידת פעילותם של כימיקלים המופקים מים המייצגים רמות שונות של טיפול 14. למרות פרוטוקולי הספק זמינים להקרין את הפעילות הביולוגית של כימיקלים או תערובות בודדים, חלקם דורשים שינויים לפני שהם יכולים להיות מיושמים על דגימות מים. קולחים שפכים 15, נגר stormwater 16, קבלת המים 17,18 ועוד 19,20 מים ממוחזרים לאחרונה הם דוגמאות מובהקות של התקשורת מימית כי הם בעלי עניין לקהילה איכות המים.
מחקר זה מציג פרוטוקול יחיד, סטנדרטי למדוד את הפעילות האנדוקרינית בדגימות מים באמצעות זמינים מסחריים, חטיבה-נעצרה bioassays transactivation במבחנה. הפגנו חוסנו של פרוטוקול באמצעות הערכה מקיפה של הרקע, תגובתיות המינון ואת הדירות של התגובה twנקודות קצה o של אסטרוגן עניין מיוחד ו transactivation קולטן Glucocorticoid (ER ו GR, בהתאמה). הפרוטוקול היה מוחל על דגימות מסך השפכים קולחין ומים עיליים ממערכות מים מתוקים בקליפורניה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. איסוף דגימת מי תהליך (השתנה מ Escher et al. 9)
- מלאו בקבוק זכוכית ענבר נקי 1 L המכיל אזיד הנתרן 1 גרם ו -50 מ"ג חומצה אסקורבית לפסגה עם דגימת מים של עניין. מדגם חנות ב 4 מעלות צלזיוס, תהליך בתוך 72 שעות.
הערה: אזיד הנתרן הוא רעיל מאוד ויש לטפל בזהירות. השתמש בציוד מגן (העיניים / פנים, כפפות, ביגוד) ולשקול בתוך קטר-ברדס מתפקד כראוי. אין להשתמש מרית מתכת לשקילה. - להעביר את המדגם דרך פילטר סיבי זכוכית 1.6 מיקרומטר ולאחר מכן באמצעות מיצוי שלב preconditioned מוצק דיו (SPE) בקצב זרימה של 5-10 מ"ל / דקה. התאם את הלחץ של משאבת ואקום כדי לשלוט על קצב הזרימה.
- אבק לייבש את המחסנית במשך 15 דקות.
- Elute את מחסנית עם 10 מ"ל של מתנול, ואחריו 10 מ"ל של אצטון: הקסאן (1: 1, V / V).
- תתרכז eluate ל ~ 1 מ"ל תחת זרם עדין של חנקן טוהר גבוהה. מֵמֵסהחליפין על ידי הוספת 500 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO) ו מתאדים לחלץ עד 500 μl.
- מעביר את תמצית בקבוקון autosampler כוס ענבר. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
2. כן דילולים של כימיקלי הפנית Assay הספציפיים חלץ מים
- כן 9 דילולים עבור עקומת הכיול.
- כן פתרון מניות של כימיקל ההתייחסות הספציפי assay ב 100% DMSO. הריכוז הסופי חייב להיות 2 מיקרומטר 17β-אסטרדיול עבור assay ER, ו- 100 מיקרומטר dexamethasone עבור assay GR. אחסן את פתרונות המניה ב -20 ° C.
- הוסף 15 μl של מניית התייחסות הכימית המתאימה ל 285 μl של מדיום assay בתוך שפופרת סטרילית (צינור # 1). מערבבים את המדגם על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- הוסף 200 μl של פתרון של 5% DMSO במדיום assay ב 8 צינורות נוספים (צינורות # 2-9).
- העברת aliquot 100 μl מהצינור # 1 עד הצינור # 2 באמצעות גיגיתדואר # 9 לבצע סדרת דילול של פי 3. כל דגימה בדילול חייב להיות מעורב באופן יסודי עם טפטפת לפני נטילת aliquot והוספתה הצינור הבא.
- כן מדגם שליטה ממס על ידי ערבוב 10 μl של DMSO ב 190 μl של מדיום assay.
- הכן ארבעה דילולים עבור כל תמצית מים.
- בצינור הראשון, להוסיף 5 μL של תמצית המים 95 μL של המדיום assay ומערבבים היטב. הוסף 50 μl של 5% DMSO במדיום assay בשלושה צינורות אחרים.
- בצע דילול פי 2 על ידי העברת 50 μl של פתרון מהצינור אחד למשנהו.
3. מכינים את תרחיף תא לנהל את המבדק סריג
- הכן את המדיום הספציפי assay פי הוראות היצרן. בינוני assay חייב להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, חימם עד 37 ° צלזיוס באמבט מים לפני השימוש.
- קח בקבוקון של תאים נעצר חלוקת ER או GR מתוך חינם קריוגניזר להפשיר את התאים במהירות על ידי הצבת את הבקבוקון א-אמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות עם תסיסה עדינה. לטהר את הבקבוקון עם 70% אתנול ומניח אותו בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II.
- פתח את בקבוקון שימוש בטכניקות aseptic ולהעביר את התאים לתוך 10 מ"ל של מדיום assay.
- צנטריפוגה ב g 200 x למשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant באמצעות pipet זכוכית סטרילית resuspend התא גלולה ב 6 מ"ל של מדיום assay.
- מערבבים 5 μl של ההשעיה תא עם 5 μl של פתרון הכתם חיוני ולהוסיף aliquot לתוך תא הספירה.
- ספירת תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ אור או נגד תא אוטומטי להערכת הצפיפות של תאי חי השעית התא. לדלל במידת צורך להשיג צפיפות סופית של 550,000 תאים חיים לכל מיליליטר של מדיום assay.
4. פלייט תאים פלייט נקה התחתונה קיר שחור 96-היטב ומוסיפים מים תמצית מדולל
- צור צלחתפריסה הכוללת עקומת כיול ספציפי assay 9 נקודות, דגימות QA / QC דילולים מרובים עבור כל תמצית מים. דוגמה של פריסת צלחת 96-היטב מוצג באיור 1.
- להוסיף 90 μl של מדיום assay אל בארות שליטת תא ללא לשכפל.
- יוצק את השעית תא מאגר pipetting סטרילי ולהוסיף 90 μl של השעית תא אל הבארות האחרות באמצעות פיפטה רבה.
- הוסף 10 μl של הדגימות בדילול המוכנות במהלך שלב 2 עד הבארות המתאימות. הריכוז הסופי של DMSO לכל טוב חייב להיות לכל היותר 0.5%.
- מכסים את הצלחת עם מכסה ומניחים אותו בתוך חממה 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
איור 1:. דוגמא של פריסת פלייט 96-גם הצלחת רבה גם נועדה לכלול עקומת כיול ספציפית assay, 3 סוגיםבקרות QA / QC (מדיה בלבד, תאים בינוניים ותאי נקי ב DMSO ממוסמרים בינונית) ו -4 דילולים לכל תמצית מים. מלאות דילול כל תמצית מים מנותח בבארות בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5. מכינים את פתרון טעינה הוסף כל טוב
- לאחר דגירה, לאפשר את הצלחת לאזן RT. עבור מבדק סריג זה, צעדים 5.2 דרך 5.6 צריכים להתנהל בהיעדר האור הישיר.
- כן פתרון טעינת 6x פי הוראות היצרן.
- הוסף 20 μl של פתרון טעינת 6x היטב כל אחד.
- הוסף 10 μl של מגיב כדאיויות תא היטב כל להעריך את הרעילות של מי תמצית המדוללת.
- חותם את הצלחת עם סרט דבק אלומיניום.
- דגירת הצלחת בחושך ב RT עבור שעה 2.
6. Cytotoxicity מדוד ותגובה פעילות האנדוקרינית
- הגדר את קורא microplate עם היכולות תחתונות הקריאה הבאות הוראות היצרן.
- עבור מבדק transactivation הסריג, למדוד קרינה הכחולה (409/460 ננומטר, עירור (Ex) / פליטה (Em גל)) וירוק (409 Ex / 530 Em ננומטר) ערוצים.
- עבור assay cytotoxicity, למדוד קרינה ב 560 Ex / 590 ננומטר Em.
7. להעריך QA / בדיקות QC כדי לקבוע את איכות הנתונים
- השווה את קרינת הגלם הממוצעת של (מדיה בלבד) ללא תא ותאי בלבד (תאים בינוניים assay נקי) שולט. קרינת הרקע בתקשורת בלבד צריכה להיות לפחות 25% נמוכות יותר מאשר בתשובתו של שליטת התאים בלבד.
- לעבד את נתוני סריג הגלם. עבור שני "הכחול" ואת מערכי הנתונים 'הירוקים', להפחית את הקרינה הממוצעת של בארות שליטה ללא תאים מכל התא המכיל גם. חשב אתיחס כחול / ירוק עבור כל טוב ניסיוני.
- השוואת כחול / ירוק יחס של תאים בלבד ותאים עם פקדי DMSO. ערכי קרינה של בקרות אלה צריכים להיות בתוך 15% סטיית תקן יחסית (RSD).
- שרטט את עקומת הכיול הספציפית assay כמו יחס כחול / ירוק נגד ריכוז המדגם המבוטא מסה מולקולרית יומן (log M). לחשב את השיפוע, R 2 והיכנס EC 50 (ריכוז אפקט 50%). פרמטרי כיול צריכים להיות בטווח הצפוי המפורט בטבלת 1.
- חשב את RSD לכל בבארות בשלושה עותקים. ההשתנות בין משכפל צריכות להיות פחות מ -20%.
- לנתוני cytotoxicity (560 Ex / 590 Em ננומטר), להפחית את הממוצע מלא ללא תאים (רקע בתקשורת כלומר) מכל בארות התא המכיל.
- חשב את קרינת רקע-מופחתים הממוצעים עבור כל דגימה. מגרש את נתוני הקרינה וכתוצאה כאחוז השליטה DMSO. דילולים מדגמים לא צריכיםבתצוגות יותר תמותת תאים 20% בהשוואה לקבוצת ביקורת תאים בלבד ו DMSO.
8. ניתוח נתונים
- חשב את מגבלת assay של זיהוי (לוד) כתגובת כיול המינימום בתוספת שתי סטיות תקן של הממוצע של בתגובה כי.
- לקבלת דוגמיות מראה מנת תגובה, לגזור את EC 50 של תמצית המים באמצעות שיפוע רגרסיה ליניארית של עקומת הכיול בין 10 ו -50 ריכוזי השפעת% של כימיקל ההתייחסות.
- חשב את הריכוז Equivalent Bioanalytical (רר"מ) באמצעות הנוסחה: רר"מ = 50 EC של כימיים התייחסות / EC 50 של דגימת מים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר הנוכחי, דגימות מרוכבי 4x 24 שעות של שפכי שפכים עירוניים מטופלים, 6 דגימות לתפוס מים עיליים ממערכות מים מתוקות בדרום קליפורניה שדה ריק המורכב מי ultrapure נבחרו כדי להמחיש בפרוטוקול זה. 3 מתוך 4 דגימות השפכים היו מצמחי טיפול בשפכי בוצה קונבנציונליים מופעלים ( "שפכים משניים"), ואת הרביעי ממפעל טיפול בשפכים מתקדם עם טיפול סינון חול / פחמן הוסיף פוסט ביולוגי ( "קולח שלישוניים"). דגימות מים עיליות נאספו היקוות מייצג שימושי קרקע שונה (פתוחה, חקלאית ועירונית).
דילולים של תמציות מים לא הראו רעילות לכאורה עם התמותה התא פחות מ -20% צפו בהשוואה לקבוצת הביקורת DMSO (טבלה 1). Cell-חינם (רק התקשורת) הרקע היה נמוך, ואת ג omparison בין תאים בלבד ותאים עם תגובות DMSO ציין כי הממס לא היה השפעה מדידה על מדידות הקרינה. פרמטרים של עקומות כיול ספציפי assay, לרבות מדרון והיכנס 50 EC, היו בטווח של ערכים היסטוריים מקובל (טבלה 1) הוכחת שחזור טוב של עקומות כיול לאורך זמן. דוגמא עקומה כיול מקובל עבור assay ER מוצגת באיור 2. הבחירה של 17β-אסטרדיול dexamethasone כימיקלי הפניה התבססו על עוצמת תגובת assay, סבירות להתרחשות קולחי שימוש היסטורי על ידי חוקרים אחרים 20 22. ההשתנות בתגובה בין דגימות בשלושה עותקים היו פחות מ -20% RSD. לפיכך, כל הנתונים נחשבו כבעלי איכות מקובלת, ושמשו לאחר מכן להעריך את ER ו ביולוגי GR (מבוטא רר"מ ב ng / L) בדגימות מי שפכי שטח.
ss = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> פקטור העשרה יחסית (REF) של 5 עד 10 ו -4 דילולים לדגימה הופיע מתאים להקרנה של דגימות המים שנבדקו במסגרת המחקר הנוכחי. רוב דגימות שפכי WWTP הראה תגובת מינון מעל לוד היא bioassays ER ו GR; היה הדילול הנמוך ביותר תשובה בתוך עקומת הכיול ואת הדילול הגבוה ביותר היה בדרך כלל מתחת לוד (איור 3). עם זאת, תמציות מים עיליים לא להראות ER חזק או פעילות GR. על אף REF 10, תגובות הניאון היו לעתים קרובות קרובות או מתחת בלוד. עדר תגובות מבדק עבור השדה הריק אשר כי לתגליות שצוינו לעיל לוד לא היו התוצאה של חפצי דגימה או במעבדה פרוצדורליים.
ER ופעילויות GR אותרו 7 ו -4 מתוך 10 דגימות מים נציג, בהתאמה (לוח 2), עם הגבוהה ביותר של BEQs של 17 ng E2 / L ו 392 ng Dex / L נמצא הקולחים המשניים. פעילות GR במדגם של שפכים שליישונים הייתה מתחת לוד המבדק. כמו כן, דגימות מים העיליים ביותר הציגו שום פעילות GR מעל לוד רמות נמוכות יותר של פעילות ER מ הקולחים המשניים.
איור 2:. דוגמה של עקומת כיול עבור assay ER עקומת מנה תגובה, זממו כיחס הקרינה הממוצעת (± SEM), הוא sigmoidal והשתמשו כדי לקבוע את 10 EC ו- EC 50 ערכים. חלק זה של העקומה מצויד באמצעות רגרסיה ליניארית המשמש לחישוב ריכוז שווה ערך מבדק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
les / ftp_upload / 54,725 / 54725fig3.jpg "/>
איור 3:. Mean הכחול / יחס קרינה ירוק (± SEM) של דגימות מים זממו נגד theRrelative עשר פקטור ריכוזי Equivalent מבדק (רר"מ) מחושב עבור דגימות אשר סדר הדילול להראות ריכוז תגובה תלויה במינימום שתי נקודות מעל הגבול של זיהוי (לוד). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| Assay קולטן אסטרוגן (ER) | Glucocorticoid קולטן (GR) Assay | |||
| תוצאות המחקר | קריטריונים לקבלה | תוצאות המחקר קריטריונים לקבלה | ||
| פרמטרי כיול | ||||
| מתכוון להיכנס EC50 (M) | -9.6 | -10.1 ל -9.1 | -8.5 | -9.0 ל -8.0 |
| Mean מדרון | 1.1 | 0.9 כדי 1.5 | 2.0 | 1.8 כדי 2.4 |
| R2 | 0.99 | > 0.95 | 0.99 | > 0.95 |
| שולטת QA / QC | ||||
| רקע מדיה | כן | <תא + מדיה בלבד | כן | <תא + מדיה בלבד |
| Cytotoxicity (תמותת%) | 0% | <20% תמותה | 0 עד 5% | <20% תמותה |
| דיוק לדוגמא (RSD%) </ Td> | 2 עד 18% | <20% | 4 עד 13% | <20% |
טבלה 1: סיכום של תוצאות QA / QC מ הקרנת Bioanalytical של קולחים קולחים דוגמאות מים עיליים.
| ID ותיאור לדוגמא | ER-רר"מ (ng E2 / L) | GR-רר"מ (ng Dex / L) |
| A - קולחים סופיים של מתקן טיהור תיכוני מלא | 6.4 | 248 |
| B - קולחים סופיים של מתקן טיהור תיכוני מלא | 13 | 392 |
| C - קולחים סופיים של מתקן טיהור תיכוני מלא | 17 | 236 |
| D - קולחים סופיים מ- p טיפול שליישוניםLant | 2.3 | <22 |
| E - מים עיליים מאזור חקלאי | <0.5 | 30 |
| F - פני מים מאזור חקלאי | <0.5 | <22 |
| G - פני מים מאזור עירוני | 4 | <22 |
| H - פני מים מאזור עירוני | 0.9 | <22 |
| ואני - פני מים משדה פתוח | 0.8 | <22 |
| J - משטח מים בשטח פתוח | <0.5 | <22 |
| K - שדה ריק (מי ultrapure) | <0.5 | <22 |
טבלה 2: ריכוזי Equivalent מבדק עבור קולטן אסטרוגן (ER-רר"מ) ו Glucocorticoid קולטן (GR-רר"מ) ac. tivity שלושה סוגים של דגימות שנאספו בקליפורניה (ארה"ב) מנותחים: בשפכי שפכים עירוניים (AD), מים עיליים (EJ), ואת שדה הריק (K).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עוצמתה המתועדת היטב של אסטרוגנים סביבתיים, כגון 17β-אסטרדיול (E2), הקרנת כתבים לכימיקלים אלה בריכוזי ng / L 23,24. במחקר זה, תגובת ER לקולחי שפכים (טווח רר"מ: 2.3 כדי 17 ng E2 / L) היה גבוה במעט ודווח שפכים משניים מן WWTPs האוסטרלי 20, ואילו BEQs במים עיליים (<0.5 כדי -4 ננוגרם E2 / L ) היו בטווח ודווח השטח stormwater במקום אחר (<1 עד 11 ng E2 / L) 16. למרות הרמות הנמוכות של פעילות ER נמדדו דגימות המים העיליות, assay זה מייצג נקודת סיום הקרנה רלוונטית להערכת איכות מים. אסטרוגנים כגון פעילי שטח A ו- alkylphenol ביספנול מזוהים לעתים קרובות בסביבה המימית, אבל הם יכולים להיות קשה לכמת באמצעות בכימיה אנליטית קונבנציונאלי. מבחני מיון תאים יכולים להיות יעילים גם להקרנה של חומרי הדברה רשומים כיום חדש, כפי שמוצגים על ידי קוג'ימה ואח25.
פעילות GR חרגה פעילות ER ידי סדר הגודל ב 4 כל דגימות השפכים נתחו במחקר זה (טבלה 2). מגמה זו עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים על בשפכי שפכים 14, ואת הטווח עבור GR-BEQs דיווח כאן הוא מעט גבוה יותר אך דומה לזה שדווח עבור שפכים משניים אחרים באמצעות אותו במבחנת המבדק 12. באמצעות מבדק תאים שונה, בטווח עבור GR-BEQs עבור שפכים ממפעלים טיהור שפכים ביפן נחלש (<3 כדי 78 ng Dex / L) מאלו שדווחו על שפכים משניים במחקר הנוכחי 22. למעט מדגם המים העילי היחידים רשום תגובת GR מקסימלית של 30 ng Dex / L (לוח 2, מדגם E), פעילות GR בדגימות המים העיליות הנותרים עלתה בקנה אחד עם הפעילות הנמוכה דיווחה על משטח הולנדי משקה 21 . עם זאת, im הסביבתיברית עבור חומרים כימיים פעילים GR היא גם פחות מאופיינת מאשר ER חומרים כימיים פעילים 26, מה שהופך הערכת פוטנציאל תופעות מסדר גבוהה אתגר.
כמו אנליזה כימית קונבנציונלית, דבקות פרוטוקולים בכתב ואימות של מדידות באמצעות QA ביצועים מבוססים / גישת QC למקסימום איכות נתונים ואת חוסן. למרות האימות של מבדקי תא מותאמים הערכת איכות מים תמשיך להתפתח ולהשתפר, מדידת פרמטרי QA / QC המפורט ראשון Mehinto et al. 14 וכן להחיל מחקר זה הראתה כי התוצאות שלנו היו גם בתוך מערכי ייחוס שנקבעו מראש (לוח 1 ). הפרמטרים העקומים כיול עבור bioassays אלה לשקף אלה המשמשים לכיול פרוטוקולים אנליטיים אחרים (למשל, GC-MS), עם התוספת של קריטריונים להעריך את הכדאיות של התאים (למשל, cytotoxicity) המייצגים את ההבדל העיקרי. מבצעי נוסףהבדל מתאפשר באמצעות תאים בפורמט תפוקה גבוהה הוא ההכללה של דילולי מדגם מרובים הממחישים את תגובת הריכוז התלויה צפויה כאשר פעילות ביולוגית נמדדת (איור. 2). בסקירת המדידות המדגמת, ER הנמוך ותגובות GR עבור הקולחים שליישונים (D מדגם) לעומת שלוש דגימות שפכים המשניות (AC) מספק ראיות נוספות של דיוק היחסי של תוצאות הקרנת מבדק שלנו בטבלה 2. התאגדות שליטה או דגימות התייחסות המייצגות את המטריצה של עניין, במים במקרה זה, היו עוד יותר לשפר את היכולת להשוות תוצאות מבדק בתוך ובמיוחד בין ישויות מדידות.
התגובות של שורות תאי ER ו GR transactivation מנוצלות במחקר זה באו לידי ביטוי ביחס לפעילות של אגוניסטים החזקים E2 ו- dexamethasone, בהתאמה. זה מאפשר הערכה כמותית של פעילות ביולוגית הביעהריכוז שווה ערך sa המבדק (רר"מ). זה מאפשר נוסף להמשך חקירה של כימיקלים שתורמות תגובת המבדק, כלומר השוואה ישירה של BEQs עם ריכוזים של אגוניסטים פרט נקבעו באמצעות בכימית אנליטית קונבנציונלית. תפיסה זו מדגישה את השירות הנוסף של bioscreening בהכוונת חקירת אבחון של סוכני סיבתי, הידוע גם בשם ניתוח תופעות-מכוון.
מאז SPE משמש באופן שגרתי כדי לבודד מגוון רחב של תרופות אחרות "מזהמים המתעוררים" ממים, העסקנו פרוטוקול שפורסם בעבר 9, 20 עם קול של sorbent שנועדה ללכוד הן כימיקלים הידרופילי הידרופובי במים. למרות שאנו מניחים ללכוד כמותית של כל התרכובות ביו האורגניות באמצעות טכניקה זו, עבודה נוספת דרושה כדי לתקנן מלא ולאמת את הביצועים של שיטות חילוץ כזה. הסוג של assay התא המועסק במחקר זה עשוי להציגעוד הגבלה. מבחנים אלה למדוד את יחסי הגומלין בין מזהמי קולטנים גרעיניים אינו מביאים אינטראקציות אפשריות אחרות חשבון, כגון קולטן כימי-קרום. לפיכך, יתכן כי תגובות ההקרנה נמדדו כאן היו לזלזל. כמו מיצוי מדגם, אין שיטות סטנדרטיות לנתח נתוני assay התא וגישות שונות עשויות להניב תוצאות שונות. הרגרסיה הליניארית השתמשה במחקר זה, אשר ימחיש את התגובה עבור החצי התחתון של עקומת הכיול לא יכולה להיות מתאימה עבור כל מבחני התא, במיוחד אם תגובת דגם הוארכה מעבר הצר יחסית שצוין במחקר הנוכחי. בדיקה נוספת לתוך הנושאים הנ"ל יש צורך להבין את המידה שבה כלים אלה ניתן ליישם ככלי ניטור חזקים.
בעוד הרבה של התשתית שהוא מונח על ER ו- GR מסך עבור חומרים כימיים פעילים האנדוקרינית, החוקר להרחיב את היריעהכלי bioanalytical לכלול מצב רלוונטי אחר של פעולות, למשל, androgenicity, עקה גנטוקסית, רעילה במערכת עצבים ואת immunotoxicity 9,27. ארגז כלים שלמים יותר ישפרו את היכולת למסך כימיקלים ביו, כוללים מוצרי טרנספורמציה של ידועים ו / או כימיקלים ידועים שיכול להתרחש 28, עכשיו אל העתיד, בסביבות מימיות שונות 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate-reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. |
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). Direct potable reuse: a path forward. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
