Abstract
In vitro trans bioassay har vist lovende som vannkvalitet overvåkingsverktøy, men deres adopsjon og utbredt program har blitt hindret delvis på grunn av mangel på standardiserte metoder og tilgjengelighet av robust, brukervennlig teknologi. I denne studien ble kommersielt tilgjengelig, divisjon arrestert cellelinjer brukes til å kvantitativt screene for endokrin aktivitet av kjemikalier i vannprøver av interesse for miljø kvalitet fagfolk. Et enkelt, standardisert protokoll som inkluderte omfattende kvalitetssikring / kvalitetskontroll (QA / QC) sjekker ble utviklet for Østrogen og glukokortikoidreseptorer aktivitet (ER og GR, henholdsvis) ved hjelp av en cellebasert Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) analyse. Prøver av behandlede kommunale avløp og overflatevann fra ferskvannsystemer i (USA) California, ble ekstrahert ved hjelp av fastfase-ekstraksjon og analysert for endokrin aktivitet ved anvendelse av standardiserte protocol. Bakgrunn og dose-respons for endepunkt spesifikke referanse kjemikalier møtte QA / QC retningslinjer som anses nødvendige for pålitelig måling. Den bioassay screening respons for overflatevannprøver var stort sett ikke synlig. I motsetning til avløpsprøver fra videregående renseanlegg hadde høyest målbar aktivitet, med anslått bioassay tilsvarende konsentrasjoner (BEQs) opp til 392 ng deksametason / L for GR og 17 ng 17β-østradiol / L for ER. Bioanalysen respons for et høyere avløps prøve var lavere enn den som ble målt for sekundær avløpsvann, noe som indikerer en lavere rest av endokrine aktive kjemikalier etter avansert behandling. Denne protokollen viste at in vitro transaktiverings bioanalyser som anvender kommersielt tilgjengelig, divisjon arrestert celle "kits", kan tilpasses for å screene for endokrin aktivitet i vann.
Introduction
Nåværende vannkvalitet overvåking forutsetter evnen til å nøyaktig og presist måle forekomsten av kjemiske forurensninger som en proxy for eksponering for dyreliv og mennesker. Men dette kan kjemisk-by-kjemisk overvåkning og vurdering paradigmet ikke holde tritt med den stadig skiftende kjemiske univers som vi står overfor. Som vi lære mer om skjebne og effekter av syntetiske og naturlige kjemikalier, fortsetter vi å søke etter måleverktøy som adresserer forventede biologiske virkninger, og at samtidig er immun mot endringer i kjemisk produksjon, bruk og miljø innspill. Slike verktøy er spesielt relevant for forståelsen av om ukjente eller nye kjemikalier og omdanningsprodukter, fortjener vår oppmerksomhet. Videre er komplekse blandinger av kjemikalier i vann dårlig ivaretatt av individuell kjemisk overvåking. Dermed står vi overfor utfordringen med å modernisere eksisterende overvåking verktøykasse for å bedre løse disse problemene i overflatevann that motta utslipp av renset avløpsvann avløp og urban / overvann avrenning.
I de senere årene har Bioanalytical teknikker vist lovende som screening verktøy for vann kvalitetsvurdering. Spesielt in'vitro bioassay som reagerer på kjemikalier som virker via kjente, spesifikke virknings 1,2 er av stor interesse for miljøovervåkingen samfunnet tre. Tallrike undersøkelser har ansatt in vitro bioassay å kvantifisere endokrin aktivitet av drikking, overflate og avløpsvann 4 -6. Videre er en rekke bioassay målrette molekylære initierende hendelser (f.eks reseptor aktivering) som potensielt kan knyttes til skadelige effekter via negativt resultat pathway analyser 7,8.
Utviklingen av bioscreening for vann kvalitetsvurdering har vært relativt hurtig, med hundrevis av forskjellige in vitro bioassay endepunkter ha blitt vurdert for deresverktøyet 9,10. For øyeblikket er bare en håndfull av bioanalyser har vist seg å oppnå god målenøyaktighet (innen laboratorier) mens demonstrere evnen til å differensiere mellom vannkvaliteter 5,6. For behandlet avløpsvannet i særdeleshet, har forekomsten av østrogener og glukokortikoid steroider vært vellykket regnskapsføres etter in vitro trans analyser 11,12. Imidlertid har de fleste studier til dags dato ansatt bioassay som cellelinjer er proprietær (og dermed ikke allment tilgjengelig), krever kontinuerlig omsorg og manipulasjon, eller begge deler. Som et resultat, evnen til standardprotokoller, utfører interlaboratoriekalibreringsøvelser, og til slutt å overføre denne screening teknologien til vannressursene fellesskap forblir hindret.
Minst én leverandør av in vitro bioassay vetted gjennom USA ToxCast programmet er kommersielt tilgjengelig 13 i lett å bruke "fryse og tine4; formater. Disse divisjons arrestert celle "kits" har vist seg å være robust ved måling av aktiviteten av kjemikalier utvunnet fra vann som representerer forskjellige nivåer av behandling 14. Selv om leverandør protokoller er tilgjengelige for å screene bioaktiviteten av individuelle kjemikalier eller blandinger, og noen av dem krever modifikasjon før de kan brukes på vannprøver. Behandlet avløpsvannet 15, overvann avrenning 16, resipientvann 17,18 og mer nylig resirkulert vann 19,20 er førsteklasses eksempler på vandige medier som er av interesse for vannkvaliteten samfunnet.
Denne studien presenterer et enkelt, standardisert protokoll for å måle endokrin aktivitet i vannprøver ved hjelp av kommersielt tilgjengelige, divisjon arrestert in vitro trans bioassay. Vi demonstrerte robusthet av protokollen gjennom en helhetlig vurdering av bakgrunn, dose responsivitet og repeterbarhet av respons for two endepunkter av særlig interesse Østrogen og glukokortikoidreseptorer trans (ER og GR, henholdsvis). Protokollen ble brukt til å screene prøver av behandlet avløpsvann og overflatevann fra ferskvannsystemer i California.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Samle og prosessvann Sample (Modifisert fra Escher et al. 9)
- Fyll en ren 1 L ravfarget glassflaske inneholdende 1 g natriumazid og 50 mg askorbinsyre til toppen med vann prøve av interesse. Lagres prøven ved 4 ° C og prosess innen 72 timer.
MERK: Natriumazid er svært giftig og må håndteres med forsiktighet. Bruk verneutstyr (vernebriller / ansikts, hansker, klær) og veier i et godt fungerende røyk-hette. Ikke bruk en metallspatel for veiing. - Passere prøven gjennom et 1,6 uM glassfiberfilter og deretter gjennom en forbehandlet fastfase-ekstraksjon (SPE) patron ved en strømningshastighet på 5-10 ml / min. Justere trykket av vakuumpumpen for å styre strømningshastigheten.
- Vakuum tørke patronen i 15 min.
- Eluer patron med 10 ml metanol, etterfulgt av 10 ml aceton: heksan (1: 1, v / v).
- Konsentrer eluatet til ~ 1 ml under en forsiktig strøm av nitrogen med høy renhet. Løsemiddelutveksling ved å tilsette 500 ul dimetylsulfoksid (DMSO) og fordampning av ekstraktet ned til 500 pl.
- Overfør den ekstrakt som et gult glass autosampler ampullen. Oppbevar ved -20 ° C.
2. Forbered Fortynninger av analysen spesifikk referanse Kjemisk og Water Extract
- Forbered 9 fortynninger for kalibreringskurven.
- Foreta en stamløsning av analysen spesifikk referanse kjemisk i 100% DMSO. Den endelige konsentrasjonen må være 2 uM 17β-østradiol for ER-analysen, og 100 uM deksametason for GR analysen. Oppbevar stamløsninger ved -20 ° C.
- Tilsett 15 pl av den hensiktsmessige referanse kjemisk lager til 285 ul analysemedium i et sterilt rør (rør 1). Bland prøven ved å pipettere opp og ned.
- Tilsett 200 ul av en løsning av 5% DMSO i analysemedium i 8 flere rør (rør # 2-9).
- Overføre en 100 mL delmengde fra tube # 1 til tube # 2 gjennom karete # 9 for å utføre en 3-gangers fortynningsserie. Hver fortynnede prøven må blandes grundig med en pipette før du tar en porsjon og legge det til neste rør.
- Fremstille et løsningsmiddel kontrollprøve ved å blande 10 ul DMSO i 190 ul analysemedium.
- Forbered fire fortynninger for hver vannekstrakt.
- I det første røret, tilsett 5 mL vann ekstrakt i 95 ul analysemedium og blandes grundig. Tilsett 50 ul 5% DMSO i analysemedium i tre andre rør.
- Utføre en to-gangers fortynning ved å overføre 50 ul løsning fra ett rør til det neste.
3. Klargjør Cell Suspension gjennomføre gnage Bioassay
- Forbered analysen bestemt medium i henhold til produsentens instruksjoner. Analysemedium må oppbevares ved 4 ° C og oppvarmet til 37 ° C i et vann-bad før bruk.
- Ta en ampulle med ER eller GR divisjon arrestert celler ut av kryogeniske gratisZer og tine cellene raskt ved å plassere beholderen i et 37 ° C vannbad i 2 min med forsiktig omrøring. Dekontaminer hetteglass med 70% etanol og legg den i en klasse II biologisk sikkerhetskabinett.
- Åpne ampullen ved hjelp av aseptiske teknikker og overføre cellene i 10 ml analysemedium.
- Sentrifuger ved 200 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten ved hjelp av en steril pipette glass og cellepelleten suspenderes i 6 ml analysemedium.
- Bland 5 mL av cellesuspensjonen med 5 ul av en vital flekk løsning og tilsett en porsjon inn i et tellekammer.
- Telle antallet levende celler ved hjelp av et lysmikroskop eller automatisk celleteller og estimere tettheten av levende celler i cellesuspensjonen. Fortynn om nødvendig for å oppnå en endelig tetthet på 550.000 levende celler per ml i analysemedium.
4. Plate celler i en 96-brønns Black Wall Clear-bunnplaten og Legg Fortynnet Vann Extract
- Opprette en platelayout som inneholder en 9-punkts-analyse spesifikk kalibreringskurve, QA / QC prøver og flere fortynninger for hver vannekstrakt. Et eksempel på en 96-brønns plate layout er vist i figur 1.
- Legg 90 mL av analysemedium til de gjentatte cellefrie kontrollbrønner.
- Hell cellesuspensjonen i en steril pipettering reservoar og tilsett 90 ul cellesuspensjon til de andre brønnene ved bruk av en multikanal pipette.
- Tilsett 10 pl av de fortynnede prøver fremstilt under trinn 2 til de passende brønner. Den endelige konsentrasjonen av DMSO per brønn må være 0,5% maksimum.
- Dekke platen med et lokk og plassere den i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 16 timer.
Fig. 1: Eksempel på en 96-brønns plate Layout Den multi-brønn plate er utformet for å omfatte en analysespesifikk kalibreringskurve, 3 typerav QA / QC-kontroller (media bare, celler i ren medium og celler i DMSO tilsatt medium) og 4 fortynninger per vann ekstrakt. Hver kontroll og fortynning av vann ekstrakt er analysert i tre eksemplarer brønner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Klargjør Loading Solution og tilsett til hver brønn
- Etter inkubasjon tillate platen å tilpasse seg til RT. For dette FRET bioassay, trinn 5.2 til 5.6 skal utføres i fravær av direkte lys.
- Forbered en 6x lasting løsning i henhold til produsentens instruksjoner.
- Tilsett 20 pl av den 6x lasteløsning til hver brønn.
- Tilsett 10 pl av celle-levedyktighet reagens til hver brønn for å evaluere cytotoksisiteten av den fortynnede ekstrakt vann.
- Tett plate med aluminium selvklebende film.
- Platen inkuberes i mørke ved RT i 2 timer.
6. Mål Cytotoksisitet og endokrin aktivitet Response
- Sett opp mikroplateleser med bunn-lesing evner etter produsentens anvisninger.
- For FRET trans bioassay, måle fluorescens i det blå (409/460 nm, eksitasjon (Ex) / utslipp (Em) bølgelengde) og grønt (409 Ex / 530 Em nm) kanaler.
- For cytotoksisitet analysen, måle fluorescens ved 560 Ex / 590 Em nm.
7. Vurdere QA / QC sjekker for å bestemme kvaliteten av data
- Sammenligne den gjennomsnittlige rå fluorescensen av cellefrie (media) og kun celler som kun (celler i ren analysemedium) kontroller. Mediene-only bakgrunnsfluorescens bør være minst 25% lavere enn responsen fra cellene kun kontroll.
- Behandle rå FRET data. For begge "blå" og "grønne" datasett, trekker gjennomsnittet fluorescens av cellefrie kontrollbrønner fra hele cellen som inneholder godt. Beregnblå / grønn grad for hvert eksperimentell godt.
- Sammenligne blå / grønn forholdet mellom celler beskyttet og celler med DMSO kontroller. Fluorescens verdier av disse kontrollene skal være innenfor 15% relativt standardavvik (RSD).
- Plott analysen bestemt kalibreringskurve som blå / grønn-forhold mot prøvekonsentrasjonen uttrykt som log molekylvekt (log M). Beregn skråningen, R2 og log EC 50 (50% effektkonsentrasjon). Kalibrering bør være innenfor det forventede området oppført i tabell 1.
- Beregn RSD for alle tredoble brønner. Variabiliteten mellom replikater bør være mindre enn 20%.
- For de cytotoksiske data (560 Ex / Em 590 nm), subtrahere den celle-frie kontroll gjennomsnitt (dvs. media bakgrunn) fra alle celle-inneholdende brønner.
- Beregne gjennomsnittlig bakgrunn subtrahert-fluorescens for hver prøve. Plott de resulterende fluorescens data som en prosent av den DMSO-kontroll. Prøvefortynningene bør ikkeoppvise mer enn 20% celle dødelighet sammenlignet med celler som bare og DMSO-kontroller.
8. data Analyser
- Beregn analysen Deteksjonsgrense (LOD) som minimum kalibreringsresponsen pluss to standardavvik over gjennomsnittet av dette svaret.
- For prøver som viser en doserespons, utlede EC 50 av vannet ekstraktet ved hjelp av helningen av en lineær regresjon av kalibreringskurven mellom 10 og 50% effekt konsentrasjoner av referanse kjemisk.
- Beregn bioanalytical Equivalent Konsentrasjon (BEQ) ved hjelp av formelen: BEQ = EC 50 referanse kjemisk / EC 50 av vannprøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble det 4x 24 timers sammensatte prøver av behandlet kommunalt avløpsvann, 6 ta prøver av overflatevann fra ferskvannssystemer i Sør-California og et felt tomt bestående av ultrarent vann valgt å illustrere denne protokollen. 3 av de 4 avløps prøvene var fra konvensjonelle aktivert slam avløpsanlegg ( "sekundær avløpsvann"), og den fjerde fra et avansert renseanlegg med sand / kullfilter lagt post biologisk behandling ( "tertiær avløp"). Overflatevannprøver ble samlet inn fra nedbørfelt som representerer ulik arealbruk (åpen, landbruk og urban).
Fortynninger av vannekstrakter viste ingen tydelig cytotoksisitet med mindre enn 20% dødelighet observert celle sammenlignet med DMSO-kontroller (tabell 1). Cell-free (kun media) bakgrunnen var lav, og comparison mellom cellene er bare for og celler med DMSO responser indikerte at oppløsningsmidlet hadde ingen målbar virkning på fluorescensmålinger. Parameterne for analyse bestemte kalibreringskurver, inkludert helling og log EC50, var innenfor det område av akseptable historiske verdier (tabell 1) som viser en god reproduserbarhet av kalibreringskurvene over tid. Et eksempel på en akseptabel kalibreringskurve for ER-analysen er vist i figur 2. Utvelgelsen av 17β-østradiol og deksametason som referanse kjemikalier var basert på styrken av analyserespons, sannsynlighet for forekomst i renset avløpsvann og historisk bruk av andre forskere 20- 22. Den variasjon i responsen mellom triplikatprøvene mindre enn 20% RSD. Således ble alle data som anses å være av akseptabel kvalitet, og ble deretter brukt til å estimere ER og GR bioaktivitet (uttrykt som BEQ i ng / l) i avløps og overflatevannprøver.
(figur 3). Men gjorde overflatevann ekstrakter ikke vise sterk ER eller GR aktivitet. Til tross for en REF fra 10, de fluorescerende responsene var ofte nær til eller under LOD. Fraværet av bioassay svar for feltet tomt bekreftet at påvisninger nevnt ovenfor LOD ikke var et resultat av prøvetaking eller prosedyre lab gjenstander.
ER og GR aktivitet ble påvist i 7 og 4 av de 10 representative vannprøver, henholdsvis (tabell 2), med den høyeste av BEQs av 17 ng E2 / L og 392 ng Dex / L funnet i de sekundære utslipp. GR aktivitet i den prøve av tertiære avløpet var under den biologiske metode LOD. Likeledes, de fleste overflater vannprøver viste ingen GR aktivitet over LOD og mye lavere ER aktivitet enn de sekundære utslipp.
Fig. 2: Eksempel på Kalibreringskurve for ER-analyse Dose-responskurven, plottet som den midlere fluorescens-forholdet (± SEM) er sigmoidal og anvendt for å bestemme EC EC 10 og 50 verdier. Denne delen av kurven er utstyrt ved hjelp av lineær regresjon og brukes til å utlede en bioassay tilsvarende konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
les / ftp_upload / 54725 / 54725fig3.jpg "/>
Fig. 3: Mean blå / grønn fluorescens Ratio (± SEM) av vannprøvene plottet mot theRrelative anrikningsfaktor bioanalyse Ekvivalente Konsentrasjoner (BEQ) er beregnet for prøver som har fortynningsrekke viser en konsentrasjonsavhengig respons med minst to punkter over grensen for påvisning (LOD). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Østrogen reseptor (ER) analyse | Glukokortikoid reseptor (GR) analyse | |||
| studie~~POS=TRUNC resultater~~POS=HEADCOMP | Akseptkriterier | studie~~POS=TRUNC resultater~~POS=HEADCOMP Akseptkriterier | ||
| kalibrering | ||||
| Logaritmisk EC50 (M) | -9,6 | -10,1 Til -9,1 | -8,5 | -9,0 Til -8,0 |
| Mean skråning | 1.1 | 0,9 til 1,5 | 2.0 | 01.08 til 02.04 |
| R2 | 0.99 | > 0,95 | 0.99 | > 0,95 |
| QA / QC-kontroller | ||||
| Media bakgrunn | ja | bare media <celle + media | ja | bare media <celle + media |
| Cytotoksisitet (% dødelighet) | 0% | <20% dødelighet | 0 til 5% | <20% dødelighet |
| Prøve presisjon (% RSD) </ Td> | 2 til 18% | <20% | 4-13% | <20% |
Tabell 1: Oppsummering av QA / QC resultater fra bioanalytical Screening av renset avløpsvann Avløps- og Surface vannprøver.
| Prøve-ID og beskrivelse | ER-BEQ (ng E2 / L) | GR-BEQ (ng Dex / L) |
| A - endelig avløpsvann fra full sekundærrenseanlegg | 6.4 | 248 |
| B - endelig avløpsvann fra full sekundærrenseanlegg | 1. 3 | 392 |
| C - endelig avløpsvann fra full sekundærrenseanlegg | 17 | 236 |
| D - endelig avløpsvann fra tertiær behandling plant | 2.3 | <22 |
| E - overvann fra jordbruksareal | <0.5 | 30 |
| F - overvann fra jordbruksareal | <0.5 | <22 |
| G - overvann fra urbane området | 4 | <22 |
| H - overvann fra urbane området | 0.9 | <22 |
| I - overvann fra marken | 0.8 | <22 |
| J - overvann fra marken | <0.5 | <22 |
| K - feltet stå tomt (ultrarent vann) | <0.5 | <22 |
Tabell 2: bioassay Tilsvarende konsentrasjoner for østrogenreseptor (ER-BEQ) og glukokortikoidreseptorer (GR-BEQ) ac. tivitet Tre typer prøver samlet inn i (USA) California er analysert: kommunalt avløpsvann (AD), overflatevann (EJ), og feltet stå tomt (K).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den godt dokumentert potens av miljømessige østrogener, for eksempel 17β-østradiol (E2), garanterer screening for disse kjemikaliene i ng / L konsentrasjoner 23,24. I denne studien ER respons for avløpsvann avløpsvann (BEQ Område: 2,3 til 17 ng E2 / L) var noe høyere enn rapportert for sekundær avløpsvann fra australske WWTPs 20, mens BEQs for overflatevann (<0,5 til 4 ng E2 / L ) var innenfor området rapportert for overflate- og overvann andre steder (<1 til 11 ng E2 / L) 16. Til tross for de lave nivåer av ER aktivitet målt i overflatevannprøver, representerer denne analysen et relevant screening endepunkt for vann kvalitetsvurdering. Østrogener slik som bisfenol A og alkylfenol-overflateaktive midler er ofte detektert i vannmiljøet, men de kan være vanskelige å kvantifisere ved anvendelse av konvensjonell analytisk kjemi. ER-celleanalyser kan også vise seg å være nyttig for screening av tiden og nylig registrert plantevernmidler, som vist ved Kojima et al25.
GR aktivitet skredet ER aktivitet ved en størrelsesorden på alle 4 avløpsprøver analysert i denne studien (tabell 2). Denne trenden er i overensstemmelse med tidligere studier på avløpsvannet 14, og rekkevidden for GR-BEQs rapporteres her er noe høyere, men kan sammenlignes med den som er rapportert for andre sekundære avløpsvann ved hjelp av den samme in vitro bioanalyse 12. Ved hjelp av en annen celle bioassay, utvalget for GR-BEQs for avløpsvann fra renseanlegg i Japan var lavere (<3-78 ng Dex / L) enn de som er rapportert for sekundær avløp i denne studien 22. Med unntak av den eneste overflatevannet prøve som registrert en maksimal GR reaksjon av 30 ng Dex / L (tabell 2, prøve E), GR aktivitet i de gjenværende overflatevannprøvene var konsistent med den lave aktivitet rapportert for nederlandsk overflatevann 21 . Imidlertid miljø impakt for GR aktive kjemikalier er mindre preget enn for ER aktive kjemikalier 26, noe som gjør vurdering av potensialet for høyere ordens effekter en utfordring.
Som med vanlig kjemisk analyse, overholdelse av skriftlige protokoller og validering av målinger ved hjelp av en prestasjonsbasert QA / QC tilnærmingen gjør datakvalitet og robusthet. Selv om validering av celle bioassay tilrettelagt for vann kvalitetsvurdering vil fortsette å utvikle seg og forbedre, måling av QA / QC parametrene først skissert i Mehinto et al. 14 og tillagt denne studien viste at resultatene var godt innenfor forhåndsdefinerte veiledende verdier (tabell 1 ). Kalibreringskurven parametrene for disse bioanalyser speile de som brukes for kalibrering av andre analytiske protokoller (for eksempel, GC-MS), med tillegg av kriterier som vurdere levedyktigheten av cellene (f.eks cytotoksisitet), som representerer den største forskjellen. en annen operasjonellForskjellen gjort mulig ved hjelp av celler i en høy gjennomstrømning format er inkluderingen av flere prøvefortynninger som illustrerer konsentrasjonsavhengig respons forventet når bioaktivitet måles (fig. 2). I går gjennom prøvemålinger, den nedre ER og GR responser for den tertiære avløpet (prøve D) sammenlignet med de tre sekundære avløpsprøver (AC) gir ytterligere bevis for den relative nøyaktigheten av våre bioanalyse screeningresultatene i tabell 2. Inkorporering av kontroll eller referanseprøver som representerer matrisen av interesse, i dette tilfelle vann, vil ytterligere forbedre evnen til å sammenligne bioassay resultater innenfor og spesielt på tvers av måleenhetene.
Responsene hos ER og GR transaktivering cellelinjene som anvendes i denne studien ble uttrykt i forhold til aktiviteten av de sterke agonister E2 og deksametason, respektivt. Dette gjør det mulig for et kvantitativt estimat av bioaktivitet uttryktsa Bioassay Equivalent Konsentrasjon (BEQ). Dette tillater videre for undersøkelse av kjemikalier som bidrar til bioassay respons, det vil si en direkte sammenligning av BEQs med konsentrasjoner av individuelle agonister bestemt ved konvensjonell analytisk kjemi. Dette konseptet understreker den ekstra nytten av bioscreening i regi diagnostiske undersøkelser av årsaks midler, også kjent som effekt rettet analyse.
Siden SPE blir rutinemessig brukt for å isolere et stort utvalg av legemidler og andre "nye forurensninger" fra vann, som anvendes vi en tidligere publisert protokoll 9, 20 som inneholdt en sorbent utformet for å fange både hydrofile og hydrofobe kjemikalier i vann. Selv om vi antar kvantitativ fangst av alle bioaktive organiske forbindelser ved hjelp av denne teknikken, er ekstra arbeid for å fullt standardisere og validere resultatene av slike utvinningsmetoder. Typen av celleanalyse anvendt i denne studien kan presentereen annen begrensning. Disse analysene måle samspillet mellom forurensninger og kjernereseptorer og ikke tar hensyn til andre mulige interaksjoner, for eksempel kjemisk-membran reseptor. Dermed er det mulig at screening responser målt her ble undervurdert. Som prøve ekstraksjon, er det ingen standardiserte metoder for å analysere celleanalysedata og ulike tilnærminger kan gi forskjellige resultater. Den lineære regresjon anvendt i denne studien for å modellere responsen til den nedre halvdel av kalibreringskurven er kanskje ikke egnet for alle celleanalyser, særlig hvis modellerte respons er forlenget ut over den forholdsvis smalt område som er angitt i den foreliggende undersøkelse. Ytterligere etterforskning i de ovennevnte problemstillinger er nødvendig for å forstå i hvilken grad disse verktøyene kan brukes som et robust overvåkingsverktøy.
Mens mye av grunnlaget blir lagt for ER og GR som skjermer for endokrine aktive kjemikalier, er forskerne utvide omfanget avBioanalytical verktøy til å omfatte annen relevant modus av tiltak, for eksempel, androgenicity, gentoksisitet, nevrotoksisitet og immunotoxicity 9,27. En mer komplett verktøykasse vil styrke evnen til å screene for bioaktive kjemikalier, inkludert omdanningsprodukter av kjente og / eller ukjente kjemikalier som kan oppstå 28, nå og i fremtiden, i ulike vannmiljøet 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96-well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate-reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. |
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). Direct potable reuse: a path forward. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
