Introduction
De mekanismer, som tarmen regulerer kosten lipid behandling, leveren styrer komplekse lipid syntese og lipoprotein metabolisme, og hvordan disse organer arbejder med det centrale nervesystem til at styre fødeindtagelsen er ufuldstændigt forstået. Det er for biomedicinsk interesse at belyse denne biologi i lyset af de nuværende epidemier af fedme, hjertekarsygdomme, diabetes og ikke-alkoholiske fedtlever sygdom. Studier i cellekultur og mus har givet de fleste af vores forståelse af de mekanistiske relationer mellem kosten lipider og sygdomme, og zebrafisk (Danio rerio) dukker op som en ideel model til at supplere dette arbejde.
Zebrafisk har lignende gastrointestinale (GI) organer, lipid metabolisme, og lipoprotein transport til højere hvirveldyr 1,2, udvikler sig hurtigt, og er genetisk medgørlig. Den optiske klarhed af larvestadiet zebrafisk letter in vivo-undersøgelser, en particular fordel for studiet af GI-systemet som sin ekstracellulære miljø (dvs. galde, mikrobiota, endokrine signalering) er næsten umuligt at modellere ex vivo. I overensstemmelse, en mængde forskning kombinerer den genetiske sporbarhed og fremmende at leve billeddannelse af zebrafisk larver med en bred vifte af kosten manipulationer (højt fedtindhold 3,4, kolesterol 5 og -carbohydrate kost 6,7), og modeller af hjertekarsygdomme 8, diabetes 9,10, leversteatose 11-13, og fedme 14-16, dukker til at give et væld af metaboliske indsigter.
Et væsentligt aspekt af overgangen larve zebrafisk i metabolisk forskning er optimering af teknikker udviklet i andre dyremodeller til zebrafisk og udvikling af nye analyser, der udnytter de unikke styrker i zebrafisk. Denne protokol præsenterer teknikker udviklet og optimeret til at fodre larver zebrafisk en Lipid-rige måltid, visualisere kosten lipid behandling fra hele kroppen til subcellulær opløsning, og måle fødeindtagelse. Kylling æggeblomme blev valgt til at komponere lipid-rige måltid som det indeholder høje niveauer af fedt og kolesterol (lipider komponere ~ 58% af kylling æggeblomme, hvoraf ~ 5% er cholesterol, 60% er triglycerider, og 35% er phospholipider ). Kylling æggeblomme giver mere fedt end typiske kommercielle zebrafisk mikropellet fødevarer (~ 15% lipider) og den fordel, at det er en standardiseret foder med kendte procentdele af specifikke fedtsyrer arter, som zebrafisk kost og fodring regimenter ikke er standardiseret på tværs labs 17. Desuden fluorescerende lipid-analoger tilvejebragt i æggeblommen visualisere transport og akkumulering af ernæringsmæssige lipider 18, billed- cellulære komponenter, herunder lipiddråber Ved at handle både som vitale farvestoffer 3 og gennem kovalent inkorporering i komplekse lipider, undersøge metabolisme gennem tyndtlagskromatografi (TLC) 19 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Disse protokoller er blevet godkendt af Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care og brug Udvalg (protokol nr. 139).
1. Dyrepræparation
- Vedligehold voksne og larver ved 28 ° C på en 14 timer: 10 timers lys: mørke cyklus. Feed voksne to gange dagligt med Shell fri Artemia (Decapsulated, ikke-skravering, der starter ved 14 dpf) og kommercielle mikropelleter.
- Disse protokoller er optimeret for brug af 6-7 dpf larver opsamlet ved naturlig gydning af AB baggrund. Protokoller kan modificeres til larver af andre aldre og baggrunde. Må ikke give eksogene mad før 6 dpf.
- Anesthetize larver med tricaine i embryo medier (EM) (4,2 ml 4 mg / ml tricaine pr 100 ml EM) ved stuetemperatur (RT).
2. Fremstilling af lipid-rige Egg Yolk Feed
- Forbered og gemme kylling æggeblommer. Adskil blommen og hvide på 12 hønseæg. Pool æggeblommer, portion 1 ml i 1,5ml rør, og opbevares ved -80 ° C op til 1 år (12 æggeblommer vil gøre ~ 80 portioner). Pool den hvide, gemme og bruge som en lipid-fattig, proteinrigt foder.
- Forbered fluorescerende lipid-analog (er), hvormed æggeblommen foder om ønsket.
- Hæng købt, pulveriseret fluorescerende lipid analog i 100% ethanol eller 100% chloroform ved 0,1 pg / pl (se følgende bemærkning diskutere opløsningsmidler), alikvot i uigennemsigtige glasrør, forsegle med parafilm, og opbevar i henhold til producentens anvisninger. På grund af hurtig afdampning af organiske opløsningsmidler ikke bruger alikvote rumfang under ~ 400 pi for langtidsopbevaring.
Bemærk: Hvis lipid analog suspenderes i ethanol, vil store mængder af lipid analoge bruges, fordi det tørrer hurtigere under N2 end chloroform. Hvis lipid analogen suspenderet i ethanol det behøver ikke at være tørret og resuspenderet før tilsætning deraf til liposomet foder i trin 2.2.4, men den samlede koncentration ethanol bør ikke overstige 0.1% i liposomet foder at undgå potentielt confounding fysiologiske virkninger af ethanol. - For fluorescerende fedtsyreanaloger: Forbered en samlet volumen på 20 ml 5% æggeblomme emulsion i EM. Fra denne forberede 5 ml prøver med en slutkoncentration på 6,4 uM 4,4-difluor-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacen (BODIPY C 16) for levende konfokal billeddannelse og fødeindtag assays eller 1 ug / ml BODIPY C 12 for stereomikroskop billeddannelse. Overfør den ønskede mængde af det fluorescerende lipid analogen i et 1,5 ml plastrør. Tør lipid under en strøm af N2, pas på ikke at blæse lipidet ud af røret.
- Straks, resuspender i 5 pi 100% ethanol ved pipettering en strøm ned siderne af røret, tilsæt 95 pi EM, og bland godt.
Bemærk: Blandingen skal vises homogen; hvis farvet lipid forbliver på siderne af røret eller væsken er klumpet, har lipidet ikke fuldt solubiliseret og kræver mere ethanol. Beskyt røret from lys og butik på is. - For fluorescerende cholesterol analog: forberede en slutkoncentration på 2,4 ug / ml cholesterol i 5 ml 0,5-5% æggeblomme emulsion for levende billeddannelse undersøgelser. Overfør den ønskede mængde af kolesterol i et 1,5 ml plastrør. Tør lipid under en strøm af N2, pas på ikke at blæse lipidet ud af røret.
- Straks, resuspender i 15 pi RT 100% ethanol ved pipettering en strøm ned siderne af røret og blandes med 85 pi RT 1% fedtsyre-frit BSA i oprenset H 2 O. Beskytte røret mod lys og opbevares på is.
- Hæng købt, pulveriseret fluorescerende lipid analog i 100% ethanol eller 100% chloroform ved 0,1 pg / pl (se følgende bemærkning diskutere opløsningsmidler), alikvot i uigennemsigtige glasrør, forsegle med parafilm, og opbevar i henhold til producentens anvisninger. På grund af hurtig afdampning af organiske opløsningsmidler ikke bruger alikvote rumfang under ~ 400 pi for langtidsopbevaring.
- Forbered æggeblomme Liposome Feed.
- Tilføj et optøet alikvot af æggeblomme til EM i et 50 ml konisk rør. Vortex fortyndede æggeblomme blandingen æg til 1-2 min; blandingen skal vises at være en homogen emulsion.
- Hæld blandingen gennem en finmasket si for at fjerne protein konglomerater og samles i en ny, frisk 50 ml konisk rør.
- Pulse SONICAte æggemassen med en fjerdedel tomme koniske mikrospids (5 gange (5 x 1 sek på, 1 sek off) dvæle 5-10 sek mellem hvert sæt, output intensitet: 6 W) ved ST til at skabe liposomer. Sonikator strømindstillinger er instrument afhængige og derfor kræver optimering for hvert instrument og mikrospids.
Bemærk: Kontinuerligt vippe liposom blanding ved stuetemperatur for at opretholde homogenitet indtil anvendelse.
- Tilsæt fluorescerende lipid analog til æggeblommen liposomer, hvis det ønskes. Umiddelbart efter sonikering, pipetteres de bearbejdede lipider i liposomet blandingen og vortex ved høj hastighed i 30 sek til at optage i liposomer. Beskytte blandingen mod lys ved indpakning røret i folie og fortsætte vipning ved stuetemperatur.
3. Fodring Paradigm
- Forbered Larver for fodring.
- Forud for påbegyndelse af foderet, skærm larver af åbenlyse morfologiske defekter, der kan hindre fodring. Overførsel larver til 60 mm x 15 mm petriskåle eller 6- eller 12-brønds plaTES, reducere EM til et minimum, og erstatte med 5 ml af forberedte liposom løsning.
- Hvis det er nødvendigt, overfører unfed kontrol larver til 5 ml EM og / eller 5 ml 5% æggehvide i EM og behandle parallelt.
- Vip forsigtigt larverne i en inkuberes rocker (29-31 ° C ved 30 rpm) i foderet for at fremme fødeindtagelse, samtidig med at beskytte mod lys, hvis fluorescerende lipid-analoger er til stede. Hvis larver behov for at blive udsat for lys, minimere eksponeringen med en tonet glas inkubator dækning.
- Ved slutningen af fodringsperioden, skylles frit svømning larver i EM 3 gange.
Bemærk: Larver kan begynde at forbruge liposomer på noget tidspunkt under foderet. Hvis det er kritisk, at larver påbegynde fodring samtidig, screening for fødeindtagelse (se 3.4) efter 1 time af fodring og returnere kun larver, der har påbegyndt fodring æggeblommen emulsionen at fuldføre foderet. - Screen larverne på dette punkt for fødeindtagelse som et lille antal kan ikke eat (generelt ~ 0-5%). Undersøg tarmene larver, der er blevet bedøvet eller let afkølet på en metalblok på is for at bestemme, om de har fodret: larver, der har spist liposomer vil have en formørket tarm (figur 1).
- Billede eller proces larver til fødeindtagelse straks. Alternativt til sted larver i frisk EM og inkuberes ved 28 ° C tillade metabolisk forarbejdning at forekomme.
4. Montering Larver til Live Imaging
- Forbered Montering Medier.
- For 3% methylcellulose: tilføj 0,75 g methylcellulose til 25 ml nær kogende EM, vortex, sten ved stuetemperatur 2-3 dage indtil fuldstændig opløsning, og opbevares ved 4 ° C i årevis ved -20 ° C. Gentagne cykler af nedfrysning og optøning ved 4 ° C vil fjerne luftbobler. Opbevar 3% methylcellulose på is under montering larver.
- For 1,2% lav-mount agarose: tilføje 0,3 g af lav-smelte agarose til 25 ml EM og opløses ved at bringe til en byld, portion i 2 ml tUBE'er, og holdes ved 26-28 ° C på en varmeblok. Ubrugte aliquoter kan opbevares ved stuetemperatur eller -20 ° C og kogt igen på anvendelsestidspunktet. Sørg for, at agarose er cool nok til at håndtere, før du udsætter til larver eller de kan være over-opvarmet.
- For lav forstørrelse, medium-throughput direkte billedvisning, skal du placere et objektglas på et væv på en metal blok på is og vente på, at dias til afkøling. Påfør en generøs mængde af 3% methyl cellulose (som er holdt på 4 ° C på is) på dias, overføre en larve på 3% methyl cellulose, ved hjælp af et fiskeri-line poker (fiskeri diameter linje 0,41 mm limet til enden af et glas kapillarrør) oprette en Tro til at dræne overskydende EM (så methylcellulose ikke bliver udvandet) og placer larver som ønsket.
- For kortvarig (<20 min), høj forstørrelse levende billeddannelse med en opretstående olie emersion mål, montere larver med dækglasset lean-metode.
- Brug cyanoacrylat lim (Superglue) tilvedhæfte aa 22 mm x 30 mm dækglas til den ene ende af et objektglas. Brug en poker at sætte en tynd linie af 3% methylcellulose på objektglasset ved siden af dækglasset og overføre larver til objektglasset med en boring bred Pasteur-pipette. Fjern overskydende EM så det ikke vil fortynde methylcellulose.
- Ved hjælp af en poker, blidt placere larver i methylcellulose på deres sider (venstre side op til billedet mere af leveren, højre side op til billedet galdeblæren) med deres hoveder ved siden af dækglasset.
- Spot superlim i hjørnerne af en anden dækglas og forsigtigt placere den ene kant af dækglasset på den monterede dækglas og den anden på det dias, bro larverne. Pas på ikke at anvende overtryk under dette trin, eller med det formål, mens billeddannelse, så larver forbliver uskadt.
- For langvarig, høj forstørrelse billeddannelse med en opretstående nedsænkning objektiv, montere larver i agarose. Tilføj et larve til en lille prøve af 1,2% lavtsmeltende agarose derefter overførelarve i et lille volumen af agarose til en petriskål.
- Hurtigt placere larver med en poker før agarose størkner. Tillad agarose tørre i 2-3 minutter og dække agarose fuldt ud med frisk EM for at forhindre det i at tørre.
- For langvarig, høj forstørrelse billeddannelse med en omvendt objektiv, montere larver på et glas-bund fad i agarose.
- Afkøl en metalblok på is. Skålen anbringes på metallet blok adskilt af et væv for at forhindre overdreven køling og larvernes frysning. Overfør en larve til fadet og fjern EM ved at væge med en serviet.
- Placer en dråbe på 28 ° C lavtsmeltende agarose (1,2%) på toppen af larve og straks placere med en poker (venstre side ned til bedste billede leveren, højre ned til billedet galdeblæren). Fjern fadet fra den kolde blok, lad det tørre i 2-3 min, og tilføje en tilstrækkelig mængde af frisk EM til dækning af agarose (~ 2-5 ml).
5. fødeindtagelseAssay
- Ved afslutningen af en æggeblomme liposom foder indeholdende 6,4 uM BODIPY C 16, pool minimum 10 vaskes larver i en plastik 1,5 eller 2 ml rør, fjerne EM, og snap fryse. Prøverne kan opbevares ved -80 ° C beskyttet mod lys i flere måneder.
Bemærk: Hvis det er muligt, indsamle flere gentagelser. Det er vigtigt at indsamle unfed larver på dette trin for at normalisere til baggrund lipid fluorescens (ideelt larver fra samme kobling anvendes). - Udfør en modificeret Bligh-Dyer fedtekstraktion 3,21.
- Tilsæt 100 pi homogeniseringsbuffer (20 mM Tris-CI, 1 mM EDTA) til prøven på is (alternativt oprenset H kan anvendes 2 O). Homogeniseres på is med en mikrospids sonikator (5 sek Antal: 1 sek på 1 sek slukket). Kontroller at larver er helt homogeniseret; hvis ikke, gentag. Overførsel til en 13 ml engangs glas kultur rør (andre glasrør kan anvendes).
Bemærk: Chloroform er farlige; udføre alle efterfølgende lipid extrækkraft trin ved RT i en kemisk hætte. - For hver 100 pi homogeniseringsbuffer anvendte, tilsættes 375 pi af 1: 2 (chloroform: methanol). Vortex 30-60 sek, inkuberes 10 min, tilsæt 125 pi chloroform pr 100 pi homogeniseringsbuffer anvendes, og vortex 30 sek.
- Tilføj 125 pi af 200 mM Tris pH 7,5 pr 100 pi homogeniseringsbuffer anvendes, vortex 30 sek, og centrifuger (2.000 x g, 5 min, RT, beskyttet mod lys). Fjern forsigtigt prøver fra centrifugen. De vil blive adskilt i to faser: en øvre fase er vandig, en grænseflade i larvernes snavs, og en nedre organisk fase (indeholder lipider).
- Med en ren glaspipette indsamle bunden, organiske fase og overføre den til et rent 13 ml reagensglas.
Bemærk: Sørg for at undgå den vandige fase og larver vragrester på grænsefladen; hvis der opstår forurening, gentag centrifugering skridt og Recollect. Kassér den øvre, vandige fase; kan det være nyttigt at fjerne og kassere dettefase, før opsamling af den organiske fase. Prøven kan opbevares ved -80 ° C i op til 1 måned. - Den organiske fase tørres under vakuum (0,12 atm) og samtidig beskytte mod lys. Må ikke fortsætte med at tørre prøverne efter at væsken er fordampet, da det vil reducere lipid opløselighed. Resuspender lipiderne i 2: 1 (chloroform: methanol) og opbevares på is. Den optimale volumen af chloroform: methanol løsning afhænger af den detektionsmetode anvendes; starte lav og fortsætte med at fortynde efter behov. En generel retningslinje er at bruge 10 ul i 10 pooled larver.
- Tilsæt 100 pi homogeniseringsbuffer (20 mM Tris-CI, 1 mM EDTA) til prøven på is (alternativt oprenset H kan anvendes 2 O). Homogeniseres på is med en mikrospids sonikator (5 sek Antal: 1 sek på 1 sek slukket). Kontroller at larver er helt homogeniseret; hvis ikke, gentag. Overførsel til en 13 ml engangs glas kultur rør (andre glasrør kan anvendes).
- Spot hele prøvevolumener i jævnt fordelte intervaller på en kanaliseret TLC-plade og scanne pladen med en laserscanner rutinemæssigt anvendes til biomolekylær billeddannelse (f.eks en fluorescerende pladelæser). For de fluorescerende lipid-analoger indgår i materialer liste, har en excitation maxima 500-650 nm og emission maxima 510-665 nm, bruge en 488 nm laser og med indsamlingen emission ved 520 nm.
- Bestemme den samlede fluorescens af hver plet med billedbehandlingssoftware.
Bemærk: Korrekt for naturligt forekommende baggrund lipid fluorescens ved at fratrække fluorescensen af parret, unfed larver prøver.
- Bestemme den samlede fluorescens af hver plet med billedbehandlingssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når fodret med en rocker ved 29-31 ° C, vil de fleste af sunde larver (≥95%) spise inden 1 time. Ved indtagelse æggeblommen emulsion, larve tarmen bliver mørkere i farven. Meget mørke tarme kan observeres ved 2 timer (figur 1). Hvis larver er unfed eller undlader at fodre, tarmen forbliver klar. Larver fodret æggehvide udviser en udspilede tarmlumen, som ikke mørkere i farven.
Figur 1:. Screening Larver for fødeindtagelse Vild type 6-dpf larver blev fodret 5% æggeblomme i EM i 2 timer eller behandles parallelt i EM at opnå unfed kontrol. Unfed larver har klare tarme mens fodret larver, der har spist æggeblomme har mørke tarme når afbildet ved 10X på et stereoskop. Scale søjler repræsenterer 0,1 mm.Klik her for at se en større version af dette tal.
Fodring med fluorescerende lipid-analoger tillader visualisering af systemisk transport og subcellulær akkumulering af ernæringsmæssige lipider. Det fluorescerende signal er til stede i hele fordøjelsesorganerne (tarm, lever og bugspytkirtel) af larver fodret 5% æggeblomme med 6,4 pM fluorescerende C16 analog i 8 timer monteret med dækglas halvtag fremgangsmåde og afbildes med en opretstående mål (figur 2) 3.
Figur 2:. Fluorescerende Lipid analoger Visualiser Dietary Lipid Transport repræsentant sammensat billede af en 6-DPF larve (hoved mod højre) fodret 5% æggeblomme i EM med 6,4 pM BODIPY FL C 16 for 8 timer. Larverne blev monteret i 3% methylcellulose ved dækglasset lean-til fremgangsmåde og afbildes med en opretstående 63X immersionsolie mål på en enkelt foton konfokal mikroskop med en argon laser. Scale søjler repræsenterer 20 um. Lever, L; tarmen, I; bugspytkirtel, P, galdeblæren, GB; genoptrykt med tilladelse fra Dev Bio 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Forskellige lipid-analoger tillade visualisering af unikke sæt af cellulære strukturer, da de differentielt metaboliseres i komplekse lipider (dvs. triglycerider, cholesterolestere, phospholipider). Efter 4-8 timers feeds, fluorescerende C 16 og C 12 analoger mærke lipid dråber, fluorescerende FL C 5 etiketter lipid dråber, lever- og pancreas kanaler, cellemembraner og arterielle netværk og fluorescerende C 2 analog etiketter lever- og pancreas kanaler og cellulære membraner (figur 3) 3.
ove_content "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 3:. Forskellige fluorescerende Lipid analoger Label Unikke Cellular organer Repræsentative sammensatte billeder af larver fodret 5% æggeblomme i EM med 6,4 pM BODIPY FL C 16, C 12, C 5 eller C 2 for 4-8 timer (6 dpf) . C 16-analog er observeret i lipiddråber (LD) af enterocytter, C 12 og C 5 analoger i enterocytterne LD og tarmlumen, og C2-analog i tarmlumen. Larver blev anbragt i 3% methylcellulose ved dækglasset lean-til fremgangsmåde og afbildes med en opretstående 63X oliebestandighedsobjektets på en enkelt foton konfokalt mikroskop med en argon laser. Scale søjler repræsenterer 20 mikrometer. Genoptrykt med tilladelse fra Drug Discov dag Dis Models 22._blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Larvestadiet fødeindtagelse assay blev udviklet for at undersøge, hvordan genetiske mutationer, transgen gen overekspression, og / eller eksogen behandling påvirke larvernes fødeindtagelse. Larverne fodres en lipid-rige måltid tilsat en fluorescerende lipid analog for at angive mængden af mad forbruges. Unfed larver indsamles parallelt for at normalisere for mængden af baggrundsfluorescens stede i larver, forøgelse af følsomheden ved hvilket kan detekteres fluorescerende lipid analogen. Dette assay blev anvendt til at vise, at overekspression af apolipoprotein A-IVb.1 (apo-IVb.1) falder fødeindtagelse. Tidligere unfed Tg (hsp70: ApoA-IVb.1: mCherry) larver fodret 10% æggeblomme med 6,4 pM fluorescerende C16 analog i 4 timer ved 7 dpf forbruges ca. 30% færre lipider end vildtype larver (figur 4) 20.
Figur 4:. Repræsentant fødeindtagelse Assay Vild type (WT) og Tg (hsp70: apo-IVb.1: mCherry) (Tg) larver blev fodret 10% kylling æggeblomme med 6,4 uM BODIPY FL C16 i 4 timer (Fed) eller behandles parallelt i EM (unfed). (A) Larver blev samlet (n = 10), blev lipider ekstraheret, og ekstrakterne blev spottet på en TLC-plade. (B) Samlet fluorescens blev kvantificeret, udtrykt i arbitrære fluorescerende enheder (AFU), normaliserede for baggrundsfluorescens i unfed søskende ved subtraktion, og udtrykkes i forhold til WT. Tg larver overudtrykker ApoA-IVb.1 indtager færre fluorescensmærkede lipid-analoger som vist ved sammenligning med WT (parret t-test, p <0,001, n = 9, 20 larver pr eksperiment). Boksen repræsenterer de 25-75 percentil, og medianen er angivet. De whiskers viser de 10-90 percentil. genoptryktmed tilladelse fra Dis Model Mech 20. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De her beskrevne teknikker gør det muligt for forskerne at behandle larvernes zebrafisk med en lipid-rige foder, visualisere kosten lipid forarbejdning i levende larver, og kvantificere larvernes fødeindtagelse. For at sikre succes, bør man være særlig opmærksom på flere kritiske trin. Kommercielle hønseæg varierer; at minimere eventuel variabilitet vi udføre alle assays på økologiske æg fra bur-fri kyllinger, som ikke er beriget med omega-3 fedtsyrer. Lavere fodring priserne kan observeres i fisk yngre end 6 dpf med resterende endogene æggeblomme energiforsyning, usund fisk eller fisk med udviklingsmæssige mutationer, der hindrer fødeindtagelse (dvs. kæbe eller tarmen misdannelse, manglende evne til at svømme ordentligt). Den Farber laboratorium generelt udfører fodring studier på 6-7 dage efter befrugtning (dpf), fordi larverne ikke kræver eksogen mad indtil deres endogene æggeblomme butikker er opbrugt og æggeblomme udtømning giver mulighed for bedre visualisering af fordøjelsessystemet. Fodringved stuetemperatur også i høj grad reducerer antallet af larver, der spiser. Manglende skærm larver for fødeindtagelse og utilsigtet inddragelse af unfed larver i efterfølgende eksperimenter kan forvirre resultater. Desuden er det vigtigt at beskytte de fluorescerende lipid analoger og alle larval prøver fodret med analogerne, fra lys når det er muligt at opretholde maksimal fluorescens, og dermed assayfølsomhed. Endelig, hvis fødeindtagelse vil blive målt, tillader ikke foder og jage (post-foder stofskifte periode) at overstige i alt 4 timer, da måltidet vil begynde at blive udskilt. Øjeblikket, den hastighed, hvormed melet og tilknyttede fluorescerende lipid-analoger udskilles er ukendt, men fluorescens kan vare hele larvestadiet kroppen i mindst 2 dage efter foder (JPO og SAF upublicerede data).
Der er flere måder at ændre og fejlfinding protokollerne til at besvare de eksperimentelle spørgsmål af interesse. Lipid-rige foder kan udføres for forskellige perioder af time: 1 time vil give et lille måltid, mens 4 timer vil fylde tarmen med en stor mængde af lipid. Men fodring larverne længere end 6 timer anbefales ikke, da blommen og EM er ikke forberedt i sterile forhold og bakteriel overvækst i æggeblomme / hvid emulsion kan forvirre resultater (dvs. øget inflammation, ændret tarm mikrobiota profil). Larver kan undersøges umiddelbart efter fodring at undersøge akutte virkninger af foderet Larver immobiliseret ved kort afkøling eller anæstesi hurtigt begynde at fodret igen efter genopvarmning, men køling er den foretrukne metode til immobilisering som larver kan udvise emesis efter anæstesi (SAF upubliceret observation). Alternativt kan chase perioder udføres efter foderet for at muliggøre transport og metabolisme af de ernæringsmæssige lipider før studere. Selvom feeds sædvanligvis udføres i 5 ml liposom-opløsningen, er feeds succes blevet udført i volumener fra 1 til 20 ml. Forskellige koncentrations æggeblomme kan anvendes til larval feeds; den Farber laboratorium rutinemæssigt udfører eksperimenter med 5% æggeblomme (1 ml æggeblomme tilsættes til 19 ml EM), 0,5% æggeblomme og 10% æggeblomme.
Der er potentielle begrænsninger af fluorescerende lipid-analoger, der skal overvejes. Når du vælger en fluorescerende lipid analog er det vigtigt at overveje, hvordan lipid er fysiologisk behandles og hvor den fluorescerende del er på den kemiske struktur af lipid ved fortolkning af resultater. For eksempel er triglycerider nedbrydes til frie fedtsyrer og glycerol og cholesterolestere i fri cholesterol og fedtsyrer, i tarmlumen før absorption. Derfor, hvis et fluorescerende triglycerid eller cholesterolester analogen tilvejebringes i kosten den observeret i kroppen fluorescens sporer fedtsyren, frit cholesterol, eller glycerol som den fluorescerende del er bundet til, ikke den oprindelige triglycerid eller cholesterolester. Forskellige fluorescent lipid-analoger mærke unikke cellulære strukturer, og denne kendsgerning bør overvejes under udvælgelsen 3. Også at bemærke, sammenlignet med metabolismen af native fedtsyrer, tilsætning af et BODIPY-del svarer omtrent til tilsætning ~ 2-3 carbonatomer til fedtsyrekædelængde (SAF upublicerede data).
De her beskrevne teknikker udgør betydelige fremskridt i forhold til tidligere beskrevne assays på området. Forud for udviklingen af denne kylling æggeblomme foder, to håndskrifter detaljerede undersøgelser, hvor larverne blev fodret drevet hårdkogte æggeblomme 4,23. Den her beskrevne teknik har den fordel, at æggeblommen ikke behøver at være hårdt kogt og pulveriseret inden anvendelse, og at pulveriseret æggeblomme har en meget kort halveringstid grundet dens hurtig oxidation. Flydende æggeblomme kan også fremstilles som liposomer, som let acceptere fluorescerende lipid-analoger til effektiv kosten levering. Alternativt kan radioaktivt mærkede lipider anvendes til at undersøtigate kosten lipid metabolisme og måle fødeindtagelse, men fluorescerende lipid-analoger ikke præsentere de sikkerhedsrisici, der er forbundet med radioaktivitet. Men hvis forskere ønsker at bruge radiomærkede lipider har Farber laboratorium gennemført undersøgelser for at verificere, at radioaktivt mærkede lipider kan inkorporeres i, og med held fodret med liposomer 19. De fluorescerende lipid-analoger, der er beskrevet her, er valgt, fordi de viser meget lignende metabolisme til endogene og radioaktivt mærkede lipider, og var tilstrækkeligt lys ud for lav- og høj-effekt billeddannelse.
Forud for udviklingen af denne teknik til at fodre fluorescerende lipid-analoger til larver, der ikke andre metoder var til rådighed til at visualisere kosten lipid transport og akkumulering in vivo. Direkte visualisering af fluorescerende lipid-analoger kan give en fordel i forhold bruge indirekte mål for fysiologi, såsom serum lipider. Nøjagtig måling af larver zebrafisk fødeindtagelse var også en lang stande udfordring på området. Det eneste alternativ var at kultur paramecia, mærke dem med den fluorescerende lipofile sporstof 4- (4- (didecylamino) styryl) - N -methylpyridinium iodid (4-Di-10-ASP), tillade larver at fodre, og måle fluorescens det intra-abdominale område med en pladelæser 24. Endelig disse teknikker har den fordel at være gældende for både mellemstore throughput skærme (dvs. forward genetiske skærme af kosten lipid behandling) samt fokuseret stor forstørrelse billeddiagnostiske undersøgelser (dvs. omvendt genetiske, hypotese drevet studier). I fremtiden kan disse teknikker anvendes på fænotype og screene forskellige modeller for metaboliske og GI sygdom zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501 (2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M.
- Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
- Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
- Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485 (2013).
- Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474 (2012).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
- Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
- Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
- Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
- Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
- Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
- Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
- Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).
