Introduction
I meccanismi mediante i quali l'intestino regola l'elaborazione lipidico dietetico, fegato controlla complesso metabolismo sintesi dei lipidi e lipoproteine, e come questi organi funzionano con il sistema nervoso centrale per controllare l'assunzione di cibo non sono completamente compresi. È di interesse biomedico per chiarire questo biologia alla luce delle epidemie attuali di obesità, malattie cardiovascolari, diabete e malattie del fegato grasso non-alcolica. Studi in colture cellulari e topi hanno fornito la maggior parte della nostra comprensione delle relazioni meccanicistiche tra lipidi alimentari e malattie, e zebrafish (Danio rerio) stanno emergendo come un modello ideale per completare questo lavoro.
Zebrafish hanno gastrointestinale simile (GI) gli organi, il metabolismo dei lipidi, e il trasporto delle lipoproteine a vertebrati superiori a 1,2, si sviluppano rapidamente, e sono geneticamente trattabili. La chiarezza ottica del pesce zebra larvale facilita studi in vivo, una particulaR vantaggio per lo studio del sistema gastrointestinale come il suo ambiente extracellulare (vale a dire, la bile, microbiota, endocrino segnalazione) è praticamente impossibile per modellare ex vivo. In accordo, un corpo di ricerca che unisce la trattabilità genetica e conduciveness di vivere l'imaging di larve di zebrafish con una varietà di manipolazioni dietetiche (alto contenuto di grassi, 3,4 -cholesterol 5, e diete -carbohydrate 6,7), e modelli di malattia cardiovascolare 8, diabete 9,10, steatosi epatica 11-13, 14-16 e l'obesità, stanno emergendo per fornire una serie di approfondimenti metabolici.
Un aspetto essenziale della transizione del pesce zebra larvale nella ricerca metabolica è l'ottimizzazione delle tecniche sviluppate in altri animali modello per il pesce zebra e lo sviluppo di nuovi test che sfruttano i punti di forza del pesce zebra. Questo protocollo presenta le tecniche sviluppati e ottimizzati per alimentare zebrafish larvale un Lipiricco d-pasto, visualizzare trasformazione alimentare di lipidi da tutto il corpo per la risoluzione subcellulare, e misurare l'assunzione di cibo. tuorlo d'uovo di gallina è stato scelto per comporre il pasto ricco di lipidi in quanto contiene livelli elevati di grassi e colesterolo (lipidi compongono ~ 58% di tuorlo d'uovo di gallina, di cui ~ 5% è il colesterolo, il 60% sono i trigliceridi, e il 35% sono fosfolipidi ). Tuorlo d'uovo di gallina fornisce più grasso di prodotti tipici commerciali zebrafish micropellet (~ 15% di lipidi) e il vantaggio che si tratta di un feed standardizzato con percentuali note di specifiche specie di acidi grassi, come le diete zebrafish e reggimenti di alimentazione non sono stati standardizzati attraverso laboratori 17. Inoltre, analoghi lipidici fluorescenti fornite nel tuorlo d'uovo visualizzare trasporto e accumulo di lipidi alimentari 18, componenti cellulari di immagine tra goccioline lipidiche agendo sia coloranti vitali 3 e attraverso covalente incorporazione in lipidi complessi, indagare metabolismo attraverso cromatografia su strato sottile (TLC) 19 20.
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Protocol
Questi protocolli sono stati approvati dalla Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care e del Comitato Usa (Protocollo n. 139).
1. Preparazione degli animali
- Mantenere gli adulti e le larve a 28 ° C su un 14 hr: luce 10 ore: ciclo scuro. Nutrire gli adulti due volte al giorno con Artemia guscio prive (decapsulated, non tratteggio, a partire da 14 DPF) e micropellet commerciali.
- Questi protocolli sono ottimizzati per l'uso di 6-7 dpf larve raccolte dalla riproduzione naturale dello sfondo AB. I protocolli possono essere modificati per le larve di altre età e provenienza. Non fornire cibo esogeno prima del 6 dpf.
- Anestetizzare larve con Tricaine in mezzi dell'embrione (EM) (4,2 ml di 4 mg / ml Tricaine per 100 ml EM) a temperatura ambiente (RT).
2. Preparazione di ricchi di lipidi tuorlo d'uovo feed
- Preparare e memorizzare i tuorli d'uovo di pollo. Separare il tuorlo e bianco di 12 uova di gallina. Pool i tuorli, aliquota 1 ml in 1,5tubi ml e conservare a -80 ° C fino a 1 anno (12 tuorli faranno ~ 80 aliquote). PISCINA La bianchi, negozio, e usare come, mangimi ricchi di proteine lipidi-poveri.
- Preparare analogico lipide fluorescente (s) da aggiungere al feed tuorlo se desiderato.
- Sospendere l'acquistato, in polvere analogico lipidi fluorescente in 100% di etanolo o il 100% cloroformio a 0,1 mg / mL (vedi nota seguente discutere solventi), aliquota in tubi di vetro opaco, sigillare con parafilm e conservare il prodotto secondo le istruzioni del produttore. A causa della rapida evaporazione dei solventi organici non utilizzare volumi di aliquote inferiori a ~ 400 microlitri per l'archiviazione a lungo termine.
Nota: Se l'analogo lipidico viene sospeso in etanolo, grandi volumi di analogico lipidi saranno utilizzati perché si asciuga velocemente sotto N 2 di cloroformio. Se l'analogo lipidico viene sospeso in etanolo non deve essere essiccato e risospeso prima di aggiungerlo al feed liposomi nel passaggio 2.2.4, ma la concentrazione totale di etanolo non deve superare 0.1% nel feed liposomi per evitare effetti fisiologici potenzialmente confondenti di etanolo. - Per analoghi di acidi grassi fluorescenti: Preparare un volume totale di 20 ml 5% emulsione di tuorlo d'uovo in EM. Da quel preparare 5 ml aliquote con una concentrazione finale di 6,4 mM 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene (BODIPY C 16) per saggi di imaging confocale vivo e assunzione di cibo o 1 mg / ml BODIPY C 12 per l'imaging stereomicroscopio. Trasferire la quantità desiderata di analogico lipide fluorescente in un tubo di plastica da 1,5 ml. Essiccare il lipide in corrente di N 2, avendo cura di non soffiare il lipide dal tubo.
- Immediatamente, risospendere in 5 ml di etanolo al 100% pipettando un torrente lungo i lati del tubo, aggiungere 95 ml di EM, e mescolare bene.
Nota: La miscela deve apparire omogeneo; se lipidi colorato rimane sui lati del tubo o il liquido non appare clumpy, il lipide non ha pienamente solubilizzazione e richiede più etanolo. Proteggere il tubo di from luce e conservare su ghiaccio. - Per fluorescente analogico colesterolo: preparare una concentrazione finale di colesterolo 2,4 mg / ml in 5 ml 0,5-5% di tuorlo d'uovo emulsione per studi di imaging dal vivo. Trasferire la quantità desiderata del colesterolo in un tubo di plastica da 1,5 ml. Essiccare il lipide in corrente di N 2, avendo cura di non soffiare il lipide dal tubo.
- Immediatamente, risospendere in 15 ml di RT 100% di etanolo pipettando un torrente lungo i lati del tubo e mescolare con 85 ml di RT 1% grassi BSA privi di acido in H 2 O. purificato Proteggere il tubo dalla luce e memorizzare sul ghiaccio.
- Sospendere l'acquistato, in polvere analogico lipidi fluorescente in 100% di etanolo o il 100% cloroformio a 0,1 mg / mL (vedi nota seguente discutere solventi), aliquota in tubi di vetro opaco, sigillare con parafilm e conservare il prodotto secondo le istruzioni del produttore. A causa della rapida evaporazione dei solventi organici non utilizzare volumi di aliquote inferiori a ~ 400 microlitri per l'archiviazione a lungo termine.
- Preparare tuorlo d'uovo liposomi Feed.
- Aggiungere un'aliquota scongelato di tuorlo d'uovo EM in una provetta conica da 50 ml. Agitare la miscela di tuorlo diluito per 1-2 minuti; la miscela deve apparire come una emulsione omogenea.
- Versare il composto attraverso un colino a maglia fine per rimuovere conglomerati proteici e raccogliere in un nuovo, da 50 ml tubo conico fresco.
- Sonica PulseTE il composto di uova con un microtip rastremata un quarto di pollice (5 volte (5 x 1 sec su, 1 sec spento), fermandosi 5-10 secondi tra ogni serie; intensità di uscita: 6 W) a temperatura ambiente per creare liposomi. impostazioni di alimentazione sonicator sono strumento dipendente e richiedono pertanto l'ottimizzazione per ogni strumento e microtip.
Nota: continuamente il rock miscela liposomi a temperatura ambiente per mantenere l'omogeneità fino al momento dell'uso.
- Aggiungere l'analogo lipide fluorescente per i liposomi tuorlo d'uovo, se desiderato. Subito dopo sonicazione, pipettare i lipidi preparati nella miscela liposomi e vortex ad alta velocità per 30 secondi per incorporare nei liposomi. Proteggere la miscela dalla luce avvolgendo il tubo in carta stagnola e continuare a dondolo a temperatura ambiente.
3. alimentazione Paradigma
- Preparare le larve per l'alimentazione.
- Prima di iniziare il feed, larve schermo per difetti morfologici evidenti che possono ostacolare l'alimentazione. Trasferimento larve di 60 mm x 15 mm piastre Petri o 6 o 12 ben plates, ridurre EM al minimo, e sostituirlo con 5 ml della soluzione di liposomi preparata.
- Se necessario, trasferire digiuni larve di controllo al 5 ml EM e / o 5 ml 5% albume in EM e trattare in parallelo.
- Agitare delicatamente le larve in una sedia a dondolo in incubazione (29-31 ° C a 30 giri al minuto) negli alimenti per favorire l'assunzione di cibo, pur continuando a proteggere dalla luce se analoghi lipidici fluorescenti sono presenti. Se necessario le larve di essere esposti alla luce, ridurre al minimo l'esposizione con una copertura in vetro colorato incubatore.
- Alla fine del periodo di alimentazione, risciacquare le larve nuotano liberamente in EM 3 volte.
Nota: Le larve può iniziare consumando liposomi in qualsiasi momento durante l'avanzamento. Se è fondamentale che le larve iniziare alimentando contemporaneamente, protezione per l'assunzione di cibo (vedi 3.4) dopo 1 ora di avanzamento e di ritorno solo larve che hanno iniziato alimentando all'emulsione tuorlo d'uovo per completare l'alimentazione. - Schermo le larve a questo punto per l'assunzione di cibo come un piccolo numero non può EAt (generalmente ~ 0-5%). Esaminate l'intestino delle larve che sono stati anestetizzati o leggermente raffreddati su un blocco di metallo su ghiaccio per determinare se sono alimentati: larve che hanno consumato liposomi avrà un intestino oscurata (Figura 1).
- Immagine o un processo larve per l'assunzione di cibo immediatamente. In alternativa, posto larve in acqua dolce EM e incubare a 28 ° C per permettere l'elaborazione metabolico a verificarsi.
4. Montaggio Le larve per Live Imaging
- Preparare il supporto di montaggio.
- Per 3% metilcellulosa: aggiungere 0,75 g metilcellulosa a 25 ml di ebollizione vicino EM, vortice, roccia a temperatura ambiente 2-3 giorni fino a completa dissoluzione, e conservare a 4 ° C per anni a -20 ° C. ripetuti cicli di congelamento e scongelamento a 4 ° C rimuoveranno le bolle d'aria. Conservare 3% metilcellulosa sul ghiaccio durante il montaggio larve.
- Per 1,2% a basso monte agarosio: aggiungere 0,3 g di bassa fondere agarosio a 25 mL EM e sciogliere portando ad ebollizione, un'aliquota in 2 ml tUBE, e mantenere a 26-28 ° C su un blocco di calore. aliquote non utilizzati possono essere conservati a temperatura ambiente oa -20 ° C e bollito di nuovo al momento dell'uso. Assicurarsi che agarosio è abbastanza fresco da gestire prima di esporlo a larve o possono essere riscaldato eccessivamente.
- Per basso ingrandimento, medio-throughput imaging dal vivo, inserire un vetrino su un tessuto su un blocco di metallo su ghiaccio e attendere la diapositiva raffreddare. Applicare una generosa quantità del 3% metil cellulosa (che è stata mantenuta a 4 ° C in ghiaccio) sul vetrino, trasferire una larva sul metilcellulosa 3%, utilizzando un poker lenza (lenza diametro 0,41 millimetri incollato al all'estremità di un tubo capillare di vetro) creare un troth per drenare l'eccesso EM (in modo che metilcellulosa non diluito) e posizionare le larve come desiderato.
- Per breve termine (<20 min), ad alto ingrandimento di immagini dal vivo con un obiettivo in posizione verticale di emersione olio, montare le larve con il vetrino tettoia metodo.
- Utilizzare colla a base di cianoacrilato (supercolla) percollegare aa 22 mm x 30 millimetri coprioggetto ad una estremità di un vetrino. Utilizzare un poker per mettere una sottile linea di 3% metilcellulosa sulla diapositiva adiacente al vetrino e trasferire le larve alla slitta con un ampio foro Pasteur pipetta. Rimuovere l'eccesso EM in modo da non diluire la metilcellulosa.
- Utilizzando una mazza, posizionare delicatamente larve in metilcellulosa sui loro lati (lato sinistro fino a un'immagine più del fegato, destra rivolto verso l'alto per l'immagine della cistifellea) con la testa accanto al coprioggetto.
- Spot superglue negli angoli di un secondo vetrino e delicatamente posto un bordo del vetrino sul vetrino montato e l'altra sul vetrino, colmando le larve. Fare attenzione a non applicare una pressione eccessiva durante questo passaggio o con l'obiettivo, mentre per immagini in modo che le larve rimanere illeso.
- Per lungo termine, immagini ad alto ingrandimento con un obiettivo ad immersione in posizione verticale, montare le larve in agarosio. Aggiungere una larva di una piccola aliquota di 1,2% bassa temperatura di fusione agarosio quindi trasferire illarva in un piccolo volume di agarosio ad una piastra di Petri.
- posizionare rapidamente le larve con un poker prima i solidifica agarosio. Lasciare che il agarosio asciugare per 2-3 minuti e coprire l'agarosio pienamente fresca EM per evitare che si secchi.
- Per lungo termine, immagini ad alto ingrandimento con un obiettivo invertito, montare larve su un piatto di vetro-bottom in agarosio.
- Raffreddare un blocco metallico su ghiaccio. Porre la capsula sul blocco metallico separati da un tessuto per impedire il raffreddamento eccessivo e larvale congelamento. Trasferire una larva al piatto e rimuovere la EM wicking con un tessuto.
- Mettere una goccia di 28 ° C bassofondente agarosio (1,2%) al di sopra della larva e subito posizionare con una mazza (lato sinistro verso il basso per migliore immagine fegato, lato destro verso il basso per l'immagine della cistifellea). Rimuovere piatto dal blocco freddo, lasciare asciugare per 2-3 minuti, e aggiungere un volume sufficiente di EM fresco per coprire l'agarosio (~ 2-5 ml).
Intake 5. Il cibosaggio
- Al termine di un feed liposomi tuorlo contenente 6,4 mM BODIPY C 16, in comune un minimo di 10 larve lavato in un tubo di plastica da 1,5 o 2 ml, togliere EM, e scattare congelamento. I campioni possono essere conservati a -80 ° C al riparo dalla luce per diversi mesi.
Nota: Se possibile, raccogliere più replicati. È importante raccogliere larve unfed in questa fase per normalizzare per sfondo lipidi fluorescenza (idealmente larve della frizione stessa vengono utilizzati). - Eseguire una versione modificata Bligh-Dyer estrazione del grasso 3,21.
- Aggiungere 100 microlitri tampone di omogeneizzazione (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) per il campione sul ghiaccio (H 2 O in alternativa purificata può essere utilizzato). Omogeneizzare su ghiaccio con un sonicatore microtip (5 sec totale: 1 sec su 1 sec spento). Verificare che le larve sono completamente omogeneizzato; in caso contrario ripetere. Trasferire in una provetta di vetro cultura usa e getta ml 13 (altri tubi di vetro possono essere utilizzate).
Nota: Il cloroformio è pericoloso; eseguire tutte le successive ex lipidifasi di trazione a temperatura ambiente in una cappa chimica. - Per ogni 100 ml di tampone di omogeneizzazione utilizzati, aggiungere 375 ml di 1: 2 (cloroformio: metanolo). Vortex 30-60 sec, incubare 10 minuti, aggiungere 125 ml di cloroformio per 100 buffer di omogeneizzazione microlitri usato, e vortex 30 sec.
- Aggiungere 125 ml di 200 mM Tris pH 7.5 a 100 buffer di omogeneizzazione microlitri utilizzato, vortice 30 sec, e centrifugare (2.000 x g, 5 min, RT, protetto dalla luce). Rimuovere con attenzione i campioni dalla centrifuga. Verranno separati in due fasi: una fase acquosa superiore è, un'interfaccia di detriti larvale, e una fase organica inferiore (contiene lipidi).
- Con una pipetta di vetro pulita raccogliere fondo, fase organica e trasferirlo in una provetta pulita di vetro 13 ml.
Nota: Fare attenzione ad evitare la fase acquosa e detriti larvale a livello di interfaccia; in caso di contaminazione, ripetere il passaggio centrifugazione e Rammentare. Eliminare la fase superiore, acquosa; può essere utile per rimuovere ed eliminare questofase prima di raccogliere la fase organica. Il campione può essere conservato a -80 ° C per un massimo di 1 mese. - Essiccare la fase organica sotto vuoto (0,12 atm) mentre protegge dalla luce. Non continuare ad asciugare i campioni dopo che il liquido è evaporato quanto ridurrà liposolubilità. Risospendere i lipidi in 2: 1 (cloroformio: metanolo) e memorizzare sul ghiaccio. Il volume ottimale del cloroformio: metanolo soluzione dipende dal metodo di rilevamento utilizzato; iniziare a bassa e continuare a diluire in base alle esigenze. Una linea guida generale è di usare 10 ml per 10 larve in pool.
- Aggiungere 100 microlitri tampone di omogeneizzazione (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) per il campione sul ghiaccio (H 2 O in alternativa purificata può essere utilizzato). Omogeneizzare su ghiaccio con un sonicatore microtip (5 sec totale: 1 sec su 1 sec spento). Verificare che le larve sono completamente omogeneizzato; in caso contrario ripetere. Trasferire in una provetta di vetro cultura usa e getta ml 13 (altri tubi di vetro possono essere utilizzate).
- Trova le interi volumi di esempio in intervalli regolari su un piatto TLC incanalata e la scansione del piatto con uno scanner laser solitamente usata per l'imaging biomolecolare (ad esempio, un lettore di piastre a fluorescenza). Per gli analoghi lipidici fluorescenti inclusi nella lista dei materiali che hanno un massimi di eccitazione 500-650 nm ed emissione massimi 510-665 nm, utilizzare un laser 488 nm e con la raccolta di emissione a 520 nm.
- Quantificare la fluorescenza totale di ogni spot con software di imaging.
Nota: corretto per naturale sfondo lipidi fluorescenza sottraendo la fluorescenza di appaiati, campioni larvali digiuni.
- Quantificare la fluorescenza totale di ogni spot con software di imaging.
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Representative Results
Quando alimentato su una sedia a dondolo a 29-31 ° C, la maggior parte delle larve sane (≥95%) si mangia entro 1 ora. Al momento di consumare l'emulsione di tuorlo d'uovo, l'intestino delle larve scurisce a colori. Molto intestini scuri possono essere osservati a 2 ore (Figura 1). Se larve sono digiuni o non vengono alimentate, l'intestino rimane chiaro. Le larve d'uovo alimentato mostra bianco un dilatate lume intestinale che non oscurano a colori.
Figura 1:. Screening Larve for Food Intake tipo selvaggio larve 6-DPF sono stati alimentati 5% tuorlo d'uovo in EM per 2 ore o trattati in parallelo in EM per ottenere controlli digiuni. larve digiuni hanno intestini chiare, mentre le larve Fed che hanno consumato il tuorlo d'uovo hanno intestino scuri quando ripreso a 10X su uno stereoscopio. Barre di scala rappresentano 0,1 mm.Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Alimentazione con analoghi lipidici fluorescenti permette la visualizzazione dei trasporti sistemica e l'accumulo subcellulare di lipidi alimentari. Il segnale fluorescente è presente in tutto l'apparato digerente (intestino, fegato e pancreas) di larve alimentate 5% tuorlo d'uovo con 6,4 micron fluorescente C 16 analogica per 8 ore montato con il vetrino tettoia metodo e ripreso con un obiettivo in posizione verticale (Figura 2) 3.
Figura 2:. Fluorescent lipidi Analoghi Visualize dietetico dei lipidi Trasporti Rappresentante immagine composita di una larva 6-DPF (testa rivolta a destra) alimentato 5% tuorlo d'uovo in EM con 6,4 micron BODIPY FL C 16 per 8 ore. Le larve è stato montato nel 3% metilcellulosa dal vetrino tettoia metodo e ripreso con un montante 63X obiettivo ad immersione su un singolo fotone microscopio confocale con un laser ad argon. Barre di scala rappresentano 20 micron. Fegato, L; intestino, I; pancreas, P, cistifellea, GB; ristampato con il permesso di Dev Bio 3. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Vari analoghi lipidi permettere la visualizzazione di gruppi unici di strutture cellulari dal momento che sono in modo differenziale metabolizzati in lipidi complessi (ad esempio, trigliceridi, esteri del colesterolo, fosfolipidi). Dopo 4-8 ore si nutre, C fluorescente 16 e C 12 analoghi etichetta gocce lipidiche, fluorescenti FL C 5 etichette gocce lipidiche, dotti epatici e pancreatici, membrane cellulari e le reti arteriose, e fluorescente C 2 analogici etichette epatica e dotti pancreatici e cellulare membrane (Figura 3) 3.
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Figura 3:. Diverso fluorescenti lipidici Analoghi un'etichetta univoca cellulari Organi immagini composite rappresentativi di larve alimentato 5% tuorlo d'uovo in EM con 6,4 micron BODIPY FL C 16, C 12, C 5 o C 2 per 4-8 ore (6 DPF) . C 16 analogico viene osservata in goccioline lipidiche (LD) di enterociti, C 12 e C 5 analoghi a enterociti LD e lume intestinale, e C 2 analogici nel lume intestinale. Le larve sono stati montati nel 3% metilcellulosa dal vetrino tettoia metodo e ripreso con un 63X obiettivo eretta immersione in olio su un singolo fotone microscopio confocale con un laser ad argon. Barre di scala rappresentano 20 micron. Ristampato con il permesso di Drug Discov Oggi Dis Models 22._blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Il saggio assunzione di cibo larvale stato sviluppato per studiare mutazioni genetiche come, transgenici sovraespressione del gene, e / o il trattamento esogeno influisce assunzione di cibo larvale. Le larve sono alimentati un pasto ricco di lipidi a spillo con un analogo lipide fluorescente per indicare la quantità di cibo consumato. larve unfed sono raccolti in parallelo per normalizzare per la quantità di fluorescenza di fondo presenti nelle larve, aumentando la sensibilità con cui l'analogo lipide fluorescente può essere rilevato. Questo test è stato utilizzato per dimostrare che la sovraespressione di Apolipoproteina A-IVb.1 (apoA-IVb.1) diminuisce l'assunzione di cibo. In precedenza digiuni Tg (HSP70: apoA-IVb.1: mCherry) larve alimentato il 10% tuorlo d'uovo con 6,4 micron fluorescente C 16 analogica per 4 ore a 7 dpf consumato circa il 30% in meno di grassi rispetto tipo larve selvatico (Figura 4) 20.
Figura 4:. Rappresentante assunzione di cibo Tipo di analisi selvaggio (WT) e Tg (HSP70: apoA-IVb.1: mCherry) (Tg) larve sono state alimentate il 10% di pollo tuorlo d'uovo con 6,4 micron BODIPY FL C16 per 4 ore (Fed) o trattati in parallelo a EM (digiuni). (A) Le larve sono stati raggruppati (n = 10), i lipidi sono stati estratti, e gli estratti sono stati avvistati su una piastra TLC. (B) la fluorescenza totale è stato quantificato, espresso in unità arbitrarie fluorescenti (AFU), normalizzato per la fluorescenza di fondo in fratelli digiuni per sottrazione, e ha espresso rispetto al WT. Tg larve iperespressione ApoA-IVb.1 ingerire meno analoghi lipidi fluorescente, come mostrato dal confronto con WT (accoppiato test t, p <0.001; n = 9, 20 larve per esperimento). La scatola rappresenta i 25-75 ° percentile, e la mediana è indicato. I baffi mostrano i 10-90 ° percentile. ristampatocon il permesso di Dis Modello Mech 20. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le tecniche qui descritte permettono ai ricercatori di trattare zebrafish larvale con mangimi ricchi di lipidi, visualizzare trasformazione dei lipidi nella dieta in larve vive, e quantificare l'assunzione di cibo larvale. Per garantire il successo, particolare attenzione deve essere data a diversi passaggi critici. uova di gallina commerciali variano; Per minimizzare la variabilità potenziale eseguiamo tutti i saggi su uova biologiche da polli privi di gabbia che non sono stati arricchiti per gli acidi grassi omega-3. Tariffe di alimentazione più bassi possono essere osservati in pesci più giovane di 6 DPF con il restante endogeni forniture di tuorlo d'energia, pesce malsano, o pesce con mutazioni di sviluppo che impediscono l'assunzione di cibo (ad esempio, della mascella o malformazione dell'intestino, l'incapacità di nuotare correttamente). Il laboratorio Farber esegue generalmente studi di alimentazione a 6-7 giorni dopo la fecondazione (DPF), perché le larve non richiedono cibo esogeno finché i loro negozi tuorlo endogeni sono esauriti e l'esaurimento tuorlo consente una migliore visualizzazione del sistema digestivo. Alimentazionea temperatura ambiente anche di ridurre drasticamente il numero di larve che mangiano. La mancata schermo larve per l'assunzione di cibo e l'inclusione non intenzionale di larve digiuni in esperimenti successivi possono confondere i risultati. Inoltre, è importante proteggere gli analoghi lipidici fluorescenti, e tutti i campioni larvali alimentati con gli analoghi, dalla luce quando possibile mantenere la massima fluorescenza e sensibilità pertanto dosaggio. Infine, se l'assunzione di cibo sarà misurato, non consentono l'alimentazione e la caccia (periodo metabolismo post-feed) per superare un totale di 4 ore, dal momento che il pasto inizierà ad essere espulso. Attualmente, il tasso a cui il pasto e associati analoghi lipidici fluorescenti sono escreti è sconosciuta, ma la fluorescenza può persistere in tutto il corpo larvale per almeno 2 giorni di alimentazione posta (JPO e SAF dati non pubblicati).
Ci sono diversi modi per modificare e risolvere i problemi dei protocolli per rispondere alle domande sperimentali di interesse. L'alimentazione ricca di lipidi può essere eseguita per vari periodi di time: 1 hr fornirà un piccolo pasto, mentre 4 hr riempirà l'intestino con una grande quantità di lipidi. Tuttavia, l'alimentazione delle larve più di 6 ore non è raccomandato come il tuorlo e EM non sono preparati in condizioni di sterilità e la proliferazione batterica nel tuorlo d'uovo / emulsione bianca può confondere risultati (vale a dire, una maggiore infiammazione, alterato profilo microbiota intestinale). Le larve può essere esaminato subito dopo la poppata per indagare gli effetti acuti di Le larve si nutrono immobilizzato da una breve raffreddamento o anestesia rapidamente cominciare a alimentato di nuovo dopo il riscaldamento, ma il raffreddamento è il metodo preferibile di immobilizzazione come larve possono presentare vomito su di anestesia (SAF inedito osservazione). In alternativa, i periodi di inseguimento possono essere effettuate dopo l'avanzamento per consentire il trasporto e il metabolismo dei lipidi alimentari precedenti per studiare. Sebbene feed sono solitamente effettuate in soluzione di liposomi 5 ml, alimentazioni sono stati condotti con successo in volumi da 1 a 20 ml. concentrazione Varis di tuorlo d'uovo può essere utilizzato per i feed larvale; laboratorio Farber esegue abitualmente esperimenti con 5% tuorlo d'uovo (1 ml tuorlo aggiunto a 19 ml EM), 0,5% tuorlo d'uovo, e il 10% tuorlo d'uovo.
Ci sono potenziali limitazioni di analoghi lipidici fluorescenti che devono essere considerati. Quando si sceglie un analogo lipide fluorescente è importante considerare come lipidi fisiologicamente elaborato e dove la porzione fluorescente è sulla struttura chimica del lipide nell'interpretazione dei risultati. Ad esempio, i trigliceridi sono suddivisi in acidi grassi liberi e glicerolo ed esteri del colesterolo in colesterolo e acidi grassi liberi, nel lume intestinale prima dell'assorbimento. Pertanto, se un fluorescenti trigliceridi o colesterolo estere analogico viene fornito nella dieta fluorescenza osservato nel corpo seguirà l'acido grasso, colesterolo libero o glicerolo che la frazione fluorescente è attaccato, non il trigliceride o colesterolo estere originale. diverso fluorescenanaloghi t lipidi etichetta strutture cellulari unici, e questo fatto dovrebbe essere considerata durante la selezione 3. Anche di nota, rispetto al metabolismo degli acidi grassi nativi, l'aggiunta di un residuo BODIPY è approssimativamente equivalente ad aggiungere ~ 2-3 atomi di carbonio per la lunghezza della catena di acido grasso (SAF dati non pubblicati).
Le tecniche qui descritte rappresentano progressi significativi rispetto saggi precedenti descritti nel campo. Prima studi per lo sviluppo di questo feed tuorlo d'uovo di gallina, due manoscritti dettagliato in cui le larve sono state alimentate alimentato uovo sodo tuorlo 4,23. La tecnica qui descritta presenta il vantaggio che il tuorlo d'uovo non deve essere sodo e polvere prima dell'uso e che tuorlo d'uovo in polvere ha una breve emivita causa della sua rapida ossidazione. tuorlo d'uovo liquido può anche essere preparato come liposomi che accettano facilmente gli analoghi lipidici fluorescenti per la consegna della dieta efficace. In alternativa, i lipidi radioattivi possono essere utilizzati per investigate dietetico metabolismo lipidico e misurare l'assunzione di cibo, ma analoghi lipidici fluorescenti non presentano i rischi per la sicurezza associati con la radioattività. Tuttavia se i ricercatori desiderano utilizzare lipidi radioattivi, il laboratorio Farber ha condotto studi per verificare che i lipidi radioattivi possono essere incorporati nella, e nutriti con successo, liposomi 19. Gli analoghi lipidici fluorescenti qui descritti sono stati scelti perché mostrano il metabolismo altamente simile a lipidi endogeni e radioattivi, e sono stati sufficientemente brillante per basso e l'imaging ad alta potenza.
Che precede lo sviluppo di questa tecnica per alimentare analoghi lipidici fluorescenti per le larve, altri metodi erano disponibili a visualizzare il trasporto dei lipidi nella dieta e l'accumulo in vivo. visualizzazione diretta degli analoghi lipidici fluorescenti in grado di fornire un vantaggio rispetto all'uso di misure indirette della fisiologia, come i lipidi sierici. Rilevazione del cibo delle larve zebrafish è stato anche un lungo-standing sfida nel campo. L'unica alternativa era quella di cultura parameci, etichettarli con il tracciante fluorescente lipofila 4- (4- (didecylamino) styryl) - N ioduro -methylpyridinium (4-Di-10-ASP), permettono larve per nutrire, e misurare la fluorescenza di l'area intra-addominale con un lettore di piastre 24. Infine, queste tecniche hanno il vantaggio di essere applicabile ad entrambi gli schermi medio-throughput (cioè forward schermi genetiche di elaborazione lipidi alimentari) nonché studi di imaging concentrata ad alto ingrandimento (cioè, genetica inversa, studi ipotesi motrici). In futuro, queste tecniche possono essere applicate a fenotipo e lo schermo diversi modelli di metabolica e GI malattia in zebrafish.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
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