Introduction
Die Mechanismen, mit denen der Darm Nahrungslipid Verarbeitung reguliert, steuert die Leber komplexe Lipidsynthese und Lipoprotein-Metabolismus und wie diese Organe mit dem zentralen Nervensystem arbeiten Nahrungsaufnahme zu steuern, sind nicht vollständig verstanden. Es ist der biomedizinischen Interesse, diese Biologie in Anbetracht der aktuellen Epidemien von Fettleibigkeit, Herz-Kreislauf- Erkrankungen aufzuklären, Diabetes und nicht-alkoholische Fettlebererkrankung. Studien in der Zellkultur und Mäusen haben die Mehrheit der unser Verständnis der mechanistischen Beziehungen zwischen Nahrungslipiden und Krankheit, und Zebrabärbling (Danio rerio) sind , sich als ideales Modell zur Verfügung gestellt , diese Arbeit zu ergänzen.
Zebrabärblinge haben ähnliche gastrointestinale (GI) Organe, den Fettstoffwechsel und Lipoprotein Transport zu den höheren Wirbeltieren 1,2, entwickeln sich schnell und sind genetisch manipulierbaren. Die optische Klarheit des Larven Zebrabärbling erleichtert in vivo - Studien, eine particular Vorteil für das Studium des GI - System als extrazelluläre Milieu (dh, Galle, Mikrobiota, endokrine Signalisierung) ist praktisch unmöglich , zu modellieren , ex vivo. Entsprechend wird ein Körper der Forschung der genetischen Lenkbarkeit und Zuträglichkeit Kombination Bildgebung von Zebrabärblingembryonen zu leben eine Vielzahl von Nahrungs Manipulationen ( mit hohem Fettgehalt 3,4, -Cholesterin 5 und Kohlenhydrat - Diäten 6,7) und Modelle von kardiovaskulären Erkrankungen 8, Diabetes 9,10, Hepatosteatose 11-13 und Fettleibigkeit 14-16, entstehen eine Vielzahl von metabolischen Erkenntnisse zur Verfügung zu stellen.
Ein wesentlicher Aspekt der Larven Zebrabärbling in Stoffwechselforschung des Übergangs ist die Optimierung der in anderen Modelltiere auf den Zebrabärbling und die Entwicklung neuer Assays entwickelt Techniken, die die einzigartigen Stärken der Zebrabärbling nutzen. Dieses Protokoll stellt Techniken entwickelt und optimiert Larven Zebrabärbling zu füttern ein lipid-reiche Mahlzeit, zu visualisieren diätetischen Lipid Verarbeitung von ganzen Körper zu subzellulärer Auflösung, und die Nahrungsaufnahme zu messen. Chicken egg yolk wurde gewählt, um die lipidreichen Mahlzeit zu schreiben, da es ein hohes Maß an Fetten und Cholesterin enthält (Lipide komponieren ~ 58% der Hühner Eigelb, von denen ca. 5% Cholesterin, 60% Triglyceride sind, und 35% sind Phospholipide ). Chicken egg yolk bietet mehr Fett als typische kommerzielle Zebrabärbling Mikropellet Lebensmittel (~ 15% Lipide) und dem Vorteil , dass es eine standardisierte Feed mit bekannten Prozentsätze der spezifischen Fettsäuren Art ist, wie Zebrabärbling Diäten und Fütterungs Regimenter nicht über labs 17 standardisiert. Darüber hinaus visualisieren fluoreszierende Lipid - Analoga im Eigelb zur Verfügung gestellt Transport und Akkumulation von Nahrungslipiden 18, Bild Zellkomponenten einschließlich Lipidtröpfchen , die durch die beiden als Vitalfarbstoffe 3 und durch kovalente Einbindung in komplexe Lipide wirken, untersuchen Stoffwechsel durch Dünnschichtchromatographie (TLC) 19 20 bereitzustellen.
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Protocol
Diese Protokolle wurden von der Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care und Use Committee (Protokoll Nr. 139) zugelassen.
1. Vorbereitung der Tiere
- Pflegen Erwachsene und Larven bei 28 ° C auf einer 14 Stunden: 10 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus. Ziehen Erwachsene zweimal täglich mit der Schale , ohne Artemia (decapsulated, nicht-Schraffur, ab 14 dpf) und kommerzielle Mikro.
- Diese Protokolle sind für den Einsatz von 6-7 dpf Larven von natürlichen Laich des AB Hintergrund gesammelt optimiert. Protokolle können für Larven anderer Altersgruppen und modifiziert werden. Nicht bieten exogene Lebensmittel vor 6 dpf.
- Anästhesieren Larven mit Tricaine in Embryomedium (EM) (4,2 ml einer 4 mg / ml Tricaine pro 100 ml EM) bei Raumtemperatur (RT).
2. Herstellung von lipidreichen Eidotter-Feed
- Bereiten Sie und speichern Sie das Huhn Eigelb. Trennen Sie das Eigelb und Eiweiß von 12 Hühnereiern. Pool die Eigelbe, aliquoten 1 ml in 1,5ml-Röhrchen, und bei -80 ° C bis zu 1 Jahr (12 Eigelb wird ~ 80 Aliquots machen). Pool die Weißen, zu speichern und zu verwenden als Lipid armen, eiweißreiches Futter.
- Bereiten fluoreszierendes Lipid analog (s) bis zu dem Eigelb Futter hinzugefügt werden, falls gewünscht.
- Hängen Sie das gekauft, pulverisierte fluoreszierende Lipid analog in 100% Ethanol oder 100% Chloroform bei 0,1 ug / ul (siehe folgenden Hinweis Lösungsmittel diskutieren), aliquoten in opaken Glasröhren, Dichtung mit Parafilm und Speicher nach den Anweisungen des Herstellers. Aufgrund der schnellen Verdampfung von organischen Lösungsmitteln nicht aliquoten Mengen von weniger als ~ 400 & mgr; l für die Langzeitlagerung verwendet werden.
Hinweis: Wenn das Lipid analog in Ethanol suspendiert wird, um große Mengen des Lipid analog verwendet werden , weil es schneller unter N 2 als Chloroform trocknet. Wenn das Lipid analog in Ethanol suspendiert muss es nicht, bevor es an das Liposom Futter in Schritt 2.2.4 getrocknet und resuspendiert werden, das Hinzufügen, aber die Gesamtethanolkonzentration nicht 0 überschreiten sollte.1% in der Liposom-Zufuhr potentiell verwirrende physiologischen Wirkungen von Ethanol zu vermeiden. - Für fluoreszierende Fettsäure-Analoga: Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von 20 ml 5% Eigelb-Emulsion in EM. Von der Vorbereitung 5 - ml - Aliquots mit einer Endkonzentration von 6,4 & mgr; M 4,4-Difluor-4-bora-3a, 4a-Diaza-s-Indacen- (BODIPY C 16) für die Live - konfokale Bildgebung und die Nahrungsaufnahme Assays oder 1 & mgr; g / ml BODIPY C 12 für Stereoabbildung. Übertragen, um die gewünschte Menge des fluoreszierenden Lipids analogen in ein 1,5 ml-Kunststoffröhrchen. Trocknen Sie das Lipid unter einem Strom von N 2, kümmert sich nicht um das Lipid aus dem Rohr zu blasen.
- Sofort Resuspension in 5 ul 100% Ethanol durch einen Strom Pipettieren an den Seiten des Rohres, fügen Sie 95 ul EM, und gut mischen.
Hinweis: Die Mischung homogen erscheinen soll; wenn farbige Lipid an den Seiten des Röhrchens bleibt oder die Flüssigkeit erscheint clumpy hat das Lipid nicht vollständig solubilisiert und Ethanol erfordert. Schützen Sie den Schlauch herm Licht und auf Eis lagern. - Für fluoreszierende Cholesterin analog: eine endgültige Konzentration von 2,4 ug / ml Cholesterin in 5 ml 0,5-5% Eigelb-Emulsion für Live-Imaging-Studien vorzubereiten. Übertragen, um die gewünschte Menge an Cholesterin in einem 1,5 ml Kunststoffröhrchen. Trocknen Sie das Lipid unter einem Strom von N 2, kümmert sich nicht um das Lipid aus dem Rohr zu blasen.
- Unmittelbar, resuspendieren in 15 ul RT 100% Ethanol , indem ein Strom an den Seiten des Röhrchens pipettiert und mit 85 ul RT 1% fettsäurefreies BSA in gereinigtem H 2 O mischen Schützen Sie das Rohr vor Licht und lagern auf dem Eis.
- Hängen Sie das gekauft, pulverisierte fluoreszierende Lipid analog in 100% Ethanol oder 100% Chloroform bei 0,1 ug / ul (siehe folgenden Hinweis Lösungsmittel diskutieren), aliquoten in opaken Glasröhren, Dichtung mit Parafilm und Speicher nach den Anweisungen des Herstellers. Aufgrund der schnellen Verdampfung von organischen Lösungsmitteln nicht aliquoten Mengen von weniger als ~ 400 & mgr; l für die Langzeitlagerung verwendet werden.
- Bereiten Sie Eidotter Liposom-Feed.
- Fügen Sie eine aufgetaute Aliquots von Eigelb EM in einem 50 ml konischen Röhrchen. Vortex die verdünnte Eigelbmischung für 1-2 min; Die Mischung sollte eine homogene Emulsion zu sein scheinen.
- Gießen Sie die Mischung durch ein Sieb feinmaschigen Protein Konglomerate zu entfernen und sammeln sich in einem neuen, frischen 50 ml konischen Röhrchen.
- Pulse sonicate die Ei-Mischung mit einem ein Viertel Zoll verjüngte microtip (5-mal (5 x 1 sec, 1 sec aus) pausieren 5-10 sec zwischen jedem Satz; Ausgangsintensität: 6 W) bei RT Liposomen zu erstellen. Sonicator Leistungseinstellungen sind Instrument abhängig und deshalb eine Optimierung für jedes Instrument und microtip erfordern.
Hinweis: Kontinuierlich Liposomenmischung rocken bei RT Homogenität bis zum Gebrauch aufrechtzuerhalten.
- Fügen Sie die fluoreszierenden Lipids analog zu den Eigelb-Liposome, falls gewünscht. Unmittelbar nach der Ultraschallbehandlung pipettieren die vorbereiteten Lipide in dem Liposom Mischung und vortex bei hoher Geschwindigkeit für 30 Sekunden in die Liposomen zu inkorporieren. Schützen Sie die Mischung aus Licht, das durch das Rohr in Folie wickeln und weiter bei RT zu schaukeln.
3. Fütterung Paradigm
- Bereiten Sie die Larve für Füttern.
- Vor dem Futter zu Beginn Bildschirm Larven auf offensichtliche morphologische Defekte, die Fütterung behindern. Transfer Larven bis 60 mm x 15 mm Petrischalen oder 6- oder 12-Well-plaTES, reduzieren EM auf ein Minimum, und mit 5 ml der hergestellten Liposomenlösung ersetzen.
- Bei Bedarf übertragen unfed Kontrollarven bis 5 ml EM und / oder 5 ml 5% Eiweiß in EM und parallel zu behandeln.
- Schütteln Sie die Larven in einem inkubiert Wippe (29-31 ° C bei 30 Umdrehungen pro Minute) während der gesamten Futternahrungsaufnahme zu fördern und gleichzeitig weiterhin von Licht abzuschirmen, wenn fluoreszierende Lipid-Analoga vorhanden sind. Wenn Larven Notwendigkeit Licht ausgesetzt werden, minimieren die Belichtung mit einer getönten Glas Inkubator Abdeckung.
- Am Ende der Fütterungsperiode, spülen Sie die frei schwimmenden Larven in EM 3 mal.
Anmerkung: Die Larven beginnen Liposomen an einem beliebigen Punkt während des Vorschubs raubend. Wenn es wichtig ist, dass Larven zur gleichen Zeit beginnen Fütterung, Bildschirm für die Nahrungsaufnahme (siehe 3.4) nach 1 Stunde der Fütterung und zurück nur Larven, die begonnen haben, auf die Eigelb-Emulsion Zuführen des Futter abzuschließen. - Bildschirm, um die Larven zu diesem Zeitpunkt für die Nahrungsaufnahme als kleine Zahl kann nicht eat (in der Regel ~ 0-5%). Untersuchen den Darm der Larven , die anästhesiert wurden oder leicht abgekühlt auf einem Metallblock auf Eis , um zu bestimmen , ob sie eingespeist wurden: Larven , die Liposomen verbraucht wird einen abgedunkelten Darm aufweisen (Abbildung 1).
- Bild oder Prozess Larven für die Nahrungsaufnahme sofort. Alternativ Ort Larven in frischen EM und bei 28 ° C inkubieren metabolische Verarbeitung auftreten zu lassen.
4. Larvae Montage für Live-Imaging
- Bereiten Sie die Montage Medien.
- Für 3% Methylcellulose: 0,75 g Methylcellulose zu 25 ml in der Nähe siedende EM, Wirbel, Felsen bei RT 2-3 Tage, bis sie vollständig gelöst und bei 4 ° C über Jahre bei -20 ° C hinzufügen. Wiederholte Zyklen von Einfrieren und Auftauen bei 4 ° C Luftblasen zu entfernen. Lagern Sie 3% Methylcellulose auf Eis, während Larven Montage.
- Für 1,2% niedrig-Mount-Agarose: add 0,3 g niedrigschmelzende Agarose zu 25 ml EM und lösen sich durch zum Kochen zu bringen, aliquoten in 2 ml tUBEs und auf einem Heizblock bei 26-28 ° C halten. Unused Aliquots können bei RT oder 20 ° C und kochte erneut zum Zeitpunkt der Verwendung gelagert werden. Achten Sie darauf, dass Agarose kühl genug ist, vor der Belichtung zu Larven zu handhaben oder sie können überheizt.
- Für Low-Vergrößerung, mittleren Durchsatz Live-Bildgebung, einen Glasobjektträger auf einem Gewebe auf einem Metallblock auf Eis und warten, bis die Folie zu kühlen. Tragen Sie eine großzügige Menge von 3% Methylcellulose (die bei 4 ° C auf Eis gehalten wurde) auf den Objektträger, übertragen eine Larve auf die 3% Methylcellulose, mit einer Angelschnur Poker (0,41 mm Durchmesser Angelschnur auf den aufgeklebten Ende eines Kapillarrohrs Glas) schaffen eine troth überschüssige EM abzulassen (so dass Methylcellulose wird nicht verdünnt) und die Larven positionieren, wie gewünscht.
- Für kurzfristige (<20 min), hoher Vergrößerung Echtzeit-Bildgebung mit einem aufrechten Öl emersion Ziel, montieren Larven mit dem Deck lean-to-Methode.
- Verwenden Sie Cyanoacrylat basierten Klebstoff (Superglue) zuaa 22 mm x 30 mm Deckglas an einem Ende eines Glasobjektträger befestigen. Verwenden Sie einen Poker eine dünne Linie von 3% Methylcellulose zu setzen auf dem Schlitten neben dem Deckglas und übertragen Larven auf den Schlitten mit einer großen Bohrung Pasteur-Pipette. Überschüssiges EM, damit es nicht die Methylcellulose zu verdünnen.
- Mit einem Poker positionieren sanft Larven in der Methylcellulose auf ihren Seiten (linke Seite bis zur Bild mehr von der Leber, der rechten Seite nach oben auf Bild, um die Gallenblase) mit ihren Köpfen neben dem Deckglas.
- Spot superglue in den Ecken eines zweiten Deckglas und legen sanft eine Kante des Deckglases auf dem montierten Deckglas und die andere auf der Folie, die Larven überbrücken. Achten Sie darauf, nicht Überdruck in diesem Schritt anzuwenden oder mit dem Ziel, während Bildgebung, so dass Larven heil bleiben.
- Für langfristige, hoher Vergrößerung Bildgebung mit einem aufrechten Tauchziel, montieren Larven in Agarose. Fügen Sie eine Larve auf eine kleine Teilmenge von 1,2% niedriger Schmelz Agarose dann übertragen dieLarve in einem kleinen Volumen von Agarose zu einer Petrischale.
- Lage, schnell die Larven mit einem Poker vor dem Agarose verfestigt. Lassen Sie die Agarose für 2-3 min zu trocknen und die Agarose vollständig mit frischem EM bedecken Austrocknen zu verhindern.
- Für langfristige, hoher Vergrößerung Bildgebung mit einem invertierten Ziel, montieren Larven auf einem Glasbodenschale in Agarose.
- Kühlen Sie einen Metallblock auf dem Eis. Die Schale auf dem Metallblock durch ein Gewebe getrennt zu starke Abkühlung und Larven Einfrieren zu verhindern. Übertragen einer Larve in die Schale und nehmen Sie die EM, indem sie mit einem Gewebe Wicking.
- Geben Sie einen Tropfen von 28 ° C niedrigschmelzende Agarose (1,2%) an der Spitze der Larve und sofort Position mit einem Poker (linke Seite nach unten auf beste Bild der Leber, rechte Seite nach unten auf Bild der Gallenblase). Entfernen Sie Gericht aus dem kalten Block, lassen für 2-3 Minuten, um zu trocknen, und fügen Sie ein ausreichendes Volumen an frischem EM decken die Agarose (~ 2-5 ml).
5. NahrungsaufnahmeProbe
- Am Ende eines Eigelb Liposom Futter mit 6,4 uM BODIPY 16 C, Pool ein Minimum von 10 gewaschen Larven in einem Kunststoff - 1,5 oder 2 - ml - Röhrchen, entfernen EM und gefrier schnappen. Die Proben können vor Licht geschützt für mehrere Monate bei -80 ° C gelagert werden.
Hinweis: Wenn möglich, sammeln Sie mehrere Replikationen. Es ist wichtig, unfed Larven in diesem Schritt zu sammeln für die Hintergrundfluoreszenz Lipid zu normalisieren (idealerweise Larven von der gleichen Kupplung verwendet werden). - Führen Sie eine modifizierte Bligh-Dyer Lipidextraktion 3,21.
- Füge 100 & mgr; l Homogenisierungspuffer (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) auf die Probe auf Eis (alternativ gereinigtem H 2 O verwendet werden können). Homogenisieren auf Eis mit einem microtip Beschallungsgerät (5 sec gesamt: 1 s auf 1 s aus). Überprüfen Sie, dass Larven sind völlig homogenisiert; wenn nicht, wiederholen. Transfer in ein 13-ml-Einwegglaskulturröhrchen (andere Glasröhren verwendet werden).
Hinweis: Chloroform ist gefährlich; führen alle nachfolgenden Lipid-exTraktionsschritte bei RT in einer chemischen Haube. - Für jeweils 100 & mgr; l verwendet Homogenisierungspuffer, fügen 375 ul 1: 2 (Chloroform: Methanol). Vortex 30-60 sec, Inkubation 10 min, fügen Sie 125 ul Chloroform pro 100 ul verwendet Homogenisierungspuffer, und Vortex 30 Sekunden.
- In 125 ul 200 mM Tris pH 7,5 pro 100 ul Homogenisierungspuffers verwendet, Wirbel 30 sec, und Zentrifuge (2000 x g, 5 min, RT, lichtgeschützt). Entfernen Sie vorsichtig die Proben aus der Zentrifuge. Sie werden in zwei Phasen getrennt werden: eine obere Phase wäßrig ist, über eine Schnittstelle von larvalen Schutt, und eine untere organische Phase (enthält Lipide).
- Mit einem sauberen Glaspipette den Boden, organische Phase sammeln und übertragen sie in ein sauberes 13 ml Glasröhrchen.
Hinweis: Achten Sie auf die wässrige Phase und Larven Trümmer an der Schnittstelle zu vermeiden; wenn Verunreinigungen auftreten, Zentrifugationsschritt und recollect wiederholen. Entsorgen Sie die obere, wässrige Phase; kann es hilfreich sein, dies zu entfernen und zu entsorgenPhase vor der organischen Phase zu sammeln. Die Probe kann bis zu 1 Monat bei -80 ° C gelagert werden. - Die organische Phase wird unter Vakuum (0,12 atm), während sie von Licht zu schützen. Machen Sie nicht weiter um die Proben zu trocknen, nachdem die Flüssigkeit verdampft ist, wie es Lipidlöslichkeit reduzieren. Resuspendieren der Lipide in 2: 1 (Chloroform: Methanol) und auf Eis lagern. Das optimale Volumen der Chloroform: Methanol-Lösung hängt von dem Nachweisverfahren verwendet wird; beginnen niedrig und weiterhin nach Bedarf zu verdünnen. Eine allgemeine Richtlinie ist 10 & mgr; l für 10 gepoolten Larven zu verwenden.
- Füge 100 & mgr; l Homogenisierungspuffer (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) auf die Probe auf Eis (alternativ gereinigtem H 2 O verwendet werden können). Homogenisieren auf Eis mit einem microtip Beschallungsgerät (5 sec gesamt: 1 s auf 1 s aus). Überprüfen Sie, dass Larven sind völlig homogenisiert; wenn nicht, wiederholen. Transfer in ein 13-ml-Einwegglaskulturröhrchen (andere Glasröhren verwendet werden).
- Finde die gesamte Probenvolumina in gleichmäßigen Abständen auf eine DC - Platte kanalisiert und scannen Sie die Platte mit einem Laserscanner routinemäßig für biomolekulare Bildgebung verwendet (zB ein Fluoreszenzplattenleser). Für die fluoreszierende Lipid-Analoga in der Materialliste enthalten, die eine Anregungsmaxima von 500 bis 650 nm und Emissionsmaxima von 510 bis 665 nm haben, verwenden Sie einen 488-nm-Laser und mit Emissions Sammlung bei 520 nm.
- Quantifizierung der Gesamtfluoreszenz von jedem Ort mit Imaging-Software.
Hinweis: Richtige für natürlich durch Subtraktion der Fluoreszenz gepaart, ungefüttert Larven Proben Hintergrund Lipid Fluoreszenz auftritt.
- Quantifizierung der Gesamtfluoreszenz von jedem Ort mit Imaging-Software.
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Representative Results
Wenn bei 29-31 ° C auf einer Wippe zugeführt wird, wird die Mehrheit der gesunden Larven (≥95%) innerhalb von 1 Stunde essen. Nach Erhalt der Eigelb-Emulsion aufwendig, verdunkelt sich der Larvendarm in Farbe. Sehr dunkle Darm kann bei 2 Stunden (Abbildung 1) beobachtet werden. Wenn Larven unfed sind oder zu füttern fehlschlagen, bleibt der Darm klar. Die Larven gefüttert Eiweiß zeigen einen aufgeblähten Darm-Lumen, das nicht in der Farbe nicht verdunkeln.
Abb . 1: Screening Larvae für Nahrungsaufnahme Wildtyp - 6-dpf Larven wurden 5% Eigelb in EM gefüttert für 2 Stunden oder parallel in EM behandelt unfed Kontrollen erhalten. Unfed Larven haben klare Darm während gefüttert Larven, die Eigelb dunklen Eingeweiden haben verbraucht haben, wenn sie bei 10X auf einem Stereoskop abgebildet. Maßstabsbalken repräsentieren 0,1 mm.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Füttern mit fluoreszierenden Lipid-Analoga ermöglicht die Visualisierung von systemischer Transport und subzellulärer Anhäufung von Nahrungslipiden. Das Fluoreszenzsignal vorhanden ist , in den Verdauungsorganen (Darm, Leber und Bauchspeicheldrüse) von Larven fed 5% Eigelb mit 6,4 uM fluoreszierendes analoge C 16 für 8 h mit dem Deckglas lean-to - Verfahren befestigt ist und mit einem aufrechten Objektivs (Abbildung abzubildenden 2) 3.
Abbildung 2:. Fluorescent Lipid - Analogen Visualize Dietary Lipid Transport Repräsentative Composite - Bild von einem 6-dpf Larve (Kopf nach rechts) gefüttert 5% Eigelb in EM mit 6,4 uM BODIPY FL 16 C für 8 Stunden. Die Larven wurden in 3% Methylcellulose durch die Deck anlehnen zu Verfahren montiert und bebildert mit einem aufrechten 63X Ölimmersionsobjektiv auf einem einzelnen Photon konfokales Mikroskop mit einem Argonlaser. Maßstabsbalken stellen 20 & mgr; m. Leber, L; Darm, I; Bauchspeicheldrüse, P, Gallenblase, GB; mit freundlicher Genehmigung von Dev Bio nachgedruckt 3. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Verschiedene Lipidanaloga ermöglichen die Visualisierung von einzigartigen Sätze von zellulären Strukturen , da sie unterschiedlich in komplexe Lipide metabolisiert werden (dh Triglyceride, Cholesterinester, Phospholipide). Nach 4 - 8 h - Feeds, fluoreszierende C 16 und C 12 - Analoga beschriften Lipidtröpfchen, fluoreszierende FL C 5 Etiketten Lipidtröpfchen, Leber- und Pankreasgänge, Zellmembranen und arterielle Netzwerke und fluoreszierende C 2 analoge Etiketten Leber- und Pankreasgänge und zelluläre 3 - Membranen (Abbildung 3).
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Fig . 3: verschiedene fluoreszierende Lipid Analogs Etikett Einzigartige Cellular Organe Representative zusammengesetzte Bilder von Larven gefüttert 5% Eigelb in EM mit 6,4 uM BODIPY FL C 16, C 12, C 5 oder C 2 für 4-8 h (6 dpf) . C 16 analog ist in Lipidtröpfchen beobachtet (LD) von Enterozyten, C 12 und C 5 Analoga in Enterozyten LD und das Darmlumen und C 2 analog in das Darmlumen. Larven wurden in 3% Methylcellulose durch das Deckglas mit magerer zu Verfahren und abgebildet mit einem aufrechten 63X Ölimmersionsobjektiv auf einem einzelnen Photon konfokales Mikroskop mit einem Argonlaser angebracht. Maßstabsbalken repräsentieren 20 Mikron. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Drug Discov Heute Dis Modelle 22._blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Larven der Nahrungsaufnahme-Assay wurde, wie genetische Mutationen zu untersuchen, entwickelten transgenen Genüberexpression und / oder exogene Behandlung Larvennahrungsaufnahme beeinflussen. Die Larven sind eine lipidreiche Mahlzeit mit einem fluoreszierenden Lipid-analogen versetzt gespeist verbraucht die Menge der Nahrung, um anzuzeigen. Unfed Larven werden in parallel gesammelt für die Menge an Hintergrundfluoreszenz vorhanden in Larven zu normalisieren, um die Empfindlichkeit erhöht wird, mit der die fluoreszierende Lipid analog detektiert werden kann. Dieser Assay wurde verwendet, dass die Überexpression von Apolipoprotein A-IVb.1 zu zeigen (ApoA-IVb.1) verringert die Nahrungsaufnahme. Zuvor unfed Tg (Hsp70: ApoA-IVb.1: mCherry) Larven gefüttert 10% Eigelb mit 6,4 um fluoreszierende C 16 analoge 4 Stunden bei 7 dpf verbraucht etwa 30% weniger Lipide als Wildtyp - Larven (Abbildung 4) 20.
Abbildung 4:. Repräsentative Nahrungsaufnahme Assay Wildtyp (WT) und Tg (Hsp70: ApoA-IVb.1: mCherry) (Tg) Larven wurden 10% Hühnerei gefüttert Eigelb mit 6,4 uM BODIPY FL C16 für 4 Stunden (Fed) oder parallel in EM (Unfed) behandelt. (A) Larven wurden gepoolt (n = 10) wurden Lipide extrahiert, und die Extrakte wurden auf einer DC - Platte getupft. (B) Gesamtfluoreszenz wurde quantifiziert, ausgedrückt in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU), normalisiert für die Hintergrundfluoreszenz in unfed Geschwister durch Subtraktion und ausgedrückt relativ zu WT. Tg Larven überexprimieren ApoA-IVb.1 weniger fluoreszierend markierten Lipidanaloga einnehmen , wie durch Vergleich zu WT gezeigt (Student-t-Test, p paarigen <0,001; n = 9, 20 Larven pro Experiment). Die Box stellt die 25-75 Perzentile, und der Median angegeben. Die Whisker zeigen die 10-90 Perzentile. Neu gedrucktmit freundlicher Genehmigung von Dis Modell Mech 20. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die hier beschriebenen Techniken können Forscher Larven Zebrabärbling mit einer lipidreichen Futter, zu visualisieren diätetischen Lipid Verarbeitung in lebenden Larven und quantifizieren Larven die Nahrungsaufnahme zu behandeln. Um den Erfolg sicherzustellen, sollte besonderes Augenmerk auf einige kritische Schritte gegeben werden. Kommerzielle Hühnereier variieren; mögliche Variabilität zu minimieren, führen wir alle Tests auf Bio-Eier aus Käfigfreie Hühner, die nicht für Omega-3-Fettsäuren angereichert haben. Niedrigere Futter Preise können in Fisch jünger als 6 dpf mit verbleibenden endogenen Dotter Energieversorgung, ungesunde Fisch oder Fisch mit Entwicklungs Mutationen beobachtet werden, die Nahrungsaufnahme behindern (dh, Kiefer oder Darm - Malformation, Unfähigkeit , richtig zu schwimmen). Das Farber Labor führt in der Regel Fütterungsstudien an 6-7 Tagen nach der Befruchtung (dpf), weil Larven exogene Nahrung nicht benötigen, bis ihre endogenen Eigelb speichert erschöpft sind und Dotter Erschöpfung ermöglicht eine bessere Visualisierung des Verdauungssystems. Ernährungbei RT reduziert auch deutlich die Anzahl der Larven, die essen. Bei Nicht Bildschirm Larven für die Nahrungsaufnahme und unbeabsichtigte Aufnahme von unfed Larven in nachfolgenden Experimenten können die Ergebnisse durcheinander bringen. Zusätzlich ist es wichtig, die fluoreszierendes Lipid-Analoga, und alle larvalen Proben mit den Analogen gespeist zu schützen, von Licht, wenn möglich, maximale Fluoreszenz zu halten und somit die Empfindlichkeit des Assays. Schließlich wird, wenn die Nahrungsaufnahme gemessen werden, nicht zulassen, dass die Zu- und Jagd (post-feed Stoffwechsel Periode) insgesamt 4 h zu überschreiten, da das Essen ausgeschieden zu werden beginnt. Derzeit ist die Geschwindigkeit, die Mahlzeit und die damit verbundenen fluoreszierenden Lipid-Analoga ausgeschieden werden, ist nicht bekannt, aber Fluoreszenz kann während des Larvenkörper für mindestens 2 Tage nach Futter (JPO und SAF nicht veröffentlichte Daten) bestehen bleiben.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, um die Protokolle zu ändern und zu beheben, die experimentellen Fragen von Interesse zu beantworten. Die lipidreichen Futter kann für verschiedene Zeiträume t durchgeführt werden,ime: 1 Stunde eine kleine Mahlzeit bieten wird, während 4 Stunden in den Darm mit einer großen Menge an Lipid füllen. Jedoch länger als 6 Stunden die Larven füttern nicht als Dotter empfohlen und EM sind nicht unter sterilen Bedingungen und bakterielle Überwucherung im Eigelb / weiße Emulsion hergestellt wurden, können Ergebnisse durcheinander bringen (dh erhöhte Entzündung, veränderte Darmflora Profil). Die Larven können sofort geprüft werden, nach der akuten Auswirkungen des Futtermittel Larvae durch kurze Abkühlung oder Anästhesie schnell nach Wiedererwärmung gefüttert wieder beginnen immobilisiert zu untersuchen Fütterung, aber Kühlung ist die bevorzugte Methode der Immobilisierung als Larven können Emesis bei Anästhesie (SAF nicht veröffentlichte Beobachtung) aufweisen. Alternativ chase Perioden können nach dem Futter für den Transport und den Stoffwechsel der Nahrungslipiden zu ermöglichen, durchgeführt werden, vor der Studie. Obwohl Zuläufe in 5 ml Liposomenlösung in der Regel durchgeführt werden, wurden erfolgreich Zuläufe in Mengen von 1 bis 20 ml bis hin durchgeführt. Verschiedene Konzentrations Eigelb kann für Larven Feeds verwendet werden; die Farber Labor führt routinemßig Versuche mit 5% Eigelb (1 ml Eigelb 19 ml EM hinzugefügt), 0,5% Eigelb, und 10% Eigelb.
Es gibt potentielle Einschränkungen von fluoreszierendem Lipid-Analoga, die berücksichtigt werden müssen. Wenn ein fluoreszierendes Lipid analog Wahl ist es wichtig, zu überlegen, wie die Lipid physiologisch verarbeitet wird und wobei die fluoreszierende Gruppe auf der chemischen Struktur des Lipids ist bei der Interpretation der Ergebnisse. Zum Beispiel sind Triglyceride aufgeteilt in freie Fettsäuren und Glycerin, und Cholesterinester in freies Cholesterin und Fettsäuren, in dem Darmlumen vor der Absorption. Deshalb, wenn ein fluoreszierendes Triglycerid oder Cholesterinester analog in der Nahrung bereitgestellt wird die Fluoreszenz in dem Körper beobachtet wird, die Fettsäure, freies Cholesterin zu verfolgen, oder Glycerin, die die fluoreszierende Gruppe an gebunden ist, nicht das Original Triglycerid oder Cholesterinester. Verschiedene fluorescent Lipid - Analoga beschriften einzigartige Zellstrukturen, und diese Tatsache sollte bei der Auswahl 3 in Betracht gezogen werden. Ebenfalls bemerkenswert, verglichen mit dem Metabolismus von nativen Fettsäuren, die Zugabe eines BODIPY-Einheit entspricht ungefähr Zugabe ~ 2-3 Kohlenstoffen, an die Fettsäurekettenlänge (SAF nicht veröffentlichte Daten).
Die hier beschriebenen Techniken stellen bedeutende Fortschritte gegenüber früheren Tests auf dem Gebiet beschrieben. Vor der Entwicklung dieses Huhn Eigelb - Feed, in dem zwei Manuskripte detaillierte Studien Larven gefüttert wurden angetrieben 4,23 hartgekochtes Eigelb. Die hier beschriebene Technik den Vorteil, dass das Eigelb braucht nicht hart gekochte und pulverisierte vor zu bedienen sein und daß Eigelbpulver hat eine sehr kurze Halbwertszeit aufgrund seiner schnellen Oxidation. Flüssiges Eigelb kann auch als Liposomen hergestellt werden, die leicht fluoreszierende Lipid-Analoga für eine effiziente Nahrungs Lieferung akzeptieren. Alternativ können radiomarkierten Lipiden Inves verwendet werdentigate Nahrungsfettstoffwechsel und messen die Nahrungsaufnahme, aber fluoreszierende Lipid-Analoga stellen nicht die Sicherheitsrisiken mit Radioaktivität in Verbindung gebracht. Allerdings , wenn die Forscher radiomarkierten Lipide verwenden möchten, hat das Farber Laboruntersuchungen durchgeführt , um sicherzustellen , dass radiomarkierten Lipide in das sie integriert werden können und erfolgreich gefüttert mit Liposomen 19. Die fluoreszierenden Lipid-Analoga hier beschrieben wurden ausgewählt, weil sie sehr ähnlich Stoffwechsel endogener und radiomarkierten Lipide zeigen, und waren ausreichend hell für Low- und High-Power-Bildgebung.
Vor der Entwicklung dieser Technik fluoreszierendes Lipid - Analoga zu Larven zu ernähren, waren keine anderen Methoden Nahrungslipidtransport und Akkumulation in vivo sichtbar zu machen. Direkte Sichtbarmachung von fluoreszierenden Lipid-Analoga können einen Vorteil gegenüber der Verwendung indirekte Maßnahmen der Physiologie, wie Serumlipiden bereitzustellen. Genaue Messung der Larven Zebrabärbling Nahrungsaufnahme war auch ein lang standen Herausforderung auf dem Gebiet. Die einzige Alternative war zu Kultur Paramecien, beschriften sie mit dem fluoreszierenden lipophilen Tracer 4- (4- (didecylamino) styryl) - N -methylpyridinium Iodid (4-Di-10-ASP), dass die Larven zu ernähren, und messen die Fluoreszenz die intra-abdominalen Bereich mit einem Plattenlesegerät 24. Schließlich haben diese Techniken den Vorteil , sowohl für mittleren Durchsatz Bildschirme anwendbar ist (dh nach vorn genetischen Screens von Nahrungsfettverarbeitung) sowie gezielte hochvergrößernden Bildgebungsstudien (dh Reverse Genetik, Hypothese getrieben Studien). In Zukunft können diese Techniken auf Phänotyp angewendet werden und Bildschirm diverse Modelle von metabolischen und GI-Krankheit in Zebrabärbling.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
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