Introduction
De mekanismer genom vilka tarmen reglerar dietary lipid bearbetning, kontrollerar levern komplexa lipid syntes och lipoprotein metabolism, och hur dessa organ arbetar med det centrala nervsystemet för att kontrollera matintag är ofullständigt känd. Det är av biomedicinska intresse att belysa denna biologi i ljuset av de nuvarande epidemier av övervikt, hjärt-kärlsjukdomar, diabetes och alkoholfri fettlever. Studier i cellodling och möss har gett majoriteten av vår förståelse av de mekaniska relationer mellan kost lipider och sjukdom, och zebrafisk (Danio rerio) växer fram som en idealisk modell för att komplettera detta arbete.
Zebrafisk har liknande gastrointestinala (GI) organ, lipidmetabolism och lipoprotein transport till högre ryggradsdjur 1,2, utvecklas snabbt, och är genetiskt lätthanterlig. Den optiska klarhet larver zebrafisk underlättar in vivo-studier, en particular fördel för studier av GI-systemet som dess extracellulära miljön (dvs, galla mikrobiota endokrin signalering) är praktiskt taget omöjligt att modellera ex vivo. Enligt en kropp av forskning som kombinerar den genetiska spårbarhet och gynnsamma villkor för att leva avbildning av zebrafisk larver med en mängd olika kost manipulationer (fettrik 3,4, -kolesterol 5 och -carbohydrate dieter 6,7), och modeller av hjärt-kärlsjukdom 8, diabetes 9,10, leversteatos 11-13, och fetma 14-16, dyker upp för att ge en mängd metaboliska insikter.
En viktig aspekt av övergången larver zebrafisk i metabolisk forskning är optimering av tekniker som utvecklats i andra djurmodeller till zebrafisk och utveckling av nya analyser som utnyttjar de unika styrkor zebrafisk. Detta protokoll presenterar tekniker utvecklas och optimeras för att mata larver zebrafisk en Lipid-rik måltid, visualisera kosten lipid behandling från hela kroppen till subcellulär upplösning och mäta födointaget. Kyckling äggula valdes för att komponera lipid-rika måltid eftersom det innehåller höga halter av fett och kolesterol (lipider komponera ~ 58% av kyckling äggula, varav ~ 5% är kolesterol, 60% är triglycerider, och 35% är fosfolipider ). Kyckling äggula ger mer fett än typiska kommersiella zebrafisk micropellet livsmedel (~ 15% lipider) och den fördelen att det är ett standardiserat foder med kända procenthalter av specifika fettsyror arter, som zebrafisk dieter och utfodring regementen inte har standardiserats tvärs labs 17. Dessutom fluorescerande lipid-analoger som i äggulan visualisera transport och ackumulation av dietlipider 18, bildcellkomponenter inklusive lipiddropparna genom att agera både som vitala färgämnen 3 och genom kovalent inkorporering i komplexa lipider, undersöka metabolism genom tunnskiktskromatografi (TLC) 19 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dessa protokoll har godkänts av Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care och användning kommittén (protokoll nr. 139).
1. Animaliska Beredning
- Behåll vuxna och larver vid 28 ° C på en 14 h: 10 h ljus: mörker-cykel. Feed vuxna två gånger dagligen med skal fri Artemia (decapsulated, icke-kläckning, börjar vid 14 dpf) och kommersiella mikropellets.
- Dessa protokoll har optimerats för användning av 6-7 dpf larver uppsamlades genom naturlig lek av AB-bakgrund. Protokoll kan modifieras för larver av andra åldrar och bakgrunder. Inte ge exogena mat före 6 dpf.
- Söva larver med Tricaine i embryo media (EM) (4,2 ml 4 mg / ml Tricaine per 100 ml EM) vid rumstemperatur (RT).
2. Beredning av Lipid rika Äggula Feed
- Förbered och lagra kyckling äggulor. Separera äggulan och vitt av 12 hönsägg. Pool äggulorna, portion en ml i 1,5ml rör och förvara vid -80 ° C upp till 1 år (12 äggulor kommer att göra ~ 80 portioner). Sammanställa vita, lagra och använda som en lipid fattigt, proteinrikt foder.
- Förbereda fluorescerande lipid analog (er) som skall läggas till äggulan foder om så önskas.
- Avbryta köpt, pulveriserad fluorescerande lipid analog i 100% etanol eller 100% kloroform på 0,1 mikrogram / l (se följande anmärkning diskuterar lösningsmedel), delprov i ogenomskinliga glasrör, tätning med parafilm, och förvara i enlighet med tillverkarens instruktioner. På grund av snabb avdunstning av organiska lösningsmedel inte använder lika stora volymer mindre än ~ 400 | il för långtidsförvaring.
Obs: Om lipid analoga suspenderas i etanol, kommer stora volymer av lipid analogen användas, eftersom det torkar snabbare under N2 än kloroform. Om lipid analoga suspenderas i etanol inte behöver torkas och resuspenderas innan den läggs till liposomen foder i steg 2.2.4, men den totala etanolkoncentrationen bör inte överstiga 0.1% i liposomen foder för att undvika potentiellt störande fysiologiska effekter av etanol. - För fluorescerande fettsyraanaloger: Förbered en total volym av 20 ml 5% äggula emulsion i EM. Från att förbereda 5 ml alikvoter med en slutkoncentration av 6,4 | iM 4,4-difluor-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacen (BODIPY C 16) för levande konfokal avbildning och födointag analyser eller 1 | ig / ml BODIPY C 12 för stereoavbildning. Överföra den önskade mängden av den fluorescerande lipiden analogen in i en 1,5 ml plaströr. Torka lipid under en ström av N2, noga med att inte blåsa lipid ut ur röret.
- Omedelbart, återsuspendera i 5 | il 100% etanol genom att pipettera en ström ner sidorna av röret, tillsätt 95 | il EM, och blanda väl.
Obs: Blandningen ska visas homogen; Om färgad lipid förblir på sidorna av röret eller vätskan är klumpiga, har lipiden inte fullständigt solubiliseras och kräver mer etanol. Skydda röret tillbakam ljus och förvara på is. - För fluorescerande kolesterol analog: förbereda en slutlig koncentration av 2,4 mikrogram / ml kolesterol i 5 ml 0,5-5% äggula emulsion för levande imaging studier. Överföra den önskade mängden av kolesterol i ett 1,5 ml plaströr. Torka lipid under en ström av N2, noga med att inte blåsa lipid ut ur röret.
- Omedelbart, återsuspendera i 15 | il av RT 100% etanol genom att pipettera en ström ner sidorna av röret och blanda med 85 pl av RT 1% fettsyrafritt BSA i renat H2O Skydda slangen från ljus och förvara på is.
- Avbryta köpt, pulveriserad fluorescerande lipid analog i 100% etanol eller 100% kloroform på 0,1 mikrogram / l (se följande anmärkning diskuterar lösningsmedel), delprov i ogenomskinliga glasrör, tätning med parafilm, och förvara i enlighet med tillverkarens instruktioner. På grund av snabb avdunstning av organiska lösningsmedel inte använder lika stora volymer mindre än ~ 400 | il för långtidsförvaring.
- Förbered Äggula Liposome Feed.
- Lägg en upptinad portion äggula till EM i ett 50 ml koniskt rör. Vortexa den utspädda äggulan blandningen under 1-2 min; blandningen skulle tyckas vara en homogen emulsion.
- Häll blandningen genom ett finmaskigt sil för att avlägsna protein konglomerat och samla in en ny, fräsch 50 ml koniska rör.
- puls sonicate äggsmeten med en fjärdedel tum avsmalnande mikro (5 gånger (5 x 1 sekund på, en sekund av) pausa 5-10 sekunder mellan varje set, utgångsintensitets: 6 W) vid RT för att skapa liposomer. Sonikator effektinställningar är instrument beroende och därför kräver optimering för varje instrument och mikro.
Obs: Kontinuerligt vagga liposomblandningen vid RT för att upprätthålla homogenitet fram till användning.
- Tillsätt fluorescerande lipid analog till äggulan liposomerna, om så önskas. Omedelbart efter ultraljudsbehandling, Pipettera de preparerade lipiderna i liposomen blandningen och vortex med hög hastighet under 30 sek för att införliva i liposomer. Skydda blandningen från ljus genom att linda röret i folie och fortsätta gunga vid RT.
3. Matnings Paradigm
- Förbered Larver för utfodring.
- Före början fodret, skärm larver av uppenbara morfologiska defekter som kan hindra matning. Transfer larver till 60 mm x 15 mm petriskålar eller 6- eller 12 brunnar plates, reducera EM till ett minimum, och ersätta med 5 ml av den framställda liposomlösningen.
- Om det behövs, överför unfed kontroll larver till 5 ml EM och / eller 5 ml 5% äggvita i EM och behandla parallellt.
- Skaka larver i en inkuberade rocker (29-31 ° C vid 30 rpm) under matningen till uppmuntra födointag samtidigt som man fortsätter att skydda från ljus om fluorescerande lipid-analoger är närvarande. Om larver behov av att utsättas för ljus, minimera exponeringen med ett tonat glas inkubator lock.
- Vid slutet av utfodringsperioden, skölj den fritt simma larver i EM 3 gånger.
Obs: Larver kan börja konsumera liposomer vid något tillfälle under matningen. Om det är viktigt att larver börja mata samtidigt, skärm för födointag (se 3.4) efter en timme av matning och tillbaka bara larver som börjat utfodring av äggula emulsion för att slutföra inmatningen. - Screen larverna vid denna tidpunkt för födointag som ett litet antal får inte eat (i allmänhet ~ 0-5%). Undersök inälvorna av larver som har bedövade eller något kylda på ett metallblock på is för att avgöra om de har utfodrats: larver som har förbrukat liposomer kommer att ha ett mörkt tarm (Figur 1).
- Bild eller process larver för födointag omedelbart. Alternativt, för att plats larver i färskt EM och inkubera vid 28 ° C tillåter metabolisk behandling skall förekomma.
4. Montering Larver för Live Imaging
- Förbered monterings Media.
- För 3% metylcellulosa: tillsätt 0,75 g metylcellulosa till 25 ml av nära kokning EM, virvel, vagga vid RT 2-3 dagar tills allt löst sig, och förvara vid 4 ° C under år vid -20 ° C. Upprepade cykler av frysning och tining vid 4 ° C kommer att ta bort luftbubblor. Lagra 3% metylcellulosa på is medan monterings larver.
- För 1,2% låg-mount agaros: lägga 0,3 g med låg smältpunkt agarosen till 25 ml EM och lös upp genom att föra till en koka, portion i 2 ml tubes, och hålls kvar vid 26-28 ° C på ett värmeblock. Oanvända alikvoter kan lagras vid RT eller -20 ° C och kokades på nytt vid tidpunkten för användning. Se till att agarosen är tillräckligt kall för att hantera innan exponering för larver eller de kan vara överhettad.
- För lågförstorande, medel genomströmning levande bilder, placera en glasskiva på en vävnad på ett metallblock på is och vänta på bilden för att svalna. Applicera en generös mängd av 3% metylcellulosa (som har hållits vid 4 ° C på is) på bilden, överföra en larv på 3% metylcellulosa, med hjälp av en metrev poker (0,41 mm fiske diameter linje limmas på änden av en glaskapillärrör) skapa en trohet att dränera överskotts EM (så att metylcellulosa inte kommer att spädas ut) och placera larver som önskas.
- För korttids (<20 min), hög förstoring levande avbildning med en upprätt olja emersion mål montera larver med täck lean-metod.
- Använda cyanoakrylat baserat lim (Superglue) tillfästa aa 22 mm x 30 mm täckglas till en ände av en glasskiva. Använd en poker att sätta en tunn linje av 3% metylcellulosa på bilden intill täck och överföra larver till bilden med ett brett hål Pasteur pipett. Ta bort överflödigt EM så att den inte kommer att späda ut metylcellulosa.
- Med användning av en poker, försiktigt placera larver i metylcellulosa på deras sidor (vänster sida upp till bilden mer av levern, med rätt sida upp till bilden gallblåsan) med sina huvuden bredvid täckglas.
- Spot superlim i hörnen av en andra täck och försiktigt placera en kant av täck på den monterade täck och den andra på bilden, överbrygga larverna. Se till att inte tillämpa övertryck under detta steg eller med målet medan avbildning så att larver förblir oskadd.
- För långsiktig, hög förstoring avbildning med en upprätt immersionsobjektiv, montera larver i agaros. Lägg en larv till en liten portion av 1,2% låg smältpunkt agaros sedan överföralarv i en liten volym agaros till en petriskål.
- Snabbt placera larver med en poker innan agarosen stelnar. Låt agarosen torka i 2-3 minuter och täcker agarosen helt med färsk EM för att förhindra den från att torka.
- För långsiktig, hög förstoring avbildning med en inverterad mål, montera larver på en glasbottnad skålen i agaros.
- Kyla ett metallblock på is. Placera skålen på metallblocket åtskilda av en servett för att förhindra överdriven kylning och larver frysning. Överför en larv till skålen och avlägsna EM genom uppsugning med en vävnad.
- Placera en droppe av 28 ° C med låg smältpunkt agaros (1,2%) ovanpå larven och omedelbart placera med en poker (vänster sida ner till bästa bild levern, höger ner till bilden gallblåsan). Ta skålen från det kalla blocket, låt torka i 2-3 minuter, och tillsätt en tillräcklig volym av färskt EM för att täcka agaros (~ 2-5 ml).
5. matkonsumtionenAnalysera
- I slutet av en äggula liposomer foder som innehåller 6,4 iM BODIPY C 16, pool minst 10 tvättas larver i en plast 1,5 eller 2 ml rör, ta bort EM, och snap frysa. Proverna kan förvaras vid -80 ° C i skydd från ljus under flera månader.
Obs: Om det är möjligt, samla flera replikat. Det är viktigt att samla in unfed larver i detta steg för att normalisera för bakgrunds lipid fluorescens (idealt larver från samma kopplingen används). - Utför en modifierad Bligh-Dyer lipidextraktion 3,21.
- Tillsätt 100 | il homogeniseringsbuffert (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) till provet på is (alternativt renat H2O kan användas). Homogenisera på is med en mikro sonikator (5 sek totalt: 1 sek på en sekund av). Kontrollera att larver är helt homogeniseras; Om inte, upprepa. Överför till en 13 ml engångsglas odlingsrör (andra glasrör kan användas).
Obs: kloroform farligt; utföra alla efterföljande lipid exdragsteg vid RT i en kemisk huva. - För varje 100 | il homogeniseringsbuffert som används, till 375 pl av 1: 2 (kloroform: metanol). Vortex 30-60 sek, inkubera 10 minuter, tillsätt 125 pl kloroform per 100 pl homogenisering buffert som används och virvel 30 sek.
- Lägg 125 | j, l av 200 mM Tris pH 7,5 per 100 | il homogeniseringsbuffert användes, virvel 30 sekund, och centrifugera (2000 x g, 5 min, RT, skyddad från ljus). Försiktigt bort proverna från centrifugen. De kommer att delas upp i två faser: en övre fasen är vattenbaserad, ett gränssnitt av larv skräp, och en lägre organisk fas (innehåller lipider).
- Med en ren glaspipett samla botten, organiska fasen och överför den till en ren 13 ml glasrör.
Obs: Var noga med att undvika vattenfasen och larver skräp vid gränsytan; Om kontaminering sker, upprepa centrifugeringssteget och påminna sig. Kassera den övre, vattenhaltiga fasen; Det kan vara till hjälp för att ta bort och kassera dennafas innan samla den organiska fasen. Provet kan lagras vid -80 ° C under upp till en månad. - Torka den organiska fasen under vakuum (0,12 atm) och samtidigt skydda mot ljus. Fortsätt inte att torka proverna efter det att vätskan har avdunstat eftersom det kommer att minska lipidlöslighet. Resuspendera lipider i 2: 1 (kloroform: metanol) och lagra på is. Den optimala volymen av kloroform: metanol-lösning beror på den detektionsmetod som används; börja lågt och fortsätter att späda efter behov. En generell riktlinje är att använda 10 pl i 10 poolade larver.
- Tillsätt 100 | il homogeniseringsbuffert (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) till provet på is (alternativt renat H2O kan användas). Homogenisera på is med en mikro sonikator (5 sek totalt: 1 sek på en sekund av). Kontrollera att larver är helt homogeniseras; Om inte, upprepa. Överför till en 13 ml engångsglas odlingsrör (andra glasrör kan användas).
- Spot hela provvolymer i jämnt fördelade intervaller på en kanaliseras TLC-platta och scanna plattan med en laserscanner som rutinmässigt används för biomolekylär avbildning (t.ex. en fluorescerande plattläsare). För de fluorescerande lipid-analoger som ingår i listan material som har en exciterings maxima 500-650 nm och emissionsmaximum 510-665 nm, använder en 488 nm laser och med emissionsuppsamlings vid 520 nm.
- Kvantifiera den totala fluorescens för varje plats med bildbehandlingsprogram.
Obs: Korrekt för naturligt förekommande bakgrunds lipid fluorescens genom att subtrahera fluorescens av parade, unfed larver prover.
- Kvantifiera den totala fluorescens för varje plats med bildbehandlingsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När matas på en rocker vid 29-31 ° C, kommer majoriteten av friska larver (≥95%) äta inom en timme. Vid konsumerar äggula emulsion, mörknar larvtarmen i färg. Mycket kan observeras mörka tarmar vid 2 h (figur 1). Om larver är unfed eller misslyckas med att mata, tarmen förblir klar. Larver matas äggvita uppvisar en utspänd intestinallumen som inte mörkare i färgen.
Figur 1:. Screening Larver för födointag Wild typ 6-DPF larver matades 5% äggula i EM för två timmar eller behandlas parallellt i EM för att få unfed kontroller. Unfed larver har tydliga tarmar medan fed larver som har ätit äggula har mörka tarmar när avbildas vid 10X på en stereoskop. Skalstrecken representerar 0,1 mm.Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Utfodring med fluorescerande lipid-analoger möjliggör visualisering av systemtransporter och subcellulära ansamling av dietlipider. Fluorescenssignalen är närvarande i hela matsmältningsorganen (tarm, lever och bukspottkörtel) av larver utfodras 5% äggula med 6,4 iM fluorescerande C16 analog under 8 h monteras med täck lean-metod och avbildas med en upprätt mål (Figur 2) 3.
Figur 2:. Fluorescerande Lipid analoger Visualisera Dietary Lipid Transport representant sammansatt bild av en 6-DPF larv (huvudet vänd höger) matas 5% äggula i EM med 6,4 iM BODIPY FL C 16 under 8 timmar. Larverna monterades i 3% metylcellulosa med täckskärm metod och avbildas med en upprätt 63X oljeimmersionsobjektiv på en enda foton konfokalmikroskop med en argonlaser. Skalstrecken representerar 20 um. Lever, L; tarmen, I; pankreas, P, gallblåsan, GB; återges med tillstånd från Dev Bio 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Olika lipid analoger tillåter visualisering av unika uppsättningar av cellulära strukturer eftersom de differentiellt metaboliseras i komplexa lipider (dvs, triglycerider, kolesterolestrar, fosfolipider). Efter 4-8 timmar flöden, fluorescerande C 16 och C 12-analoger märka lipiddropparna, fluorescerande FL C 5 etiketter lipiddropparna, lever- och pankreas kanaler, cellmembran och arteriella nätverk och fluorescerande C2 analog etiketter lever- och pankreaskanalerna och cellulära membran (Figur 3) 3.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 3:. Olika fluorescerande Lipid analoger Label Unika Cellular Organs Representativa sammansatta bilder av larver utfodras 5% äggula i EM med 6,4 iM BODIPY FL C 16, C 12, C 5, eller C2 för 4-8 timmar (6 dpf) . C 16-analog observeras i lipiddroppar (LD) av enterocyter, C 12 och C 5-analoger i enterocyter LD och tarmlumen, och C 2-analog i tarmlumen. Larver monterades i 3% metylcellulosa med täckskärm metod och avbildas med en upprätt 63x oljeimmersion mål på en enda foton konfokalmikroskop med en argonlaser. Skalstrecken representerar 20 mikrometer. Återgivet med tillstånd från Läkemedels Discov dag Dis modeller 22._blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Larver analys födointag utvecklades för att undersöka hur genetiska mutationer, transgena genen uttryck, och / eller exogen behandling påverkar larv födointag. Larver matas en lipid-rik måltid spetsade med en fluorescerande lipid analog för att indikera mängden mat som konsumeras. Unfed larver samlas parallellt för att normalisera för mängden bakgrundsfluorescens närvarande i larver, vilket ökar känsligheten, vid vilken den fluorescerande lipiden analogen kan detekteras. Denna analys användes för att visa att överuttryck av apolipoprotein A-IVb.1 (apoA-IVb.1) minskar livsmedelsintag. Tidigare unfed Tg (hsp70: ApoA-IVb.1: mCherry) larver matades 10% äggula med 6,4 | iM fluorescerande C 16-analog under 4 h vid 7 dpf konsumeras ungefär 30% färre lipider än vildtyp larver (figur 4) 20.
Figur 4:. Representant födointag analys Vildtyp (WT) och Tg (hsp70: apo-IVb.1: mCherry) (Tg) larver matades 10% kyckling äggula med 6,4 iM BODIPY FL C16 under 4 timmar (Fed) eller behandlas parallellt i EM (unfed). (A) Larver slogs samman (n = 10), var lipider extraherades och extrakten fläckvis på en TLC-platta. (B) Total fluorescens kvantifierades, uttryckt i godtyckliga fluorescensenheter (AFU), normaliserade för bakgrundsfluorescens i unfed syskon genom subtraktion, och uttrycks i förhållande till WT. Tg larver som överuttrycker ApoA-IVb.1 ingest färre fluorescerande lipid-analoger, såsom visas genom jämförelse med WT (parad t-test, p <0,001; n = 9, 20 larver per experiment). Lådan representerar 25-75: e percentilen och medianen indikeras. Whiskers visar 10-90: e percentilen. omtrycktmed tillstånd från Dis Model Mech 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tekniker som beskrivs här tillåter forskare att behandla larver zebrafisk med en lipid rikt foder, visualisera kosten lipid bearbetning i levande larver, och kvantifiera larv födointag. För att säkerställa framgång, bör särskild uppmärksamhet ägnas åt flera viktiga steg. Kommersiella hönsägg varierar; att minimera potentiella variabilitet vi utföra alla analyser på ekologiska ägg från buren fria kycklingar som inte har berikats för omega-3-fettsyror. Lägre matningshastigheter kan observeras i fisk yngre än 6 dpf med kvarvarande endogena äggula energiförsörjning, ohälsosam fisk eller fisk med utvecklings mutationer som hindrar födointag (dvs käken eller tarm missbildningar, oförmåga att simma ordentligt). Den Farber laboratorium utför i allmänhet matar studier vid 6-7 dagar efter befruktningen (DPF) eftersom larver inte kräver exogen mat tills deras endogena gule butiker är uttömda och äggula utarmning ger bättre visualisering av matsmältningssystemet. Matningvid RT också kraftigt minskar antalet larver som äter. Underlåtenhet att screena larver för födointag och oavsiktlig införandet av unfed larver i efterföljande experiment kan förbrylla resultat. Dessutom är det viktigt att skydda de fluorescerande lipid-analoger, och alla larver prover som utfodrats med de analoger, från ljus när det är möjligt att upprätthålla maximal fluorescens, och därmed analyskänsligheten. Slutligen, om födointaget kommer att mätas, inte tillåter fodret och jaga (post-feed metabolism period) att överstiga 4 timmar, sedan måltiden börjar att utsöndras. För närvarande är den hastighet med vilken måltiden och tillhörande fluorescerande lipid-analoger utsöndras okänd, men fluorescens kan kvarstå hela larvkroppen under åtminstone 2 dagar efter foder (JPO och SAF opublicerade data).
Det finns flera sätt att ändra och felsöka protokoll för att svara på de experimentella frågor av intresse. Lipid-rika foder kan utföras för olika perioder av tIME: 1 hr kommer att ge en liten måltid, medan 4 tim kommer att fylla tarmen med en stor mängd lipid. Men mata larverna längre än sex timmar rekommenderas inte eftersom äggulan och EM är inte beredda under sterila förhållanden och bakteriell överväxt i äggulan / vit emulsion kan förvirra resultat (det vill säga ökad inflammation, förändrad tarmfloran profil). Larver kan undersökas omedelbart efter utfodring att undersöka akuta effekter av foder larver immobiliserade genom kortvarig kylning eller anestesi snabbt börja matas igen efter återuppvärmning, men kylning är att föredra metod för immobilisering som larver kan uppvisa kräkningar vid anestesi (SAF opublicerad observation). Alternativt kan chase perioder utföras efter fodret för att möjliggöra transport och metabolism av dietlipider före studien. Även foder genomförs vanligen i 5 ml liposomlösning har flöden varit framgångsrikt bedrivit i volymer från 1 till 20 ml. olika koncentrationers från äggula kan användas för larv flöden; det Farber laboratoriet utför rutinmässigt experiment med 5% äggula (1 ml äggula sattes till 19 ml EM), 0,5% äggula, och 10% äggula.
Det finns potentiella begränsningar av fluorescerande lipid-analoger som måste beaktas. När du väljer en fluorescerande lipid analog är det viktigt att tänka på hur lipid är fysiologiskt bearbetas och där den fluorescerande gruppen är på den kemiska strukturen hos lipid vid tolkning av resultaten. Till exempel är triglycerider bryts ned till fria fettsyror och glycerol, och kolesterolestrar till fria kolesterol och fettsyror, i tarmlumen före absorption. Därför, om en fluorescerande triglycerid eller kolesterolester-analog är anordnad i dieten den fluorescens som observeras i kroppen kommer att spåra fettsyran, fri kolesterol, eller glycerol som den fluorescerande delen är fäst till, inte den ursprungliga triglycerid eller kolesterolester. annorlunda fluorescent lipid-analoger märka unika cellulära strukturer, och detta faktum bör övervägas vid val 3. Lägg också märke till, jämfört med metabolismen av inhemska fettsyror, är tillägget av en BODIPY del ungefär motsvarar lägga ~ 2-3 kolatomer till fettsyra-kedjelängden (SAF opublicerade data).
De tekniker som beskrivs här utgör betydande förbättringar jämfört med tidigare analyser som beskrivs i fält. Innan utvecklingen av denna kyckling äggula foder, två manuskript detaljerade studier där larverna matades drivs hårdkokt äggula 4,23. Den teknik som beskrivs här uppvisar fördelen att äggulan inte behöver vara svårt kokt och pulveriserad före användning och att pulveriserad äggula har en mycket kort halveringstid på grund av dess snabba oxidation. Flytande äggula kan också framställas som liposomer som lätt accepterar fluorescerande lipid-analoger för effektiv kost leverans. Alternativt kan radiomärkta lipider användas för att undersöktigate kost lipidmetabolism och mäta födointaget, men fluorescerande lipid-analoger inte presentera säkerhetsrisker förknippade med radioaktivitet. Men om forskarna vill använda radiomärkta lipider har Farber laboratorium utfört studier för att verifiera att radiomärkta lipider kan införlivas i, och framgångsrikt matas med liposomer 19. De fluorescerande lipid-analoger som beskrivs här valdes eftersom de visar mycket liknande metabolism till endogena och radiomärkta lipider, och var tillräckligt ljus för låg- och hög effekt avbildning.
Föregår utvecklingen av denna teknik för att mata fluorescerande lipid-analoger till larver, inga andra metoder var tillgängliga för att visualisera dietary lipidtransport och ackumulering i vivo. Direkt visualisering av fluorescerande lipid-analoger kan ge en fördel jämfört med användning av indirekta åtgärder för fysiologi, såsom serumlipider. Noggrann mätning av larver zebrafisk födointag var också en lång staENDE utmaning inom området. Det enda alternativet var att odla paramecia, märka dem med fluorescerande lipofila spårämne 4- (4- (didecylamino) styryl) - N -methylpyridinium jodid (4-Di-10-ASP), tillåta larverna att mata och mäta fluorescens intra-buken med en plattläsare 24. Slutligen, dessa tekniker har fördelen av att vara tillämplig på både medel genomströmning skärmar (dvs framåt genetiska skärmar av kosten lipid bearbetning) samt fokuserad hög förstoring avbildningsstudier (dvs. omvända genetiska, hypotes drivna studier). I framtiden kan dessa tekniker tillämpas på fenotyp och screena olika modeller av metabola och GI sjukdom i zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501 (2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M.
- Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
- Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
- Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485 (2013).
- Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474 (2012).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
- Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
- Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
- Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
- Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
- Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
- Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
- Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).
